JPH0571230B2

JPH0571230B2 -

Info

Publication number: JPH0571230B2
Application number: JP61004185A
Authority: JP
Inventors: Juzo Udaka; Hideo Kamyama; Junichi Taniguchi; Keiji Adachi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-01-14
Filing date: 1986-01-14
Publication date: 1993-10-06
Also published as: JPS62164627A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な抗腫瘍性成分SPF10−10及び
その製法に関するものである。従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38−
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許
1163865号）、溶連菌の菌体を破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55−7014）などが知られてい
る。このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質（特公昭48−43841、特開昭51−
44617）及び分子量150000の糖蛋白質（特開昭58
−22026）が知られている程度である。本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍
性成分を溶出させる方法を鋭意研究したところ、
培養中にペニシリン又はその関連物質を添加する
ことによつて抗腫瘍性成分が培養液中に溶出する
ことを見出し（特開昭60−30677号）、培養液中か
ら生理活性物質SPF−１を分離するに至つたので
ある。（特開昭60−30689号）本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中から
より有効な成分を分離する目的で研究したとこ
ろ、本発明において、癌化白血球培養細胞L1210
（以下培養細胞L1210という）の生育を阻害し、
かつ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性の画
分であることにより特徴づけられる抗腫瘍性成分
SPF10−10を分離するに至つた。本発明の抗腫瘍性成分SPF10−10は元素分析、
呈色反応および赤外線吸収スペクトル等から糖を
含むペプチド様物質と考えられるが、紫外線吸収
スペクトルおよび赤外線吸収スペクトルから、既
知の抗腫瘍性物質とは、相違する新規な物質と認
められるものである。本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性成分SPF10−10生産菌を培養し、培養物から
抗腫瘍性成分SPF10−10を採取することを特徴と
する抗腫瘍性成分SPF10−10の製造法を包含する
ものである。本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性成分SPF10−10生産菌が広く使用で
きる。次に抗腫瘍性成分SPF10−10生産菌を記載
する。ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes） ATCC21060 ストレプトコツカス・エスピー
（Streptococcus sp.） ATCC21597 ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes） ATCC21546 ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes） ATCC21547 ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes） ATCC21548 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌の生育に適した培地であれば
任意の培地を使用できる。培養は、PH5.0〜8.0、好ましくは、6.1〜7.2で
あり、培養温度は、30〜40℃、好ましくは、35〜
37℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養
を行なうことができる。本発明においては、培養中に適当な時期に、ペ
ニシリンまたは、その関連物質を添加すること
が、抗腫瘍性成分SPF10−10の採取に重要な役割
をはたすことになる。ペニシリンまたは、その関連物質の添加時期
は、35〜37℃の培養で、対数増殖期にかかつて
後、３〜20時間の間、特に５〜10時間が好まし
い。その後１〜20時間、好ましくは３〜15時間培
養を継続することにより、培養中に抗腫瘍性成分
SPF10−10を多量蓄積させることができる。ペニシリンまたはその関連物質としては、すで
に知られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物
質であればいかなるものでもよいが、ペニシリン
Ｇが普通用いられる。添加量は、ペニシリンＧで
100〜7000単位／ml、好ましくは、300〜5000単
位／ml培養液程度で十分である。ストレプトコツカス属細菌のペニシリンまた
は、その関連物質の添加培養によつて得られた培
養液は遠心分離によつて菌体を除去し、濾液を得
る。濾液は、硫安を添加し、50〜90％飽和度の画
分を分取するか、もしくは、濾液は、限外濾過膜
を用いて濃縮する。得られた抗腫瘍性成分SPF10−10を含む硫安塩
析物は凍結状態で保存することもできる。この硫安塩析物から抗腫瘍性成分SPF10−10を
抽出するには、塩析物を緩衝液に溶解して用い
る。又、限外濾過膜を用いて得た濃縮液を、その
まま用いることもできる。この水溶液をDEAEセ
ルロースカラムに吸着させ、燐酸緩衝液を用いて
段階的に溶出させ、培養細胞L1210の生育を阻害
する活性画分を分取し、この活性画分をDEAEセ
フアデツクスＡ−25カラムに吸着させ、燐酸緩衝
液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させつ
つ溶出し、その非吸着部分及び塩化ナトリウム低
濃度部分を分取し、この分画部分を緩衝液に対し
て透析し、ゲル濾過材トヨパールHW−50Fカラ
ムに吸着させ、0.1M NaClを含む燐酸緩衝液で
溶出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応を調
べる。SPF10−10は、トヨパールHW50F下の排
除限界（以下Voと略す）付近のアンスロン硫酸
法による呈色反応でピークを形成する画分として
得ることが出来る。次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10
−10の凍結乾燥標品は、次の理化学的性質を示
す。１元素元析Ｃ 39.5〜43.5％Ｈ 5.8〜6.7％Ｎ 7.3〜10.4％Ｏ 46.9〜37.5％ Ash 0.5〜1.9％２分解点本物質は165℃で褐変し240℃になる
と黒色となり分解する。３比旋光度〔α〕²⁰ _D＝＋5゜〜＋30゜（Ｃ＝1.00）４紫外線吸収スペクトル本物質0.1％の水溶
液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示され
る。５赤外線吸収スペクトル第２図に示される。
3300cm^-1付近および1640cm^-1付近のペプチドに
よる吸収、又、840cm^-1の糖による吸収が認め
られ特徴的である。６塩基性、酸性、中性の区別本物質0.1％の
水溶液のPHは5.5〜6.0である。７物質の色淡褐色８呈色反応ローリー反応＋ビユーレツト反応＋ニンヒドリン反応＋アンスロン硫酸反応＋モーリツシユ反応＋システイン硫酸反応＋オルシン塩酸反応 − ９分子量ゲル濾過法による測定では分子量約
10000以上である。 10 溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ア
セトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロ
ロホルム、酢酸エチル等の溶剤には難溶又は不
溶である。次にインビトロにおける培養細胞L1210に対す
る抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法
による呈色反応の方法を示す。抗腫瘍活性の測定方法抗腫瘍活性の測定は、培養細胞L1210の生育阻
止率（IR％）の測定により行つた。 L1210細胞を10％FBS添加RPMI1640培地（５
mg／カナマイシン含有）に懸濁した。この培養
液0.5mlをフアルコン2058チユーブに注加し、細
胞数が１×10⁵cells／tubeになるようにした。次
いでこの培養液に所定量の標品（抗腫瘍性成分
SPF10−10）を目的濃度になるように培養液に溶
解した0.5mlを注加して、37℃で５％CO₂存在下
に培養した。標品を添加して48時間後にトリパン
ブルーによる染色をおこない、次式によりIR
（％）を算出した。 IR（％）＝(A)−各実験群の生細胞数／対照群の生細
胞数×100 ここで(A)とは対照群の生細胞数を示す。対照は標品を含まない培養液0.5mlを用い同時
に行つた。アンスロン硫酸法による呈色反応脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１mlに
２mlのアンスロン試薬（0.20grのアンスロンを
100mlの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混合
30分後、標品１mlに代えて脱イオン水１mlに２ml
のアンスロン試薬を注加した液を対照として
620nmで吸収を測定する。定量値はグルコースを
用いて同様に測定して得た検量式より求める。次に本発明の実施例を示す。実施例１ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）ATCC21060をBHI
培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養をお
こなつて得た種培養液を第１表に示す培地A1lに
接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培養を行
つた。第１表培地Ａマルトース 0.25％肉エキス 1.0％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.8、300回転／分で撹拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンG1000単位／ml培養液にな
るように添加して、培養を更に５時間継続した。
得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去し
た。培養濾液は、分画分子量10000の限外濾過膜
（米国、ロミコン社）を用いて、1.5に縮濃し
た。この濃縮液を、DEAEセルロースカラム（５
×70cm）に吸着させた後、10mM、PHを7.0の燐
酸緩衝液を用いて、洗浄し、次いで0.3M塩化ナ
トリウムを含む上記燐酸緩衝液を用いて、段階的
に溶出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽
性でかつ培養細胞L1210の生育を阻害する活性画
分を分取した。この活性画分をDEAEセフアデツクスＡ−25カ
ラム（7.5×50cm）に吸着させ、次いで上記燐酸
緩衝液で洗浄後塩化ナトリウム濃度を直線的に上
昇させて溶出を行い、培養細胞L1210に対して活
性のある部分を分取する。この溶出曲線は第３図
に示される。第３図において点線部分は非吸着部
分で、実線部分は塩化ナトリウム添加部分であ
る。Ａは培養細胞L1210生育阻害活性画分で、
MP−２（特開昭60−30689）生育阻害非活性画分
であり、Ｂは培養細胞L1210生育阻害非活性画分
で、MP−２生育阻害活性画分である。Ａの活性画分の溶出液を分画分子量10000の限
外濾過膜（ミリポア社）で30mlに濃縮する。この
濃縮液をトヨパールHW50Fカラム（5.0×100cm）
に吸着させ、次いで、上記燐酸緩衝液中に塩化ナ
トリウム0.1Mを含む溶液で溶出させ、アンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性の画分を分取した。
この溶出曲線は第４図に示される。第４図におい
て実線は全体の溶出曲線を示し、点線はアンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性部分の溶出曲線を示
している。ここで、Ｃはアンスロン硫酸法による
呈色反応陽性画分であるが、培養細胞L1210に対
する生育阻止活性を調べ活性の強いVo付近の、
アンスロン硫酸法でピークを形成するＤ画分を得
る。Ｄの画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品
は、抗腫瘍性成分SPF10−10であり1.70grを得
た。実施例２ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは300単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を10
時間継続した。この培養濾液に硫安を添加し50〜
90％飽和度の画分を分取する。透析により硫安を除き実施例１と同様に精製し
て抗腫瘍性成分SPF10−10 0.86grを得た。実施例３ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは3000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を３
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−10 1.93grを得た。実施例４ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第２表に示した培地Ｂを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−10 1.23grを得た。第２表培地Ｂマルトース 0.1％肉エキス 0.5％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％塩化ナトリウム 0.1％ PH＝7.2 実施例５ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第３表に示した培地Ｃを用いて実施例１と同様
に35℃で培養した。この場合、ペニシリンＧは
1000単位／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF10−10 0.92gr
を得た。第３表培地Ｃマルトース 0.1％肉エキス 0.5％ポリペプトン 0.5％カザミノ酸 0.3％酵母エキス 0.5％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.5 実施例６ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第４表に示した培地Ｄを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−10 0.73grを得た。第４表培地Ｄマルトース 0.25％カザミノ酸 0.3％酵母エキス 1.0％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.9 実施例７ストレプトコツカス・エスピーATCC21597を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF10−10 1.31grを得た。実施例８ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21546
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−10 1.45grを得た。実施例９ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21547
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−10 1.48grを得た。実施例 10 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21548
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−10 1.26grを得た。実施例 11 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、セフアロスポリンＣは
600μｇ／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF10−10 1.57gr
を得た。実験例１実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10−10
（以下、SPF10−10という）のインビトロにおけ
る抗腫瘍活性試験は、本文中に記載した抗腫瘍活
性の測定方法により行い、その結果を第５表に示
す。第５表 SPF10−10の抗腫瘍活性の結果 SPF10−10（mg／ml） IR％ 1.0 94.0 0.5 81.6 0.25 25.2 実験例２実施例１で得られたSPF10−10のインビボにお
ける抗腫瘍活性試験は、Crj；CD−１（ICR系、
雌性７週齢）マウスを使用して実施した。腫瘍細胞としては、Sarcoma−180腹水癌細胞
を用いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹
腔内に５×10⁵cells／マウス接種した。 SPF10−10は、癌細胞接種24時間後から、１日
１回５日間連続して腹腔内に投与し、その生存数
を観察しその結果を第６表に示す。第６表において、SPF10−10を目的濃度に調整
し、その1/2量はそのまま使用し、残り1/2量は、
沸ととう水中20分間加熱処理後投与した場合を最
下段に示した。

【表】実験例３実施例２で得られたSPF10−10の抗体産生能促
進試験を下記の方法により行つた。ヒツジ赤血球（SRBC）（以下、SRBCという）
は、Crj；CD−１（ICR系雌性５週齢）の尾静脈
に２×10⁷コ／マウス接種する。 SPF10−10は、SRBC接種前３日目から１日１
回３日間及びSRBC接種後１日目から１日１回３
日間合計６回腹腔内に投与する。抗血清は、SRBC投与18日目にマウス心臓から
採血し調整する。抗体産生活性は、SRBCとの凝集反応及び補体
を加え、SRBCの溶血の２種類の方法で調べた。それぞれSRBCは、２×10⁸コ／mlを50μを用
い、又、抗血清は50μを用いた。抗血清は、２倍階段希釈法により希釈し、それ
ぞれの反応の生じる最大希釈倍数を求め、希釈係
数の平均値として表示し、第７表に示す。

【表】実験例４実験例２で得られたSPF10−10の固形癌に対す
る抗腫瘍活性試験は、Crj；CD−１（ICR系、雌
性５週齢）マウスを使用し実施した。固形癌細胞としては、Sarcoma180を用い、マ
ウス左大腿部皮下に５×10⁵cells／マウス接種し
た。 SPF10−10は、癌細胞接種24時間後から１日１
回５日間連続して腹腔内に投与し、癌細胞接種32
日目に、固形癌を切り取り、その重量を測定し
た。その重量の平均値を第８表に示す。

【表】実験例５実施例２で得られたSPF10−10のTNF誘導活
性の測定は、原中勝征；『TNF』日本医事新報社
（1984）を参考にして、下記の通り行つた。マウス（Crj；CD−１、ICR系、雌性７週齢）
の腹腔にBCG（日本ビーシージー製造協会）５mg
を接種し、（１次感作）、２週間後、SPF10−10を
尾静脈より投与し、（２次感作）、SPF10−10投与
２時間後心臓から採血し、血清を調整する。検定細胞は10％FBS添加RPMI1640培地（５
mg／カナマイシン含有）で３〜４日間培養した
L929細胞を用いる。 L929細胞は、１×10⁵cells／mlの懸濁液0.5mlを
フアルコン24wellsに注加する。ここに、上記血清を上記RPMI1640培地で20倍
希釈しその0.5mlを注加混合後、37℃ ５％
CO₂存在下48時間培養する。 TNF誘導活性の測定は、L929細胞をトリパン
ブルーで染色し、色素排除法で生細胞数を計測し
た。その結果を第９表に示す。

【表】実験例６実施例１で得られたSPF10−10のマクロフアー
ジの培養細胞Ｊ−774−１（以下、Ｊ−774−１と
略す）に対する変形活性の測定は、下記の通り行
つた。Ｊ−774−１は10％FBS添加RPMI640培地（５
mg／カナマイシン含有）で３〜４日培養後、10
×10⁴コ／mlに調整する。 SPF10−10は、生理食塩水で５mg／mlとし、
0.22μmの除菌フイルターで濾過し、10μずつ96
穴のwell（フアルコン）に２倍階段希釈法により
分注する。各wellに上記Ｊ−774−１懸濁液100μ注加
し、96時間37℃ ５％CO₂条件下で培養する。変形活性の測定は、各wellを倒立顕微鏡下観察
し、形態変化（球状から伸展し細長くなる）を誘
起する最少濃度を求めた。その結果を第10表に示
す。第10表 SPF10−10のＪ−774−１に対する変
形誘起最少濃度変形誘起最少濃度 SPF10−10 25.0μｇ／ml

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性成分SPF10−10の紫外線吸収
スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収ス
ペクトルを示す。第３図は実施例１における活性
画分のDEAEセフアデツクスＡ−25カラムの溶出
曲線を示す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパー
ルHW50Fカラムに吸着させ、0.1M NaCl燐酸緩
衝液による溶出曲線を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分
SPF10−10。１元素元析Ｃ 39.5〜43.5％Ｈ 5.8〜6.7％Ｎ 7.3〜10.4％Ｏ 46.9〜37.5％ Ash 0.5〜1.9％２分解点本物質は165℃で褐変し240℃になる
と黒色となり分解する。３比旋光度〔α〕²⁰ _D＝＋5゜〜＋30゜（Ｃ＝1.00）４紫外線吸収スペクトル本物質0.1％の水溶
液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示され
る。５赤外線吸収スペクトル第２図に示される。
3300cm^-1付近および1640cm^-1付近のペプチドに
よる吸収、又、840cm^-1の糖による吸収が認め
られ特徴的である。６塩基性、酸性、中性の区別本物質0.1％の
水溶液のPHは5.5〜6.0である。７物質の色淡褐色８呈色反応ローリー反応＋ビユーレツト反応＋ニンヒドリン反応＋アンスロン硫酸反応＋モーリツシユ反応＋システイン硫酸反応＋オルシン塩酸反応 − ９分子量ゲル濾過法による測定では分子量約
10000以上である。 10 溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ア
セトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロ
ロホルム、酢酸エチル等の溶剤には、難溶又は
不溶である。２ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10−10生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
成分SPF10−10を採取することを特徴とする抗腫
瘍性成分SPF10−10の製法。３ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10−10生産菌を培養するに際し、培養中の適
当な時期にペニシリン又はその関連物質を添加し
て培養することを特徴とする特許請求の範囲第２
項に記載の抗腫瘍性成分SPF10−10の製法。４ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10−10生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
成分SPF10−10を採取するに当たり、培養細胞
L1210の生育を阻害し、又は／及びアンスロン硫
酸法による呈色反応陽性の画分を分取することを
特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍
性成分SPF10−10の製法。