JPH08500485A

JPH08500485A - アルカリ条件および高温度で高い活性および安定性を有する新規キシラナーゼ

Info

Publication number: JPH08500485A
Application number: JP6505799A
Authority: JP
Inventors: アゲリンオルセン，アルネ; イングボルセン，ケルト; ビスゴールド−フランツェン，ヘンリク; アナントパトカー，シャムカント; ハルキール，トルベン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1992-08-26
Filing date: 1993-08-25
Publication date: 1996-01-23
Also published as: WO1994004664A1; BR9306980A; AU4944693A; EP0663949A1; DK105592D0; FI950852L; FI950852A7; FI950852A0; CA2142818A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、好アルカリ性バシラス（Basillus）sp．の菌株から得ることのできる新規なキシラン分解酵素に関する。更に詳しくは、該酵素の製造方法並びにパルプおよび製紙工業における該酵素の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】アルカリ条件および高温度で高い活性および安定性を有する新規キシラナーゼ技術分野本発明は、好アルカリ性バシラス(Bacillus)sp. の菌株から得ることのできる新規なキシラン分解酵素に関する。更に詳しくは、本発明は該酵素の製造方法並びにパルプおよび製紙工業における該酵素の使用に関する。背景技術アルカリ条件下で高い活性と安定性を有するキシラナーゼは、例えばパルプおよび製紙工業の適用に対し、およびリグノセルロースの改質に対し、商業的に非常に興味がある。しかし、極めて少数のキシラナーゼについてpH値９〜12で機能し得ることが報告されておりそして入手可能な文献によれば、これらの酵素は10 を超えるpHで、特に50℃を超える温度で急速に不活性化することが示されている。発明の要約本発明は、アルカリ領域において活性と安定性に関し、これまで記載された細菌キシラナーゼよりも秀れた、アルカリ性バシラス(Bacillus)sp. から得られる新規なキシラナーゼ酵素を記載する。更に、本発明のキシラナーゼはまた、高温で例えばpH７〜８で70℃で機能し得る。従って、本発明はキシラン分解活性を有し、そして50℃でpH６〜９の範囲内に 50％を超える相対活性を有しそして（pH6〜10で） 55 〜70℃の範囲内に最適温度を有する酵素調製品を提供する。他の面において、本発明は酵素調製品の製造方法を提供するものであり、この方法は炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地内でバシラス (Bacillus)sp. の菌株、好ましくは菌株バシラス(Bacillus)sp., DSM 7197 、又はそれらの突然変異株又は変異株を培養し、引き続き所望の酵素を回収することを含んでなる。第三の面において、本発明はリグノセルロースのパルプの処理方法における酵素調製品の使用に関する。更に別の面において、本発明は粒質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形態で与えられる酵素調製品を含有する薬剤を提供する。図面の簡単な説明本発明を、添付の図面を参照して更に説明する：図中、図１〜３は、それぞれ pH７，pH９およびpH10の標準ブリットン(Britton) およびロビンソン(Robinson) 緩衝液中、例２に従って精製した分画の温度プロフィルを示す。全ての反応混合物は、0.013EXU／mlを含有ンク）；図４は、50mMのブリットンおよびロビンソン緩衝液中、例２に従って精製された分画の活性に対するpHの効果を示す(0.0l3EXU／ml; ンク）；および図５，６および７は、基質の不存在下、例２に従って精製された分画の安定性に対する温度およびpHの効果を示す。分画を、それぞれpH７，pH９およびpH10 の50mMブリットンおよびロビンソンの緩衝液中、0.05 EXU／mlの濃度に希釈し、次いで40℃でインキュベートした。適当な間隔で、50μｌの試料を各インキュベーション混合物から取り出し次いで950 μｌの50mMのブリットンおよびロビンソン緩衝液（pH10）に移した。残留キシラン分解活性を、キシラザイムタブレット(Xylazyme Tablets)（商標）（メガザイム，オーストラリア）を用い50℃で測定した。インキュベーション時間は、全ての発明の詳細な開示本発明は、アルカリ条件下で高い安定性および秀れた活性を有するキシラナーゼ調製品を提供する。本発明の酵素調製品は、次の特性により更に説明されることができる。物理化学的性質本発明の酵素調製品は、少なくとも５つのキシラン分解酵素を含んでなり、約３〜約9.5 の範囲内にpIを有する。例２に従って精製された酵素調製品の分画は、50℃で、30分インキュベーション後に測定し、pH６〜10の範囲内に50％超の相対活性を有する。顕著な最適pHは検出できなかったが、pH5.5 〜9.0 の範囲内に見られる（図４参照）。 pH7.0 で、例２に従って精製された酵素調製品の分画は、30分のインキュベーション後に測定し、60〜75℃の範囲内、より明確には約70℃に最適温度を有する（図１参照）。 pH9.0 で、例２に従って精製された酵素調製品の分画は、30分インキュベーション後に測定し、55〜75℃の範囲内、より明確には60〜75℃の範囲内に最適温度を有する（図２参照）。 pH10.0で、例２に従って精製された酵素調製品の分画は、30分インキュベーション後に測定し、50〜70℃の範囲内、より明確には60 ℃付近に最適温度を有する（図３参照）。例２に従って精製された、酵素調製品の分画は、pH10および40℃で６時間インキュベーション後、少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％の相対的残留活性を有する。同様の相対的残留活性を、pH 10および55℃で、pH10で50℃で；pH10および40℃で；pH９および40℃で；pH９および50℃で；およびpH７および50℃で６時間インキュベーション後に測定した（注例３）。免疫化学的性質本発明の酵素調製品は、菌株バシラス(Bacillus)sp., DSM 7197から由来されるキシラナーゼの免疫化学的性質を同一又は部分的同一（すなわち、少なくとも部分的同一）を有する。免疫化学的性質は、交差反応同一性試験により免疫学的に測定できる。同一性試験は、周知のオクテルロニー二重免疫拡散法又はN.H.アケルセン； Handbook of immuno-precipitation-in-Gel Techーniquess;ブラックウェルサイエンティフィック社（1983）、５章および14章に従い、双頭交差免疫電気泳動により行うことができる。語句「抗原同一性」および「部分的抗原同一性」は、同書中、５章、19章および20章に記載されている。単一特異性抗血清が、本発明の精製キシラナーゼを用い家兎を免疫することにより前記方法に従って発生した。免疫源をフロイドアジュバントと混合しそして二週毎に家兎に皮下注入した。８週の総免疫化期間後、抗血清を得、次いで免疫グロブリンを上記のN.H.アケルセンにより記載した如くそこから調製した。酵素の製造方法酵素調製品は、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地内で好アルカリ性バシラス（Bacillus）sp. を培養し、次いで所望の酵素を回収することにより得られ得る。好ましい態様において、酵素調製品はゴードンアンドハイド［Gordon R.E .and Hyde J.L.(1982); Journal of general Microbio-logy, 128 1109-1116, 表４］により群３として記載されている好アルカリ性種を培養することによって得られる。他の好ましい態様において、酵素調製品は菌株バシラス(Bacillus)sp., DSM 7 197 により代表される好アルカリ性種の菌株を培養することによって得られる。更に好ましい態様において、酵素調製品は菌株バシラス(Bacillus)sp., DSM 7 197 、又はその突然変異株もしくは変異株を培養することによって得られる。酵素は、また組換えDNA工学によっても得ることができる。菌株バシラス（Bacillus）sp., DSM 7197は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い1992年8月4日に、ドイッチェザンムルクフォンミクロオルガニズメンウントツェルクルツレン（Deutsche Sam mlung von Mikroorganismenund Zellkulturen）（マッシュローデルベーク１ｂ，3300 ブラウンシュバイク，ドイツ）に寄託された。キシラン分解活性に対する分析キシラン分解活性を、基質としてレマゾールーキシラン（remazol-xylan）を用いpH9.0で測定しエンドーキシラナーゼ単位（EXU）で表わす。キシラナーゼ試料を、レマゾールーキシラン基質と共にインキュベートする。非分解染色基質のバックグラウンドをエタノールにより沈殿させる。上澄み中の残りの青色は、キシラナーゼ活性に比例しており、そしてキシラナーゼ単位を標準反応条件、すなわち50.0±0.1 ℃、pH9.0および30分の反応時間で、標準酵素との関連において測定する。分析方法を記載する折りたたみ印刷物AF293.9/1は、ノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）に対し要求により入手可能であり、この印刷物はその番号を引用して本明細書に含まれる。もしも違ったふうに言及しない限り、酵素活性および安定性に対する温度およびpHの効果に関する実験は、AZCL-xylan錠剤（XylazymeTablets（商標）メガザイム、オーストラリアにより提供）を用いて行なわれた。分析を次の如く行った：適当量の酵素を、温度平衡化ブリットン（Britton）アンドロビンソン（Rob inson）緩衝液（50mM）１mlに溶解した。１個のキシラザイム錠剤（Xylazyme Ta blet）を加えて反応を開始し、ワーレイミキサー（Whirley mixer）で手短かに混合し、次いで所望の温度で15分間又は30分間インキュベートする。酵素反応を、９mlの冷（２〜３℃）１％トリス（Tris）緩衝液を添加させて終了させ、激しくうず巻かせ、次いで、ホワットマンNo.１フィルターサークルを通して濾過する。濾液の吸光度を590nMで測定する。AZCL-xylan（注、またメガザイム（Megazym e）製品情報印刷物）の化学的加水分解を矯正するため、全ての場合においてブランクインキュベーションを行った。リグノセルロースのパルプの処理方法別の面において、本発明はリグノセルロースのパルプの酵素的処理方法に関し、この方法は本発明の酵素を用いることを含んでなる。リグノセルロースのパルプの酵素的処理は、パルプの漂白性能を改善しおよび／又は満足できる漂白を得るために必要な化学薬品の量を減少する。その温度安定性のために、本発明の酵素は、過酸化水素又はオゾン漂白の前に、パルププロセスのコンプレックシング（complexing）工程において適用されることもできる。リグノセルロースのパルプの脱リグニン化のための本発明のキシラナーゼの使用に対し、キシラナーゼは好ましくは粒質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、又は保護された酵素の形態で提供されるべきである。更に好ましい態様において、薬剤は全酵素蛋白質の少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％の量のキシラナーゼを含有する。キシラン分解活性は、キシラナーゼ単位で測定できる。この明細書において、２つの種類の単位が用いられる：FXUおよびEXU。分析方法により、キシラナーゼ試料をレマゾール−キシラン（remazol-xylan）基質を共にインキュベートする。非分崩着色基質のバックグラウンドを、エタノールにより沈殿させる。上澄み中の残りの青色は、キシラナーゼ活性に比例しており、次いでキシラナーゼ単位を標準反応条件で酵素標準との関連において測定する。分析方法および標準反応条件は２つの折りたたみ印刷物：AF293.6/1（FXU）およびAF293.9/1（EXU）において記載されている。FXUはpH6.0で測定されそしてEX UはpH9.0で測定される。しかし、FXUおよびEXUは同じ桁の酵素活性を表わす。折りたたみ印刷物AF293.6/1および293.9/1は、ノボノルディスクＡ／Ｓ（デンマーク）に対し要求により入手可能であり、これらの印刷物はその番号を引用して本明細書に加えられる。好ましくは、本発明のプロセスは、40〜100℃の温度で、より好ましくは50〜9 0℃の温度でそして最も好ましくは60〜80℃の温度で行なわれる。本発明に係る方法の他の好ましい態様において、酵素処理は5.0超のpHで、より好ましくは6.0超のpHで、最も好ましくは7.0超のpHで行なわれる。本発明に係るプロセスの更に他の態様において、酵素処理は５分〜24時間の期間内、より好ましくは15分〜６時間以内、最も好ましくは20分〜３時間以内で行なわれる。適当なキシラナーゼ用量は、10〜5000 FXU／kg又はEXU／kg乾燥パルプのキシラナーゼ活性に通常相当し、より好ましくは100〜5000FXU／kg又はEXU／kg乾燥パルプのキシラナーゼ活性に相当する。本発明に係るプロセスの更により好ましいにおいて、３〜35％のコンシステンシー、より好ましくは５〜25％のコンシステンシー、最も好ましくは８〜15％のコンシステンシーでおこる。コンシステンシーはパルプの乾物含量である。35％を超えるコンシステンシーを有するパルプは、酵素調素品と有効に混合することは難しく、そして３％未満のコンシステンシーを有するパルプは、はるかに多くの水を有し、これは経済的観点から不利である。幾つかの他の好ましい態様において、本発明のキシラナーゼは例えば国際特許出願PCT／DK91／00239、又は国際公開公報WO91／02839において本質的に記載されている如くリグノセルロースのパルプの処理方法において提供され得る。他の適用本発明に係る新規キシラナーゼ酵素はヨーロッパ特許0 507 723に記載される如く動物の飼料に対する添加剤としておよびベーキング剤（baking agents）として使用するのに良好に適合している。新規キシラナーゼ酵素は、ぺントサン分画のインビボ分解において動物飼料に添加するのに特に有効であろう；何故なら例えば飼い鳥類、子豚そして典型的には豚の小腸内のpHは5.5〜７の範囲内にあるであろうし、その範囲において新規キシラナーゼ酵素は著るしい活性を有する。次の実施例により更に本発明を説明するが、これらの実施例はいかなる場合も本発明の範囲を制限するものではない。例１培養例菌株バシラス（Bacillus）sp., DSM 7197を、次の組成の培地100m1を含有するバッフル付エルレンマイヤーフラスコ500ml内の回転振とうテーブル（300r.p.m. ）上で40℃で培養した：キシラン（ブナ材）２．５ｇ酵母抽出物５ｇポリペプトン５ｇ NaCl １０ｇ K₂HPO₄ １．０ｇ MgSO₄ ・7H₂O ０．４ｇ CaCl₂ ・2H₂O ０．１ｇ微量元素溶液^* ２ｍｌ＊デサルフォトマカラム（Desuefotomaculum）アセトキダンス（acetoxidans ）培地に対する微量ミネラル溶液；培地１２４；菌株のDSMカタログ1983。培地を120℃で45分間加熱することにより殺菌する。殺菌後、各フラスコに１Ｍのセスキ炭酸ナトリウム約10mlを添加することにより培地のpHを調整する。 40℃で２日間インキュベーション後、幾つかのキシラン分解化合物が生成しそして培養ブロス内に排出された。キシランで加層したゲルに関する標準ザイモグラム（zymogram）技術と組合せた等電点電気泳動により、少なくとも５種のキシラン分解酵素を検出し、これらは約３〜約9.5の範囲内にplを有する。例２精製例酸性のplを有するキシラナーゼの分画を、限外濾過および硫酸アンモニウム沈殿による試料濃縮を含む通常の精製法およびＳ−セファロースハイロードおよびＱ−セファロースハイロードでのイオン交換クロマトグラフィー、スーパーデックス200又はG-2000SWによるサイズ排除クロマトグラフィー並びにプロテナーゼの特別な除去のためのアフィニティークロマトグラフィーによる通常のクロマトグラフィー分離により部分的に精製した。例３特性決定例例２に従って得られた、部分精製酵素分画を動力学的研究に委ね、そして下記の表１で述べる条件でインキュベートした場合、活性は少なくとも６時間直線状である（零次の動力学）ことが判明した。例４特性決定例例２に従って得られた、部分精製酵素分画を、AZCL-xylan錠剤（キシラザイムタブレット（Xylazyme Tablets）（商標）、メガザイム、オーストラリアより提供）を用ることにより酵素活性を安定性に対する温度とpHの効果に関する実験に委ねた。分析を次の如く行った：適当量の酵素を、1mlの温度−平衡化ブリットンアンドロビンソン（Britt on and Robinson）緩衝液（50mM）に溶解する。反応は、１個のXylazyme Tablet （キシラザイムタブレット）を加えることによって開始させ、Wirley（ウイレー）ミキサーで手短かに混合し、そして所望の温度で15分〜30分間インキュベートした。酵素反応を、９mlの冷（２〜３℃）１％トリス（Tris）緩衝液を添加して終了させ、激しく渦巻かせ、そしてホワットマン（whatman）No．１フィルターサークルを通して濾過する。濾液の吸光度を、590nMで測定する。AZCL-xylan の化学的加水分解に対し矯正する目的で全ての場合においてブランクインキュベーションを行った。（また、メガザイムプロダクト情報印刷物を参照のこと）。結果を図１〜４に示す。前記分画を、それぞれpH７，pH９およびpH10の50mMのブリットンアンドロビンソン（Britton and Robinson）緩衝液中、0.05 EXU／mlの濃度に希釈しそして４０℃でインキュベートした。適当な間隔で、50μｌの試料を各インキュベーション混合物から取り出しそして50mMのブリットンアンドロビンソン緩衝液（ pH10）950μｌに移した。残留キシラン分解活性を、Xylazyme Tablets（商標）を用い50℃で測定した。インキュベーション時間は、全ての場合に30分であった。結果を図５〜７に示す。例５Ｎ−末端アミノ酸配列分析キシラナーゼのＮ−末端アミノ酸配列を、ぺプチドを得そして配列決定するための標準方法を用いて測定した（フィンドレイアンドブレイゾウ（編者、Protein Sequencing-a Practical approarch,1989, IR L プレス）。例２に従って得られそしてSDS-PAGEを用い約43kDaのMWを有し更に3.5 〜9.5の等電点電気泳動ゲルにおいて約4.5のpl値を有することを特徴とするキシラナーゼのＮ末端アミノ酸配列は（添付の配列表の配列番号１）： Asn-Asp-Gln-Pro-Phe-Ala-Trp-Gln-Val-Ala-Seｒ-Leu-であることが見出された。このアミノ酸配列は、好アルカリ性バシラス（Bacillus）sp．由来の45kDaキシラナーゼにおける残基18〜29のアミノ酸配列と同一である（ハマモト等、Agri c. Biol. Chem. 51, 1987, 953 〜955頁）。通常のクロマトグラフィー法により例１の発酵ブロスから精製されそしてSDS- PAGEを用い約22kDa のMWを有することを特徴としそして3.5 〜9.5の等電点電気泳動ゲルにおいて約９のpl値を特徴とする別のキシラナーゼのＮ末端アミノ酸列は（添付の配列表の配列番号２）： Asn-Thr-Tyr Trp-Gln-Tyr-Xaa-Thr-Asp-Gly-Gly-Gly-Thr-Val- Asn-Ala-Xaa-Asn-Gly- である。 Xaaは未同定残基である。このアミノ酸配列は、これまで特徴づけられた他の低分子量キシラナーゼの幾つかに対し相同性である（例えば、バシラスズブチリリス（Bacillus subtilis）由来のキシラナーゼ、文献に対し、ぺイス等Arch. Microbiol. 144, 1986,201 〜206頁参照）。例６質量分析法製造者の指示に従い、VGアメリチカル市販のToftspec （商標）質量分析計を用い、マトリックスアシステッド（matrix assisted）レーザ脱着イオン化タイムーオブーフライト（time-of-flight）質量分析法を行った。マトリックスアシステッドレーザ脱着イオン化タイム−オブーフライト質量分析法により、約22kDaのMWおよび約９のplを有する例５で記載されるキシラナーゼに対し20532 Da±0.1％の質量値を得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者ビスゴールド−フランツェン，ヘンリクデンマーク国，デーコー―2800 リングビー，サンドクローゲン 27 (72)発明者パトカー，シャムカントアナントデンマーク国，デーコー―2800 リングビー，クリストフェルスアレ 91 (72)発明者ハルキール，トルベンデンマーク国，デーコー―1900 フレデリクスベルトセー，ボドロフスバイ４アー．７

Claims

【特許請求の範囲】１．次の特性（ａ）〜（ｃ）：（ａ）５０℃でpH６〜９の範囲に50％超の相対活性；（ｂ）（pH6〜10で）55〜75℃の範囲内に最適温度；および（ｃ）菌株バシラス（Bacillus）sp., DSM 7197から由来するキシラナーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の免疫化学的性質を有することを特徴としそしてキシラン分解活性を有する酵素調製品。２．酵素調製品が、バシラス(Bacillus)sp. の菌株から、得ることのできるものであるか又は菌株バシラス(Bacillus)sp., DSM 7197から由来するキシラナーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の免疫化学的性質を有するキシラナーゼをコードする遺伝子を有する他の宿主生物から得ることのできるものである、請求の範囲第１項記載の酵素調製品。３．酵素調製品が、菌株バシラス(Bacillus)sp.DSM 7197 により代表される種に属する菌株から得ることができるものである、請求の範囲第１又は２項記載の酵素調製品。４．酵素調製品が、菌株バシラス(Bacillus)sp.DSM 7197 、又はその突然変異株もしくは変異株から得ることのできるものである、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の酵素調製品。５．請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の酵素調製品の製造方法であって、バシラス(Bacillus)sp. の菌株、好ましくは菌株バシラスsp., DSM 7197 、又はそれらの突然変異株もしくは変異株を、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地内で培養し、引き続き目的の酵素を回収することを含んでなる、前記方法。６．リグノセルロースのパルプの処理方法における請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の酵素調製品の使用。７．リグノセルロースのパルプを6.5 を超えるpHで、好ましくは7.5 を超える pHで酵素調製品を用いて処理し、しかる後このように処理されたセルロースのパルプを、最初の塩素化工程において0.20又はそれ以下の活性塩素倍量にて塩素を用いて処理する、リグノセルロースのケミカルパルプの処理のための請求の範囲第６項記載の方法。８．動物の飼料の処理のためのプロセスにおける請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の酵素調製品の使用。９．パンの製造においてベーキング剤(baking agent)としての請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の酵素調製品の使用。 10．粒質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、または保護された酵素の形態で提供される、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の酵素調製品を含有する薬剤。 11．キシラナーゼ調製品が、全酵素蛋白質の少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％を構成する、請求の範囲第10項記載の薬剤。