JPH09124683A - 新規化合物ａ３８８４０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】高脂血症、動脈硬化症等の予防薬および／また
は治療薬として有用なＡ３８８４０またはその塩を提供
する。 【解決手段】式（Ｉ） 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は脂質代謝障害による
高コレステロール血症などの高脂血症の治療とアテロー
ム性動脈硬化症の予防に有効な、Ａ３８８４０またはそ
の薬理上許容される塩に関する。

【０００２】

【従来の技術】動脈硬化症は、体内におけるコレステロ
ールの蓄積が原因の一つであることが知られている。ま
た、動脈硬化症のほとんどはアテローム性動脈硬化症で
あり、この疾患ではコレステロールが動脈壁に蓄積して
アテローム斑点を作り、この蓄積したコレステロール
は、血中に含まれている低密度リポタンパク質（Low De
nsity Lipoprotein ：ＬＤＬ）と呼ばれる粒子に由来し
ているとされている。従って、血中のＬＤＬ濃度が高い
ほど、アテローム性動脈硬化症は早く進行する。

【０００３】ヒトＬＤＬ受容体遺伝子を導入したトラン
スジェニックマウスが作製され、人為的にＬＤＬ受容体
遺伝子の発現を上昇させることにより血中のＬＤＬが、
著明に低下したとの報告がなされている［Science 、25
0 巻、1273頁（1990年）］。血中ＬＤＬを低下させる薬
剤としては、内因性コレステロールの生合成経路上の律
速酵素である３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコ
エンザイムＡ リダクターゼ（3-Hydroxy-3-Methylglut
aryl-Co A reductase ：ＨＭＧ ＣｏＡリダクターゼ）
を特異的に阻害する物質、例えば、現在市販されている
メバロチン（登録商標名；一般名 プラバスタチンナト
リウム）およびメバコール（登録商標名；一般名 ロバ
スタチン）があげられる。これらの物質は、肝臓におけ
るコレステロールの生合成を阻害する事によって、間接
的にＬＤＬ受容体の数の上昇をもたらし、それによっ
て、血中のＬＤＬ濃度を低下させる。

【０００４】サポニン系の化合物としては、例えばアス
ツラガルス・メンブランセス( Astragalus membranceu
s) 、ウィステリア・ブラキボツリス(Wisteria brachyb
otrys) 、クロタラリア・テバイカ(Crotalaria thebaic
a) から単離されているアスツラガロサイドＶＩＩＩ(12
-Oleanene-3、22、24-triol、3-O- α-L-Rhamnopyranosyl-
1、2- β-D-xylopyranosyl-1、2- β-D-glucuronopyranos
ide)(北川ら、Chem.Pharm.Bull.、 31 巻、 2号、 716-
722頁(1983 年))またはオキシツロピス・オクロセファ
ラ(Oxytropis ochrocephala)から単離されている１２−
オレアネン−３、２２、２４−トリオール、３−Ｏ−α
−Ｌ−ラムノピラノシル−１、２−α−Ｌ−アラビノピ
ラノシル−１、４−β−Ｄ−グルクロノピラノサイド(1
2-Oleanene-3、22、24-triol、 3-O-α-L-Rhamnopyranosyl
-1、2- α-L-arabinopyranosyl-1、4-β-D-glucuronopyra
noside)(アール・サン（R.Sun)ら、Planta Med.、 58
巻、 211-213 頁(1992 年))が知られているが、効能につ
いての記載はない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ＬＤＬ
受容体遺伝子の発現を直接亢進させ、血中のＬＤＬを特
異的に低下させる作用を有する物質の検索を行い、スト
レプトミセス属に属するＳＡＮＫ ６０８９２株の培養
液から新規化合物としてＡ３８８４０が生産されること
を見出し、Ａ３８８４０およびその薬理上許容される塩
が優れたＬＤＬ受容体遺伝子発現増強作用を有し、脂質
代謝障害による高コレステロール血症などの高脂血症の
治療とアテローム性動脈硬化症に有効なことを見出して
本発明を完成した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は式（Ｉ）

【０００７】

【化２】

【０００８】を有するＡ３８８４０またはその塩に関す
る。

【０００９】更に、本発明は式（Ｉ）を有するＡ３８８
４０またはその塩の製法、その用途に関する。

【００１０】本発明の式（Ｉ）を有するＡ３８８４０は
下記の理化学的性状を有する。

【００１１】（１）物質の性状： 酸性脂溶性。 （２）分子式： Ｃ₄₇Ｈ₇₆Ｏ₁₇ 高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［（Ｍ＋Ｎａ）⁺ ］法を用いて、
推定式Ｃ₄₇Ｈ₇₆Ｏ₁₇Ｎａ（Ｎａ塩として）で測定した結
果、 理論値： ９３５．４９８０ 測定値： ９３５．５０１５ であった。

【００１２】（３）分子量： ９１２（高分解能ＦＡＢ
−ＭＳ法により測定） （４）紫外線吸収スペクトル（λ_max nm (ε) ）：メタ
ノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは、末端吸収
のみである。

【００１３】（５）赤外線吸収スペクトル：ν_max cm^-1 臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定した赤外線吸収ス
ペクトルは、次に示す通りである。 3425、 2947、 1730、 1676、 1637、 1458、 1414、 1384、 1364、 1257、 1205、 1176、 1138、 1079、 1052、 979 。

【００１４】（６） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：
（δ、ｐｐｍ）重メタノール中、テトラメチルシランを
内部基準として使用して測定した核磁気共鳴スペクトル
（360MHz) は、次に示す通りである。 0.82(s)、 0.89(s)、 0.91(s)、 0.94(m)、 0.96(m)、 1.00(s)、 1.04(m)、 1.05(m)、 1.12(s)、 1.25(s)、 1.25(s)、 1.31(m)、 1.33(m)、 1.37(m)、 1.40(m)、 1.46(m)、 1.58(m)、 1.59(m)、 1.63(m)、 1.65(m)、 1.76(m)、 1.77(m)、 1.81(m)、 1.87(m)、 1.97(s)、 2.05(m)、 2.10(m)、 3.20(d)、 3.38(m)、 3.38(m)、 3.4 (m)、 3.4 (m)、 3.53(d)、 3.55(m)、 3.55(m)、 3.57(m)、 3.64(m)、 3.65(m)、 3.72(m)、 3.74(m)、 3.84(d)、 3.92(dd)、 4.10(m)、 4.14(d)、 4.45(d)、 4.78(d)、 5.12(brs)、 5.25(t) 。

【００１５】（７）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：
（δ、ｐｐｍ） 重メタノール中、テトラメチルシランを内部基準として
使用して測定した核磁気共鳴スペクトル（90MHz)は、次
に示す通りである。 16.47, 17.59, 18.29, 19.44, 20.43, 23.38, 2
4.87, 25.41,26.90, 27.09, 29.10, 29.96, 31.40
(s), 32.56, 34.42,37.52(s), 38.61(s), 39.88,
40.79(s), 42.27, 43.40(s),44.76(s), 46.80, 47.
47, 49.0, 57.42, 64.39, 67.13,69.61, 71.12,
72.24, 72.30, 74.16, 74.29, 75.85, 77.00 77.01, 77.69, 78.05, 78.43, 92.27, 102.32, 1
02.54,105.62, 123.77, 145.15(s), 176.56(s) 。

【００１６】 （８）高速液体クロマトグラフィー： 分離カラム： センシュウパック Ｈ−２１５１（カラム φ６× １５０ｍｍ、センシュウ科学（株）製） 移動層 ： アセトニトリル−０．２Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ ６．８）＝３４：６６ 流 速 ： １．０ ｍｌ／分 検出波長 ： ＵＶ ２１０ ｎｍ 保持時間（Ｒｆ値）： ７．９分。

【００１７】（９）溶解性：メタノール、エタノール、
ジメチルスルホキシドに可溶、酢酸エチル、水に難溶、
クロロホルム、ヘキサンに不溶。

【００１８】本発明のＡ３８８４０は種々の立体異性体
を有する。本発明のＡ３８８４０においては、これらの
異性体の等量および非等量混合物がすべて単一の式で示
されている。従って、本発明においてはこれらの異性体
およびこれらの異性体の混合物をもすべて含むものであ
る。

【００１９】更に本発明において、Ａ３８８４０が溶剤
和物（例えば水和物）を形成する場合には、これらもす
べて含むものである。

【００２０】例えば、本発明のＡ３８８４０が、大気中
に放置されたり、または再結晶をすることにより、水分
を吸収し、吸着水が付着したり、水和物を形成する場合
がある。本発明にはこのような溶剤和物も含まれる。

【００２１】更に本発明において、生体内において代謝
されてＡ３８８４０に変換される化合物、いわゆるプロ
ドラッグもすべて含むものである。

【００２２】本発明のＡ３８８４０は、常法に従って塩
にすることができる。Ａ３８８４０の塩としては、Ａ３
８８４０に比べて医学的に使用され、薬理上受け入れら
れる、即ち活性を低下せしめない、毒性を増加せしめな
い、ものであれば特に限定はない。なお、医薬以外の用
途、例えば中間体として使用する場合は、なんら限定は
ない。

【００２３】そのような塩としては例えばリチウム、ナ
トリウム、カリウムのようなアルカリ金属塩；カルシウ
ム、バリウム、マグネシウムのようなアルカリ土類金属
塩；アルミニウム塩；リジン、アルギニンのような塩基
性アミノ酸の塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチル
アミンのようなアミン塩：等をあげることができる。好
適には薬理上許容される塩である。

【００２４】本発明の新規化合物Ａ３８８４０を生産す
る上記 ＳＡＮＫ ６０８９２株は土壌より分離された
ものである。ＳＡＮＫ ６０８９２株の形態学的特徴、
生理学的性状は次の通りである。

【００２５】１．形態学的特徴 ＳＡＮＫ ６０８９２株はインターナショナル・ストレ
プトマイセス・プロジェクト（ＩＳＰ：International
Streptomyces Project）規定の培地上で２８℃、１４日
間の培養により次のような形態学的特徴を示した。光学
顕微鏡による観察ではＳＡＮＫ ６０８９２の基生菌糸
は良好に伸長、分岐し薄茶、灰味黄茶ないしオリーブ灰
色を示すが、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌株
様の断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は単純
分岐する。胞子連鎖の形態は螺旋状を示し、およそ１０
ないし５０個またはそれ以上の胞子の連鎖を形成する。
走査型電子顕微鏡による観察では胞子は楕円形で、その
表面構造はとげ状（Ｓｐｉｎｙ）を示す。胞子の大きさ
は０．８〜１．０×０．８〜１．２μｍである。胞子は
気菌糸上にのみ形成される。また、胞子のう、気菌糸の
車軸分岐、気菌糸の断裂、菌核などの特殊器官は認めら
れない。

【００２６】２．各種培養基上での培養性状 ＳＡＮＫ ６０８９２株の２８℃、１４日間培養後の寒
天培地上での培養性状は表１に示す通りである。

【００２７】

【表１】 ────────────────────────────────── 培地の種類 項目^*1 ＳＡＮＫ ６０８９２株の性状 ────────────────────────────────── イーストエキス・ Ｇ ： 非常に良好、平坦、灰味黄茶 (2.5Y 5/3) ^*2 麦芽エキス寒天 ＡＭ： 豊富に形成、ビロード状、薄黄味茶(2.5Y7/2) （ＩＳＰ２） Ｒ ： 黄味茶(10YR 6/6) ＳＰ： 黄味茶(10YR 6/6) ────────────────────────────────── オートミール寒天 Ｇ ： 非常に良好、平坦、オリーブ灰 (5Y 7/3) ＡＭ： 豊富に形成、ビロード状、茶味灰(2.5Y6/2) Ｒ ： 黄味茶(2.5Y 6/4) ＳＰ： 産生せず ────────────────────────────────── 澱粉・無機塩寒天 Ｇ ： 良好、平坦、薄茶 (2.5Y 8/2) ＡＭ： 豊富に形成、ビロード状、薄茶(2.5Y8/2) Ｒ ： 薄茶(2.5Y 9/4) ＳＰ： 産生せず ────────────────────────────────── グリセリン・ Ｇ ： 非常に良好、平坦、灰味黄茶 （２．５Ｙ ６／
３） アスパラギン寒天 ＡＭ： 豊富に形成、ビロード状、茶味灰（１０ＹＲ６／
２） （ＩＳＰ５） Ｒ ： 黄味茶(2.5Y 7/4) ＳＰ： 産生せず ────────────────────────────────── ペプトン・イーストＧ ： 良好、平坦、茶味灰 (2.5Y 6/2) エキス・鉄寒天 ＡＭ： 形成せず （ＩＳＰ６） Ｒ ： 茶味灰(10YR 4/2) ＳＰ： 暗い黄味茶(7.5YR 3/2) ────────────────────────────────── チロシン・寒天 Ｇ ： 非常に良好、平坦、灰味黄茶 (2.5Y 5/3) （ＩＳＰ７） ＡＭ： 豊富に形成、綿毛状、薄黄味茶(2.5Y7/2) Ｒ ： 暗い茶味灰(7.5YR 3/1) ＳＰ： 茶味灰(10YR 4/2) ────────────────────────────────── シュクロース・ Ｇ ： あまり良くない、平坦、茶味白 (2.5Y 9/1) 硝酸塩寒天 ＡＭ： 良好、ビロード状、薄黄味茶(2.5Y7/2) Ｒ ： 茶味白(2.5YR 9/1) ＳＰ： 産生せず ────────────────────────────────── グルコース・ Ｇ ： 良好、平坦、茶味白 (10YR 9/2) アスパラギン寒天 ＡＭ： 良好、ビロード状、明るい茶味灰(10YR 8/2) Ｒ ： 茶味白(2.5Y 9/1) ＳＰ： 産生せず ────────────────────────────────── 栄養寒天 Ｇ ： 良好、平坦、薄黄味茶 (2.5Y 7/3) （ＤＩＦＤＯ） ＡＭ： 僅かに形成、白 Ｒ ： 薄黄味茶(2.5Y 8/4) ＳＰ： 薄黄味茶(2.5Y 8/6) ────────────────────────────────── ポテトエキス・ Ｇ ： 良くない、平坦、茶味白 (2.5Y 9/1) 人参エキス寒天 ＡＭ： 非常に良好、綿毛状、明るい茶味灰（10YR 8/2) Ｒ ： 茶味白(2.5Y 9/1) ＳＰ： 産生せず ────────────────────────────────── 水寒天 Ｇ ： 良くない、平坦、茶味白 (2.5Y 9/1) ＡＭ： 良好、綿毛状、明るい茶味灰（10YR 8/2) Ｒ ： 茶味白(2.5Y 9/1) ＳＰ： 産生せず ────────────────────────────────── ＊１：Ｇ：生育、ＡＭ：気菌糸、Ｒ：裏面、ＳＰ：可溶性色素 ＊２：マンセル方式に準拠した色調の表示３．生理学的性質 ２８℃で培養後、２ないし２１日間に観察したＳＡＮＫ
６０８９２株の生理学的性質は表２に示す通りであ
る。

【００２８】

【表２】 生理学的性質 ＳＡＮＫ ６０８９２株 ──────────────────────────── 澱粉の水解 陽 性 ゼラチンの液化 陰 性 硝酸塩の還元 陽 性 ミルクの凝固 陰 性 ミルクのペプトン化 陰 性 メラニン様色素生産性 陽 性 基質分解性：カゼイン 陰 性 チロシン 陰 性 キサンチン 陰 性 生育温度範囲（培地１） １５−４１℃ 生育適正温度（培地１） １８−３３℃ 食塩存在下での生育（培地１） ５％ ──────────────────────────── 培地１：イーストエキス・麦芽エキス寒天（ＩＳＰ２）。

【００２９】また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地
（ＩＳＰ９）を使用して、２８℃、１４日間培養後に観
察したＳＡＮＫ ６０８９２株の炭素源の資化性は表３
に示す通りである。

【００３０】

【表３】 ＳＡＮＫ ６０８９２株の炭素源の資
化性 ＋：資化する、 −：資化しない。

【００３１】４．化学分類学的性質 ＳＡＮＫ ６０８９２株の細胞壁は長谷川らの方法［長
谷川ら、ザ・ジャーナル・オブ・ゼネラル・アンド・ア
プライド・マイクロバイオロジー（TheJournal of Gene
ral and Applied Microbiology)、29巻、 319−322 頁
(1983 年) ］に従い検討した結果、ＬＬ−ジアミノピメ
リン酸が検出された。また、ＳＡＮＫ ６０８９２株の
全細胞中の主要糖成分をエム・ピー・レシェバリエの方
法［M.P.Lechevalier 、ジャーナル・オブ・ラボラトリ
ー・アンド・クリニカル・メディシン（Journal of Lab
oratory and Clinical Medicine)、71巻、 934−944 頁
(1968 年) ］に従い検討した結果、特徴的な成分は検出
されなかった。

【００３２】以上の菌学的性質からＳＡＮＫ ６０８９
２株は放線菌の中でもストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）属に属することが明らかにされた。従
ってＳＡＮＫ ６０８９２株はストレプトマイセス・エ
スピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ
６０８９２株と同定された。ＳＡＮＫ ６０８９２株
は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５２２５ として寄託されている。

【００３３】以上、ＳＡＮＫ ６０８９２株について説
明したが、ストレプトミセス属の菌類の諸性質は一定し
たものではなく、自然的、人工的に容易に変化すること
は周知の通りであり、本発明で使用しうる菌株はストレ
プトミセス属に属するＡ３８８４０を生産する全ての菌
株を包含するものである。

【００３４】

【発明の実施の形態】本発明のＡ３８８４０を得るた
め、これらの微生物の培養は他の発酵生成物を生産する
ために用いられるような培地中で行なわれる。このよう
な培地中には、微生物が資化出来る炭素源および無機塩
を含有する。

【００３５】一般に、炭素源としてグルコース、フラク
トース、マルトース、シュークロース、マンニトール、
グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウ
モロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、綿実
油、糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一に、あるいは併
用して用いる事が出来る。一般には、培地量の １−１
０重量％で変量する。

【００３６】窒素源としては、一般に蛋白質を含有する
物質を発酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆
粉、フスマ、落花生粉、綿実粉、カゼイン加水分解物、
ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプト
ン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキ
ス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム等である。窒素源は、単一または併用して培地量の
０．２−６重量％の範囲で用いる。

【００３７】培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニ
ウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カ
ーボネート等のイオンを得ることの出来る通常の塩類で
ある。また、コバルト、マンガン、鉄等の微量の金属も
含む。

【００３８】液体培養に際しては、消泡剤としてシリコ
ン油、植物油、界面活性剤等が使用される。

【００３９】ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ６０８９２株を培養
しＡ３８８４０を生産する培地のｐＨは、５．０−７．
０に変化させることが出来る。

【００４０】菌の生育温度は１５℃から４１℃までであ
るが、１８℃から３３℃の範囲が生育良好であり、更に
Ａ３８８４０の生産には、２２℃から３０℃が好適であ
る。Ａ３８８４０は、好気的に培養して得られるが通常
用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培
養法、通気撹拌培養法等が用いられる。

【００４１】小規模な培養においては、２８℃で数日
間、振とう培養を行うのが良好である。 培養は、バッ
フル（水流調節壁）のついた三角フラスコ中で、１−２
段階の種の発育工程により開始する。種発育段階の培地
は、炭素源および窒素源を併用出来る。種フラスコは定
温インキュベーター中で２８℃、７日間振とうするか、
または充分に成長するまで振とうする。成長した種は第
二の種培地、または生産培地に接種するのに用いる。中
間の発育工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で
成長させ、生産培地に接種するためにそれを部分的に用
いる。接種したフラスコを一定温度で数日間振とうし、
インキュベーションが終わったらフラスコの含有物を遠
心分離またはろ過する。

【００４２】大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を
付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法
によれば、栄養培地をタンクの中で作成出来る。栄養培
地を１２５℃まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地に
あらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は２８
℃で通気撹拌して行う。この方法は、多量の化合物を得
るのに適している。

【００４３】培養終了後、培養液中の液体部分に存在す
るＡ３８８４０は、菌体、その他の固形部分を珪藻土を
ろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別
し、そのろ液または上清中に存在するＡ３８８４０を、
その物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得
られる。例えば、ろ液または、上清中に存在するＡ３８
８４０は、酸性ｐＨ条件下で水と混和しない有機溶剤、
例えば酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチレン、塩化
メチレン−ブタノールなどの単独または、それらの組み
合わせにより抽出精製することができる。あるいは吸着
剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバ
ーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（ローム・アンド・ハ
ース社製）等や、ダイアイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２
０、ＣＨＰ−２０、ＨＰ−５０（三菱化成（株）社製）
等が使用される。Ａ３８８４０を含む液を上記のごとき
吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除く
か、またはＡ３８８４０を吸着させた後、メタノール
水、アセトン水、ブタノール水などを用いて溶出させる
ことにより得られる。

【００４４】このようにして得られたＡ３８８４０は、
更にシリカゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリ
ジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィ
ー、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）な
どを用いた分配カラムクロマトグラフィー、コスモシー
ル１４０Ｃ₁₈−ＯＰＮ（商品名、ナカライテスク（株）
製）などの逆相担体を用いたカラムクロマトグラフィー
および順相、逆相カラムを用いた高速液体グクロマトグ
ラフィー等で精製することが出来る。

【００４５】以上の分離、精製の手段を単独または適宜
組み合わせ反復用いることによりＡ３８８４０を分離精
製することができる。

【００４６】本発明のＡ３８８４０を医薬として用いる
場合、常法に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許容
される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末、顆粒、錠
剤、カプセル剤、注射剤などの形態で経口的または非経
口的に安全に投与することが出来る。投与量は対象疾
患、投与経路および投与回数などにより異なるが、例え
ば成人に対しては１日下限０．１ｍｇ（好適には１ｍ
ｇ、更に好適には１０ｍｇ）から上限２０００ｍｇ（好
適には２００ｍｇ、更に好適には２０ｍｇ）を、症状に
応じて１回または数回に分けて投与するのが好ましい。

【００４７】

【実施例】次に実施例および試験例をあげて本発明を更
に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。

【００４８】実施例１ （１） 培養 ストレプトミセス・エスピー ＳＡＮＫ ６０８９２株
を滅菌した後述の表４の組成から成るＴ−１２培地 ８
０ｍｌを含む ５００ｍｌの三角フラスコに白金耳接触
し、２８℃で２００ｒｐｍ（７ｃｍ、回転半径）の回転
数のロータリー振とう培養機で３日間前培養した。この
前培養液を滅菌した同じ組成のＴ−１２培地 ８０ｍｌ
を含む ５００ｍｌの三角フラスコ７０本に各フラスコ
に２ｍｌづつ植菌し、２８℃でロータリー振とう培養機
で７日間本培養を行った。

【００４９】

【表４】 Ｔ−１２培地 ────────────────────── グルコース ３．０％ 生イースト １．０％ 大豆粉 ３．０％ 炭酸カルシウム ０．４％ 硫酸マグネシウム・７水和物 ０．２％ 消泡剤 ０．１％ ────────────────────── ｐＨ ７．２。

【００５０】（２） 単離精製 得られた培養液 ５．６リットルにろ過助剤としてセラ
イト５４５（ジョーンズ・マンビル・プロジェクト・コ
ーポレーション製、米国） ５００ｇを加えてろ過を行
い、ろ液 ４リットルを得た。このろ液に当量（４リッ
トル）の酢酸エチルを加えた後、塩酸で ｐＨ３．０に
調整し、酢酸エチルで抽出を行った。抽出液の水層は再
度、４リットルの酢酸エチルで抽出を行い、得られた酢
酸エチルを合併し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。酢
酸エチル層は減圧下で濃縮した。得られた抽出物 １．
９ｇを少量のメタノールに溶解し、Ｓｅｐ−ｐａｋ−Ｃ
−１８（Ｖａｃ，３５ｃｃ，ウォータース社製） １０
ｇに充填し、順次２０％、３０％、４０％、５０％、７
０％アセトニトリルで溶出した。５０％アセトニトリル
の溶出画分を濃縮し、次いで凍結乾燥を行うと ４４ｍ
ｇの粉末が得られた。次に、この粉末を高速液体クロマ
トグラフィーを用いて分取した。即ち、上記の粗粉末を
少量のメタノール １ｍｌに溶解し、この １００μｌ
づつをセンシュウパック ＯＤＳ型のＨ−４２５１（セ
ンシュウ科学（株）社製、φ１０×２５０ｍｍ）に注入
した。展開溶剤として３４％アセトニトリル−０．０４
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて流速 ３ｍｌ／
分で展開した。Ａ３８８４０は１０分〜１２分に溶出し
た。この区分を減圧下でアセトニトリルを留去し、得ら
れた水溶液は先に記したＳｅｐ−ｐａｋ−Ｃ−１８を用
いて脱塩した。即ち、水溶液をＳｅｐ−ｐａｋ−Ｃ−１
８に吸着させ、次いで水洗後、４０％アセトニトリルで
溶出した。溶出液を減圧下で濃縮後、凍結乾燥するとＡ
３８８４０が粉末として １５．２ｍｇ得られた。

【００５１】

【試験例】試験例１ クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼを用いたアッセイ法（レポーターアッセイ法）
によるＬＤＬ受容体遺伝子増強活性の測定 ＬＤＬ受容体遺伝子の発現量の定量は、基本的にはＳｕ
ｄｈｏｆｆらの方法［Cell、48巻、1061頁（1987年）］
を用いた。即ち、ＬＤＬレセプター遺伝子のプロモータ
ー領域に存在する、ステロール レギュラトリー エレ
メント（SterolRegulatory Element：ＳＲＥ）と呼ばれ
るＤＮＡ領域をＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステ
ムズ社製）を用いて、化学的に合成し、細菌のクロラム
フェニコール耐性遺伝子を持つプラスミドｐＵＣＣＡＴ
へと挿入した。次に、作成した組み替えプラスミドをチ
ャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（Chinese Hamster Ov
ary Cell：ＣＨＯ）へ遺伝子導入装置（ＧＴＥ−１（商
品名）、（株）島津製作所製）を用いて導入した。この
細胞のＬＤＬ受容体遺伝子のレベルはクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（Chloramphenicol Ac
etyltransferase ：ＣＡＴ）の活性を測定することで定
量できる。この方法は、一般にレポーターアッセイ法と
呼ばれる方法であり、ゴーマンらによって開発された
［Molecular and Cellular Biology、2 巻、1044頁（19
82年）］。ＬＤＬ受容体遺伝子とＣＡＴ遺伝子を染色体
上に有する細胞の抽出液の調整法とクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼの測定法は、上記のゴー
マンらの方法に従った。また、この細胞の培養は、以下
のように行った。即ち、４穴プレートに適当な数の細胞
を植え込み、２４時間後に培養液（９０％α−ＭＥＭ
（Minimum Essential Medium) ＋１０％牛胎児血清（Fe
tal Calf Serum：ＦＣＳ）を除き、被検物質を添加した
培養液（９５％α−ＭＥＭ＋５％ＦＣＳ）で更に２４時
間培養した。細胞培養は、３７℃に保温した５％炭酸ガ
スインキュベーター中で行った。被検物質を培養液に添
加し、２４時間後に細胞抽出液を調製して、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼの活性を測定し
た結果、無添加のコントロールの １．７倍のクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼの活性の上昇
が認められた。従って、ＬＤＬ受容体遺伝子の発現を上
昇させている事が示された。

【００５２】試験例２ ルシフェラーゼ・アッセイ法
によるＬＤＬ受容体遺伝子増強活性の測定 ルシフェラーゼアッセイ法は、上記の試験例１で述べた
レポーターアッセイ法の一種であり、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の代わりに、蛍
由来のルシフェラーゼ遺伝子を用いる方法である［J.R.
de Wet ら、Molecular and Cellular Biology、7 巻、
725 頁（1987年）］。上記の試験例１で化学合成したＬ
ＤＬ受容体遺伝子のプロモーター領域に、蛍ルシフェラ
ーゼ遺伝子を結合したプラスミドを作成して、チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）へ同様な方法で導
入した。この細胞のＬＤＬ受容体遺伝子のレベルはルシ
フェラーゼの活性を測ることで定量できる。

【００５３】ルシフェラーゼ酵素のアッセイ用試薬とし
ては、ピッカジーンルシフェラーゼアッセイシステム
（東洋インキ（株）社製）を使用した。ケミルミネッセ
ンス測定装置（ルミノメーター）としては、「ルミノス
キャン」（商品名、ラボシステムズ社製）を用いた。細
胞の培養と破砕法は、以下の方法で行った。即ち、ＬＤ
Ｌ受容体遺伝子プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を
組み込んだチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）を２４穴プレートに適当量植え込み、約２４時間後
に、培養液（９０％α−ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）を除
き、適当量のアッセイ用サンプルを添加した培養液（９
５％α−ＭＥＭ＋５％ＦＣＳ）と交換した。更に、２４
時間培養後、培養液を除き、緩衝液（１３７ｍＭ 塩化
ナトリウム、２．７ｍＭ 塩化カリウム、４．３ｍＭ
リン酸水素ニナトリウム、１．４ｍＭリン酸ニ水素カリ
ウム）で細胞を２回洗い、５０μｌの細胞溶解液（２５
ｍＭトリス−リン酸(Tris-phosphate 、ｐＨ７．８）、
２ｍＭ ジチオスレイトール（dithiothreitol：ＤＴ
Ｔ）、２ｍＭ １、２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ、
Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸、 １０％ グリセロール、
１％ トライトン(Triton) Ｘ−１００）を加えた後、
低速遠心機で遠心した上清を細胞粗抽出液として、ルシ
フェラーゼアッセイに用いた。細胞抽出液の蛋白質濃度
は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオ−ラ
ド(Bio-Rad) 社製）を用いて測定した。ルシフェラーゼ
アッセイ用９６穴プレートに細胞粗抽出液２０μｌを入
れ、プレートをルミノスキャンにセットした後、発光基
質液（２０ｍＭ トリシン（Tricine)、 ３３．３ｍＭ
ＤＴＴ、 １．０７ｍＭ 炭酸マグネシウム・水酸化
マグネシウム・５水和物（(MgCO₃)₄Mg(OH)₂/5H₂O）、
２７０μＭ 補酵素Ａ、２．６７ｍＭ 硫酸マグネシウ
ム、 ４７０μＭ ルシフェリン(luciferin) 、０．１
ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ethylenediamine tetr
aacetic acid：ＥＤＴＡ）、５３０μＭ アデノシン三
リン酸（adenosine triphosphate：ＡＴＰ）を１００μ
ｌずつ分注して室温で反応を開始させた。反応開始後、
５秒間の発光量の積分値（単位：ｒｌｕ）を読み取り、
蛋白質量（単位：ｍｇ）で割った値（ｒｌｕ／ｍｇ）を
計算した。その結果、被検物質は、無添加のコントロー
ルに比べて、ルシフェラーゼ活性を２．５倍上昇させる
活性が認められた。

【００５４】試験例３ 放射性ヨード標識 ＬＤＬ
ＢＩＮＤＩＮＧ ＡＳＳＡＹ法によるＬＤＬ受容体増強
活性の測定 ＬＤＬ受容体遺伝子発現増強作用が、実際にＬＤＬ受容
体蛋白質の上昇につながるかどうかを確認するために、
ＬＤＬ受容体にヨードで放射標識したＬＤＬ（［
¹²⁵Ｉ］ＬＤＬ）を結合させて、ＬＤＬ受容体の上昇を
直接確認する実験を行った。ヒト新鮮血１４０ｍｌよ
り、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの方法［Method inEnzymolo
gy、98巻、241 頁（1983年）］に従って、コレステロー
ルを除いたヒト血清（Lipoprotein Deficient Serum ：
ＬＰＤＳ）およびヒトＬＤＬを調製した。ＬＤＬのヨー
ド標識と細胞への結合実験もＧｏｌｄｓｔｅｉｎらの方
法に従った。ヒト繊維芽細胞ＮＨＤＦ株の培養は、適当
量の培養液（９０％Ｅ・ＭＥＭ（Eagle Minimum Essent
ial Medium）＋必須アミノ酸（GIBCO 社）＋Ｌ−グルタ
ミン（SIGMA 社）＋炭酸水素ナトリウム（SIGMA 社）＋
ペニシリン／ストレプトマイシン（SIGMA 社）＋１０％
ＦＣＳ）を用いて行った。２４穴のプレートに適当な数
の細胞を植え込み、血清濃度を５％に落として、サンプ
ルを添加した。２４時間後に、培地を除き、２００μｌ
の培養液（９０％Ｅ・ＭＥＭ＋１０％ ＬＰＤＳ）に［
¹²⁵ Ｉ］−ＬＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。３７
℃で２時間放置後、１ｍｌの緩衝液Ｂ（１５０ｍＭ 塩
化ナトリウム、５０ｍＭ トリス−塩酸(Tris)、２ｍｇ
／ｍｌ 牛血清アルブミン［Bovine Serum Albumin：Ｂ
ＳＡ，（生化学工業（株）製の Fraction V）］で３回
洗浄し、更に緩衝液Ａ（ＢＳＡを含まない緩衝液Ｂ）で
１回洗浄した。 ０．５ｍｌの０．１Ｍ食塩水を添加し
て細胞を溶解し、懸濁液をチューブに移してガンマカウ
ンターで放射性ヨードを測定した。上記の培養液に、非
標識ＬＤＬ（５００μｇ／ｍｌ）を加えた場合のカウン
トを非特異時結合として最終的に差し引いた。細胞破砕
液の一部を蛋白質の定量に用いた。ガンマカウンターに
よって測定した放射活性より、取り込まれた［ ¹²⁵Ｉ］
−ＬＤＬ量を計算し、細胞の蛋白質量で割って、ＬＤＬ
（ｎｇ）／Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｍｇ）で活性を表わした。
その結果、被検物質は、［¹²⁵ Ｉ］−ＬＤＬのヒト繊維
芽細胞ＮＨＤＦ株への結合と細胞内への取り込みを非添
加のコントロールに比べて５倍に上昇させた。

【００５５】

【発明の効果】本発明のＡ３８８４０またはその塩は高
コレステロール血症などの高脂血症、動脈硬化症などの
治療薬および／または予防薬として有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 岡崎 尚夫 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 (72)発明者 榎田 竜三 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式（Ｉ） 【化１】 を有するＡ３８８４０またはその塩。
2. 【請求項２】下記の理化学的性状を有するＡ３８８４０
   またはその塩。 （１）物質の性状： 酸性脂溶性。 （２）分子式： Ｃ₄₇Ｈ₇₆Ｏ₁₇ 高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［（Ｍ＋Ｎａ）⁺ ］法を用いて、
   推定式Ｃ₄₇Ｈ₇₆Ｏ₁₇Ｎａ（Ｎａ塩として）で測定した結
   果、 理論値： ９３５．４９８０ 測定値： ９３５．５０１５ であった。 （３）分子量： ９１２（高分解能ＦＡＢ−ＭＳ法によ
   り測定） （４）紫外線吸収スペクトル（λ_max nm (ε) ）：メタ
   ノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは、末端吸収
   のみである。 （５）赤外線吸収スペクトル：ν_max cm^-1 臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定した赤外線吸収ス
   ペクトルは、次に示す通りである。 3425、 2947、 1730、 1676、 1637、 1458、 1414、 1384、 1364、 1257、 1205、 1176、 1138、 1079、 1052、 979 。 （６） ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：（δ、ｐｐｍ） 重メタノール中、テトラメチルシランを内部基準として
   使用して測定した核磁気共鳴スペクトル（360MHz) は、
   次に示す通りである。 0.82(s)、 0.89(s)、 0.91(s)、 0.94(m)、 0.96(m)、 1.00(s)、 1.04(m)、 1.05(m)、 1.12(s)、 1.25(s)、 1.25(s)、 1.31(m)、 1.33(m)、 1.37(m)、 1.40(m)、 1.46(m)、 1.58(m)、 1.59(m)、 1.63(m)、 1.65(m)、 1.76(m)、 1.77(m)、 1.81(m)、 1.87(m)、 1.97(s)、 2.05(m)、 2.10(m)、 3.20(d)、 3.38(m)、 3.38(m)、 3.4 (m)、 3.4 (m)、 3.53(d)、 3.55(m)、 3.55(m)、 3.57(m)、 3.64(m)、 3.65(m)、 3.72(m)、 3.74(m)、 3.84(d)、 3.92(dd)、 4.10(m)、 4.14(d)、 4.45(d)、 4.78(d)、 5.12(brs)、 5.25(t) 。 （７）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：（δ、ｐｐｍ） 重メタノール中、テトラメチルシランを内部基準として
   使用して測定した核磁気共鳴スペクトル（90MHz)は、次
   に示す通りである。16.47, 17.59, 18.29, 19.44,
   20.43, 23.38, 24.87, 25.41,26.90, 27.09, 29.1
   0, 29.96, 31.40(s), 32.56, 34.42,37.52(s), 3
   8.61(s), 39.88, 40.79(s), 42.27, 43.40(s),44.7
   6(s), 46.80, 47.47, 49.0, 57.42, 64.39, 6
   7.13,69.61, 71.12, 72.24, 72.30, 74.16, 74.2
   9, 75.85, 77.00 77.01, 77.69, 78.05, 78.43, 92.27, 102.32, 1
   02.54,105.62, 123.77, 145.15(s), 176.56(s) 。 （８）高速液体クロマトグラフィー： 分離カラム： センシュウパック Ｈ−２１５１（カラム φ６× １５０ｍｍ、センシュウ科学（株）製） 移動層 ： アセトニトリル−０．２Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ ６．８）＝３４：６６ 流 速 ： １．０ ｍｌ／分 検出波長 ： ＵＶ ２１０ ｎｍ 保持時間（Ｒｆ値）： ７．９分 （９）溶解性：メタノール、エタノール、ジメチルスル
   ホキシドに可溶、酢酸エチル、水に難溶、クロロホル
   ム、ヘキサンに不溶。
3. 【請求項３】ストレプトミセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
   ｅｓ）属に属するＡ３８８４０生産菌を培養し、その培
   養物よりＡ３８８４０を採取することを特徴とするＡ３
   ８８４０の製法。
4. 【請求項４】ストレプトミセス属に属するＡ３８８４０
   生産菌がストレプトミセス・エスピー（ｓｔｒｅｐｔｏ
   ｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＡＮＫ ６０８９２株（ＦＥＲ
   ＭＢＰ−５２２５）である請求項３に記載の製法。
5. 【請求項５】Ａ３８８４０またはその塩を有効成分とす
   る医薬。
6. 【請求項６】Ａ３８８４０またはその塩を有効成分とす
   る高脂血症の治療薬および／または予防薬。
7. 【請求項７】Ａ３８８４０またはその塩を有効成分とす
   る動脈硬化症の治療薬および／または予防薬。