JPH0843394A

JPH0843394A - 多層乾式イムノアッセイ要素およびイムノアッセイの実施方法

Info

Publication number: JPH0843394A
Application number: JP7073194A
Authority: JP
Inventors: Robert T Belly; ティー．ベリーロバート; Caroline Erdrich; エードリッチキャロライン; Richard C Sutton; シー．サットンリチャード
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 1996-02-16
Anticipated expiration: 2016-06-25
Also published as: EP0675362A2; DE69518936T2; ATE196689T1; EP0675362A3; US6090568A; JP3179673B2; DE69518936D1; EP0675362B1

Abstract

(57)【要約】【目的】多層乾式イムノアッセイ要素およびイムノア
ッセイ方法を提供する。【構成】前記多層乾式イムノアッセイ要素は、１）試
料塗布領域および信号読み取り領域を有する展開層、
２）分離レセプター層、ならびに３）輻射線透過性支持
体を、前記支持体上に前記展開層および前記レセプター
層が存在するように含んでなる。また、前記展開層が光
吸収性物質を含むことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床化学、特にイムノ
アッセイ要素および方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】自然の免疫学的反応の利点を利用したイ
ムノアッセイは、臨床化学における分析技法として広範
な用途が見出されてきた。反応の特異性により、それら
は、生物学的流体中に非常に低濃度で存在する生物学的
被分析物を定量する際に、特に有利である。そのような
被分析物としては、例えば、抗原、抗体、治療薬、麻
薬、酵素、ホルモンおよびタンパク質などが挙げられ
る。アッセイの標的である被分析物は本明細書ではリガ
ンドと称され、そして標識した被分析物は標識リガンド
（そのようなリガンドの免疫競合誘導体類および類似体
類を包含する）と称される。リガンドおよび標識リガン
ドを特異的に認識し、そしてそれらと反応して複合体を
形成する化合物は、本明細書ではレセプターと称され
る。レセプターおよびリガンドもしくは標識リガンド
は、接合ペアを構成する。ペアの構成部分のいずれも
が、レセプターもしくはリガンドとして機能できる。

【０００３】競合バインディング・イムノアッセイで
は、標識リガンドが、一定量の適当なレセプターとの反
応について、標識されていないリガンドとの競争状態に
置かれる。結合したかあるいは結合していない（すなわ
ち、遊離の）標識リガンドのいずれかの信号を測定し、
それから未知濃度のリガンドを求めることができる。反
応は以下のように進行する。リガンド＋標識リガンド＋レセプター＜＝＞リガンド−レセプター＋標識リガンド−レセプター

【０００４】通常、サンドイッチ・アッセイと称される
別のタイプの免疫学的アッセイでは、リガンド（抗体も
しくは抗原被分析物）をレセプターと接触させて、リガ
ンドをレセプターに対して結合させる。次いで、この複
合体を、結合したリガンドと反応する標識結合剤、例え
ば、抗体の溶液と接触させる。従って、結合した標識結
合剤の量が、結合したリガンドの量に直接比例する。乾
式イムノアッセイ分析要素は既知である。一般的には、
そのような要素は、粒状層に固定化されたレセプター
類、例えば、リガンドについての抗体類を含んでなる。
さらに、要素は、一般的には、結合したかまたは結合し
ていない種との相互作用を介して、試料中のリガンドの
濃度に相関させることができる信号を提供する試薬系を
含む。使用に際して、試料は、酵素標識リガンドと手で
混合されて、要素に塗布される。その後、標識リガンド
の基質を含む洗浄溶液を粒状層に塗布する。基質は酵素
標識により触媒されて、最終的に信号、例えば、化学ル
ミネセンスを発生する反応生成物を生成して、試料中の
リガンドの濃度に相関させることができるものを発生さ
せる。信号発生システムは、別の既知である従来の標
識、例えば、放射性タグ、発色団、発蛍光団、安定な遊
離ラジカル、ならびに酵素補因子、阻害剤およびアロス
テリック・エフェクターに関して知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】血清試料のイムノアッ
セイで生じる１つの問題は、赤血球溶解で生じるヘモグ
ロビンの存在により引き起こされるバックグラウンド干
渉である。ヘモグロビンは疑似ペルオキシダーゼであ
る。このように、それは、ペルオキシダーゼ酵素標識と
同様に、ロイコ色素もしくは化学ルミネセンス化合物前
駆体の酸化を触媒してバックグラウンド信号を生成す
る。このバックグラウンド信号は、精密さおよび正確さ
を欠くアッセイ結果を与える。この問題は、多くの診断
的に重要な血清ホルモンおよび癌マーカーのためにピコ
モル濃度での検出および定量が要求されるとき、さらに
重大なものになる。ピコモル濃度で血清中に存在する医
学的に重要なホルモンの中には、アルドステロン、イン
スリン、ＴＳＨ、アンジオテンシン、オシトシン、副甲
状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン、ＡＣＴＨおよ
びバソプレシンがある。ピコモル濃度で存在する血清被
分析物についてのイムノアッセイを実施するために、高
感度検出化学現象、例えば、蛍光もしくは化学ルミネセ
ンスが必要とされる。このタイプの検出化学現象の感度
ゆえに、血清試料中に存在する溶解したヘモグロビン、
結合していない標識もしくは化学干渉体によるバックグ
ラウンドを、徹底的に除去しなければならない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、１）試料塗布
領域および信号読み取り領域を有する展開層、２）分離
レセプター層、ならびに３）輻射線透過性支持体を、前
記支持体上に前記展開層および前記レセプター層が存在
するように含んでなる多層乾式イムノアッセイ要素であ
って、前記展開層が光吸収性物質を含むことを特徴とす
る多層乾式イムノアッセイ要素を提供する。この要素
は、特に化学ルミネセンス検出および測定を使用するア
ッセイについて、血清試料中のヘモグロビンにいより引
き起こされる干渉を著しく低減することにより、信号対
ノイズ比を増大する。吸収性物質の分離層が、（ａ）展
開層と接触状態であり、（ｂ）展開層中の試料塗布領域
の周囲に隣接して配置され、そして（ｃ）信号読み取り
領域から、可溶性干渉体および結合していない標識を含
む洗浄流体を吸収するとき、前記要素は、約１ナノモル
未満の濃度で存在するリガンドについてのイムノアッセ
イに特に有用である。

【０００７】

【具体的な態様】ビーズ展開層を包含する有用な展開層
は、米国特許第 4,670,381号、同第 4,258,001号および
同第 4,430,436号明細書に開示されている。特に有用な
展開層は、米国特許第 4,258,001号明細書に記載される
オルガノ−ポリマー粒子およびそれらの粒子用のポリマ
ー接着剤により形成される粒状構造を有するものであ
る。一般的には、展開層に有用なオルガノ−ポリマー粒
子は、直径約10〜40μｍの範囲内もしくは幾分小さい粒
子サイズを有する、熱安定性で球状のビーズである。試
料塗布領域は、信号が展開層の最上部から読み取られる
本発明の態様では、信号読み取り領域として役立つ。信
号が要素の裏側から読み取られる態様では、信号読み取
り領域は、展開層の上か、レセプター層と展開層との間
か、試料塗布領域の正反対の所に配置される。

【０００８】光吸収性物質を含む粒子もしくはビーズを
10〜100 パーセント、好ましくは50〜100 パーセント含
むような展開層は新規でありかつ明白なものではない。
光吸収性物質としては、所望の波長の光を吸収するよう
に作られた、カーボンブラック、色素類および顔料類が
挙げられる。粒子もしくはビーズは、必要な性質を有す
る、天然および合成ポリマー類の両方を包含する多種多
様な有機ポリマー類から構成できる。好ましくは、しか
しながら、それらは、前記特許に記載された１つ以上の
追加のポリマーから構成される。

【０００９】分離レセプター層は、調製されて輻射線透
過性支持体の上に被覆される。分離輻射線反射性層を、
展開層とレセプター層との間に被覆して、支持体を通し
てモニターされる信号領域を改良することができる。レ
セプターは、レセプター上の表面反応性基（親核性遊離
アミノ基およびスルフヒドリル基）を介してポリマー粒
子に共有結合させることができる。小さなポリマービー
ズにレセプターを付着させるための一般的な方法として
は、周知反応を用いて選ばれたレセプターをビーズに共
有結合させることが挙げられる。数多くのペンダント
基、例えば、ハロアルキル、２−置換活性化エチルスル
ホニルおよびビニルスルホニルを用いて、レセプターを
ビーズに直接付着させることができる。一般的には、ビ
ーズが、水性緩衝液（一般的にはpH約５〜約10）中のレ
セプターおよび濃度約 0.1〜約40重量パーセントのポリ
マー粒子（好ましくは約 0.1〜約10重量パーセント）と
混合される。レセプターの量は、ポリマーに対する比が
約 0.1:1000 〜約1:10、そして好ましくは約1:100 〜約
1:10である。混合処理は、約５〜約50℃、好ましくは約
５〜約40℃の範囲内の温度で、約0.5〜約48時間実施さ
れる。いずれかの適当な緩衝剤が使用できる。

【００１０】幾つかの場合では、外表面上のペンダント
反応性基を、リガンドを共有結合させるために修飾また
は活性化しなければならない。例えば、カルボニル基
は、1992年７月22日に発行されたEP 308235 および米国
特許第 5,155,166号明細書に記載される既知カルボジイ
ミドもしくはカルバモイルオニウムの化学的作用、また
は米国特許第 5,266,500号明細書から既知であるジカチ
オンエーテルを用いて活性化しなければならない。しか
しながら、カルボキシル基含有単分散ポリマー・ビーズ
へのレセプターの付着は、２つの段階で実施される。第
１段階は、粒子の水性懸濁液をカルボジイミドもしくは
カルバモイルオニウムまたはジカチオンエーテル化合物
と接触させて、カルボキシル基の代わりに中間反応性基
を有する反応性中間ポリマー粒子を生成することを含
む。この段階は、所望のpHを提供するために適当な酸も
しくは緩衝剤を用いて、適当なpHで実施される。一般的
には、pHは６未満であるが、しかしこれは反応が進行で
きる限り、決定的ではない。より適当なpHは、約 3.5〜
約７の間である。カルボジイミドもしくはカルバモイル
オニウムまたはジカチオンエーテル化合物対粒子の表面
上のカルボキシル基のモル比は、約10:1〜500:1であ
る。

【００１１】前記方法の第２段階では、第１段階で形成
された反応性中間体を、反応性アミンもしくはスルフヒ
ドリル基含有レセプターと接触させる。それによって、
粒子とレセプターとの間に共有結合が形成される。レセ
プター対ポリマー粒子の重量比は、一般的には約1:1000
〜約1:1 、好ましくは約 1:100〜約1:10である。別の場
合には、外表面上のエポキシ基を加水分解して、臭化シ
アンと反応できるジオール化合物を形成し、それを免疫
学的種のアミン基についてのカプリング剤として作用さ
せることができる。アルデヒドは、アミンと直接反応し
てシッフ塩基（Schiff's base)を形成し、次いでそれを
還元して共有結合を形成できる。あるいは、アルデヒド
を酸に酸化して、カルビキシル基について先に記載した
化学現象を用いてアミド結合を形成できる。

【００１２】それぞれ、ポリマー上の反応性基と、また
はカルボジイミドもしくはカルバモイルオニウムまたは
ジカチオンエーテル化合物と粒子上のカルボキシル基と
の反応により形成された中間体（この場合には、ポリマ
ーが反応性カルボキシル基を有する）と反応するであろ
う、反応性アミンもしくはスルフヒドリル基をレセプタ
ーが含有する限り、いかなる反応性アミンもしくはスル
フヒドリル含有レセプターでもポリマー・ビーズに付着
できる。レセプター上のアミンもしくはスルフヒドリル
基と容易に直接反応する反応性基を有する小さなポリマ
ー・ビーズは、必要であれば適当な緩衝剤中で、単にレ
セプターと混合されると反応する。

【００１３】レセプターについてのビーズを選択できる
ポリマーとしては、以下のもの：ポリ（ｍ＆ｐ−クロロ
メチルスチレン）、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロ
ロメチルスチレン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレ
ート）（モル比67:30:3 ）、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆
ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）（モル比
95.5:4.5）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２
−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリル
アミド｝（モル比99.3:0.7）ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチ
ルスチレン−コ−メタクリル酸）（モル比95:5, 98:2,
および99.8:0.2）、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロ
ロエチルスルホニルメチルスチレン−コ−メタクリル
酸）（モル比93.5:4.5:2）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−
〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェ
ニル〕アクリルアミド−コ−メタクリル酸｝（モル比9
7.3:0.7:2）、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメ
チルスチレン）（モル比70:30 ）、ポリ〔スチレン−コ
−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モ
ル比97.6:2.4）、ポリ（スチレン−コ−塩化ビニルベン
ジル−コ−アクリル酸）（モル比85:10:5 ）、ポリ（ス
チレン−コ−アクリル酸）（モル比99:1）、ポリ（スチ
レン−コ−メタクリル酸）（モル比90:10 ）、ポリ（ス
チレン−コ−アクリル酸−コ−ｍ＆ｐ−ジビニルベンゼ
ン）（モル比89:10:1 ）、ポリ（スチレン−コ−２−カ
ルボキシエチルアクリレート）（モル比90:10 ）、ポリ
（メチルメタクリレート−コ−アクリル酸）（モル比7
0:30 ）、ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−ビニルベンジ
ルアルデヒド）（モル比95:5）およびポリ（スチレン−
コ−ｍ＆ｐ−ビニルベンジルアルデヒド−コ−メタクリ
ル酸）（モル比93:5:2）が挙げられる。

【００１４】レセプター層についての好ましいポリマー
・バインダーは、カナダ特許第 1,240,445号明細書に大
体記載されており、それらは引用することにより本明細
書中に特に組み入れられる。有用なポリマーは、約30〜
97重量パーセントの重合Ｎ−アルキル置換アクリルアミ
ド、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含む、
冷却ゲル化（chill-gelable)ポリマーである。別の有用
なＮ−アルキル置換アクリルアミドとしては、Ｎ−ｎ−
ブチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミ
ドおよびＮ−ｎ−プロピルアクリルアミドが挙げられ
る。実施例では、60〜97重量パーセントの重合Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドを含むポリマー・バインダーを
用いて、これらのバインダーの有用性を明らかにしてい
る。また、ポリマー・バインダーは、約３〜25重量パー
セントの、１つ以上の、１分子当たり少なくとも２つの
付加重合可能な基を有する重合架橋モノマーを含んでな
る。これらの架橋モノマーは、一般的には当該技術分野
で周知である。好ましい架橋モノマーは、Ｎ−アルキル
置換アクリルアミドとの重合を促進する、アクリルアミ
ド基もしくはメタクリルアミド基を含む。

【００１５】有用な架橋モノマーの具体例としては、以
下のもの：Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド、
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスメタクリルアミド、エチレンジ
メタクリレート、２，２−ジメチル−１，３−プロピレ
ンジアクリレート、ジビニルベンゼン、モノ〔２，３−
ビス（メタクリロイルオキシ）プロピル〕ホスフェー
ト、Ｎ，Ｎ′−ビス（メタクリロイル）ウレア、トリア
リルシアヌレート、アリルアクリレート、アリルメタク
リレート、Ｎ−アリルメタクリルアミド、４，４′−イ
ソプロピリデンジフェニレンジアクリレート、１，３−
ブチレンジアクリレート、１，４−シクロヘキシレンジ
メチレンジメタクリレート、２，２′−オキシジエチレ
ンジメタクリレート、ジビニルオキシメタン、エチレン
ジアクリレート、エチリデンジアクリレート、プロピリ
デンジメタクリレート、１，６−ジアクリルアミドヘキ
サン、１，６−ヘキサメチレンジアクリレート、１，６
−ヘキサメチレンジメタクリレート、フェニルエチレン
ジメタクリレート、テトラメチレンジメタクリレート、
２，２，２−トリクロロエチリデンジメタクリレート、
エチレンビス（オキシエチレン）ジアクリレート、エチ
レンビス（オキシエチレン）ジメタクリレート、エチリ
ジントリメタクリレート、プロピリジントリアクリレー
ト、ビニルアロイルオキシアセテート、１−ビニルオキ
シ−２−アリルオキシエタン、２−クロトノイルオキシ
エチルメタクリレート、ジアリルフタレート、および２
−（５−フェニル−２，４−ペンタジエノイルオキシ）
エチルメタクリレートが挙げられる。

【００１６】レセプター層に好ましい前記ポリマー・バ
インダーは、０〜60重量パーセントの重合親水性モノマ
ーを含むことができる。 0.5〜35重合パーセントの量が
有用である。親水性モノマーは、カナダ特許第 1,240,4
45号明細書に開示されている。特に、そのようなモノマ
ーは、ヒドロキシ、ピロリドン、アミン、アミド、カル
ボキシ、スルホ、カルボキシレート塩、スルホネート塩
およびスルフェート塩基より選ばれる１つ以上の基を有
する。一般的には、塩基の対イオンは、アルカリ金属も
しくはアンモニウムである。有用な親水性モノマーは、
アクリル酸およびメタクリル酸ならびにそれらのナトリ
ウム塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスル
ホン酸ナトリウム、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロ
キシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルメ
タクリレートおよびグリセリルメタクリレートである。

【００１７】レセプター層に有用なポリマー・バインダ
ーとしては、・ポリ（ビニルアルコール）；・ウシ血清アルブミン；・アラビアゴム； 8000〜400,000 の範囲内の分子量を有するポリ−Ｎ−ビ
ニルピロリドンのホモポリマー；ならびに・アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキル置
換アクリルアミド、Ｎ−アルキル置換メタクリルアミ
ド、１−ビニルイミダゾール、２−アルキル置換−１−
ビニルイミダゾール、２−ヒドロキシアルキル置換−１
−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロ
キシアルキルアクリレート、ヒドロキシアルキルメタク
リレート、アクリル酸およびメタクリル酸からなる群よ
り選ばれる、２つ以上のモノマーを有する水溶性ビニル
付加コポリマー（ここで、コポリマー中のアルキルおよ
びヒドロキシアルキルは１〜６個の炭素原子を有する。
例えば、メチル、エチル、プロピルおよびヘキシルであ
る）；が挙げられる。

【００１８】12μＬを越えて約 100μＬまでの大量の洗
浄容量を添加する本発明の態様は、分離吸収性層を含ん
でなる。この吸収性層は、低レベルの被分析物について
のアッセイにおける偽陽性もしくは偽陰性の結果を最低
限におさえる。図１には、符号１０として、一般的に吸
収性層を備えた本発明の要素の態様が示されている。要
素は、輻射線透過性支持体１３の上に置かれたレセプタ
ー層１４を含んでなり、そして展開層１７と接触状態で
ある吸収性物質１６に試料塗布領域１５を有する。吸収
性層は、試料塗布領域１５の周囲の少なくとも一部分に
隣接して配置されている。光吸収性手段は、分離吸収性
層に包含させることができる。分離吸収性層は、薄型フ
ィルム・イムノアッセイを実施する際の洗浄容量を実質
的に増大させることができる。これは、結合していない
標識および可溶性干渉体を信号読み取り領域から除去す
ることにより、アッセイの感度を増強する。この態様で
は、読み取る信号が輻射線透過性支持体の前に置かれた
反射率計で読み取られるであろうから、信号読み取り領
域はレセプター層と展開層との間に配置される。吸収性
物質は、その物質が液体を吸収できる限り、例えば、ガ
ラス・マイクロファイバー、紙、スポンジ、織物および
プラスチックなどからなることができる。液体を吸収す
る能力は、吸収性物質を、例えば、さらなる吸収性増強
剤、例えば、湿潤剤で予備処理することにより、または
官能基の導入により影響を受けるかもしれない。所望に
より、吸収性物質の信号読み取り領域に直接隣接する領
域の回りを、パラフィンもしくは別の水不浸透性物質で
目止め（seal）をすることができる。これは、流体がマ
トリックスを介して浸透する前に吸収されないようにす
ることによって、洗浄効率を増大するかもしれない。

【００１９】図１の態様では、分析要素１０は、少なく
とも１つの多孔質展開層を含んでなる。展開層が、粒
子、繊維もしくはポリマー鎖の間の相互に連結した空間
もしくは孔により生じた多孔性が、層の各方向で同じで
あることを意味する、等方性多孔質であることは望まし
い。ある具体的な態様では、分離吸収性層を備えた分析
要素を用いてイムノアッセイを実施する際に、血清の試
料もしくは別流体が、展開層の試料塗布領域にスポット
される。インキュベーション期間の後、免疫学的バイン
ディング反応を引き起こしてから（すなわち、競合もし
くはサンドイッチ・アッセイ）、試料塗布領域を約 250
μＬまでの洗浄溶液を用いて好ましくは10μＬ／秒まで
の、最も好ましくは１μＬ／秒の測定速度で洗浄する。
検出溶液が洗浄溶液として使用されることが好ましい。
しかしながら、信号発生性基質は、洗浄段階の後に別個
の流体として添加できる。湿潤させる際に、要素の吸収
性物質は、試薬マトリックスの信号読み取り領域から可
溶性干渉体および結合していない標識を含有する洗浄流
体を吸収し、それにより、信号読み取り領域からバック
グラウンド干渉を低減する。さらに、吸収性物質と関連
がある光吸収性手段は、信号読み取り領域の外から標識
および別の干渉体を洗浄して除去することにより、発生
したバックグラウンド信号を吸収または遮断し、それに
よって、透明な支持体を介してモニターされる信号読み
取り領域にバックグラウンド信号が逆行することを防止
する。これは、イムノアッセイの効率および感度を増強
する。その後、検出信号（すなわち、化学ルミネセン
ス、蛍光もしくは比色）を測定して被分析物の濃度が求
められる。

【００２０】酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、発色団、蛍光および化学ルミネセンス化合物で標識
したリガンドは、蛍光、紫外線分光光度計もしくは別の
分光測光手段により直接測定可能である。標的リガンド
を検出および測定する際にそのような標識を用いる方法
は、当業者らに周知である。具体的な効果については、
好ましい検出化学現象が、以下の反応に従って化学ルミ
ネセンスを増強する。

【化１】ここで、ＥＴＡ（電子移動剤）はアニリンもしくはフェ
ノール、例えば、４′−ヒドロキシアセトアニリド
（４′−ＨＡ）であり、そしてＨＲＰは西洋ワサビペル
オキシダーゼである。

【００２１】分離レセプター層中のレセプターにより認
識された標識リガンドもしくはリガンド類似体は、使用
する前に展開層に組み入れられるか、またはアッセイの
ときに添加されうる。好ましくは両者が、使用する前に
展開層に組み入れられる。イムノアッセイは、手動であ
っても、または自動であってもよい。一般的には、液体
中のリガンドの量は、供給ロール、チップ・パケットも
しくは別の供給源から要素を取り出し、そして展開層の
限定領域を液体、例えば、１〜100 μＬの試料と物理的
に接触させることにより求められる。接触させる限定領
域は、一般的には約 150mm²を越えない。

【００２２】要素は、適当な輻射線透過性支持体の上に
置かれており、そして当該技術分野で周知であるよう
に、それを通してイムノアッセイ信号が検出され定量さ
れる。支持体は、いずれか適当な寸法安定性であり、そ
して好ましくは、約 200〜約900nm 間の波長の電磁輻射
線を透過する、非孔質かつ透明な（すなわち、輻射線透
過性）物質である。特定の要素について選択される支持
体は、目的の検出モード（反射、透過もしくは蛍光分光
光度計）に合うものでなければならない。有用な支持体
材料としては、ポリスチレン、ポリエステル類〔例え
ば、ポリ（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネ
ート類、セルロースエステル類（例えば、酢酸セルロー
ス）などが挙げられる。以下の実施例は、光吸収性手段
を含む展開層の有効性を具体的に示すものである。実施
例の要素および溶液に用いた材料の名称および頭字語
は、以下の意味を有する。

【００２３】トリス（Tris）：トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン緩衝剤。ＤＴＰＡ：ジエチレントリアミン五酢酸。ポリマー接着剤：ポリ（メチルアクリレート−コ−２−
アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリ
ウム−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト）抗ＴＳＨ捕捉抗体／ビーズ：ポリマーのカルボキシル基
と抗体のアミン基とから形成されたアミド基を介してポ
リマー粒子に抗ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）捕捉抗体
を結合させたポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベ
ンジルチオプロピオン酸）〕のラテックス・ポリマー粒
子。ポリマー・バインダー：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパ
ンスルホン酸ナトリウム−コ−Ｎ，Ｎ′−メチレンビス
アクリルアミド）（重量比80/10/10）のミクロゲル。トリトン（Triton) X-100 ：Union Carbide Chem. and
Plastics Co.市販のオクチルフェノキシポリエトキシエ
タノール界面活性剤（TX-100）。硬化剤：ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル（BV
SME ）。ＣＴＡＣ：Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモ
ニウムクロリド。

【００２４】

【実施例】実施例１幾つかの機械コーティング要素を調製して、ヘモグロビ
ンの吸収におけるブラック・ビーズを含む展開層の効果
を評価した。要素は、以下の一般的な構造および組成を
有するものであった。

【００２５】

【表１】

【００２６】前記配置および成分に従う５つの要素を調
製した。また、各要素は、本明細書に先に記載したとお
り展開層の上にそれと接触状態で位置する分離吸収性層
を含むものであった。得られた要素は、図１に従う配置
を有した。要素は、ビーズ展開層中のポリマー・ビーズ
に従って互いに異なるものであった。異なるビーズは以
下に記載する。Ａ．すべて平均直径約30μｍのポリ（ビニルトルエン−
コ−メタクリル酸）のホワイトビーズ（PVM-W ）。Ｂ．Ａのホワイト（PVM-W ）ポリマー粒子（50％，付着
量65g/m²）およびカーボンブラック 1.4％を混合した同
型のポリマー・ビーズ（PVM-B ）（50％，付着量65g/
m²）の混合物。Ｃ．Ａのホワイト（PVM-W ）ポリマー・ビーズ（50％，
付着量65g/m²）およびカーボンブラック 1.4％を混合し
かつ平均粒子サイズ約24μｍのポリ（スチレン−コ−メ
タクリル酸）（99/1）ビーズ（PS-B）（50％，付着量65
g/m²）の混合物。Ｄ．すべて前記Ｃに記載したブラック（PS-B）ビーズ。Ｅ．すべて前記Ｂに記載したブラック（PVM-B ）ビー
ズ。

【００２７】本実施例で使用するために、以下の溶液を
提供した。血清：GIBCO より購入した。ヘモグロビン／血清溶液：メトヘモグロビン75％を含む
ヘモグロビン（SigmaChemical Co., cat. H7379）を、
蒸留水で10mg/mL に再構成した。アリコートを凍結保存
し、そして使用する１時間前にヤギ血清で 100mg/dL に
希釈した。化学ルミネセンス（ルミノール）信号試薬／洗浄流体を
使用時に調製した：トリス，pH8.0 0.05Ｍルミノール１ｍＭ３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトニトリド 150
μＭ過酸化水素２μＭＤＴＰＡ 100μＭＣＴＡＣ 0.1％

【００２８】方法各要素の展開層に、ヘモグロビン／血清溶液10μＬをス
ポットし、次いで５分間37℃で水浴にセットされたカバ
ーをかけた湿性ペトリ皿中でインキュベーションした。
ヘモグロビンは、ビーズ展開層の成分に結合する。次い
でスライドを、新たに調製した化学ルミネセンス信号試
薬／洗浄溶液 100μＬで、洗浄速度 1.0μＬ／秒で洗浄
した。インキュベーション後、塗膜をスライド台から取
り外して、それをルミノメーターに適合させ、そして要
素由来の化学ルミネセンス（ＣＬ）をTurner Model TD2
0E ルミノメーター (luminometer)で測定した。測定
は、１分間時間を隔てて４分間に渡って５回読み取り、
その第１回目はゼロ時間に読み取った。各回の読み取り
は、10秒間の積分（10-second integration)である。デ
ータ集成（data workup)には４分間の読み取りが用いら
れている。結果を第Ｉ表に示す。

【００２９】

【表２】

【００３０】ブッラク・ビーズのいずれかをすべて（ 1
00％）含有する展開層（塗膜ＤもしくはＥ）は、同程度
によく働き、ヘモグロビン信号の96％を吸収する（４％
は検出可能である）。50％のみブラック PS-B ビーズを
含有する塗膜（塗膜Ｃ）は、50％のみブラック PVM-Bビ
ーズを有するもの（塗膜Ｂ）よりも優秀であった。恐ら
く、それらの高いカーボンブラック添加量によるのであ
ろう。

【００３１】実施例２洗浄容量の増加による有害な作用を低減するために、ビ
ーズ展開層にブラック・ビーズを使用した。イムノアッ
セイの感度は、アッセイ中に結合していない標識および
干渉体をより効率よく除去することにより増強できる。
もちろん、この最も明白な実施方法は、インキュベーシ
ョン段階の後に、大量の洗浄容量で洗浄することによる
ものである。しかしながら、本発明者らは、洗浄流体が
ルミノールおよびＨ₂Ｏ₂を含むため、大量の洗浄容量
を用いると強力なバックグラウンド信号が伴うことに気
付いていた。この実施例は、大量の洗浄容量がイムノア
ッセイで使用されるときに、ブラック・ビーズ展開層が
バックグラウンドを調節するのを思いがけなく助けるこ
とも示している。

【００３２】実施例１におけるように、２組の要素を調
製した。一方の要素は、実施例１でＡとして示したホワ
イト・ビーズ（ホワイトBSL ）を有する機械コーティン
グ展開層を含んでなるものであった。もう一方の要素
は、実施例１でＥとして示したブラック・ビーズ（ブラ
ックBSL ）を有する手動コーティング展開層を含んでな
るものであった。他の点では、要素は同じであった。各
要素を、実施例１に記載した化学ルミネセンス信号試薬
／洗浄溶液で、速度１μＬ／秒で、各要素について異な
る洗浄容量で洗浄して、洗浄容量に基づく一連の各要素
について実施した。化学ルミネセンスを実施例１におけ
るように読み取った。結果を、第II表に報告する。ブラ
ック・ビーズ展開層についてのバックグラウンド信号が
非常に低く、そして洗浄容量の増加に対して比較的平ら
なままであることが示されている。一方、ホワイト・ビ
ーズ展開層のバックグラウンド信号は、最初から非常に
高く、洗浄容量の増加に伴ってより高レベルに増加す
る。

【００３３】

【表３】

【００３４】実施例３ホワイト・ビーズ展開層に対するブラック・ビーズ展開
層を備えた多層イムノアッセイ要素を用いる甲状腺刺激
ホルモン（ＴＳＨ）についての化学ルミネセンス・サン
ドイッチ・アッセイ実施例２のホワイト・ビーズ展開層あるいは実施例２の
ブラック・ビーズ展開層のいずれかを有する要素を、こ
れらの要素が展開層とゲル・パッドとの間に配置された
分離レセプター層を含むことを除いて、実施例１におけ
るように調製した。レセプター層は、以下の組成を有す
るものであった。

【００３５】

【表４】

【００３６】以下の試薬を本実施例について提供した。ＴＳＨアッセイについてのAmerlite較正試薬Ｂ〜Ｆ：較正試薬濃度（mIU/L) Ｂ 0.125 Ｃ 0.75 Ｄ 4 Ｅ 20 Ｆ 100 抗ＴＳＨ抗体／ＨＲＰ接合体：この試薬は、0.01％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝溶液
（ＰＢＳ）で５×10^-9Ｍに希釈した、約 0.223mg/mL
（ 1.5×10^-6Ｍ）の濃度で西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）に共有結合させた抗ＴＳＨ抗体の接合体であ
る。

【００３７】化学ルミネセンス（ルミノール）信号試薬
／洗浄流体：この試薬／洗浄溶液は、まさに実施例１と
同じ方法で調製して使用した。ヘモグロビン：水へのSigma H7379 （ヘモグロビン）の
10mg/mL の保存溶液を、Amerlite ＴＳＨ較正試薬Ｂで
100mg/dL に希釈した。ＴＳＨアッセイ：抗体／ＲＨＰ接合体（４μＬ）を、36
μＬのＴＳＨ較正試薬の１つ（最終接合体濃度は５×10
^-10Ｍであった）に添加して混合した。10μＬの混合物
を直ちに要素の１つにスポットした。次いで要素を、37
℃の水浴にセットしたペトリ皿で10分間37℃でインキュ
ベーションした。次いで要素を、信号／洗浄試薬 100μ
Ｌで速度 0.8μＬ／秒で洗浄した。得られた化学ルミネ
センスを、実施例１におけるようにルミノメーターで要
素から読み取った。結果を第III表に示す。

【００３８】

【表５】

【００３９】較正試薬Ｂの濃度はあまりに低かったの
で、これは信号／ノイズ比の計算値がゼロであると見な
した。ブラック・ビーズ展開層を有する要素が高い信号
対ノイズ比を与えたことは、第III 表から明らかであ
る。第III 表のデータを用いて用量／応答曲線を作成し
た。ブラック・ビーズ展開層についての用量／応答曲線
の傾斜がホワイト・ビーズ展開層についての用量／応答
曲線の傾斜より低かったとはいえ、前者の要素はより良
好な感度を提供した。本発明者らが検出限界をバックグ
ラウンドの２倍に制限するとき（第III 表：ブラック＝
２×0.214 ＣＬ単位、ホワイト＝２×5.9 ＣＬ単位）、
ブラック・ビーズ要素は２mIU/L の検出限界を有し、そ
してホワイトは５mIU/L の検出限界を有する。これは、
ホワイト・ビーズ展開層を越えるブラック・ビーズ展開
層の信号対ノイズ比における著しい改良を示すものであ
る。本発明を、それらの好ましい態様を特に参照して詳
細に記載してきたが、変更および修正が本発明の精神お
よび範囲内で可能であることは理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、分離吸収性層を有する本発明の態様で
ある。

【符号の説明】

１０…要素１３…輻射線透過性支持体１４…レセプター層１５…試料塗布領域１６…吸収性物質１７…展開層

フロントページの続き (72)発明者キャロラインエードリッチアメリカ合衆国，ニューヨーク 14450, フェアポート，キングスレイシーウェイ 49 (72)発明者リチャードシー．サットンアメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，トワイライトドライブ 24

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１）試料塗布領域および信号読み取り領
域を有する展開層、２）分離レセプター層、ならびに３）輻射線透過性支持
体を、前記支持体上に前記展開層および前記レセプター
層が存在するように含んでなる多層乾式イムノアッセイ
要素であって、前記展開層が光吸収性物質を含むことを
特徴とする多層乾式イムノアッセイ要素。
【請求項２】前記展開層が光吸収性物質を含む粒子を
含む、請求項１に記載の要素。
【請求項３】前記粒子が 0.1〜300 マイクロメートル
のサイズを有するビーズの形である、請求項２に記載の
要素。
【請求項４】前記光吸収性物質がカーボンブラックで
ある、請求項２または３に記載の要素。
【請求項５】前記ビーズが展開層の10〜100 パーセン
トを占める、請求項３に記載の要素。
【請求項６】前記レセプター層と展開層との間に光反
射層を有する請求項３に記載の要素。
【請求項７】前記展開層の上に、（ａ）展開層と接触状態であり、（ｂ）展開層中の試料塗布領域の周囲に隣接して配置さ
れ、そして（ｃ）試料塗布領域から、可溶性干渉体および結合して
いない標識を含む洗浄流体を吸収する、吸収性物質の分
離層をさらに含んでなる、請求項１、２または３に記載
の要素。
【請求項８】前記吸収性物質が、信号読み取り領域の
外から洗い流した結合していない標識および別の干渉体
により発生した信号を吸収するための光吸収性手段も含
む、請求項７に記載の要素。
【請求項９】以下の段階、ａ）わずかピコモル量の被分析物を含むことが推測され
る試料を提供すること、ｂ）前記請求項のいずれか一項に記載の構造を有するイ
ムノアッセイ要素の展開層に、試料の一部分を塗布する
こと、ｃ）イムノアッセイ要素の展開層に、標識した被分析物
もしくは被分析物の類似体を塗布すること、ｄ）被分析物と、標識した被分析物もしくは被分析物の
類似体と、レセプター層中のレセプターとが反応するの
に十分な時間、要素をインキュベーションすること、ｅ）要素を十分な洗浄溶液で洗浄して、結合していない
標識した被分析物もしくは被分析物の類似体を展開層の
信号読み取り領域から除去すること、ｆ）化学ルミネセンス試薬溶液を展開層に塗布するこ
と、そしてｇ）ルミノメーターで化学ルミネセンスを読み取るこ
と、を含んでなり、被分析物がピコモル濃度で存在す
る、競合イムノアッセイの実施方法。
【請求項１０】以下の段階、ａ）わずかピコモル量の被分析物を含むことが推測され
る試料を提供すること、ｂ）前記請求項のいずれか一項に記載の構造を有するイ
ムノアッセイ要素の展開層に、試料の一部分を塗布する
こと、ｃ）イムノアッセイ要素の展開層の試料塗布領域に、被
分析物に対する標識した抗体を塗布すること、ｄ）被分析物と、標識した抗体と、レセプター層中のレ
セプターとが反応するのに十分な時間、要素をインキュ
ベーションすること、ｅ）要素を十分な洗浄溶液で洗浄して、結合していない
標識した被分析物もしくは被分析物の類似体を展開層の
信号読み取り領域から除去すること、ｆ）化学ルミネセンス試薬溶液を展開層に塗布するこ
と、そしてｇ）ルミノメーターで化学ルミネセンスを読み取るこ
と、を含んでなり、被分析物がピコモル濃度で存在する、サ
ンドイッチ・イムノアッセイの実施方法。