JPH084503B2

JPH084503B2 - ウロキナーゼの回収方法及びそれにより得られるウロキナーゼ含有画分

Info

Publication number: JPH084503B2
Application number: JP62297831A
Authority: JP
Inventors: 再起妹尾; 晴行中原; 隆吉浜欠; 進大庭
Original assignee: 株式会社ミドリ十字
Priority date: 1987-11-27
Filing date: 1987-11-27
Publication date: 1996-01-24
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: CN1033279A; JPH01141593A; KR890008315A

Description

【発明の詳細な説明】イ．利用分野本発明はウロキナーゼの回収方法及びそれにより得ら
れるウロキナーゼ含有画分に関する。

ロ．従来技術ウロキナーゼは人尿および腎細胞の組織培養液中の存
在する酵素であり、人血漿中に含まれるプラスミノーゲ
ンを賦活化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを
生成する機能がある。この故にウロキナーゼは人尿等か
ら捕集して精製され、各種血栓症や心筋梗塞症等の治療
に広く臨床使用されている。のみならず、最近において
は制癌剤と併用することにより、制癌剤の薬効を向上せ
しめることが知られている。しかも、ウロキナーゼは人
間の尿または腎細胞の組織培養液からの抽出精製物であ
るから、抗原性を有さないため、抗原抗体反応による副
作用がなく、広く賞用されている。

ところで、ヒト尿などにはウロキナーゼがごく微量に
しか含まれていないので、効率よくウロキナーゼを分
離、濃縮、精製することが困難である。

たとえば、従来から繁用されている硅酸塩、硅藻土な
どの鉱物を尿自体に接触させてウロキナーゼを吸着、溶
出する方法、種々のイオン交換クロマトグラフィーによ
って回収する方法においては操作性が繁雑であり、一度
に処理出来る尿も限られているため、微量成分であるウ
ロキナーゼを多量に回収するにはコスト高になるという
問題点がある。

ハ．本発明が解決しようとする問題点通常の限外濾過膜による濃縮回収では、ウロキナーゼ
の一部が膜に取り込まれ、回収率が悪く（40−50％）、
精製は伴わない。

すなわち、具体的には以下のような問題が挙げられ
る。

（１）膜は蛋白（ウロキナーゼ）を吸着する性質があ
り、そのままでは、収量が大幅に低下する。収量をあげ
るには、pHを10〜11に調整したり、吸着阻害剤を添加す
る等の前処理が必要。

（２）濃縮するにしたがって、蛋白の濁りを生じ、次工
程のトラブル原因となる為、遠心又は、ろ過工程をいれ
て、濁りをろ過してやる必要がある。

（３）濁りの多い原料尿使用の時は、水酸化ナトリウム
処理等の前処理をおこない、前もって濁りを除去してや
らねばならない。

（４）尿から数種類の蛋白を製造する場合、分子量の接
近した蛋白分子の分離（ウロキナーゼとコロニー形成刺
激因子またはカリクレインなど）は、この工程では困難
で、次工程にクロマトを用いることで、始めて可能とな
る。しかし、それは液状のままで蛋白を長時間置くこと
となり、その間の失活等が考えられる。

そこで、尿中から効率良くウロキナーゼを回収するた
めの処理方法を検討したところ、アルカリ処理したポリ
アクリロニトリル系限外濾過膜を用いることにより、原
尿からウロキナーゼの濃縮・精製が一度に行いうること
を見出し、本発明を完成した。

ニ．問題点を解決するための手段本発明の原料である尿（原尿中）には、ウロキナーゼ
は１〜10IU/ml程度含有されている。

担体となる限外濾過膜はポリアクリロニトリル系で、
分画分子量１万〜５万程度であることが好ましい。以
下、本発明に使用できる商品名の具体例を挙げる。

ダイセル化学工業（株）:DUY−Ｈ（基礎分画分子量１
万）、DUY−Ｍ（同２万）、DUY−Ｍ（同４万）、PLS−H
A1090（同１万）、PLS−MA（同２万）、PLS−LA1090
（同４万）ミリポア社:PTGC（同１万）、PTTK（同３万）アミコン社:H1P10（同１万）、H1P30（同３万）、H1P50
（同５万）、H1X50（同５万）、H5P10（同１万）、H5P3
0（同３万）、H5P50（同５万）、H10P10（同１万）、H1
0X50（同５万）ロミコン社:PM10（同１万）、XM50（同５万）などが挙
げられる。

特に、アクリロニトリルとビニルポロリドンの共重合
体からなるポリアクリロニトリル系限外濾過膜を用いる
ことが好ましい。

このものは以下のような化学構造を有する。

この限外濾過膜をアルカリで処理する。アルカリとし
ては、0.1〜1N程度の水酸化物（pH10〜13程度）が好ま
しく、より好ましくは水酸化ナトリウムを用いる。

その調製方法としては、限外濾過膜をアルカリ溶液で
10〜60分間循環させた後に10〜20時間静置し、次いで冷
精製水で洗浄した後に原尿を循環させる。これを数回く
り返すことが好ましい。

こうして調製した限外濾過膜を用いて原尿を処理す
る。

原尿をpH6〜８に調整し、限外濾過膜に接触させ、限
外濾過膜により濃縮する。その条件としては、プリーツ
型モジュールで操作圧１〜5kg/cm²程度が好ましい。こ
の時、原尿中のウロキナーゼが吸着する。

濃縮液はpH6〜８、低イオン強度（例えば、0.01〜0.1
M程度）の条件下で押し出せば、UK以外の尿蛋白（例え
ば、コロニー形成刺激因子、カリクレインなど）を回収
することも可能である。

濃縮液（未吸着液）を除去した後、所望により当該膜
をpH6〜８、低イオン強度（例えば0.005〜0.05M程度）
の条件下で洗浄した後、pH6〜８、イオン強度0.05〜0.3
M程度、好ましくは0.2〜0.3M程度の条件下で、膜に吸着
していたウロキナーゼを前記した濃縮時の操作圧と同程
度で押し出しながら、または落差圧で透過側へ（すなわ
ち、膜を透過して）溶出させて、エンドトキシンおよび
菌を除去されたウロキナーゼ含有画分を得る。

かくして精製された溶出液であるエンドトキシンおよ
び菌を除去されたウロキナーゼ含有画分は常法により脱
塩、濃縮、高度精製の処理を行い、医薬品として使用で
きるウロキナーゼとすることができる。

ホ．効果本発明の方法により（１）ウロキナーゼ吸着のための尿処理は不要（２）限外濾過膜濃縮液を押し出すだけで他の尿蛋白と
分離が簡単にできる（３）ウロキナーゼの濃縮と精製が一度にできる（４）限外濾過膜濃縮液は少量となっているので、精製
し、他の蛋白取得等多目的に使える（５）濁り、エンドトキシンおよび菌を除去できる（６）結果としてウロキナーゼの収量、比活性は向上
し、製造時間は短縮できる。

などの効果がある。

従って、簡単な操作によってウロキナーゼを微量しか
含有せず、かつ多量に不純物を含む尿から高能率、高純
度、低コストでエンドトキシンおよび菌を除去されたウ
ロキナーゼ含有画分を精製することができる。

ヘ．実験例・実施例本発明をより詳細に説明するために実験例および実施
例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。

実験例本発明法と従来法により回収したウロキナーゼ画分中
の生菌数およびエンドトキシン含有の有無を比較した
（第１表）。

本発明法は、実施例に準じて行った。

従来法は、実施例において、膜に吸着したウロキナー
ゼを押し出し操作を行うことなく（即ち、膜を透過させ
ずに）濃縮側へ溶出させた。

生菌数は、寒天培地（ニッスイ製又は栄研製）を使用
し、JIS規格の方法により、エンドトキシンはリムラス
反応により測定した。

実施例１原尿をpH6.0に調整し、参考例により調製したプリー
ツ型ポリアクリロニトリル系限外濾過膜（分画分子量２
万、ダイセル（株）製）を用いて濃縮した後、0.01Mリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で押し出すことにより濃縮液を除
去した。膜を0.01Mリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄した後
に0.25M硫酸アンモニウムを用いて落差圧でウロキナー
ゼを透過側へ溶出した。第２表に示す値を得た。

参考例プリーツ型ポリアクリロニトリル系限外ろ過膜（分画
分子量２万、ダイセル（株）製）に0.5N水酸化ナトリウ
ムを30分間循環させた後に10時間静置し、冷精製水で洗
浄し、原尿を循環する。これを５回くり返した。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アルカリ処理したポリアクリロニトリル系
限外濾過膜に原尿を接触させ、限外濾過による濃縮を行
うことにより尿中のウロキナーゼを膜に吸着させた後に
濃縮液（未吸着液）を除去し、次に膜に吸着したウロキ
ナーゼを膜を透過して溶出させることを特徴とするウロ
キナーゼの回収方法。
【請求項２】アルカリ処理したポリアクリロニトリル系
限外濾過膜に原尿を接触させ、限外濾過による濃縮を行
うことにより尿中のウロキナーゼを膜に吸着させた後に
濃縮液（未吸着液）を除去し、次に膜に吸着したウロキ
ナーゼを膜を透過して溶出させることにより得られるウ
ロキナーゼ含有画分。
【請求項３】エンドトキシン及び菌を除去された特許請
求の範囲第２項記載のウロキナーゼ含有画分。