JPH0439623B2

JPH0439623B2 -

Info

Publication number: JPH0439623B2
Application number: JP1142684A
Authority: JP
Priority date: 1984-01-24
Filing date: 1984-01-24
Publication date: 1992-06-30
Also published as: JPS60155129A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗原または抗体をフイブロインに固定
化する新規な製造方法に関する。抗原と抗体とが結合し、複合体を形成する特異
的な反応は一般に抗原抗体反応と呼ばれている。近年、微量の生物試料の分析にこの特異的な反
応を利用したラジオイムノアツセイ（RIA）、エ
ンザイムイムノアツセイ（EIA）等のいわゆる免
疫測定法が広く行われるようになつてきている。
これらの方法においては操作上、抗体と抗原が結
合した複合体と未結合の抗原または抗体とを分離
する必要があり、この分離を容易に行うために抗
原または抗体を適当な担体に固定化することが
種々試みられている。上記の固定化方法は、一般に化学結合法、吸着
法、包括法の三つに大別することができ、そのな
かで吸着法によるものが実用化されているとはい
え、各方法とも後述する種々の欠点を各々有して
いる。即ち、化学結合法は例えばグルタルアルデヒド
法、臭化シアン法、カルボジイミド法等により不
溶性の担体の官能基と抗原または抗体の官能基と
を共有結合させるものであるが、一般にこの化学
結合法は反応時に抗原または抗体の変性が起こり
易く、固定化された抗原または抗体の複合体形成
能が低下してしまうことが多い。また結合反応が数段階を要するものや高価な試
薬を用いなければならないことが多く、更にその
未反応の試薬類の除去にも多大の注意を払わなけ
ればならない等の欠点がある。吸着法は不溶性担体に抗原または抗体を物理的
あるいはイオン的な吸着力によつて結合させるも
のであるが、化学結合法と異なり、その結果力は
比較的弱いために抗原または抗体が遊離し易く、
PH、共存イオンの種類あるいは強度等の至適範囲
が狭いので、その使用に際しては著しく制約を受
ける。また、抗原または抗体は変性し易いために、吸
着法による固定化では長期の保存安定性を期待す
ることは難しい。包括法としてポリアクリルアミドゲルあるいは
アセチルセルロース中への抗原または抗体の包括
固定化が報告されている〔例えばクリニカル・ケ
ミストリイ（Clinical Chemistry）第19巻、1341
頁（1973年）文献参照〕。しかしながらポリアク
リルアミドゲルを用いる固定化では重合反応時の
抗原または抗体の失活およびモノマーの毒性が問
題となり、また該固定化物はゲル状物であるため
機械的強度が十分でなく、非特異的吸着物を除去
するための充分な洗浄を施すことができない。またアセチルセルロース等の水不溶性で非水溶
媒を用いる必要のあるポリマーでは、一般に水溶
性である抗原または抗体の分散性が悪く、そのた
め均一な固定化抗原または抗体が得られにくい。次に、抗原または抗体を担体中に従来通りの方
法で包括させると、抗原または抗体分子量が大き
いため、担体の内部に固定化された抗原または抗
体は反応に関与し難い。反対に担体内部の抗原ま
たは抗体が反内できるようにポーラスな材質で包
括した場合には、その使用に際しては複合体を形
成しなかつた抗原または抗体を洗浄除去すること
が困難で、測定の感度が著しく低下してしまう欠
点がある。本発明者等はこれら従来技術の欠点を解決すべ
く鋭意検討を重ねた結果、後述する如く抗原また
は抗体の機能を損うことなく強固に固定化され且
つまた保存安定性に優れた固定化抗原または抗体
を製造する方法を見い出し本発明を完成した。斯かる本発明の製造方法は、予め抗原または抗
体を塗布した基板に、フイブロイン水溶液を塗布
し、乾燥もしくは塩析により皮膜化させ、次いで
該皮膜を基板より引き剥がすことを特徴とする固
定化抗原または抗体の製造方法である。該フイブロイン水溶液は通常生糸、絹紡糸、生
糸屑、キキ、ビス、くずまゆ、ブーレツト等の絹
及び絹原料を、常法によりセリシンを精練除去し
た後、例えば銅−アンモニア水溶液、水酸化銅−
エチレンジアミン水溶液、ロダン酸塩水溶液、臭
化リチウム水溶液、塩化カルシウム水溶液、硝酸
カルシウム水溶液、あるいは硝酸マグネシウム水
溶液等に溶解し、水に対して透析脱塩することに
より調製される。フイブロイン水溶液のフイブロイン濃度は乾燥
によつて皮膜化させる場合には、通常２〜25重量
％、好ましくは３〜20重量％、特に好ましくは５
〜15重量％であり、また塩析によつて皮膜化させ
る場合には、通常15〜30重量％である。固定化抗原または抗体は、通常水溶液中で使用
されることが多く担体の耐水性が要求される。従つて本発明のフイブロインフイルムにおける
フイブロインの結晶化度は少なくとも約20％、特
に約30％以上が好ましく、無定型ないしは結晶化
度が約20％に満たない場合には、フイブロインフ
イルムは水に可溶性になつたり水膨潤性が非常に
大きくなる等好ましくない。斯かる結晶化度を有するフイブロインフイルム
は、塩析によつて皮膜化させる場合には、例えば
常法に従つて飽和硫安水溶液で塩析することによ
つて得られる。一方、乾燥によつて皮膜化させる場合には、結
晶化が充分進むようにフイブロイン水溶液に予め
結晶化促進剤として、エチルアルコール、エチレ
ングリコール、グリセリン等のアルコール類、あ
るいは硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
アンモニウム等の凝固性塩を添加しておくことが
好ましい。各々の添加量はアルコール類ではフイブロイン
に対して通常２〜50重量％、好ましくは15〜35重
量％、凝固性塩ではフイブロインに対して通常２
〜20重量％、好ましくは５〜10重量％である。乾燥は、抗原または抗体が熱変性や失活を引き
起こさない温度、通常45℃以下、好ましくは30℃
以下で10〜20時間行う。斯かる方法により、いずれの場合においてもフ
イブロインの結晶化度は約20％以上となるが、通
常概ね50％を超えることはない。なお本発明で規定するフイブロインの結晶化度
は以下の方法により得られた数値である。本発明のフイブロインフイルム（被検フイル
ム）と、対照として４℃で相対湿度が55％の条件
下でフイブロインのみの水溶液から皮膜化したほ
ぼ無定形のフイブロインフイルム（対照フイル
ム）に、それぞれCu−Kα線を照射し赤道方向の
回折強度を記録して得られるＸ線広角回折チヤー
ト（第１図）において、2θ＝15°と30°の強度を直
線で結び、この直線と被検フイルムの回折強度曲
線ａとで囲まれた部分の面積をＡ、また上記直線
と対照フイルムの回折強度曲線ｂとで囲まれた部
分の面積をＢとすると、結晶化度（％）は次式で
表わされる。結晶化度（％）＝Ａ−Ｂ／Ａ×100 本発明に用い得る抗原または抗体は特に限定さ
れるものではなく、抗体としてはIgG、IgM、
IgAあるいはIgEのいずれのクラスでも良い。またマウス、ラツト、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、
あるいは人等いずれの動物から採取した抗体でも
使用可能であるが、特に細胞融合法によつて採取
したモノクローナル抗体の使用が感度、精度の点
で好ましい。なお、通常使用する抗体はいずれも常法により
例えば硫安塩析またはDEAEイオン交換カラムク
ロマトグラフイー等で精製したものを用いる。抗原としてはフイブロインに固定化され得る程
度の分子量を有するものならばいずれも使用可能
で、低分子量のハプテンも他の高分子に結合させ
たものならば用いることができる。具体例としてはヒト絨毛性ゴナドトロピン
（hCG）、ヒト胎盤性ラクトゲン等のホルモンまた
はその抗体、α−フエトプロテイン（AFP）、ハ
プトグロビン、HBs抗原等の血清蛋白またはそ
の抗体、大腸菌毒素、コレラトキシン等のトキシ
ンまたはその抗体、風疹ウイルス、インフルエン
ザウイルス等のウイルスまたはその抗体、あるい
はエストラジオール、プロゲステロン、テストス
テロン、フエニトイン、プロカインアミド、カナ
マイシン、ペニシリン、バルビツール酸等のハプ
テンまたはその抗体等が挙げられる。抗原または抗体は例えば水、生理食塩液あるい
は緩衝液等に溶解した状態で基板上に塗布される
が、その濃度は通常50μｇ／ml〜50mg／ml、好ま
しくは100μｇ／ml〜10mg／mlである。塗布される抗原または抗体量は基板の単位面積
当たり、通常0.2〜20μｇ／cm²、好ましくは0.5〜
15μｇ／cm²、特に好ましくは１〜10μｇ／cm²であ
る。塗布は、例えば流延あるいは噴霧によつて行う
ことが好ましい。塗布する基板は特に限定されないが、例えば四
方を仕切つたテフロン板、アクリル板あるいはガ
ラス板等が挙げられる。またこれら基板の表面をサンドペーパー等で粗
面加工することにより実質的にフイブロインフイ
ルムの有効面積を増加させることもできる。抗原または抗体を基板に塗布した後、必要によ
り乾燥するが、乾燥はフイブロイン水溶液をその
上から塗布できる程度であれば良く、従つて完全
な乾燥状態、あるいは未だ湿潤している状態であ
つても良い。フイブロイン水溶液の塗布は、例えば流延によ
つて行うことが好ましい。乾燥温度は抗原または抗体が熱変性、失活を引
き起こさない温度、通常45℃以下、好ましくは30
℃以下で行う。本発明方法によつて得られる抗原または抗体固
定化フイブロインフイルムを用いてRIA、EIA等
を行う場合には、該フイブロインフイルムをその
まま、あるいは必要に応じて適当な基材や容器へ
の接着等によつて固定したものを使用することが
できる。斯かる本発明方法によれば、極めて容易に所望
の抗原または抗体をフイブロインフイルム（表
面）上にはなはだ効率良くその機能を損うことな
く且つまた強固に固定化することができる（各実
施例参照）。従つて本発明方法によつて得られる固定化抗原
または抗体は吸着法の場合とは異なりPHやイオン
強度等の変化によつて、抗原または抗体が担体か
ら遊離することはほとんどなく（試験例２参照）
非特異的吸着物を除去するための洗浄も充分に行
うことができ、更にフイブロイン自身が非特異的
吸着の生じ難い素材であることも相俟つて、測定
精度を高くすることができる（試験例４，６，11
参照）。更に保存安定性に関しても吸着法による固定化
抗原または抗体に比して極めて優れた特性を有し
ている（試験例７参照）。次に本発明を以下の実施例および試験例により
更に詳細に説明する。実施例１モノクローナル抗ヒトAFP抗体固定化フイブ
ロインフイルムの製造： (1) フイブロイン水溶液の調製：生糸100ｇを1.0重量％のマルセル石けん水溶
液５中に浸漬し、80℃で３時間精練した。水
洗後、更に0.5重量％のマルセル石けん水溶液
５に浸漬して80℃で３時間精練し、セリシン
等を実質的に除去したフイブロイン原料72ｇを
得た。水100ｇとエチルアルコール80ｇの入つたニ
ーダー中に塩化カルシウム150ｇを溶解し、75
℃に昇温後、前記のフイブロイン原料70ｇを投
入、撹拌下に１時間溶解した。次いで180ｇの
温水（75℃）を加えて希釈混合した。フイブロ
インの溶解液を冷却した後、ホローフアイバー
型の透析器を用いて、流水に対して透析脱塩
し、5.7重量％のフイブロイン水溶液1200mlを
得た。塩化カルシウムの残留量は0.08重量％で
あつた。 (2) モノクローナル抗ヒトAFP抗体固定化フイ
ブロインフイルムの製造：モノクローナル抗ヒトAFP抗体（免疫動物
マウス）を生理食塩液に溶解し、250μｇ／ml
の抗体溶液を調製した。次にこの溶液を四方を
仕切つたテフロン板上に抗体量が5μｇ／cm²と
なるように流延し、15℃で３時間乾燥した。前
記フイブロイン水溶液にグリセリンをフイブロ
インに対して30重量％になるように加えた溶液
をその上から流延し、20℃で10時間乾燥するこ
とによつて皮膜化させ、厚さ60μｍの表記モノ
クローナル抗ヒトAFP抗体固定化フイブロイ
ンフイルムを得た。前記の方法（但し、理学電
機(株)ガイガー・フレツクス2027型を使用し、
Cu−Kα線、40KV、20ｍＡで測定。）によつて
算出したフイブロインの結晶化度は35％であつ
た。表記フイブロインフイルムを用いて以下の各試
験を行つた。試験例１見掛単位面積当たりの抗体固定化量表記フイブロインフイルムを１×0.5cmの大き
さに裁断し、生理食塩液で洗浄後、抗マウスIgG
抗体（免疫動物ウサギ）の西洋ワサビのペルオキ
シダーゼ標識物溶液（50μｇ／ml）〔酵素標識は、
ジヤーナル・オブ・ヒストケミストリー・エン
ド・サイトケミストリー（Journal of
Histochemistry and Cytochemistry）第22巻、
1084頁（1974年）に記載の方法に準じて過ヨウ素
酸酸化法により行つた。〕４ml中に浸漬し、４℃
で24時間反応させた。次いで遊離の抗マウスIgG
抗体−ペルオキシダーゼ標識物を除去するために
生理食塩液で該フイルムを充分洗浄し、これに
16.7ｍMo−フエニレンジアミン、2.45ｍＭ過酸
化水素を含むクエン酸−リン酸２ナトリウム緩衝
液（PH5.5）４mlを加えて室温で５分間反応させ
た後、3.4N硫酸２mlを加えて反応を停止させた。
この反応液について492nｍにおける吸光度（以
下Abs492と略す。）を測定し、予め作成した検量
線から該フイルムの表面に固定化された表記抗体
固定化量を求めたところ0.29μｇ／cm²であつた。試験例２固定化の強度３種のリン酸緩衝液（PH5.3、6.8、8.1）各５ml
中に１×0.5cmの大きさの該フイブロインフイル
ムをそれぞれ浸漬し、25℃で24時間振とうした。
次に前記試験例１と同様にして見掛単位面積当た
りの抗体の固定化量を測定したところいずれの場
合にも前記試験例１の値に比し固定化量の減少は
認められなかつた。従つて抗体は該フイブロイン
フイルムに強固に固定化されていることが確認さ
れた。実施例２モノクローナル抗ヒトAFP抗体固定化フイブ
ロインフイルムの製造：実施例１と同じモノクローナル抗ヒトAFP抗
体を生理食塩液に溶解し、375μｇ／mlの抗体溶
液を調製した。次にこの溶液を四方を仕切つたア
クリル板（180番のサンドペーパーで粗面加工し
たもの）上に抗体量が10μｇ／cm²となるように流
延し、22℃で６時間乾燥した。次いで実施例１(1)
と同様にして得たフイブロイン水溶液を濃縮して
13.5重量％のフイブロイン水溶液とし、更にグリ
セリンをフイブロインに対して30重量％になるよ
うに加えた溶液をその上から流延し、室温で一夜
乾燥することによつて皮膜化させ、厚さ110μｍ
の表記モノクローナル抗ヒトAFP抗体固定化フ
イブロインフイルムを得た。実施例１(2)と同様にして測定したフイブロイン
フイルムの結晶化度は37％であつた。表記フイブロインフイルムを用いて以下の各試
験を行つた。試験例３見掛単位面積当たりの抗体固定化量試験例１と同様にして測定した結果、該フイル
ム表面に固定化された表記抗体固定化量は0.32μ
ｇ／cm²であつた。試験例４定量感度の測定表記フイブロインフイルムを７×12mmの大きさ
に裁断し、厚さ200μｍのポリエステルシート
（巾２mm、長さ10cm）の先端部と該フイルムの上
端をシアノアクリレート系接着剤で接着した。次に内径10mmの試験管に0.5重量％牛血清アル
ブミンを含む生理食塩液を0.5mlずつ分注し、上
記フイルムを各々が完全に浸漬するように入れ、
室温で１時間放置した。次いで該0.5重量％牛血
清アルブミンを含む生理食塩液を吸引除去した
後、各々に各既知濃度の標準AFP、10％人血清
およびモノクローナル抗ヒトAFP抗体（免疫動
物マウス、但し、固定化したモノクローナル抗体
とは認識部位の異なるもの。）のペルオキターゼ
標識物（1.2μｇ／ml）の入つた0.1重量％牛血清
アルブミンを含む生理食塩液を0.5mlずつ入れ、
22℃で２時間静置した。次いでイオン交換水で、
それぞれ３回洗浄した後、別に準備した内径15mm
の試験管中に入れ、各試験管にそれぞれ19.1ｍＭ
−フエニレンジアミン、2.45ｍＭ過酸化水素を含
むクエン酸−リン酸２ナトリウム緩衝溶液（PH
5.5）１mlずつを加え入れ、室温で暗所に１時間
静置した。1N硫酸１mlによつて酵素反応を停止
させ、この反応液についてAbs492を測定し標準
曲線を得た。結果を第２図に示したが固相への非特異的吸着
は少なく、AFP1nｇ／mlの測定が可能であるこ
とが解る。また該フイルム自体が着色し、肉眼でその着色
度を比較したところ２〜4nｇ／mlの判定も可能
であつた。実施例３モノクローナル抗hCG抗体固定化フイブロイン
フイルムの製造：モノクローナル抗hCG抗体（免疫動物マウス）
を生理食塩液に溶解し、250μｇ／mlの抗体溶液
を調製した。次にこの溶液を、四方を仕切つたア
クリル板上に抗体量が7.5μｇ／cm²となるように流
延し、10℃で５時間乾燥した。次いで実施例１(1)
と同様にして得たフイブロイン水溶液を濃縮して
12.7重量％のフイブロイン水溶液とし、更にグリ
セリンをフイブロインに対して25重量％になるよ
うに加えた溶液をその上から流延し、15℃で10時
間乾燥することによつて皮膜化させ、厚さ100μ
ｍの表記モノクローナル抗hCG抗体固定化フイブ
ロインフイルムを得た。実施例１(2)と同様にして
測定した表記フイブロインフイルムの結晶化度は
39％であつた。表記フイブロインフイルムを用いて以下の各試
験を行つた。試験例５見掛単位面積当たりの抗体固定化量試験例１と同様にして測定した結果、該フイル
ム表面に固定化された表記抗体固定化量は0.31μ
ｇ／cm²であつた。試験例６定量感度の測定表記フイブロインフイルムを１×0.5cmの大き
さに裁断し、標準hCGを０〜1000ｍIU／mlの範
囲の種々の濃度で含有する0.1重量％牛血清アル
ブミンを含む生理食塩液0.5ml中に各々浸漬し、
25℃で１時間反応した。続いて未結合のhCGを生
理食塩液で充分に洗浄除去後、抗hCG抗体のペル
オキシダーゼ標識物（20μｇ／ml）を含有する0.1
重量％牛血清アルブミンの生理食塩液0.5ml中に
浸漬し、25℃で１時間反応した。次いで、未結合
の該標識物を生理食塩液で洗浄除去し、各々のフ
イルムを試験例１と同様に酵素反応を行つて、こ
の反応液についてAbs492を測定し標準曲線を得
た。結果を第３図に示したが固相への非特異的吸着
は少なく、hCG2ｍIU／mlの測定が可能であるこ
とが解る。次に生理食塩液の代りに健康な男子人尿を用い
て上記hCGを溶解し、同様にして測定した結果、
吸光度がやや低下したものの第３図と同様の結果
が得られた。試験例７保存安定性試験表記フイブロインフイルムと、対照として吸着
法により製造された固定化抗体のポリ塩化ビニル
フイルム（比較例１参照）との保存安定性を比較
した。各々のフイルムを４℃で45℃（相対湿度が共に
65％）の各雰囲気中に放置し、試験例１と同様に
して見掛単位面積当たりの抗体固定化量および試
験例２と同様にして標準hCGの100ｍIU／mlの
Abs492をそれぞれ経時的に測定した。

【表】その結果を第１表に示した。第１表から明らか
な如く表記フイブロインフイルムは45℃で６ケ月
経過後も初期の抗体活性を保持していた。一方、対照のポリ塩化ビニルフイルムは45℃で
３ケ月で活性が半減し、４℃でさえ６ケ月で初期
活性の約2/3に低下した。下つて本発明方法で製
造される表記フイブロインフイルムは対照のポリ
塩化ビニルフイルムに比して遥かに優れた保存安
定性を有していることが解る。比較例１ポリ塩化ビニルフイルム（厚さ120μ）を１×
0.5cmに裁断し、実施例３と同じモノクローナル
抗hCG抗体の生理食塩液（10μｇ／ml）２ml中に
浸漬し、４℃で24時間放置して抗体を吸着させた
後、未吸着の抗体を生理食塩液で洗浄除去して、
吸着法により製造された固定化抗体であるポリ塩
化ビニルフイルムを得た。実施例４抗ヒトIgG抗体固定化フイブロインフイルムの
製造：抗ヒトIgG抗体（免疫動物ヤギ）を生理食塩液
に溶解し、１mg／mlの抗体溶液を調製した。次に
この溶液を、四方を仕切つたガラス板上に抗体量
が5μｇ／cm²となるように塗布し、20℃で１時間
乾燥した。次いで実施例２と同様にして調製した
フイブロイン溶液をその上から流延し、25℃で10
時間乾燥することによつて皮膜化させ、厚さ
110μｍの表記抗ヒトIgG抗体固定化フイブロイン
フイルムを得た。実施例１(2)と同様にして測定し
た表記フイブロインフイルムの結晶化度は37％で
あつた。表記フイブロインフイルムを用いて以下の試験
を行つた。試験例８見掛単位面積当たりの抗体固定化量抗ヤギIgG抗体（免疫動物ウサギ）の西洋ワサ
ビのペルオキシダーゼ標識物溶液（50μｇ／ml）
を用いる他は試験例１と同様にして測定した結
果、該フイルム表面に固定化された表記抗体固定
化量は0.23μｇ／cm²であつた。実施例５抗ヒトアルブミン抗体固定化フイブロインフイ
ルムの製造：抗ヒトアルブミン抗体（免疫動物ヤギ）を生理
食塩液に溶解し、１mg／mlの抗体溶液を調製し
た。次にこの溶液を、四方を仕切つたガラス板上
に抗体量が5μｇ／cm²となるように塗布し、20℃
で１時間乾燥した。次いで実施例２と同様にして
調製したフイブロイン溶液をその上から流延し、
25℃で10時間乾燥することによつて皮膜化させ、
厚さ120μｍの表記抗ヒトアルブミン抗体固定化
フイブロインフイルムを得た。実施例１(2)と同様
にして測定した表記フイブロインフイルムの結晶
化度は41％であつた。表記フイブロインフイルムを用いて以下の試験
を行つた。試験例９見掛単位面積当たりの抗体固定化量試験例８と同様にして測定した結果、該フイル
ム表面に固定化された表記抗体固定化量は0.21μ
ｇ／cm²であつた。実施例６ hCG固定化フイブロインフイルムの製造： hCGを、四方を仕切つたガラス板上に10IU／
cm²となるように流延し、15℃で10時間乾燥した。
次いで実施例１(1)と同様にして得たフイブロイン
溶液を濃縮して10.2重量％のフイブロイン水溶液
とし更にグリセリンをフイブロインに対して25重
量％になるように加えた溶液をその上から流延
し、15℃で15時間乾燥することによつて皮膜化さ
せ、厚さ120μｍの表記hCG固定化フイブロイン
フイルムを得た。実施例１(2)と同様にして測定し
た表記フイブロインフイルムの結晶化度は35％で
あつた。表記フイブロインフイルムを用いて以下の各試
験を行つた。試験例 10 見掛け単位面積当たりの抗原固定化量表記フイブロインフイルムを１×0.5cmの大き
さに裁断し、生理食塩液で洗滌後、抗hCG抗体
（免疫動物マウス）のペルオキシダーゼ標識物
（10μｇ／ml）を含む0.1重量％牛血清アルブミン
生理食塩液0.5ml中に浸漬し４℃で24時間反応さ
せた。以下試験例１と同様にして測定を行つた結
果、表記抗原固定化量は約0.1IU／cm²であつた。試験例 11 定量感度の測定表記フイブロインフイルムを１×0.5cmの大き
さに裁断し、モノクローナル抗hCG抗体（免疫動
物マウス）を０〜10μｇ／mlの範囲の種々の濃度
で含有すると共にまた、同じ抗体にビオチンを結
合したビオチニル化モノクローナル抗hCG抗体を
0.5μｇ／ml含む0.1重量％の牛血清アルブミン生
理食塩液0.5ml中に、各々浸漬し、25℃で１時間
反応した。次に未結合の抗hCG抗体及びビオチニ
ル化抗hCG抗体を生理食塩液で洗浄除去した後、
アビジンペルオキシダーゼ（5μｇ／ml）を含む
0.1重量％牛血清アルブミン生理食塩液0.5ml中に
浸漬して25℃で１時間反応し生理食塩液で洗浄
後、各々のフイルムを試験例１と同様に酵素反応
を行つてこの反応液についてAbs492を測定し標
準曲線を得た。結果を第４図に示したが固相への非特異的吸着
は少なく、モノクローナル抗hCG抗体0.02〜10μ
ｇ／mlの範囲の測定が可能であることが解る。実施例７ヒト黄体形成ホルモン固定化フイブロインフイ
ルムの製造：ヒト黄体形成ホルモンを、四方を仕切つたアク
リル板上に5μｇ／cm²となるように流延し、10℃
で10時間乾燥した。次いで実施例１(1)と同様にし
て得たフイブロイン水溶液を濃縮して13重量％の
フイブロイン水溶液とし、更にグリセリンをフイ
ブロインに対して30重量％になるように加えた溶
液をその上から流延し、15℃で10時間乾燥するこ
とによつて皮膜化させ、厚さ110μｍの表記ヒト
黄体形成ホルモン固定化フイブロインフイルムを
得た。実施例１(2)と同様にして測定した表記フイ
ブロインフイルムの結晶化度は37％であつた。表記フイブロインフイルムを用いて以下の試験
を行つた。試験例 12 見掛単位面積当たりの抗原固定化量抗ヒト黄体形成ホルモン抗体（免疫動物マウ
ス）のペルオキシダーゼ標識物を用いて試験例１
と同様にして測定した結果、該フイルム表面に固
定化された表記抗原固定化量は0.26μｇ／cm²であ
つた。実施例８ヒトAFP固定化フイブロインフイルムの製
造：ヒトAFPを、四方を仕切つたアクリル板上に
5μｇ／cm²となるように流延し、10℃で10時間乾
燥した。次いで実施例１(1)と同様にして得たフイ
ブロイン水溶液を濃縮して13重量％のフイブロイ
ン水溶液とし、更にグリセリンをフイブロインに
対して30重量％になるように加えた溶液をその上
から流延し、15℃で10時間乾燥することによつて
皮膜化させ、厚さ120μｍの表記ヒトAFP固定化
フイブロインフイルムを得た。実施例１(2)と同様
にして測定した表記フイブロインフイルムの結晶
化度は42％であつた。表記フイブロインフイルムを用いて以下の試験
を行つた。試験例 13 見掛単位面積当たりの抗原固定化量抗ヒトAFP抗体（免疫動物マウス）のペルオ
キシダーゼ標識物を用いて試験例１と同様にして
測定した結果、該フイルム表面に固定化された表
記抗原固定化量は0.21μｇ／cm²であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、フイブロインの結晶化度測定のため
のＸ線広角回折チヤートの一例を示すものであ
り、ａはフイブロインフイルムの、またｂは対照
の無定形フイブロインフイルムの回折強度曲線で
ある。第２図はAFPの標準曲線（試験例４）を、
第３図はhCGの標準曲線（試験例６）を、第４図
は抗hCG抗体の標準曲線（試験例11）をそれぞれ
表わす。

Claims

【特許請求の範囲】

１予め抗原または抗体を塗布した基板に、フイ
ブロイン水溶液を塗布して皮膜化させ、次いで該
皮膜を基板より引き剥がすことを特徴とする固定
化抗原または抗体の製造方法。