JPS6048930A - アンチトロンビン３の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアフィニティークロマトグラフィーにおいて、
天然硫酸化ムコ多糖であるヘパリンよる。

血漿中には、十数種類のタンパク質が血液凝固因子とし
て存在し、異物表面との接触あるいは組織トロンボプラ
スチンとの接触により順次る不活性型として存在してい
るが、何等かの原因により血管内において活性化される
ことがある。しかしながら、血漿中には凝固因子ととも
に、凝固抑制因子が存在しているため、正常な場合、活
性化された凝固因子はこれらの抑制因子により中和され
血栓を生ずるには至らない。

このような抑制因子のうち、最も重要かつ強力なものと
してアンチトロンビン■を挙ケルことができる。アンチ
トロンビン■は、トロンビンおよび活性化第に因子に対
するセリンプロテアーゼインヒビターであり、血管内凝
固症候群（Ｄ　Ｉ　Ｃ）　・肝硬変・避妊薬投与などを
原因とする各種血栓性疾患の治療薬として、その製剤化
への期待が高まっている。

アンチトロンビン■の分離精製法としては、（１１硫酸
アンモニウムなどの中性塩あるいはポリエチレングリコ
ールなどの水溶性高分子添加による分別沈澱法 （２）分子の荷電を利用したイオン交換クマトグラフィ
ー （３）　分子の大きさを利用した、分子♂クロマトグラ
フィー （４）分子の等電点を利用した、電気泳動法（５）ヘパ
リンとの親和性を利用した、アフィニティークロマトグ
ラフィー などが知られており、これらの方法の１つ、あるいは２
つ以上を組み合せた方法により、アンチトロンビン■を
分離精製することができる。

これらのうち、アンチトロンビンｕ１の回収率・分離精
製操作の容易さを考えると、（５）のアフィニティーク
ロマトグラフィーが最も優れており、工業的規模の精製
には、もっばらアフィニティーク１コマトゲラフイーか
用いられている。

しかし、従来のアフィニティーゲルである架橋ヘパリン
アガロース（商品名　ヘパリンセファローズ）では、 （１）アンチトロンビン■結合能が低い（２）リガンド
（ヘパリン）とゲルとの結合が不安定である。

ｆ３１　ト＋７ンビン・フィブロネクチンなど数十種の
タンパク質と親和性を有する。

（４）Ｂ型肝炎表面抗原を吸着するため精製分画に抗原
が濃縮される。。

といった欠点が指摘されている。

本発明１９等は、これらの欠点を改善すべく鋭意研究の
結果、血漿タンパク質混合液中のアンチトロンビン■１
を迅速かつ簡便に効率良く精製できると同時に、従来の
クロマトグラフィーでは精製標品に含まれていた夾雑タ
ンパク質へも有効に除去すること７’＋（できる方法を
１．い出し、本発明を完成したものである。

ヘパリンは、抗ンＶ固作用・脂質清澄作用など数種の生
物活性を示す。すなわち、アンチトロンビン■を含む多
くの血漿タンパク質と結合する能力をもち、その結果、
そのタンパク質の作用を促進し、活性に影響を与える。

この様な多種タンパク質と結合する性質は、流酸化多−
咄糖鎮の複雑なハイブリット構造に由来するものと考え
られている。ところが、アンチトロンビン■の精製に関
してみると、他のタンパク質とは結合せずアンチトロン
ビン■のみを選択的に結合する性質が、アフィニティー
クロマトクラフィーのリガンドとして要求される。

本発明において使用されるアフィニティーゲルは、ヘパ
リンおよびそのアセチル化誘導体よりアンチトロンビン
■結合部構造を選択的に分取しリガンドとし、強固な結
合法により親水性担体と結合させることにより合成した
ゲルである。そして、そのゲルと血漿タンパク質混合液
とを接触させることにより、溶液中から、アンチトロン
ビン■を特異的に分取する方法を提供するものである。

本発明に用いるアンチトロンビン■結合部はヘパリンお
よびそのアセチル化誘導体を、ヘパリナーゼ等の特異酵
素による消化、あるいは亜硝酸すトリウム、亜硝酸イソ
アミル等による脱アミノ化分解などの方法により分解せ
しめ、得られたオリコ糖をアンチトロンビン■セファロ
ース′、リジンセファローズ等のアフィニティークロマ
トグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィーなどの方法１ごより事前ｊｌｌ、：
Ｉ　ｌ／　？こものである。そして、該リガンドを親水
性担体に６１固な結合法により固定化したゲルに血′ｌ
Ｊタンパ々質混合液を接触させることに５にり、混合液
中のアンチトロンビン■を特異的に吸着し、溶出するこ
とにより、分離精製するものである。

本発明におけるリガンドと親水性担体との結合法として
は、 （１）水溶性力ルポジイミド存在下における該リガンド
のカルボキシル基と親水性担体のアミノ基、ヒドラジド
基、チオール基との脱水反応による方法 （２）該リガンド還元末端のアルデヒド基と親水性担体
のアミノ基とで形成するシラノ塩基を還元アルキル化す
る方法 （３）エポキシ活性化した親水性担体と該リガンドの水
酸基とを結合させる方法 （４）ハロゲン化トリアジン等の架橋試薬を用いる方法 等を挙げることができる。

なお、該リガンドにアミノ基が存在し、結合反応におい
て該リガンド相互間の結合が予想される場合は、無水酢
酸により、アミノ基を不活性化しておくことが望ましい
。

本発明における親水性担体は、通常用いられている親へ
体から任意に選択することができ、′架橋アガロースゲ
ル（商品名　セファロース′４Ｂ・６Ｂ）、架橋デキス
トランゲル（商品名セファデックスＧ２００、Ｇ１００
）、架橋アクリルアミドゲル（商品名　バイオゲルＰ−
１００、Ｐ−２００）等を挙げることができる。

本発明において、血漿タンパク質混合液からのアンチト
ロンビン■の吸着には、ｐＨ６〜８かつイオン強度０〜
ｌの緩衝液及び中性塩を含む血漿タンパク質混合液を用
いるものである。

本発明における吸着アンチトロンビン■分画の溶出液に
は、ｐＴ（６〜８かつイオン強度１〜４の中性塩を含む
緩衝液を用いるものである。

緩衝液・中性塩・水溶性高分子またはアルコール類を共
存する血漿タンパク質水溶液を用いるものである。

本発明においては、カラム法および回分法を用いること
ができる。本発明において、カラム法を用いる場合は、
処理量にみあった任意の大きさのカラム内にアフィニテ
ィーゲルを充填し、ｐ　１（６〜８かつイオン強度Ｏ〜
１の中性塩および緩衝液を含む溶離液でカラムを平衡化
する。次に、該カラムに血漿タンパク質混合液を、０５
Ｉｏ〆Ｊｓｍｉｎ以下の流速で負荷し、アンチトロンビ
ン■を吸着させる。同溶離液でカラムを洗浄した後ｐＨ
６〜８　かつイオン強度１〜４の中性塩および緩衝液を
含む溶出液を通液し、アンチトロンビン■分画を回収す
る。溶出液の流速は、使用した親水性担体の機械的強度
の範囲において任意に選ぶことができる。

本発明において、回分法を用いる場合も該ゲルの量は、
血漿タンパク質混合液の処理量に応じて変化させること
ができる。該ゲルと血漿タンパク質混合液との接触時間
は、撹拌の度合あるいは容器の形状により異なるが、一
般に２時間以上が好ましい。この操作でアンチトロンビ
ン■を吸着させた該ゲルを、ガラスフィルター上等に回
収し、溶離液で洗浄する。次いで、溶出液で該ゲルを洗
浄し、アンチトロンビン■を回収する。

■ 以上の操作は、アンチトロンビンの活性を安定に保持す
るため、低温で行なうことが望ましい。

以上説明したように、本発明は、ヘパリンのと アンチトロンビン厘結合部をリガ７７ドしたアフィニテ
ィーゲルを用い、血漿タンパク質混合液と接触させるこ
とによりアンチトロンビンＩを特異的に吸着せしめ、そ
れを溶出することにより、迅速かつ簡便に効率良（アン
チトロンビンＩを分離精製する方法を提供するものであ
る。

以下、本発明を実施例および比較例により詳細に説明す
る。

実施例１．７２−仁デしｔ−７仁二）−化１８ト成−ヘ
バリンナトリウム３ｇを３００　ｍｌの１０％凍結乾燥
して得た粉末２ｇを７５　ｍｌの０．１Ｍ酢酸アガロー
スゲル（商品名　セファローズ４Ｂ）に固定化したＡＴ
ＩＩＩ−セファローズゲル５Ｑｉ＋１に吸着せしめ、５
００ｍ１のＱ、３ＭＮａＣ＋を含む５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，３）で洗浄後　２　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃアを含
む同上のリン酸緩衝液で溶出される分画を採取した。こ
の分画中に含まれるヘパリン由来オリゴ糖は、単位重量
当りの活性化ス因子阻害活性が７２３単位／ｍｇと高値
を示すことから、ヘパリン中のＡＴＩＩＩ結合部位が濃
縮されて存在することが示された。また分子篩型高速液
体クロマトグラムより原料ヘパリンに較べ分子量が著し
く減少していることが示された。この分画３００ｎ￥を
分子篩カラム（商品名　セファデックスＧ−２５）で脱
塩後、凍結乾燥し５０ｍ１の１０ｍＭＭＥＳ緩衝液に溶
解しアミノヘキシル基を側鎖として有するした。ゲルに
固定化されたオリゴ糖量の測定は色素結合法（Ｓｍｉｔ
ｈらΔｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｖｏｌ　１０９．　ｐ
４６６（１９８０））によった。

ツ’ｔ＝Ｔ　ｌ−の吸潰−屡 ｐ２３５　（１９６５））　により測定し、ゲルのＡＴ
Ｉに府する吸着容量を算出した。

表１　合成されたアフィニティーゲルのＡＴＩ吸表１に
示す如く、ｌ　ｍｌ当り０．４７　ｍｇのオリゴ糖を固
定化したｇｅｌの吸着容量は４．５１単位／　ｍｌであ
る。ここでいうＩＩｉ位とは、正常人血漿１　ｍｌ中に
含マレるＡＴＩの示す活性量である。この値は、同様に
表１に示された、同程度のリガンド）１（を固定した従
来使用されているヘパリンセファローズ２種に比較して
、５〜１０倍に増加しており、このゲルがＡＴＩＩ［の
吸着操作に対して、非常に有効であることが示された。

採取した。これを上述のゲルを充填したカラムに通液し
ＡＴＩＩＩの飽和溶出容量から、ＡＴＴＩＩの吸着〜０
．２１２　、ｌｌｉ　ｉｌｌ　／ｍｌと低値であり、本
ゲルではその１７〜３０倍の値である。血漿中には、リ
ポプロティン、ある種の０固因子をはじめとする多くの
ヘパリン結合性タンパク質が含有されていることは、５
ｈｅｌｂｏｖｎｅｓ　；　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅ
ｇｔ、、ｖｏｌ、　６０ｐ９４４　（１９７７）、旧８
量ｅ】　ら、ＢｉｏｅｈｅｍｌｓＢｙ　ｖｏｌ、１　４
ｐ　４９２８　（１９７５）、　Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ　
Ｂ、Ｔｈ、ｒｏｍｂ、　Ｒｅ　ｔ４．＞７゜１．７ｐ４
５□（１９□６）　Ｆ。ｊｉｋａｗｉ’９、Ｂｉ。。５
゜。１ｓｔｒｙ。

ｖｏｌ、１２ｐ４９３Ｂ　（１９７３）、Ｋｏｌｄａ　
ら、Ｂｉｏａｈａｍｉｓｔｒｙ　ｖｏｌ。

１６　ｐ２２７９　（１９７７）によって示されている
。従ってヘパリン固定化ゲルのＡＴＩ［吸着容量は、血
漿通液時にはこれらのタンパク質との相互作用の影響で
ＡＴｎｌ溶液通時よりも減少する。すなわち、この相互
作用が血漿からヘパリンセファローズを用いて、ＡＴＩ
ＩＩを回収する際の効率を低下させる原因となっている
。本発明では、ヘパリンのＡＴ■結合部位の精製濃縮を
行なったのでアフィニティーゲルと他のヘパリン結合性
タンパク質との相互作用を弱めると同時にＡＴＩＩ［と
の結合の特異性を高めた。これは血漿通液時のＡＴＩＩ
［吸着容量が、ＡＴＩ通液時の吸着容量と同様に高値を
示すことから明らかである。このような性質は血漿やこ
れに相等するタンパク質混合液からのＡＴＩＩＩの回収
１操作において、このゲルが便利であることを示してい
る。すなわち本例で合成されたゲルは同容量）従来法の
ヘパリンセファロースに較べ１７〜３゜・倍量の血漿か
らＡＴＩ［を回収することが可能である。

血漿からのＡＴＩｕの　１ 人血漿をゲル１０ｍ１を充填したカラムに対し、表２に
示した吸着容量を充分溝す量を通液し、ゲむ５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，３）を通液し、Ａ　Ｔｌｘ。

■を回収した。この分画のＡＴＩ［活性をＱｄｓｇａｒ
ｄらの方法（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅａ、、Ｍｏ１．６ｐ
、　２　Ｂ　？　（１９７５））により、タンパク質含
量をＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ、　Ｂ、　Ｃ。

ｖｏｌ、　１９６）２６５　（１９５１））こよりめ、
比活性を算■標品の性質 表３に示すように比活性４．２６単位／ｍｌで出発原料
血漿より２１３倍に精製されている。従来法のヘパリン
セファローズを使用して同様な方法により得られたＡ、
Ｔ　ＩＨの比活性はこれに比べて著しく低値であり、多
くの夾雑タンパク質を含んでいる。

（表３参照）このように本発明により得られたゲルは従
来使用されているヘパリンセファロース′に比べて、Ａ
ＴＴ［Ｉに対する特異性が高（、単位ゲル当りの吸着容
量が大きく、精製の際の夾雑タンパ質も少ないので、Ａ
ＴＩ［Ｉ精製用のアフィニティーゲルとして優れている
。

実施例２゜ ヘパリンナトリウムを実施例１で示した方法で、分間反
応させた後、Ｎ　ａ　ＯＨ水溶液を加え反応を停；′止
した。次に反応混合物をエタノール中に滴下シ、イニテ
ィークロマトグラフィーを行ない、高塩強度で溶出され
る分画を採取した。この分画中に含まれるヘパリン由来
オリゴ糖の単位重量当りの活性化ｉ因子阻害活性は１７
３単位であり精製前と比較して約３．３倍に上昇した。

脱塩、凍結乾燥して得た粉末２００　ｍｇを１０ｍ１の
０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐ）１９．０）に溶解し１
０ｍ１のアミノヘキシルセファロースを加え、さらに１
０ｍｇのシアノ水素化ホウ素援ナトリウムを加え、シッ
フを基を還元。

ｊ′ し固定化した。ゲルをカラムに充填し、ＡＴｌｌＴｌｌ
溶脱液ィブリノーゲＸ血漿を使用して吸着容量□ン を測定した。このゲルの結合オリゴ糖量は０．５５０ｍ
ｇ／ｍｌである。吸着容量は、ＡＴＩＩ［溶液通液時で
２．４１単位／ｍｌ、脱フィブリノーゲン血漿で１．２
３単位／ｍｌであり、実施例１で作成されたゲルにはや
や劣るが、比較例１．２のヘパリンセファローズに比べ
優れていることが示された。

実施例３゜ ヘパリン１ｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶
解し、ヘパリナーゼ２０単位を加え、３０℃で３時間分
解後、ＡＴＩ［［セファローズカラム（Ｂｅｄｖｏｌ　
１００ｍ１）に通液し、０．１Ｍ　ＮａＣ１を含むｐ。

λＭトリス緩衝液（ｐ、Ｈ８，Ｏ）で洗浄後、２ＭＮＩ
ＬＣ１を含む同緩衝液でオリゴ糖分画を回収した。これ
を脱塩濃縮後、１０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐ　Ｈ４７）の
存在下で、ＫＤＣにより、アミノへキシルセファロース
′に固定化し、１ｍｌゲル当り２．１４ｍｇのオリゴ糖
を結合したアフィニティーゲルを合成した。このゲル１
ｍｌにＡＴＩ溶液（２５単位／ｍ＋比活性１４６単位／
ｍｇ）を加え、４℃で５ＩＩＩ！１％１ｊ−シヱした。

０．３　Ｍ　Ｎ　ａ。

、／Ｃ１を含む５ＱｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、２ＭＸ
ＮａＣ１を含む同緩衝液で洗浄し、ゲルに吸着したＡＴ
［を回収した。比活性４．１３単位／　ｍｇ　（７）　
ＡＴ　ｌ。

、、　（１，２５単位が回収された。

実施例４゜ 人血漿１１！にポリエチレングリコール（平均分子量４
，０００）粉末１．５釉を加え溶解し、シャープレス遠
心機で沈澱を除去した。この」−澄に、実施例１で合成
したゲル５３　ｍｌを加え５時間緩やかに−４後グラス
フィルター上にゲルを回収した。

１　ｌ！（７）Ｏ１３ＭＮａｃｌを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐ　Ｈ７，３）で洗浄後５００　ｍｌの２ＭＮ
ａＣ１を含む５０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液でＡＴＩを溶出回
収した。

このような簡単な操作で比活性４．６２単位／ｍｇのＡ
ＴＩが６５９６の回収率で得られた。

実施例５゜ コーンアルコール法（Ｃｏｈｎ、　Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ。、
ｖｏｌ、６８ｐ４５９　（１９４６））ペイストＶｌ−
１分画　ＩＫｆを１０１の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，３）に溶解し；リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）
で洗浄し、２ＭＮａＣ１を含む同緩衝液５ｔでゲルを洗
浄しＡＴ［を回収した。これを限外口過装置（商品名ペ
リコンカセット）で濃縮後脱塩し、バイアル瓶に分注し
、凍結乾燥し、ＡＴＩ精製標品を得た。この標品の生物
活性は長期間の保存に対して安定である。

比較例１゜ ヘパリンナトリウム２５０ｍｇを０．１ＭＮａ　ＨＣｏ
　３５０ｍ１で溶解し、ＣＮＢｒで活性化したアガロー
スゲル（商品名　セファローズ４Ｂ）５０ｍｌに固定化
した。このゲルの１ｍｌ当りの固定化ヘパリン量は表１
に示すように０．４２τ■／ｍである。ゲル１１と表２
に示すように前者では０．４２７単位／ｍｌで、後者で
は０．１０５単位／ｍｌであり、両値とも実施１よりも
著しく低下している。ゲル１０ｍ１をカラムに充填し、
実施例１と同様に人血漿を充分量通液後３０ｍ１の０．
３ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，３
）でカラムを洗浄し、５０ｍ１の２ＭＮａＣｌを含む５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）でＡＴＩＩ［を製標
品に比べて純度が低く、夾雑タンパク質を多量に含んで
いることが示された。

比較例２ 実施例１に示した方法でヘパリンナトリウムをアセチル
化し、脱塩、凍結乾燥し、粉末３００　ｍｇを得た。こ
れを５０ｍ１のｌＱｍＭＭＥｓ緩衝液に溶解し、アミノ
へキシルセファロ−２５０ｍ１と混合シＩＤＣの架橋反
応で固定した。このゲルの１　ｍｌ当りの固定化アセチ
ルヘパリン量は０．４９３ｍｇである（表１参照）。次
に実施例１および比較例１と同様にゲルをカラムに充填
し、ＡＴＩＩ［溶液および脱フィブリノーゲン血漿を用
いて吸着容量を測定した。各々１．３２単位／ｍ　１と
０２１２単位／ｍｌ　であった（表１および表２参照）
。ゲルｌＱｍｌをカラムに充填し、実施例１＃よび比較
例１と同様な方法で人血漿からＡＴｎｌを精製した。得
られたＡＴＩ［は比活性０．５４６単Ｗｍｇ　％その純
度は原料血漿の２７．３倍であった（表３参照）。比較
例１と同様にゲルのＡＴｍ吸着容量が低く、精製品の純
度も劣る。

１９７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）天然の硫酸化炭化水素からアンチトロンビン■の
   特異的結合部位を抽出し、親水性担体に結合させ、この
   ゲルを血漿タンパク質混合液と接触させることによりア
   ンチトロンビン■を回収分離して精製する方法。 （２）硫酸化炭化水素がヘパリンおよびそのアセチル化
   誘導体である前項（１）記載の方法。 （３）ヘパリンおよびそのアセチル化誘導体からのアン
   チトロンビン■の特異結合部位の抽出法が、該物質を酵
   素分解あるいは脱アミノ化分解したのち、アフィニティ
   ークロマドグラリ特異結合部位を精製する方法である前
   項（１）および（２）記載の方法。 （４）ヘパリンおよびそのアセチル化誘導体のアンチト
   ロンビン■の特異結合部位と親水性担体との結合法が、
   カルボジイミド法、シッフ塩基法、エポキシ活性化法、
   ハロゲン化トリアジン法のいずれかである前項（１）な
   いしく３）記載の方法。 ＋５１　アフィニティークロマトグラフィーにおいて、
   ｐＨ６〜８かつイオン強度０〜１の条件でアンチトロン
   ビン璽を含む血漿タンパク質混合液と吸着剤を接触させ
   ることによりアンチトロンビン■を特異的に吸着せしめ
   、ｐＨ５〜８かつイオン強度１〜４の緩衝液および中性
   塩を含む溶出液により溶出する方法である前項（１）な
   いしく４）記載の方法。 （６）血漿タンパク質混合液が緩衝液ないし中性塩を含
   有する水溶液である前項（１）ないしく５）記載の方法
   。 （力　血漿タンパク質混合液がアルコール類ないし水溶
   性高分子を共存する溶液である前項（１）ないしく６）
   記載の方丸