JPH08334509A - 生物学的活性物質の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 タンパク質、核酸などの活性物質を、簡便、
効率的にかつ強固に担体に結合させる。 【構成】 担体に固定化された生物学的に活性な第１の
物質と、この第１の物質に特異的に結合し得る第２の物
質とを反応させ、前記第１の物質と第２の物質との結合
を介して担体に間接的に結合した第２の物質又は結合し
ない第２の物質を検出することにより、試料中の第１の
物質又は第２の物質を分析する方法において、前記担体
にカルボジイミド基を２〜１００個有する化合物を担持
させ、前記第１の物質はカルボジイミド基を介して担体
に固定化させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸、抗体、抗原など
生物学的に活性な物質を検出するための材料及びそのた
めの方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査、食品検査、法医学検査などの
分野において、検体中に存在する核酸、抗体、抗原など
生物学的に活性な物質を検出、同定する方法として、目
的物質に応じて核酸プローブ法、酵素免疫測定法などが
用いられている。

【０００３】核酸を検出する分野としては、病原微生物
などの菌種同定、法医学におけるＤＮＡ鑑定などがあ
る。核酸の検出においては、通常、標的となる核酸と相
補的な配列を有する核酸を用い、このものを酵素などで
直接、またはハプテンなどを介して間接的に標識する。
この標識核酸と標的となる核酸をハイブリダイズさせ
る。ハイブリダイズしなかった標識核酸を除くかまたは
標識部分を不活性化したのちに、標識部分を検出する事
により標的核酸の存在及び量を確認できる。

【０００４】また、抗原、抗体などを検出する分野とし
ては、核酸と同様に病原微生物などの菌種同定の他、種
々の臨床検査などがある。抗原、抗体の検出に用いられ
る酵素免疫測定法の１態様である競合的酵素免疫測定法
は、次のようにして行われる。ポリスチレンビーズ、マ
イクロタイタープレート、チューブなどの固相表面に抗
体または抗原を固定化し、固相表面に一定量の検体溶液
を添加した後、抗原酵素複合体または抗体酵素複合体を
加える。固相表面に抗体を固定化した場合には、検体中
の抗原と抗原酵素複合体とが固相表面に固定化された抗
体との結合反応において競合し、固相表面に抗原を固定
化した場合には、検体中の抗原と固相表面に固定化され
た抗原とが抗体酵素複合体と結合反応で競合させる。

【０００５】一定時間経過後に、抗体を固定化した場合
には、固定化抗体に結合していない抗原および抗原酵素
複合体を洗浄し除去する。また、抗原を固定化した場合
には、未反応の検体中の抗原、抗体酵素複合体および検
体中の抗原と抗体−酵素複合体との結合物を洗浄し除去
する。このときの洗浄は、洗浄液を固相部に満たしたの
ち、洗浄液を捨て、再び固相部に洗浄液を満たして捨て
るという洗浄操作を通常数回から十回程度繰り返す。こ
の操作を一般にＢ／Ｆ分離と呼び、酵素免疫測定法を原
理とする検査では必須の操作である。

【０００６】最後に、抗原又は抗体の標識に用いた酵素
に対する発色基質液を固相部に加えて、残存する酵素に
より発色させる。このとき用いる酵素はペルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ
などが一般的である。発色に用いる基質はそれぞれの酵
素に適したものを用いる。検体液中に標的となる抗原が
多く存在すれば残存する抗原酵素複合体あるいは抗体酵
素複合体の量が減り、結果として発色強度が弱くなる。
発色強度は一般的に比色計を用いて測定する。

【０００７】また、酵素免疫測定法の他の態様であるサ
ンドイッチ酵素免疫測定法では、抗体を固相表面に固定
化し、固相表面に検体液を加える。一定時間経過後、固
相表面の抗体に結合していない抗原を洗浄し除去する。
次いで抗体酵素複合体を一定量加える。一定時間経過
後、固相表面の抗原に結合していない抗体酵素複合体を
洗浄除去したのち、固相表面に発色基質を加えて発色さ
せる。この発色強度を測定することにより、検体液中の
抗原濃度を定量することが可能になる。

【０００８】上述のように従来の核酸の検出法、競合的
酵素免疫法、サンドイッチ酵素免疫法などにおいては、
チューブ、マイクロタイタープレート、メンブランフィ
ルター、ビーズなどの固相表面に抗体、抗原、酵素、核
酸などを固定化することが非常に重要である。そのた
め、生物学的活性物質を固定化する種々の方法が公表さ
れている。たとえば、タンパク質では、 ジアゾ法、ペプチド法、アルキル化法、架橋試薬によ
る基材結合法やＵｇｉ反応による基材結合法などのよう
な、タンパク質を架橋剤や縮合剤等を用いて基剤に化学
結合させる方法（「固定化酵素」［千畑一郎 編、講談
社サイエンティフィク（１９８６）］第９−４１ページ
参照）、 イオン結合により基剤に固定する方法（「固定化酵
素」第４１−４３ページ参照）、 物理吸着により基剤に固定する方法（「固定化酵素」
第４３−４５ページ参照）、 などが知られている。

【０００９】また核酸では、 ５’末端にチオール基を有する核酸とチオール基を含
むビーズ状基材間のジスルフィド結合による固定 （P.
J.R.Day, P.S.Flora, J.E.Fox, M.R.Walker, Biochm.
J., 278, 735-740 (1991)参照）などのような修飾基を
導入した核酸を化学結合させる方法（尚、この範疇に属
する他の方法については、Soren R.R., Mette R.L., Sv
end E.R., Anal. Biochm., 198, 138-142 (1991), Jona
than N.K.,Joseph L.W., Joseph P.D., Rachel E.M., M
ary C., Eugene L.B., Nucleic Acids Res..15, 2891-2
909 (1987), Allan J.M., Jeffrey R.B., Terence W.
P., Biochem. J., 191, 855-858 (1980), J.A.Running,
M.S.Urdea, BioTechniques,8, 276-279 (1990)などに
記載されている。）、 核酸を、ＵＶ照射あるいは加熱処理によりニトロセル
ロースまたはナイロン膜上に吸着固定（J.Sambrok, E.
F.Fritsch and T.Maniatis, Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory Pres, Second Edition, pag
e 2.109-2.113 and page 9.34-9.46）したり、マイクロ
プレート上に物理吸着させ固定（G.C.N.Parry and A.D.
B.Malcolm, Biochm. Soc. Trans., 17, 230-231 (198
9)）するなどの物理吸着で固定する方法、 などが知られている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ような従来方法には難点のあることが指摘されていた。
例えば、化学結合による方法では、特殊試薬が必要でそ
れらの中には例えばアジド、イソシアナートやＮａＢＨ
₃ＣＮ などのような有毒物質が含まれるばかりか、例え
ばペプチド結合を介して固定化しようとする場合は、活
性物質あるいは基材のどちらか一方にアミノ基を、残る
片方にはカルボキシル基を導入する必要があり、さら
に、導入された官能基同士を縮合試薬で処理して固定化
する工程を経なければならないというように、操作が複
雑となることを避けられない。

【００１１】また化学結合では、例えばグルタルアルデ
ヒドを架橋剤として使用するには、基材と活性物質の双
方にアミノ基が存在せねばならないというように、基材
自体に官能基が必要なために基材の選択が必要となる結
果、固定に適した基材の選択が困難になり、加えて、た
とえば天然のＤＮＡや修飾基を持たない合成ＤＮＡなど
の反応性の乏しい官能基（末端リン酸基、末端ヒドロキ
シル基等）しか有しないものについては化学反応による
方法を用いることが困難であるというように、活性物質
に活性官能基が無い場合は固定できないという難点があ
る。

【００１２】一方、物理吸着には、基材の吸着性能に固
定化量が左右されたり、吸着した活性物質が脱離しやす
く、活性物質が低分子（オリゴマー）の場合、基材との
相互作用が弱いため、吸着しにくいという難点がある。

【００１３】以上のようにタンパク質、核酸などの活性
物質の検出において重要な固定化には多くの問題点を残
している。本発明は、簡便、効率的にかつ強固に生物学
的に活性な物質を固定できるカルボジイミド基を有する
高分子化合物よりなる材料を用いて、生物学的に活性な
化合物を検出する方法を提供するためになされたもので
ある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明が採用した生物学的に活性な物質を固定するた
めの材料の構成は、基材と、該基材上に担持されたカル
ボジイミド基を有する高分子化合物よりなることを特徴
とするものであり、上記目標を達成するために本発明が
採用した生物学的に活性な物質を固定するための方法の
構成は、基材および該基材上に担持されたカルボジイミ
ド基を有する高分子化合物より成る固定用の材料と、カ
ルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物
質を接触させることを特徴とするものである。

【００１５】低分子カルボジイミド誘導体、例えば、ジ
シクロヘキシルカルボジイミドやジ−ｐ−トルオイルカ
ルボジイミドは、エステルおよびペプチドなどの合成に
おける脱水縮合剤として従来より広く使用されていて、
これらカルボジイミド誘導体は、以下の反応式に示すよ
うに容易にカルボン酸と付加体を形成し（一般式
(I)）、さらにこの付加体がアルコール、アミン、カル
ボン酸等と尿素誘導体を放出しつつ縮合し、それぞれ相
当するエステル、アミド、酸無水物を生成する（一般式
(II)）ので、このような低分子カルボジイミド誘導体を
活性物質の固定に使用することも考えられた。

【００１６】

【化１】 R'CO₂H + RN=C=NR → R'C(=O)OC(NHR)=NR ・・・(I) R'C(=O)OC(NHR)=NR ＋ R"OH → R'C(=O)OR" + RNHCONHR ・・・(II) R"NH₂ → R'C(=O)NHR" + RNHCONHR ・・・(II') R"CO₂H → R'C(=O)OC(=O)R" + RNHCONHR ・・・(II")

【００１７】しかしながら、これら低分子カルボジイミ
ド誘導体は、縮合剤として開発されてきた試薬であっ
て、溶剤に対する溶解性が付与されており、基材に適用
し、該基材表面に担持させる使用目的に関しては、脱離
しやすく、実用上使用できないことが判明した。そこ
で、本発明の発明者らは、カルボジイミド基を分子内に
含む高分子量カルボジイミド化合物に着目し、鋭意研究
を続けた結果、このようなカルボジイミド化合物が、活
性物質との反応性を有しているばかりでなく、様々な種
類の基材との接着性がよく、固定した物質を利用する種
々の生物学的に重要な化合物の検出に適用できることを
見いだし本発明の完成に至った。

【００１８】すなわち本発明は、担体に固定化された生
物学的に活性な第１の物質と、この第１の物質に特異的
に結合し得る第２の物質とを反応させ、前記第１の物質
と第２の物質との結合を介して担体に間接的に結合した
第２の物質又は結合しない第２の物質を検出することに
より、試料中の第１の物質又は第２の物質を分析する方
法において、前記担体はカルボジイミド基を２〜１００
個有する化合物を含み、前記第１の物質はカルボジイミ
ド基を介して担体に固定化されることを特徴とする、生
物学的に活性な物質の分析法である。

【００１９】以下に本発明を詳細に説明する。

【００２０】＜１＞担体 本発明に用いられる担体は、生物学的に活性な物質を固
相化するためのものであり、カルボジイミド基を有する
高分子化合物を含む。通常は、基剤にカルボジイミド基
を有する高分子化合物を担持させたものである。

【００２１】（１）基剤 本発明で使用される基材としては、生物学的に活性な物
質を固定化するための支持体としての役割を果たすもの
であって、基本的には、水あるいは溶剤またはそのどち
らにも不溶性であり、かつ常温もしくはその付近の温度
範囲内（０〜１００℃）で固体又はゲル状であるもの、
たとえば、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分
子、セラミックが挙げられる。

【００２２】プラスチックとして具体的には、ポリエチ
レン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレ
ン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリ
カルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニ
リデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミドおよびアクリ
ル樹脂などが、無機高分子としては、ガラス、水晶、カ
ーボン、シリカゲル、およびグラファイト等が、金属と
しては、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、
パラマグネットおよびアパタイト等の常温固体金属が、
天然高分子としては、セルロース、セルロース誘導体、
キチン、キトサン、アルギン酸およびアルギン酸塩等
が、セラミックとしては、アルミナ、シリカ、炭化ケイ
素、窒化ケイ素および炭化ホウ素等などを例示すること
が出来る。

【００２３】上記基材の形状としては、たとえば、フィ
ルム、平板、粒子、成型品（ビーズ、ストリップ、マル
チウェルプレートのウェルまたはストリップ、チュー
ブ、メッシュ、連続発砲フォーム、膜、紙、針、ファイ
バー、プレート、スライドおよび細胞培養容器）、ラテ
ックスを挙げることが出来、またその大きさについて
は、当然であるが特に制限はない。

【００２４】（２）カルボジイミド基を有する高分子化
合物 一方、本発明で使用するカルボジイミド基を有する高分
子化合物（以下、単に「カルボジイミド化合物」という
ことがある）としては、例えば、特開昭５１−６１５９
９号公報に開示されている方法や L. M. Alberino らの
方法（J. Appl.Polym. Sci., 21, 190 (1990) あるいは
特開平２−２９２３１６号公報に開示されている方法な
どによって製造することができるポリカルボジイミドを
挙げることができる。すなわち、有機ポリイソシアネー
ト化合物からイソシアネートのカルボジイミド化を促進
する触媒（例えば３−メチル−１−フェニル−２−ホス
ホレン−１−オキシド）の存在下に製造することができ
るものである。

【００２５】上記の有機ポリイソシアネート化合物とし
ては、例えば、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイ
ソシアネート、ｍ−テトラメチルキシリレンジイソシア
ネート、２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−
トリレンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシ
アネートと２，６−トリレンジイソシアネートの混合
物、粗トリレンジイソシアネート、粗メチレンジフェニ
ルジイソシアネート、４，４’，４”−トリフェニルメ
チレントリイソシアネート、キシレンジイソシアネー
ト、ヘキサメチレン−１，６−ジイソシアネート、リジ
ンジイソシアネート、水添メチレンジフェニルジイソシ
アネート、ｍ−フェニルジイソシアネート、ナフチレン
−１，５−ジイソシアネート、４，４’−ビフェニレン
ジイソシアネート、４，４’−ジフェニルメタンジイソ
シアネート、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェ
ニルジイソシアネート、３，３’−ジメチルジフェニル
メタン−４，４’−ジイソシアネート、イソホロンジイ
ソシアネートやこれらの任意の混合物を挙げることがで
きる。

【００２６】上記ポリイソシアネート化合物又はそれら
の混合物のイソシアネート基をカルボジイミド化するこ
とによって重縮合が起こる。その際、適当な段階でモノ
イソシアネートの一種または２種以上を適当量加え、カ
ルボジイミド化合物の末端を封止することにより、分子
量（重合度）を調整することができる。また、モノイソ
シアネートは、重縮合反応の初めから適当量加えてもよ
い。このようなモノイソシアネートとしては、フェニル
イソシアネート、（オルト、メタ、パラ）−トリルイソ
シアネート、ジメチルフェニルイソシアネート、ｎ−ブ
チルイソシアネート、シクロヘキシルイソシアネート、
メチルイソシアネート等を例示することができる。重合
度は、ポリイソシアネート化合物等の濃度や反応時間に
よっても調整することができる。

【００２７】又、容易に類推されることであるが、この
他にも末端封止剤としては、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＣＯ
ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ等の官能基を末端に有するアルキ
ル基を有する化合物約１モルと、芳香族ジイソシアネー
ト２モルとの反応によって簡便に製造できるイソシアネ
ート末端化合物から誘導されるものでもよい。

【００２８】上記有機イソシアネートのカルボジイミド
化を促進する触媒としては、種々のものを例示すること
ができるが、１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキ
シド、３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン−１
−オキシド、１−エチル−２−ホスホレン−１−オキシ
ドやこれらの３−ホスホレン異性体などが収率その他の
面で好適である。

【００２９】上記ポリカルボジイミドの製造は、無溶媒
又は非反応性の有機溶媒中で行うものであり、本発明で
はこれらにより製造したワニス状あるいは固体状（粉
末）のポリカルボジイミドの一種又は混合物をカルボジ
イミド化合物の一例として用いることができる。なお、
これらのポリカルボジイミドは、基材との結合性を増加
させるために、部分的に架橋するようにしてもよい。

【００３０】他のカルボジイミド化合物、例えば特開昭
６３−１７２７１８号公報及び特開昭６３−２６４１２
８号公報に記載されるような、分子構造内にポリオキシ
エチレン鎖を付加して成る親水性を付与されたタイプの
カルボジイミド化合物も本発明で使用することができ
る。

【００３１】いずれのタイプであっても、本発明で使用
するカルボジイミド高分子化合物は、その分子中に２以
上１００以下のカルボジイミド基を有しているものが好
ましく、このカルボジイミド高分子化合物においてカル
ボジイミド基の数が２未満、すなわち１の場合は生物学
的に活性な物質を固定する能力に欠け、また逆にカルボ
ジイミド基の数が１０１以上の場合は性能面では問題は
ないが、粘度が高すぎたり、溶液とすることが出来ない
場合があり、基材上に担持させる際の取り扱い性が悪化
することがある。

【００３２】また、本発明で使用するカルボジイミド高
分子化合物の分子量の範囲としては、１０００以上であ
り、１０００００以下であることが好ましい。なお、た
とえば、前記有機ポリイソシアネート化合物からイソシ
アネートのカルボジイミド化を促進する触媒の存在下に
製造されたポリカルボジイミドの中には、分子量が１０
００に満たないものも存在するが、このようなポリカル
ボジイミドについては、ポリカルボジイミドの両末端
に、ウレア結合またはウレタン結合を介して、ポリアル
キレン、ポリオキシアルキレン、ポリウレタン、ポリア
ミドなどを導入し、分子量を前記範囲に調整すればよ
い。

【００３３】すでに説明したように、上記カルボジイミ
ド高分子化合物におけるカルボジイミド基の反応性は高
く、アルコール、アミン、チオール、フェノール、カル
ボン酸等の有するほとんどの活性水素基と反応するので
あり、前記カルボジイミド誘導体とカルボン酸との反応
以外の反応を示せば、例えば、アルコールとは、下記(I
II)式のように進行し、アミノ基とは(IV)式のように進
行する（Frederick Kurzer, K. Douraghi-Zadeh, Chemi
cal Reviews, 67, 117-135, (1967) および Andrew Wil
liams, Ibrahim T. Ibrahim, Chemical Reviews, 81, 5
99-606, (1981)参照）ので、本発明は、このような反応
性を利用して活性物質を基剤に固定するのである。

【００３４】

【化２】 C₂H₅OH + C₆H₅N=C=NC₆H₅ → C₆H₅NHC(=NC₆H₅)OC₂H₅ ・・・(III) RN=C=NR + R'NH₂ → RNHC(=NR')NHR ・・・(IV)

【００３５】（３）担体の調製 本発明に用いる生物学的に活性な物質を固相化するため
の担体は、上記基剤と、該基材上に担持された、上記カ
ルボジイミド化合物よりなる。該カルボジイミド化合物
の前記基材に対する高い接着性を利用して、基剤にカル
ボジイミド化合物を担持させたものである。なお、ここ
でいう「担持」とは、水あるいは溶媒中で、基剤からカ
ルボジイミド化合物が脱離しないことを意味する。

【００３６】カルボジイミド化合物は、必要に応じ、基
材上の全面において担持されても、また、その一部にお
いて担持されてもよく、その代表的な形態は皮膜であ
る。前記基材上に前記カルボジイミド化合物を担持させ
る方法としては、スプレー、浸漬、ブラッシング、スタ
ンプ、蒸着、フィルムコーターを用いたコーティング等
の公知の手段を採用することができる。

【００３７】このようにして得られた本発明の活性物質
を固相化するための担体は、カルボジイミド化合物の反
応性を利用して、様々な活性物質を固定することができ
るものである。

【００３８】＜２＞生物学的に活性な物質 担体に固定化する生物学的に活性な第１の物質として
は、タンパク質、ペプチド若しくはその他の抗体結合性
物質、核酸などの生体高分子等を挙げることができる。

【００３９】具体的には、タンパク質、ペプチドとして
は、インシュリン、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモ
ン）、オキシトシン等のタンパク質ホルモンもしくはペ
プチドホルモン、コリンエステラーゼ、アミラーゼ、ペ
プシン等の酵素又はその前駆体、ＨＢｓ抗原、ＨＩＶ抗
原等のタンパク質抗原、プロテインＡのような抗体結合
性タンパク質などが、抗体結合性物質としては低分子量
のハプテンが、核酸としては天然又は合成のＤＮＡ（オ
リゴヌクレオチドを含む）もしくはＲＮＡ（オリゴヌク
レオチドを含む）が挙げられる。

【００４０】具体的には、次のような化合物を例示でき
る。抗菌性を有する生理活性物質、例えばペニシリン、
アンピシリン、セファロスポリン、カナマイシン、スト
レプトマイシン、フラジオマイシン、デストマイシン、
カスガマイシン、タイロシン、エリスロマイシン、オレ
アンドマイシン、スピラマイシン、リンコマイシン、コ
リスチン、バシトラシン、サリノマイシン、モネンシ
ン、ラサロシド、テトラサイクリンおよびその類縁物
質、クロラムフェニコール、バージニアマイシンなど。
合成抗菌剤としてはサルファ剤、オキソリン酸、ピロミ
ド酸、フラゾリドン、ジフラゾンなどが挙げられ、天然
毒素全般としてはアフラトキシン、Ｔ２トキシン、ゼア
ラレノン、デオキシニバレノール、パツリン、フモニシ
ン、ＨＴ−２、オクラトキシン、テトロドトキシン、オ
カダ酸、サキシトシン、ゴニオトキシン、ボツリヌス毒
素などが挙げられ、合成化学品としては農薬全般、例え
ばダイオキシン、２，４−Ｄ、ベミノル、アルディカル
ブ、カルボフラン、メソミル、ＤＤＶＰ、マラソン、パ
ラコート、ダイアジノン、フェニトロチオン、エンドリ
ン、アルドリン、ヘプタクロルなどが挙げられる。ま
た、生体化学物質全般としてはヘモグロビン、α−フェ
トプロテイン、免疫グロブリン、アルブミン、アンチト
ロンビン、トロンビン、プラスミノーゲン、フェリチ
ン、チログロブリン、ゼラチン、コレステロール、テス
トステロン、コルチコステロン、プロゲステロン、エル
ゴステロール、エストラジオール、チトクロムＣ、アド
レナリン、各種ビタミン等が挙げられる。

【００４１】さらに、上記タンパク質、ペプチド、その
他の生物学的に活性な物質に結合し得る抗体が挙げられ
る。該抗体は、例えば上述の物質又は免疫用担体との結
合物を、免疫動物例えばラット、モルモット、ウサギ、
マウス、ヤギ、ヒツジ、馬、牛などの哺乳類に免疫して
得るか、マウスに免疫後そのリンパ球とマウスミエロー
マ細胞とのハイブリドーマが生産するモノクローナル抗
体として得られる。

【００４２】一方、生物学的に活性な第２の物質は、上
記のような第１の物質と同様のタンパク質、ペプチド、
抗原性物質、核酸、その他の生理活性物質であって、第
１の物質に特異的に結合するものである。すなわち、例
えば、第１の物質と第２の物質の一方がタンパク質、核
酸又はその他の生理活性物質である場合には、他方はそ
れに対する抗体であり、一方の物質が核酸である場合に
は、他方はその核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基
配列を有する核酸である。ここで実質的に相補的とは、
１又は２以上のミスマッチがあっても、各々の核酸が水
素結合によってハイブリダイズし、２本鎖を形成するこ
とができることをいう。

【００４３】尚、分析対象は、第１の物質であっても、
第２の物質であってもよい。

【００４４】＜４＞生物学的に活性な物質の分析 本発明による生物学的に活性な物質の分析法は、上記の
ようなた生物学的に活性な第１の物質を前記担体に結合
させ、これと第２の物質とを反応させ、第１の物質と第
２の物質との結合を介して担体に間接的に結合した第２
の物質又は結合しない第２の物質を検出することによ
り、行われる。

【００４５】第１の物質を担体に固定するには、当該材
料と活性物質とを接触させれば良く、担体に担持された
カルボジイミド高分子化合物のカルボジイミド基と、第
１の物質が有する水酸基、アミノ基、チオール基、カル
ボキシル基等との反応により、第１の物質はカルボジイ
ミド高分子化合物と共有結合する。その結果、第１の物
質は担体に固定化される。

【００４６】第１の物質と担体との接触は、第１の物質
の生物学的活性が維持されるように、水あるいはバッフ
ァー中で行うことが好ましく、また、接触の際の温度と
しては、やはり活性物質の活性が損なわれないように、
０〜１００℃とすることが好ましい。

【００４７】尚、担体へ第２の物質等が非特異的に結合
することを防ぐために、第１の物質を担体に固定化した
後に、過剰量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイ
ン、サケ精子ＤＮＡ等を担体に接触させ、フリーのカル
ボジイミド基をブロックしておくことが好ましい。

【００４８】このようにして得られた固相化された生物
学的活性物質は、該物質が担体に対して非常に強固に固
定されたものであり、イムノアッセイの分野で広く使わ
れている洗浄法（例えば界面活性剤を用いた洗浄法）に
よっても担体から脱離することがなく、抗体あるいは抗
原を固定した担体の免疫学的利用、核酸固定担体の診断
薬としての利用分野を有している。

【００４９】担体に固定化された第１の物質と第２の物
質とを反応させた後、担体に結合した第２の物質を検出
するには、通常の固相のイムノアッセイ、核酸のハイブ
リダイゼーション法と同様に行えばよい。例えば、第１
の物質が測定対象である場合には、標識物質で標識して
おいた第２の物質を固定化された第１の物質と反応さ
せ、担体に固定化された標識物質を検出又は定量するこ
とにより、結合した第２の物質を検出又は定量すること
ができる。その結果、第１の物質を検出又は定量するこ
とができる。第１の物質に結合した第２の物質のかわり
に、結合しなかって第２の物質を検出、定量してもよ
い。

【００５０】また、第２の物質が測定対象である場合に
は、第１の物質と第２の物質とを反応させる際に、反応
系に標識物質で標識された第２の物質をさらに加え、第
１の物質に結合した標識された第２の物質の結合量によ
り、間接的に試料中の第２の物質の量を定量することが
できる（阻害法）。

【００５１】さらに、担体に結合した第２の物質の検出
は、第２の物質に特異的に結合し得る、第３の物質を反
応させることによっても行うことができる。例えば、第
２の物質が抗原であり、第１の物質がこの抗原に対する
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（第１抗
体）である場合、担体−抗体−抗原複合体に、ポリクロ
ーナル抗体又は前記モノクローナル抗体とエピトープが
異なる他のモノクローナル抗体（第２抗体）を反応さ
せ、担体−抗体−抗原−抗体複合体を形成させ、複合体
中の第３の物質を検出することにより、第２の物質を検
出することができる（サンドイッチ法）。このとき、第
３の物質が標識されている場合にはその標識を検出すれ
ばよく、標識されていない場合であっても、さらに第３
の物質に結合する物質を用い、これを標識しておいても
よい。例えば、上記の例では第１抗体と第２抗体とを別
の動物で調製し、第２抗体の調製に用いた動物のイムノ
グロブリンに対する抗体を第３の物質とする。また、核
酸の場合も同様に、担体に固定化した第１の核酸にこれ
に特異性を有する第２の核酸を結合させ、さらに第２の
核酸に特異性を有し第１の核酸に特異性を有しない第３
の核酸を結合させ、担体に結合した第３の核酸の量から
第２の核酸を定量することができる。

【００５２】また乳濁状の担体を用いて、一般的な凝集
法により、第２の物質を検出することもできる。標識物
質としては、放射性物質、蛍光物質、酵素、色素、化学
発光物質、ジゴキシゲニン等が挙げられる。放射性物
質、蛍光物質、色素で標識した場合には、標識はシンチ
レーションカウンターによる測定、フィルムへの露光あ
るいは肉眼観察により、直接検出することができる。酵
素を用いた場合には、酵素反応により発色する基質色素
を用い、その発色を検出すればよい。このような酵素
は、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、リゾチームなど一般的に用い
られるものでよい。

【００５３】また、必ずしも標識物質自体が検出するこ
とができないものであってもよい。例えば標識物質とし
てビオチンを用いた場合には、これに特異的に結合する
アビジン又はストレプトアビジンを結合させた酵素等を
用いることにより、間接的に検出することができる。

【００５４】第１の物質と第２の物質、さらに必要に応
じて第３の物質又はその他の物質を反応させた後に未反
応の物質を除去、すなわちＢ／Ｆ分離するには、通常の
固相イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション法と同様
に行えばよい。すなわち、担体が容器状である場合に
は、担体に洗浄液を満たしたのち、洗浄液を捨てるとい
う操作を度繰り返す。担体が粒子である場合には、洗浄
液に担体を懸濁する操作を繰り返せばよい。

【００５５】

【実施例】以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。

【００５６】

【製造例１】カルボジイミド化合物溶液の製造（１） ４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１
１７．９ｇとシクロヘキシルイソシアネート１２．５ｇ
をカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニル−
２−ホスホレン−１−オキシド）１．３ｇと共に窒素雰
囲気下、１８０℃で４日間反応させ、室温で粉末状のカ
ルボジイミド化合物（重合度１０、数平均分子量２４０
０）を得た。これを１０ｇ取りメタノール１００ｍｌに
溶解させ、カルボジイミド化合物溶液１を得た。

【００５７】

【製造例２】カルボジイミド化合物溶液の製造（２） イソホロンジイソシアネート１９．９ｇとｎ−ブチルイ
ソシアネート２．０ｇをカルボジイミド化触媒（３−メ
チル−１−フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド）
０．２ｇと共に窒素雰囲気下、１８０℃で３日間反応さ
せ、室温で粉末状のカルボジイミド化合物（重合度１
０、数平均分子量１９００）を得た。これを１０ｇ取り
ジクロロメタン１００ｍｌに溶解し、カルボジイミド化
合物溶液２を得た。

【００５８】

【製造例３】カルボジイミド化合物溶液の製造（３） ２，４−トリレンジイソシアネート／２，６−トリレン
ジイソシアネート混合物（混合割合＝８０：２０）７
８．４ｇとフェニルイソシアネート１１．９ｇとをテト
ラクロロエチレン６１５ｇ中で、カルボジイミド化触媒
（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシ
ド）０．９ｇと共に窒素雰囲気下、７５℃で２４時間反
応させ、カルボジイミド化合物溶液３（重合度１０、数
平均分子量１５００）を得た。

【００５９】

【製造例４】カルボジイミド化合物溶液の製造（４） ４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート１１２．
６ｇとフェニルイソシアネート１１．９ｇとをテトラヒ
ドロフラン９２２．７ｇ中でカルボジイミド化触媒（３
−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシド）
１．２ｇと共に窒素雰囲気下、７５℃で１６時間反応さ
せ、カルボジイミド化合物溶液４（重合度１０、数平均
分子量２３００）を得た。

【００６０】

【製造例５】カルボジイミド化合物溶液の製造（５） ｍ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート７００ｇ
とカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホ
スホレン−１−オキシド）１４ｇを窒素雰囲気下、１８
０℃で１２時間反応させ、イソシアネート末端テトラメ
チルキシリレンカルボジイミド（重合度＝３）を得た。
次いで、得られたカルボジイミド７４．６ｇと重合度６
のポリ（オキシエチレン）モノメチルエーテル６３．６
ｇを１００℃で４８時間反応させた。これを１０ｇ取
り、５０℃で蒸留水９０ｇを徐々に加えることでカルボ
ジイミド化合物溶液５（数平均分子量１４００）を得
た。

【００６１】

【製造例６】カルボジイミド化合物溶液の製造（６） ４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート１６２ｇ
をテトラヒドロフラン８８６ｇ中でカルボジイミド化触
媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−１−オキシ
ド）０．３３ｇと共に窒素雰囲気下、還流下で７時間反
応させ、カルボジイミド化合物溶液６（重合度６０、数
平均分子量１３０００、ポリマー濃度１５重量％）を得
た。

【００６２】

【製造例７】カルボジイミド化合物溶液の製造（７） ｍ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート７００ｇ
とカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホ
スホレン−１−オキシド）１４ｇを窒素雰囲気下、１８
０℃で１８時間反応させ、イソシアネート末端テトラメ
チルキシリレンカルボジイミド（重合度＝４）を得た。
次いで、得られたカルボジイミド５０．２ｇと２−ジメ
チルアミノエタノール８．９ｇを８０℃で２４時間反応
させた後、ｐ−トルエンスルホン酸メチル１８．６ｇを
加え１時間反応させた。これに蒸留水６９９．３ｇを徐
々に加えることでカルボジイミド化合物溶液７（数平均
分子量１６００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。

【００６３】

【製造例８】カルボジイミド化合物溶液の製造（８） イソホロンジイソシアネート２０ｇとカルボジイミド化
触媒（３−メチル−１−フェニル−２−ホスホレン−１
−オキシド）０．２ｇを窒素雰囲気下、１８０℃で１８
時間反応させ、イソシアネート末端イソホロンカルボジ
イミド（重合度＝４）を得た。次いで、得られたカルボ
ジイミド７．５６ｇと３−ジメチルアミノプロピルアミ
ン２．０４ｇを８０℃で１時間反応させた後、ｐ−トル
エンスルホン酸メチル３．７２ｇを加え１時間反応させ
た。これに蒸留水１２０ｇを徐々に加えることでカルボ
ジイミド化合物溶液８（数平均分子量１４００、ポリマ
ー濃度１０重量％）を得た。

【００６４】

【製造例９】カルボジイミド化合物溶液の製造（９） ４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１
１７．９ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−
フェニル−２−ホスホレン−１−オキシド）１．２ｇを
窒素雰囲気下、１８０℃で８時間反応させ、イソシアネ
ート末端ジシクロヘキシルカルボジイミド（平均重合度
＝２．４）を得た。次いで、得られたカルボジイミド
７．８５ｇと重合度約６のポリ（オキシエチレン）モノ
メチルエーテル５．９２ｇを１００℃で４８時間反応さ
せた。これに蒸留水１２４ｇを徐々に加えることでカル
ボジイミド化合物溶液９（数平均分子量１３００、ポリ
マー濃度１０重量％）を得た。

【００６５】

【製造例１０】カルボジイミド化合物溶液の製造（１
０） ４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート１
５ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニ
ル−２−ホスホレン−１−オキシド）０．１ｇをテトラ
ヒドロフラン１４５ｇ中、窒素雰囲気下、７５℃で８時
間反応させ、イソシアネート末端ジフェニルメタンカル
ボジイミド（重合度＝５）を得た。次いで、得られたカ
ルボジイミド溶液に重合度約１０のポリ（オキシエチレ
ン）モノメチルエーテル９．４４ｇを加え、７５℃で４
８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１０（数平
均分子量２１００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。

【００６６】

【製造例１１】カルボジイミド化合物溶液の製造（１
１） ２，４−トリレンジイソシアネート／２，６−トリレン
ジイソシアネートの混合物（混合割合＝８０：２０）１
３．９ｇとカルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フ
ェニルホスホレン−１−オキシド）０．１ｇをテトラヒ
ドロフラン１５０ｇ中、窒素雰囲気下、７５℃で８時間
反応させ、イソシアネート末端トリレンカルボジイミド
（重合度＝４）を得た。次いで、得られたカルボジイミ
ド溶液にヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム１．
６２ｇを加え、７５℃で２４時間反応させ、カルボジイ
ミド化合物溶液１１（数平均分子量１０００、ポリマー
濃度１０重量％）を得た。

【００６７】

【製造例１２】カルボジイミド化合物溶液の製造（１
２） ４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート２４ｇと
平均分子量４００のポリエチレングリコール２０ｇをテ
トラヒドロフラン４４０ｇに加え反応させた。次に、カ
ルボジイミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホ
レン−１−オキシド）０．２ｇを、窒素雰囲気下、７５
℃で４８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１２
（数平均分子量５３００、ポリマー濃度１０重量％）を
得た。

【００６８】

【製造例１３】カルボジイミド化合物溶液の製造（１
３） ４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート５
２．４ｇと１，４−ジアミノブタン８．８ｇをテトラヒ
ドロフラン６２０ｇに加え反応させた。次に、カルボジ
イミド化触媒（３−メチル−１−フェニルホスホレン−
１−オキシド）０．５ｇを、窒素雰囲気下、７５℃で４
８時間反応させ、カルボジイミド化合物溶液１３（数平
均分子量３７００、ポリマー濃度１０重量％）を得た。

【００６９】

【実施例１】カルボコートマイクロプレートに固定した
ＤＮＡの標識ＤＮＡによる検出 （１）マイクロプレート上へのＤＮＡオリゴマーの固定 ＤＮＡ合成機（ミリポア社製、サイクロンプラス ＤＮ
Ａ／ＲＮＡシンセサイザー）によりキャプチャーＤＮＡ
オリゴマー（配列番号１）及びビオチン化プローブＤＮ
Ａオリゴマー（配列番号２）を合成した。プローブは、
ＤＮＡオリゴマー合成の際にビオチンフォスフォルアミ
ダイト（ミリポア社製）を用いて、ビオチンを５’末端
に導入した。

【００７０】ポリスチレン製の９６穴マイクロプレート
の各ウェルにカルボジイミド化合物溶液１を０．１ｍｌ
ずつ分注し、６０℃で１時間インキュベートした。溶液
を抜き取った後、各ウェルをエタノールでよく洗浄し
た。６０℃で３０分乾燥した後各ウェルにキャプチャー
３０ｍｅｒ水溶液（１０ｐｍｏｌ／１００μｌ）を１０
０μｌ加えプレートをシールをした。３７℃のインキュ
ベーター中で１時間固定化させた。

【００７１】一方、コントロールとして上記プローブと
全く相補性を示さないオリゴヌクレオチド（配列番号
３）も同様に固定化した。

【００７２】（２）ハイブリダイゼーションによるキャ
プチャーオリゴヌクレオチドの検出 キャプチャーオリゴヌクレオチド（配列番号１）又はコ
ントロールＤＮＡオリゴマーを固定したプレートにプレ
ハイブリダイゼーション溶液（１００μｌ／ウェル）を
加えプレートをシールをし、４２℃のインキュベーター
中で２時間放置した。プレハイブリダイゼーション溶液
の組成は、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，０．０
７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５× Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．０２％ フィコール，
０．０２％ ＢＳＡフラクションＶ，０．０２％ ポリ
ビニルピロリドン）、２５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６．６）、５０％フォルムアミド、０．５ｍｇ／ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡである。

【００７３】各ウェルの溶液をディスペンサーで吸い取
り、プローブを加えたハイブリダイゼーション溶液（１
００μｌ／ウェル）を加えプレートをシールをした。４
２℃のインキュベーター中で１５時間反応させた。ハイ
ブリダイゼーション溶液の組成は、５×ＳＳＣ、１×Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２５ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ６．６）、４５％フォルムアミド、
０．２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％デキスト
ラン硫酸である。

【００７４】プローブは、１，１０，１００ｐｍｏｌ／
ウェルになるように７０℃、５分間処理後、氷中で５分
間急冷し、ハイブリダイゼーション溶液に加えた。ハイ
ブリダイゼーション後、ウェルの溶液を吸い取り１×Ｓ
ＳＣ（３００μｌ／ウェル）を加え、室温下で５分間放
置した。この操作をあと２回行い非特異的に吸着したプ
ローブを除去した。

【００７５】（３）検出 ウェル中のＳＳＣを吸い取り、３％ＢＳＡを含む緩衝液
Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩酸，ｐ
Ｈ７．５，０．０５％トライトンＸ−１００）を３００
μｌ／ウェル加え、室温下３０分間ブロッキングを行な
った。ウェル中の溶液を吸い取り、ストレプトアビジン
−アルカリフォスファターゼコンジュゲート溶液（ギブ
コＢＲＬ社製、緩衝液Ａで原液を５０００倍希釈したも
の）を１００μｌ／ウェル加え、室温下３０分間反応さ
せた。コンジュゲート溶液を吸い取り、緩衝液Ａを３０
０μｌ／ウェル加え、室温下５分間放置した。この操作
をあと２回行い、ビオチンと結合しなかったコンジュゲ
ートを除去した。ｐＮｐｐ溶液を１００μｌ／ウェル加
え、３０℃３０分間反応させた。ｐＮｐｐ溶液の組成
は、５０ｍＭ 四ほう酸ナトリウム（ｐＨ１０．０）、
５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ ｐ−ニトロフェニル
リン酸２ナトリウムである。

【００７６】反応後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
を加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリー
ダーで各ウェルの４０５ｎｍの吸収を計測した。計測の
結果、相補性のないオリゴマー（配列番号３）を固定し
たプレートの吸収値はバックグラウンドに等しく、キャ
プチャーを固定したプレートではバックグラウンドと有
意な差を示す吸収値を得た。表１に結果を示す。

【００７７】

【表１】

【００７８】

【実施例２】カルボコートポリスチレンビーズに固定し
たＭ１３ＤＮＡの標識Ｍ１３ＤＮＡによる検出 （１）ビーズ上へのキャプチャーＤＮＡ固定 ポリスチレンビーズ５ｇをカルボジイミド化合物溶液２
（１００ｍｌ）に３０分間浸漬した後、６０℃で３時間
乾燥し、カルボジイミド被膜ビーズを得た。

【００７９】カルボジイミド被膜ビーズ１ｇを滅菌蒸留
水１０ｍｌに懸濁した。この懸濁液中に熱変性させたＭ
１３ＲＦＤＮＡ又はｐＢＲ３２２ＤＮＡを１００ｎｇ／
ｍｌになるように加え、振盪させながら３７℃で２時間
固定化させた。ビーズをフィルターを用いて蒸留水５０
０ｍｌで洗浄し、風乾させた。

【００８０】（２）ハイブリダイゼーション 風乾したビーズ１００ｍｇを１．５ｍｌ容ディスポーザ
ブルチューブに秤取り、実施例１で用いたプレハイブリ
ダイゼーション溶液を１ｍｌ加え、４２℃中で２時間放
置した。遠心操作によりビーズを分離し、実施例１のハ
イブリダイゼーション溶液を１ｍｌ加えよく懸濁させ
た。あと２回同一の操作を行なった。ハイブリダイゼー
ション溶液１ｍｌを加え、ビーズをよく懸濁させた。フ
ォトビオチン（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いてビオチン標
識したＭ１３ｓｓＤＮＡを熱変性後１μｇ／ｍｌになる
ように加えた（尚、コントロールとして同標識方法でビ
オチンを導入したｐＢＲ３２２を用いた。）。４２℃で
振盪させながら、１５時間反応させた。

【００８１】遠心操作によりビーズを分離し、上清を除
去し２×ＳＳＣを１ｍｌ加えてよく懸濁させ、５分間室
温下放置した。この操作をあと２回繰り返した。遠心操
作により上清を除去し、０．２×ＳＳＣ１ｍｌを加えビ
ーズをよく懸濁させ、室温下５分間放置した。この操作
をあと２回行なった。遠心操作によって上清を除去し、
５０℃に予め温めた０．１６×ＳＳＣを１ｍｌ加えよく
懸濁させ、５０℃で１０分間放置した。この操作をあと
１回行なった。

【００８２】上清を遠心操作によって除去し、実施例１
の３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａを１ｍｌ加え、振盪させな
がら室温下３０分間放置した。遠心操作により上清を除
去し、緩衝液Ａで１０００倍希釈したストレプトアビジ
ン−アルカリフォスファターゼ（ギブコＢＲＬ社製）を
１ｍｌ加え、ビーズをよく懸濁させ室温下３０分間振盪
させながら放置した。遠心操作により上清を除去したの
ち、緩衝液Ａを１ｍｌ加えてビーズをよく懸濁させ室温
下５分間放置した。あと２回同操作を行なった。

【００８３】遠心操作により上清を除去し、ほう酸緩衝
液（５０ｍＭ四ほう酸ナトリウム、ｐＨ１０．０、５ｍ
Ｍ塩化マグネシウム）を１ｍｌ加え、ビーズを懸濁させ
た。この操作をあと２回行なった。遠心操作により上清
を除去し実施例１のｐＮｐｐ溶液を４００μｌ加え、ビ
ーズをよく懸濁させた。３０℃で３０分間反応させた後
０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を８００μｌ加え、反
応を停止させた。吸光光度計を用いて４０５ｎｍの吸収
を測定した。

【００８４】その結果ｐＢＲ３２２を固定したビーズに
は吸収が認められず、Ｍ１３ＤＮＡを固定したビーズに
はバックグラウンドと有意な差を示す値が得られた。表
２に結果を示す。

【００８５】

【表２】

【００８６】

【実施例３】カルボコート変性セルロースメンブレンに
固定したＤＮＡオリゴマーの標識Ｍ１３ＤＮＡによる検
出 （１）ＤＮＡオリゴマーの固定 変性セルロースフィルターをカルボジイミド溶液３に１
０秒間浸した後、６０℃で３０分間乾燥させた。このフ
ィルターを濾紙上に置き、実施例１と同様にして合成し
たＭ１３ＤＮＡのマルチクローニングサイトと相補的な
配列を有するＤＮＡオリゴマー（４０ｍｅｒ）（配列番
号４）の水溶液とＭ１３ＤＮＡと相補性を示さないＤＮ
Ａオリゴマー（４０ｍｅｒ）（配列番号５）の水溶液を
それぞれ１ｎｇから１０ｆｇまでの１０段階希釈溶液を
１μｌずつスポットした。３７℃中で１５分間放置し、
ＤＮＡオリゴマーを固定化させた。

【００８７】（２）ハイブリダイゼーション オリゴマーを固定化させたカルボコート変性セルロース
メンブレンをハイブリダイゼーションバッグ（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリー製）に入れ、実施例１のプレ
ハイブリダイゼーション溶液を加えて（０．０８ｍｌ／
ｃｍ² メンブレン）、ヒートシーラーで封入した。４２
℃中で２時間放置した。ハイブリダイゼーションバッグ
からメンブレンを取り出し、新しいハイブリダイゼーシ
ョンバッグに入れた。このバッグに熱変性したフォトビ
オチン（ＶＥＣＴＯＲ社製）でビオチン標識したＭ１３
ＲＦＤＮＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む実施例１のハイ
ブリダイゼーション溶液を加え（０．０３ｍｌ／ｃｍ
² ）、ヒートシーラーで封入し、４２℃で１５時間置い
た。ハイブリダイゼーションバッグからメンブレンを取
り出し、メンブレンが充分浸る量の２×ＳＳＣが入った
トレイに入れた。ゆっくりと室温下で５分間振盪させ
た。この操作を再度行なった。次に４０℃に予め温めた
充分量の０．２×ＳＳＣの入ったトレイにメンブレンを
入れ、４０℃でゆっくりと５分間振盪させた。この操作
をあと２回行なった。２×ＳＳＣの入ったトレイにメン
ブレンを移し、よく洗浄した。

【００８８】（３）検出 新しいハイブリダイゼーションバッグにメンブレンを入
れ、３％ＢＳＡを含む緩衝液Ａを加えて（１ｍｌ／ｃｍ
² ）ヒートシーラーで封入した。室温下で３０分間置い
た。ハイブリダイゼーションバッグからメンブレンを取
り出し新しいハイブリダイゼーションバッグに移しスト
レプトアビジン−アルカリフォスファターゼコンジュゲ
ート溶液（ギブコＢＲＬ社製、緩衝液Ａで１０００倍に
希釈したもの）を加え（０．１ｍｌ／ｃｍ² ）、ヒート
シーラーで封入し、室温下で３０分間放置した。ハイブ
リダイゼーションバッグからメンブレンを取り出し、充
分量の緩衝液Ａの入ったトレイに移し、室温下で５分間
振盪しながら洗浄した。この操作をあと２回行なった。

【００８９】新しいハイブリダイゼーションバッグにメ
ンブレンを入れ、発色基質溶液を加え（０．１ｍｌ／ｃ
ｍ² ）ヒートシーラーで封入した。室温下で適度のシグ
ナルが得られるまで放置した。発色基質の組成は、０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．５、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭ塩化マグネシウムの溶液１ｍｌにＢＣＩＰ
溶液（５０ｍｇ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルフォスフェート／９００ｍｌジメチルフォルムアミ
ド）３．２μｌとＮＢＴ溶液（５０ｍｇニトロブルーテ
トラゾリウム／１．８ｍｌ ７０％エタノール）６．４
μｌを加えたものである。

【００９０】充分なシグナルが得られた後、メンブレン
を０．２Ｍ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し発
色反応を停止させた。その結果、Ｍ１３ＤＮＡに相補性
を持つオリゴマーを固定した位置にのみシグナルを得
た。結果を表３に示す。

【００９１】

【表３】 表３ ───────────────────────────── 固定したDNAオリコ゛マー シ グ ナ ル ───────────────────────────── 配列番号４ ○ ○ ○ ○ △ × 配列番号５ × × × × × × オリゴマー使用量 1ng 100pg 10pg 1pg 100fg 10fg ───────────────────────────── ○：はっきり見える △：見える ×：見えない

【００９２】

【実施例４】カルボコートマイクロプレートに固定した
ＤＮＡオリゴマーの２段階のハイブリダイゼーションに
よる検出 （１）ＤＮＡオリゴマーの固定 実施例１に従ってＭ１３ｓｓＤＮＡに相補的なキャプチ
ャーＤＮＡオリゴマー（４０ｍｅｒ）（配列番号４）を
固定化させた。

【００９３】（２）ハイブリダイゼーション 各ウェルに１００μｌのプレハイブリダイゼーションを
加え、プレートをシールをして４２℃中で２時間置い
た。各ウェルの溶液をディスペンサーで吸い取り、熱変
性させたＭ１３ｓｓＤＮＡを１００ｎｇ／ｍｌ（コント
ロールの系にはｐＢＲ３２２を加えた）と、実施例１と
同様の方法で合成し５’末端をビオチン標識し、熱変性
させたＭ１３ｓｓＤＮＡと相補的なビオチン化ＤＮＡオ
リゴマー（４０ｍｅｒ）（プレートに固定したキャプチ
ャーオリゴマーとは相補性を示さない：配列番号６）を
含む実施例１のハイブリダイゼーション溶液を（１μｇ
／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）加えた。プレートをシー
ルをし、４２℃中で１５時間置いた。

【００９４】各ウェルの溶液を吸い取り、１×ＳＳＣを
加え（２００μｌ／ウェル）、室温下５分間放置した。
この操作をあと２回行なった。

【００９５】（３）検出 実施例１（３）と同じ方法で行なった。その結果、Ｍ１
３ｓｓＤＮＡを用いた系ではバックグラウンドと有意な
差を示す吸収値を得たがコントールであるｐＢＲ３２２
を用いた系ではバックグラウンドと有意な差は認められ
なかった。（結果を表４に示す。）

【００９６】

【表４】

【００９７】

【実施例５】カルボコートアルミニウム蒸着膜に固定し
たＩｇＧの標識抗ＩｇＧによる検出 （１）金属板上へのＩｇＧの固定 ガラス基板上にアルミニウムを２０００Å蒸着した。こ
の蒸着膜上にカルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１
０〜１３の各々０．５ｍｌをスピンコーターで被膜した
ものと、カルボジイミド化合物で被膜していないアルミ
ニウム蒸着膜の各々に、ウサギＩｇＧ溶液（１％ゼラチ
ン，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７．５，０．５Ｍ
ＮａＣｌ）を３ドットずつスポットし、室温で１０分
間固定した。これらのアルミニウム蒸着膜を洗浄液１
（２０ｍＭトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７．５，０．５Ｍ
ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１０分間ず
つ３回洗浄した。

【００９８】（２）抗原抗体反応によるウサギＩｇＧの
検出 （ａ）ブロッキング ブロッキング溶液（３％ゼラチン，２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液 ｐＨ７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ）中で３０分
間、２５℃でブロッキングした。

【００９９】（ｂ）抗原抗体反応 アルカリファスファターゼ標識した抗ウサギ−ヤギＩｇ
Ｇ溶液（１％ゼラチン，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液 ｐ
Ｈ７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０）中で２時間、３７℃でインキュベートした。未反
応の抗体を、洗浄液１で１０分間ずつ３回洗浄して除去
した後、洗浄液２（２０ｍＭトリス塩酸緩衝液 ｐＨ
７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ）で置換した。

【０１００】（ｃ）発色操作 基質用緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸緩衝液 ｐＨ９．
５，０．１Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）１ｍ
ｌにＢＣＩＰ溶液（５０ｍｇ ５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリルフォスフェート，９００ｍｌ ジメチ
ルフォルムアミド）３．２μｌとＮＢＴ溶液（５０ｍｇ
ニトロブルーテトラゾリウム，１．８ｍｌ ７０％
ｅｔｈａｎｏｌ）６．４μｌを混合した溶液を加え、室
温で３時間発色させた。結果は表５に示した。

【０１０１】

【表５】 ○：発色した ×：発色しない

【０１０２】

【実施例６】カルボコートプレートを使ったサンドイッ
チＥＬＩＳＡ （１）マイクロプレート上へのＩＦＮγの固定 実施例１と同様の方法でカルボジイミド化合物を被膜さ
せたポリスチレン製９６穴マイクロタイタープレート
に、１μｇ／μｌ抗ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）γ
抗体溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．
４，１５０ｍＭＮａＣｌ）を１ウェルにつき１００μｌ
ずつ分注し、４℃で一晩放置した。吸着されなかった抗
体は、洗浄溶液１（リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．
４，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間ずつ５回洗
浄して除いた。

【０１０３】（２）ブロッキング ブロッキング溶液（３％スキムミルク，２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．４，０．５Ｍ ＮａＣｌ）
を１ウェルにつき３００μｌずつ分注し、２５℃で３０
分間ブロッキングした。

【０１０４】（３）抗原抗体反応 ＩＦＮγを緩衝液（１％スキムミルク、１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）で４００ｐｇ、２００ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐ
ｇ、２５ｐｇ、１２．５ｐｇとなるように調製した標準
液を、（１）で抗ヒトＩＦＮγ抗体を固定化したマイク
ロタイタープレートに１００μｌずつ加えた。このプレ
ートをシールした後、３７℃で２時間インキュベートし
た。未反応の抗原は、洗浄液１で５分間ずつ５回洗浄し
て除いた。

【０１０５】次にアルカリフォスファターゼ標識抗ＩＦ
Ｎγ抗体溶液（１％スキムミルク，１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液 ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を
１ウェルにつき１００μｌずつ加え、プレートをシール
した後、３７℃で２時間インキュベートした。反応しな
かった抗体は、洗浄液１で５分間ずつ５回洗浄し除い
た。

【０１０６】（４）発色操作 実施例１と同様にｐＮｐｐ溶液を調製し、１ウェルにつ
き１００μｌずつ加えた。３０℃で２５分間反応させた
後、０．１Ｎ ＮａＯＨを１００μｌずつ加えて発色を
停止させ、生じた色の濃さを吸収波長４０５ｎｍに調節
したマイクロプレートリーダーで測定した。結果を表６
に示した。

【０１０７】

【表６】

【０１０８】

【実施例７】乳濁状のカルボコートポリスチレンラテッ
クスを使った凝集法によるヒトプラスミノーゲンの検出
（１）（１）カルボコートポリスチレンラテックス上へ
の抗ヒトプラスミノーゲン抗体の固定 カルボジイミド化合物溶液３で被膜した直径０．１５μ
ｍのポリスチレンラテックスを５０ｍＭホウ酸緩衝液
ｐＨ８．５で１重量％に調製した。この溶液を１ｍｌと
り、３７℃に保温した後、抗ヒトプラスミノーゲン抗体
３００μｇを加え、３７℃で１時間振盪した。この溶液
を４℃、１８，０００ｒｐｍ、１時間の条件で遠心分離
し、上清を除いた。

【０１０９】（２）ブロッキング 沈澱物を、３％牛血清アルブミン，５０ｍＭホウ酸緩衝
液 ｐＨ８．５に懸濁し、３７℃、１時間振盪した。こ
の溶液を４℃、１８，０００ｒｐｍ、１時間の条件で遠
心分離し、上清を除いた。沈澱物は１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ７．４に懸濁し、０．５重量％溶液と
した。

【０１１０】（３）凝集反応による吸光度変化の測定 １０ｍｇ／ｍｌヒトプラスミノーゲン溶液（３％牛血清
アルブミン、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ
７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）５０μｌと（１）及び
（２）で調製した抗ヒトプラスミノーゲン抗体を固定し
たラテックス溶液５０μｌを１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液 ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ４００μ
ｌに加え、混合した。この溶液の波長６６０ｎｍにおけ
る吸光度の変化を反応後３０秒から１２０秒測定した。
又、コントロールとして、１０ｍｇ／ｍｌヒトトランス
フェリン溶液（３％牛血清アルブミン、１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）についても同様の試験を行なった。結果は、表７に
示した。

【０１１１】

【表７】

【０１１２】

【実施例８】乳濁状のカルボコートポリスチレンラテッ
クスを使った凝集法によるヒトプラスミノーゲンの検出
（２）（１）カルボコートＣ−タイプポリスチレンラテ
ックス上への抗ヒトプラスミノーゲン抗体の固定 カルボジイミド化合物溶液９で被膜した直径０．１５μ
ｍのカルボキシル基含有ポリスチレンラテックスを５０
ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１重量％に調製し
た。この溶液を１ｍｌとり、３７℃に保温した後、抗ヒ
トプラスミノーゲン抗体３００μｇを加え、３７℃で１
時間振盪した。この溶液を４℃、１８，０００ｒｐｍ、
１時間の条件で遠心分離し、上清を除いた。

【０１１３】（２）ブロッキング 沈澱物は、３％牛血清アルブミン，５０ｍＭホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．５）に懸濁し、３７℃、１時間振盪した。
この溶液を４℃、１８，０００ｒｐｍ、１時間の条件で
遠心分離し、上清を除いた。沈澱物は１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、０．５重量％
溶液とした。

【０１１４】（３）凝集反応による吸光度変化の測定 １０ｍｇ／ｍｌヒトプラスミノーゲン溶液（３％牛血清
アルブミン、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）５０μｌと（１）及
び（２）で調製した抗ヒトプラスミノーゲン抗体を固定
したラテックス溶液５０μｌを１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ４０
０μｌに加え、混合した。この溶液の波長６６０ｎｍに
おける吸光度の変化を反応後３０秒から１２０秒測定し
た。又、コントロールとして、１０ｍｇ／ｍｌヒトトラ
ンスフェリン溶液（３％牛血清アルブミン、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ）についても同様の試験を行なった。結果は、表８
に示した。

【０１１５】

【表８】

【０１１６】

【実施例９】乳濁状のカルボコートカルボキシルタイプ
ポリスチレンラテックスを使った凝集法によるＤＮＡの
検出 （１）カルボコートラテックス上へのＭ１３ｍｐ１８ｓ
ｓの固定 カルボジイミド化合物溶液１１で被膜した直径０．１５
μｍのカルボキシル基含有ポリスチレンラテックスを５
０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１重量％に調製し
た。この溶液を０．５ｍｌとり、３７℃に保温した後、
２０μｇ／ｍｌＭ１３ｍｐ１８ｓｓ溶液０．５ｍｌを加
え、３７℃で２時間振盪した。この溶液を４℃、１８，
０００ｒｐｍ、１時間の条件で遠心分離し、上清を除い
た。

【０１１７】（２）プレハイブリダイゼーション 沈澱物を、プレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳ
Ｃ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液，２５ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．６），５０％ホルムアミド，０．５ｍｇ
／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）に懸濁し、４２℃、１時間
振盪した。この溶液を４℃、１８，０００ｒｐｍ、１時
間の条件で遠心分離し、上清を除いた。沈澱物は１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、
０．５重量％溶液とした。

【０１１８】（３）ハイブリダイゼーション （１）、（２）で調製したラテックス溶液２００μｌに
ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ，１×Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓ溶液，２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
６），４５％ホルムアミド，０．２ｍｇ／ｍｌ変性サケ
精子ＤＮＡ，２０ｎｇ／ｍｌ Ｍ１３ｍｐ１８ ＲＦ）
２００μｌを加えて混合し、４２℃，２時間振盪した。
又、ハイブリダイゼーション溶液中の２０ｎｇ／ｍｌ
Ｍ１３ｍｐ１８ ＲＦをｐＢＲ３２２に置き換えたもの
をコントロールとして、同様に反応させた。

【０１１９】（４）凝集反応による吸光度変化の測定 この溶液の波長５５０ｎｍにおける吸光度の変化を調べ
るため、反応直後、及び反応から２時間後の吸光度を測
定した。結果は、表９に示した。

【０１２０】

【表９】

【０１２１】

【実施例１０】乳濁状のカルボコートラテックスを使っ
た凝集法によるヒトプラスミノーゲンの検出 （１）カルボコートラテックス上への抗ヒトプラスミノ
ーゲン抗体の固定 カルボジイミド化合物溶液３で被膜した直径０．１５μ
ｍのポリスチレンラテックスを５０ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．５）で１重量％に調製した。この溶液を１ｍ
ｌとり、３７℃に保温した後、抗ヒトプラスミノーゲン
抗体３００μｇを加え、３７℃で１時間振盪した。この
溶液を４℃、１８，０００ｒｐｍ、１時間の条件で遠心
分離し、上清を除いた。

【０１２２】（２）ブロッキング 沈澱物は、３％牛血清アルブミン，５０ｍＭホウ酸緩衝
液（ｐＨ８．５）に懸濁し、３７℃、１時間振盪した。
この溶液を４℃、１８，０００ｒｐｍ、１時間の条件で
遠心分離し、上清を除いた。沈澱物は１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、０．５重量％
溶液とした。

【０１２３】（３）凝集反応による吸光度変化の測定 １０ｍｇ／ｍｌヒトプラスミノーゲン溶液（３％牛血清
アルブミン、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ）５０μｌと（１）及
び（２）で調製した抗ヒトプラスミノーゲン抗体を固定
したラテックス溶液５０μｌを１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ４０
０μｌに加え、混合した。この溶液の波長６６０ｎｍに
おける吸光度の変化を反応後３０秒から１２０秒測定し
た。又、コントロールとして、１０ｍｇ／ｍｌヒトトラ
ンスフェリン溶液（３％牛血清アルブミン、１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）についても同様の試験を行なった。結果は、表
１０に示した。

【０１２４】

【表１０】

【０１２５】

【実施例１１】乳濁状のカルボコートラテックスを使っ
た凝集法によるＤＮＡの検出 （１）カルボコートラテックス上へのＭ１３ｍｐ１８ｓ
ｓの固定 カルボジイミド化合物溶液３で被膜した直径０．１５μ
ｍのポリスチレンラテックスを５０ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．５）で２重量％に調製した。この溶液を０．
５ｍｌとり、３７℃に保温した後、２０μｇ／ｍｌ Ｍ
１３ｍｐ１８ｓｓ溶液０．５ｍｌを加え、３７℃で２時
間振盪した。この溶液を４℃、１８，０００ｒｐｍ、１
時間の条件で遠心分離し、上清を除いた。

【０１２６】（２）プレハイブリダイゼーション 沈澱物を、プレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳ
Ｃ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液，２５ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．６），５０％ホルムアミド，０．５ｍｇ
／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）に懸濁し、４２℃、１時間
振盪した。この溶液を４℃、１８，０００ｒｐｍ、１時
間の条件で遠心分離し、上清を除いた。沈澱物は１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、
０．５重量％溶液とした。

【０１２７】（３）ハイブリダイゼーション （１）、（２）で調製したラテックス溶液２００μｌに
ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ，１×Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓ溶液，２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
６），４５％ホルムアミド，０．２ｍｇ／ｍｌ変性サケ
精子ＤＮＡ，２０ｎｇ／ｍｌ Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ）２
００μｌを加えて混合し、４２℃，２時間振盪した。
又、ハイブリダイゼーション溶液中の２０ｎｇ／ｍｌ
Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦをｐＢＲ３２２に置き換えたものを
コントロールとして、同様に反応させた。

【０１２８】（４）凝集反応による吸光度変化の測定 この溶液の波長５５０ｎｍにおける吸光度の変化を調べ
るため、反応直後、及び反応から２時間後の吸光度を測
定した。結果は、表１１に示した。

【０１２９】

【表１１】

【０１３０】

【実施例１２】カルボコートＰＥＴフィルムに固定した
オリゴペプチドのＥＬＩＳＡ検出 （１）カルボコートＰＥＴフィルム上へのヒトＡＣＴＨ
の固定 カルボジイミド化合物溶液１〜４、６、１０〜１３で被
膜したＰＥＴフィルムと被膜していないＰＥＴフィルム
にヒトＡＣＴＨ溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．
０））をそれぞれ３ドットずつスポットし、室温で１０
分間固定した。

【０１３１】（２）抗原抗体反応によるヒトＡＣＴＨの
検出 （ａ）ブロッキング ブロッキング溶液（３％ ゼラチン，２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５），０．５Ｍ ＮａＣｌ）中で３
０分間、２５℃でブロッキングした。

【０１３２】（ｂ）抗原抗体反応 アルカリファスファターゼ標識した抗ＡＣＴＨ―ヤギＩ
ｇＧ溶液（１％ゼラチン，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５），０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ２０）中で２時間、３７℃でインキュベートし
た。未反応の抗体を、洗浄液１で１０分間ずつ３回洗浄
して除去した後、洗浄液２（２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５），０．５Ｍ ＮａＣｌ）で置換した。

【０１３３】（ｃ）発色操作 基質用緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．
５），０．１Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）１
ｍｌにＢＣＩＰ溶液（５０ｍｇ ５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルフォスフェート，９００ｍｌジチル
フォルムアミド）３．２μｌとＮＢＴ溶液（５０ｍｇニ
トロブルーテトラゾリウム，１．８ｍｌ７０％エタノー
ル）６．４μｌを混合した溶液を加え、室温で３時間発
色させた。結果は表１２に示した。

【０１３４】

【表１２】 ○：発色した ×：発色しない

【０１３５】

【発明の効果】本発明により、タンパク質、核酸などの
活性物質の検出において重要な担体への固定化を、簡
便、効率的にかつ強固に行うことができる。

【０１３６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ GAATTCGAGG GTACCCGGGG ATCCTCTAGA

【０１３７】配列番号：２ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ CTAGAGGATC CCCGGGTACC CTCGAATTC

【０１３８】配列番号：３ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ AGCTAGCTAG CTAGCTAGCT AGCTAGCTAG

【０１３９】配列番号：４ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ CAAGCTTGCA TGCCTGCAGG TCGACTCTAG AGGATCCCCT

【０１４０】配列番号：５ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ CTGACTGACT GACTGACTGA CTGACTGACT GACTGACTGA

【０１４１】配列番号：６ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ACCTCCGGCT TAGGTTGGGT TATATAACTA TATGTAAAT

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡田 小苗 東京都足立区西新井栄町１−18−１日清紡 績株式会社東京研究センター内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 担体に固定化された生物学的に活性な第
   １の物質と、この第１の物質に特異的に結合し得る第２
   の物質とを反応させ、 前記第１の物質と第２の物質との結合を介して担体に間
   接的に結合した第２の物質又は結合しない第２の物質を
   検出することにより、試料中の第１の物質又は第２の物
   質を分析する方法において、 前記担体はカルボジイミド基を２〜１００個有する化合
   物を含み、前記第１の物質はカルボジイミド基を介して
   担体に固定化されることを特徴とする、生物学的に活性
   な物質の分析法。
2. 【請求項２】 前記第１の物質と第２の物質とを反応さ
   せる際に、さらに標識物質で標識された第２の物質を反
   応系に加えることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記第１の物質と第２の物質とを反応さ
   せた後に、第２の物質に特異的に結合し得る第３の物質
   を反応させることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 前記第３の物質が標識物質で標識された
   請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 前記第１の物質は核酸であり、第２の物
   質はこの核酸の塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を
   有する核酸である請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 前記第１の物質は、タンパク質、ペプチ
   ドまたはその他の抗体結合性物質であり、第２の物質は
   これに特異的に結合し得るタンパク質、ペプチドまたは
   その他の抗体結合性物質である請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 前記担体が乳濁状である請求項１記載の
   方法。
8. 【請求項８】 カルボジイミド基を有する化合物の分子
   量が、１０００以上、１００，０００以下である請求項
   １記載の方法。
9. 【請求項９】 標識物質が、放射性物質、蛍光物質、酵
   素、色素、化学発光物質、ビオチン、アビジン、ストレ
   プトアビジン及びジゴキシゲニンから選ばれる請求項２
   又は４記載の方法。