JPH0271152A - 固相免疫測定用成形品の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液学、細菌学、ウィルス学、病理学、薬理
学などの分野における固相免疫測定法に用いる蛋白質の
吸着性に優れた成形品の製造法に関する。

（従来の技術） 近年、医学の幅広い分野で免疫反応を利用した分析手法
が取り入れられ、血中薬物の定量、癌性蛋白質の検出、
組織適合性の決定などが行なわれ。

非常に有用な臨床データーを与えている。

また、現在著しい展開を見せているバイオテクノロジー
の各分野でも、この免疫反応を利用した分析手法が取り
入れられている１例えば、遺伝子変換によって生み出さ
れる生理活性物質の検知にこの手法は欠くべからざるも
のになっている。

免疫反応を利用した分析法としては、様々な方法がある
。すなわち、免疫拡散法、免疫クロマトグラフィー、免
疫電気泳動法、補体結合反応、赤血球凝集反応、受身赤
血球凝集反応、けい光抗体法、ラジオイムノアッセイ、
酵素免疫測定法等である。この中でも、抗原もしくは抗
体を固相上に固定して測定を行なう手法を固相免疫測定
法といい、例えば、固相ラジオイムノアッセイや、固相
酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｌｍｍ
ｕｎｏｓｏｒｂａｎｔＡｓｓａｙ以下ＥＬＩＳＡ）があ
る、この固相免疫測定法は。

多くの免疫測定法の中でも最も感度よく定量的に測定で
きる手法である。この測定法はあらかじめ固相上に抗原
もしくは抗体を固定し、ラジオアイソトープ、けい光性
物質もしくは酵素等の標識物を結合させた抗体もしくは
抗原と、抗原−抗体反応を行なわせる０反応物と未反応
物の分離は洗浄によって容易に行なうことができ、固相
表面に抗原−抗体反応によって固定された抗原もしくは
抗体は、標識物を測定することによって定量できる。

この測定法では、抗原もしくは抗体を固相に多量−に且
つ安定性良く吸着固定することが重要である。

これまでは、固相としてガラス、ポリスチレン。

ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、シリコンゴム、ナ
イロン−６、ナイロン−６６、アクリル樹脂、ＡＢＳ樹
脂などが用いられてきているが、これらの表面は疎水性
のため、その吸着性に関しては十分ではない、そこで、
これらの材質に表面処理を行い抗原もしくは抗体の吸着
性を上げる検討がなされてきた。ポリスチレンに１級ア
ミノ基を導入し吸着性を上げる方法［Ｊ、Ｉｎｍｕｎｏ
ｌＭｅｔｈｏｄ　８．２２３（１９７５）］、ナイロン
−６６を加水分解してから化学的に蛋白質を固定する方
法［Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、２９（５）、８２３（１９８
３）］などが提案されてきた。

しかし、これらはいずれも効果が少なかったり、非特異
的吸着値が高いなどの問題点があるばかりでなく、処理
工程が複雑なため大量に製造することが難しい欠点があ
る。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、従来の固相免疫測定法用成形品切持つ
欠点、すなわち蛋白質の吸着性が十分でないという点を
解決するために、単なる材質の検討や化学的表面処理の
手法検討にとどまらず、物理的、電気的な検討を進めた
結果１本発明を完成するに至ったものである。その目的
とする。ところは、蛋白質が安定に且つ多量に特異的に
吸着可能な固相免疫測定法用成形品を製造する方法を提
供本発明は、抗原又は抗体を吸着させるべき面に処理出
力が１０〜５００ｖ、処理時間が０．１〜１０秒の条件
下、好ましくは、３３０〜３７０ｖ、　７〜９秒の条件
下でコロナ放電処理、または処理出力２５０％１以下、
空気圧１ｔｏｒｒ以下、処理時間５秒以内の条件下で低
温プラズマ処理して該面の抗原又は抗体の吸着量を高め
ることを特徴とする固相免疫測定用成形品の製造法であ
り、コロナ放電或は低温プラズマ処理によってその表面
を親水性化し、蛋白質の吸着性を高めるのである。コロ
ナ放電の場合、５００ｖ以上、１０秒以上になると、親
水化されすぎて蛋白質の吸着量が下がり、また、　Ｌｏ
ｗ、０．１秒未満では親水化度が低く５吸着量が少なく
なる。他方、低温プラズマ処理の場合、処理出力２５０
ｖ、空気圧１ｔｏｒｒ、及び処理時間が５秒を超えた場
合には蛋白質の吸着性が低下する。

更に本発明を詳細に述べると１本発明で言う抗原又は抗
体を吸着させるべき面とは、固相免疫測定用成形品の一
部分で抗原又は抗体を収容する面であり、これらの成形
品はポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、
ポリプロピレン、トリメチルペンテン樹脂、ポリ塩化ビ
ニルポリメチルメタアクリレートないしはその混合物か
らなるプラスチックからなる成形品、或はガラス、金属
、プラスチック等に上記のプラスチックをコーティング
した成形品や、上記のプラスチックを複合シート化した
成形品等をも含む、そして、成形品の形状は、免疫測定
の方法によって自ず決まってくるもので、特に限定され
るものではないが、試験管、ビーズ、マイクロプレート
、キュベツト、ディスクなどがその好例である。これら
成形品で特に透明性を必要とされる場合は材質としてポ
リスチレン、ポリカーボネート、トリメチルペンテン樹
脂、もしくはポリメチルメタアクリレートが好適である
。

ところで、上述のプラスチックは疎水性のため未処理状
態では抗体又は抗原が付着せず、その為本発明では抗原
又は抗体を吸着させるべき面をコロナ放電処理或は低温
プラズマ処理を行って、親水性にするのであるが、余り
親水化度が高くなると非特異的吸着量が大となって測定
感度が低下するのである。

そこで、本発明者らはコロナ放電及び低温プラズマの条
件と吸着量との関係について測定を行った。

先づ、コロナ放電の条件と吸着量との関係について測定
する。測定方法としては、抗体としてＩｇＧ　Ｆｒａｃ
ｔｉｏｎ　Ｒａｂｂｉｔ抗ヒトアルブミン（以下、抗Ｈ
Ａ　ＩｇＧという）を固相化用緩衝液（炭酸ナトリウム
緩衝液、ｐｌ＋９．６）に溶解し、その濃度を２．５μ
ｇ／−〇とし、プレートに分注し、３７℃１時間静置し
吸着させる。１時間後、非吸着物を１回洗浄した。この
洗浄とは、Ｏ，ＯＳ％ツイーン２０（牛丼化学工業社製
界面活性剤）を含むリン酸塩緩衝液（以下、　　Ｔｗｅ
ｅｎ２０−ＰＢＳという）を各ウェルに２５０μＱ／ウ
エルの割合で入れ、プレート攪拌機で１０秒間攪拌後排
液することである０次に、抗原としてのヒトアルブミン
（ＨＡ）をＴｖｅｅｎ２０−ＰＢＳで、２．５ｎｇ／ｍ
　Ｑ、５．０ｎｇ／ｍ　ｎ　。

７．５ｎｇ／ｍｆｌ　、　ＩＯ，ｏｎｇ／鵬Ａの濃度に
希釈後、それぞれのプレートに分注し、３７℃で１時間
静置して吸着させる。１時間後非吸着物を洗滌し、次に
ペルオキシターゼを標識した抗１１ＡＩｇＧを加え、３
７℃で１時間放置した後、非吸着物を洗滌し、基質ｏ−
ｐｈａｎｙｌｅｎ　ｄｉａｍｉｎｅを加え、発色させ、
ソノ吸光度を一定した。

先ず、コロナ放電処理の処理条件として電極とプレート
との間の距離について検討した結果を第１表に示す。

第１表 吸光度　　　Ｈｕ＋ａａｎ　Ａｌｂｕｍｉｎ　　（ｎｇ
／ｍ　Ｑ　）サンプル　　　　　０　　２．５　　５．
０　　７．５　１０．００．５ｃｍ　　　　　　Ｏ，１
２００，４５０Ｇ、５９５　０．７３０　０．９００１
．０ｃｍ　　　　　　　　　Ｏ，１２５０，３３００，
４０５０，５４００，６７０２，５ｃ＋ｗ　　　　　　
　　　Ｏ，０９００，２１００，３６００，４１００，
５９５上記の結果を図示すると第１図のようになる。

次に電極とプレートとの距離を０．５０謙と一定にし、
処理時間を変化させたときの結果を第２図に示す、この
場合の測定方法は、先ず、ベルオキシターゼを標識した
抗１１Ａ　ＩｇＧを固相化用緩衝液で、１０ｎｇ／ｍ　
Ｑ　、５０ｎｇ／ｍ　Ｑ、１１００ｎ／＋　Ｑの濃度に
希釈後、それぞれのプレートに分注する。また、ベルオ
キシターゼを標識した抗ＨＡ　ＩｇＧをＴｗｅｅｎ２０
−ＰＢＳに溶解し、その濃度を１μｇ／ｖ＊　Ｑとした
溶液を別のウェルに分注し、３７℃で１時間静置して吸
着させる。１時間後、非吸着物を洗浄し、基質０−ｐｈ
ｅｒｙｌｅｎ　ｄｉａｗｈｉｎｓを加え１発色させ、そ
の吸光度を測定した。

第２図より、約８秒の処理時間で、吸着量の増加が期待
できる６図中、バックグランドとは、ベルオキシターゼ
を標識した抗ＨＡ　ＩｇＧをＴｖｅｅｎ２０−ＰＢＳに
溶解した場合の結果である。

同様な方法によって、低温プラズマ処理の場合について
測定した。

先づ、真空度０．８５ｔｏｒｒ、処理時間０秒と一定に
して、出力を変化させた場合の結果を第２表として示す
、この処理時間０秒とは出力０より所定の出力に到達後
直ちに出力を０にした場合のことを云う、その結果は第
２表である。

第２表 吸光度　　　１１ｕｍａｎ　Ａｌｂｕｍｉｎ　　（ｎｇ
／ｍ　Ｑ　）サンプル　　　　　０　　２，５　　５．
０　　７．５　１０．０ＬＯＯｗＯ，２５４０，４４０
０，６０２０，８１８１，０１２３００１１０，５５７
０，８６５０，７７００，６５４０，５２０この結果、
１００１では吸着量は増加するが３００ｖでは非特異的
吸着も大になり測定精度は上がらない。

次に、出力１００ｖ、真空度０．８５ｔｏｒｒと一定に
して処理時間を変化させた場合の結果を第３表に示す。

第３表 吸光度　　　１１ｕｓ＋ａｎ　Ａｌｂｕｍｉｎ　　（ｎ
ｇ／ｍ　１１　）サンプル　　　　　０　　２．５　　
５．０　　　？、５　１０．００秒　　　０．１２２０
．２９３０．４５８０．５６８０．７１５１０秒　　　
　０．６０３　０．４９７　　Ｇ、４０５　０．４８６
　０．６６５この場合処理時間０秒とは、前述のとおり
であり、また、１０秒とは出力ｔｏｏｖに到達後１０秒
間処理したことを指す、この結果、１０秒間では非特異
的吸着が増加する。

最後に出力ｔｏｏｗ、処理時間０秒と一定にし、真空度
を変化させた場合の結果を第４表に示す。

第４表 吸光度　　　）１Ｎｍａｎ　Ａｌｂｕｍｉｎ　　（ｎｇ
／ａ＋　Ｑ　）サンプル　　　　　０　　２．５　　５
．０　　７．５　１０．００．２ｔｏｒｒ　　　　　Ｏ
，０９６０，２０６０，３３５０，４５ｇ　　０．５８
０１．０ｔｏｒｒ　　　　　Ｏ，１０２０，２０５０，
３２５０，４Ｇ３　０．５０６２．０ｔｏｒｒ　　　　
　Ｏ，１０５０，１６２０，２３４０，３１５０，３８
０この表より明らかなように真空度２．０ｔｏｒｒにな
ると吸着量は未処理の場合と変わらず、吸着量の増加は
期待できない。

以上の結果より、低温プラズマの処理条件としては、処
理出力２５０ｗ以下、真空度１ｔｏｒｒ以下及び処理時
間５秒以内に設定する。

（実施例） 次に本発明の実施例をもって本発明を説明する。

（実施例１） ポリスチレン製９６ウエル平底マイクロプレートに低温
プラズマ処理し、これと未処理の平底マイクロプレート
とを抗原の吸着性について酵素免疫法により比較検討し
た。

低温プラズマ処理の条件を、空気圧１ｔｏｒｒ以下。

高周波出力５０〜１００％Ｉ、処理時間プラズマ発生直
後−５秒の範囲で変動させ処理物を得た。

まず、ＨＡを炭酸ナトリウム緩衝液で希釈し、５ｎｇ／
ｍ　ｎ　、２５ｎｇ／ｍ　Ｑ　＊５０ｎｇ／ｓ　Ｑに調
製する。ｌウェルあたり１００μΩずつ各溶液を入れ、
３７℃で１時間静置する６次に、０．０５％ツイーン２
０（牛丼化学工業社製界面活性剤）を含むリン酸塩緩衝
液（以下、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳという）で、１回洗
浄する。この場合洗浄とはＴｖｅｅｎ２０−ＰＢＳ　２
５０μＱ／ウエルを入れ、プレート攪拌機でｌθ秒間攪
伸した後排液することを言う０次いで、ペルオキシダー
ゼを標識した坑ＨＡウサギ抗体を１００μＱ／ウェル加
え、３７℃で１時間放置してから３回洗浄を行う、過酸
化水素水（３０％）０．４ｐｎｊａｎ、０−フェニレン
ジアミンＬｎ＋ｇ／ｍ　Ｑをクエン酸−第２リン酸ナト
リウム液に溶解し、２００μＱ／ウエルずつ加え、１５
分間の酵素反応を行う。

６Ｎの硫酸を５０μＱ／ウェル加え１反応を停止する。

ダブルビームマイクロプレート光度計（三光純薬社ＥＲ
−８０００）で主波長４９０ｎｍ、補正波長６３０ｎｍ
で吸光度を測定する０表に示したとおり処理プレートの
吸光度が高く、抗原の吸着量が増加することがわかる。

吸光度測定結果 ＨＡ濃度ｎｇ／ｍＱ　　Ｏ５２５５０ 処理品　　　　　　０．０１２　０．２６９　０．９３
１　１．３２１未処理比較品　　　０．００４　０．０
４４　０．１１９　０．２４０（実施例２） ポリスチレン製９６ウエル平底マイクロプレートにコロ
ナ放電処理し、これと未処理の平底マイクロプレートと
を抗原の吸着性について酵素免疫法により比較検討した
。

コロナ放電処理の条件を、出力３５０ｗ、処理時間を４
．７秒とした。

まず、ＨＡを炭酸ナトリウム緩衝液で希釈し、５ｎｇ／
ｍ　Ｑ　、２５ｎｇ／ｍ　ｎ　、５０ｎｇ／ｌａ　Ｑに
調製する。１ウェルあたり１００μΩずつ各溶液を入れ
、３７℃で１時間静置する０次に、Ｏ，ＯＳ％ツイーン
２０（牛丼化学工業社製界面活性剤）を含むリン酸塩緩
衝液（以下。

Ｔｖｅｅｎ２０−ＰＢＳという）で、１回洗浄する。こ
の場合も洗浄とはＰＢＳ−ツイーン２０２５０μＱ／ウ
エルを入れ、プレート攪拌機で１０秒間攪攪伴た後排液
することを言う０次いで、ペルオキシダーゼをＳ識した
坑１１Ａウサギ抗体を１００μｎ／ウェル加え、３７℃
で１時間放置してから３回洗浄を行う、過酸化水素水（
３０％）０．４μＱ／脂Ω、０−フェニレンジアミン１
ｍｇ／ｍ〔をクエン酸−第２リン酸ナトリウム液に溶解
し、２００μｆｉ／ウエルずつ加え、１５分間の酵素反
応を行う、　６Ｎの硫酸を５０μＱ／ウェル加え、反応
を停止する。ダブルビームマイクロプレート光度計（三
光純薬社［ＥＲ−８０００）で主波長４９０ｎｍ、補正
波長６３００票で吸光度を測定する０表に示したとおり
処理プレートの吸光度が高く、抗原の吸着量が増加する
ことがわかる。

吸光度測定結果 ＯＡａ度ｎｇ／ｍＱ　　０　　　５　　２５　　５０処
理品　　　　　　０．０２５　０．２２２　０．７９１
　１．１９１未処理比較品　　　０．００４　０．０４
４　０．１１９　０．２４０（発明の効果） 本発明の固相免疫測定用成形品は、抗原もしくは抗体の
吸着性に優れ、良好な免疫学的分析結果を与えるもので
医療、バイオテクノロジーの研究等の分野で極めて有用
なものであり、その製造法においても成形品の形状を問
わず、薬品等を使用した複雑な作業も必要としないなど
の長所がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はコロナ放電処理における電極と処理面との距離
と吸着量との関係図、第２図は同処理における処理時間
と吸着量との関係図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　抗原又は抗体を吸着させるべき面に処理出力が１０
   〜５００ｗ、処理時間が０．１〜１０秒の条件下、好ま
   しくは３３０〜３７０ｗ、７〜９秒の条件下でコロナ放
   電処理して、該面の抗原又は抗体の吸着能を高めること
   を特徴とする固相免疫測定用成形品の製造法。 ２　抗原又は抗体を吸着させるべき面に処理出力２５０
   ｗ以下、空気圧１ｔｏｒｒ以下、処理時間５秒以内の条
   件下で低温プラズマ処理をして、該面の抗原又は抗体の
   吸着能を高めることを特徴とする固相免疫測定用成形品
   の製造法。