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Xylanase, micrcorganismes la produisant, molécule d'ADN, procédés de préparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci
L'invention concerne une nouvelle xylanase. L'invention concerne également une nouvelle souche de microorganismes produisant cette xylanase et une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides qui code pour cette xylanase.
L'invention concerne également les procédés de préparation de cette xylanase, les utilisations de celle-ci et les compositions comprenant celle-ci.
Des xylanases thermostables. activas dans une large gamme ci pH sont connues, telles que notamment la xylanase produite par
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une souche de Bacillus alcalophile, (Gupta, =t ai. BIOTECHNOLùGY LETTERS, 1992, 14 (11), pages 1045-106). Cependant, malgré ces zicaces en blanchiiiien propriétés, ces enzymes sembleraient peu efficaces en blanchiment de pâte à papier.
En conséquence, il y a actuellement un besoin pour une xylanase utilisable lors du traitement de la pâte à papier, très stable et également très active dans une large gamme de campé- rature et de pH basique et acide.
La présente invention a pour but de fournir une nouvelle xylanase, active dans une large gamme de pH, aussi bien à pH alcalin qu'à pH acide.
La présente invention a également pour but d'identifier, isoler et fournir une souche, en particulier une souche de Bacillus, qui produit naturellement ladite xylanase.
La présente invention a également pour but d'isoler et de fournir une molécule d'ADN comprenant une séquence de nucléotides qui code pour ladite xylanase.
La présente invention a également pour but de préparer et fournir un vecteur d'expression et un vecteur d'intégration chromosomique contenant la séquence de nucléotides codant pour ladite xylanase.
La présente invention a également pour but de préparer et
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fournir un hôte de Bacillus transformé avec le vecteur d'expression ou le vecteur d'intégration contenant la molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides de la souche de Bacillus codant pour ladite xylanase.
La présente invention a également pour but de préparer et fournir une composition contenant cette xylanase.
La présente invention a également pour but de préparer et fournir une xylanase utilisable dans le traitement de la pâte à papier, et notamment des pâtes ayant un pH basique, et des pâtes à papier de diverses provenances, telles que les pâtes provenant d'arbres résineux, les pâtes provenant d'arbres feuillus, et particulièrement la pâte d'eucalyptus.
A cet effet, l'invention concerne une xylanase provenant d'un Bacillus, et plus particulièrement d'un microorganisme aérobie et non thermophile. On utilise de préférence la souche de Bacillus sp. 720/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche. La xylanase de l'invention est dérivée de la souche de Bacillus sp.
720/1. La xylanase est classifiée dans le système international sous le numéro E. C. 3.2. 1.8. Il s'agit d'une endo-1, 4-xylanase.
De préférence la xylanase, isolée et purifiée, est constituée d'un seul type de polypeptide, ayant un poids moléculaire d'environ 25 kDa.
L'invention concerne une xylanase, isolée et purifiée, comprenant la séquence d'acides aminés de 1 à 221 acides aminés (SEQ ID N0 : 1) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. La séquence d'acides aminés et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) codant pour la xylanase mature, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 3), est donnée à la figure 1 (figures la et Ib).
La xylanase de l'invention est synthétisée sous forme d'un précurseur. Le précurseur contient 248 acides aminés (SEQ ID NO : 4). On identifie la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) codant pour le précurseur de la xylanase, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 6).
Le précurseur contient la séquence de 221 acides aminés (SEQ ID N0 : 1) de la xylanase mature et la séquence de 27 acides
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aminés (SEQ ID N0 : 7) de la préséquence ; décrite ci-après.
Ceci a pour conséquence que la séquence de la xylanase mature est précédée d'une préséquence. Il s'agit d'une séquence additionnelle de 27 acides aminés (SEQ ID NO : 7). On identifie la séquence de nucléotides correspondante (SEQ ID NO : 8). Cette séquence de nucléotides, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 9), est illustrée à la figure 2 (figures 2a et 2b).
De manière particulièrement préférée, ladite xylanase a un point isoélectrique déterminé compris entre environ 9,5 et environ 9,7.
La xylanase selon l'invention est thermostable et active dans une large gamme de pH.
La xylanase selon l'invention possède par ailleurs toutes les propriétés adéquates compatibles avec les conditions industrielles réelles de traitement enzymatique de la pâte à papier.
Selon les multiples étapes des divers traitements de la pâte à papier mis en oeuvre industriellement, ces propriétés sont une bonne stabilité vis-à-vis du pH et de la température, une activité enzymatique dans une large gamme de pH et de température, tels que notamment un pH compris entre environ 5 et 9,5 et une température comprise entre environ 50 et 80 C.
L'invention concerne également une xylanase modifiée, c'est-à-dire une enzyme dont la séquence en acides aminés diffère de celle de l'enzyme sauvage par au moins un acide aminé. Ces modifications peuvent être obtenues par des techniques classiques de mutagénèse sur l'ADN, telles que l'exposition à des rayonnements ultraviolets, à des produits chimiques, tels que l'éthyl méthane sulfonate (EMS), le N-méthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), le nitrite de sodium ou l'O-méthylhydroxylamine ou par des techniques de génie génétique, comme, par exemple, la mutagénèse dirigée ou la mutagénèse aléatoire. Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING-a laboratory manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989, chapitre 15.
La présente invention concerne également l'identification et la fourniture d'une nouvelle bactérie, isolée et purifiée,
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aérobie produisant la xylanase. Généralement elle appartient à la famille de Bacillaceae. De préférence elle appartient au genre Bacillus. De manière particulièrement préférée, ledit Bacillus est la souche de Bacillus sp. 720/1 ou un dérivé ou mutant de cette souche.
Par dérivé ou mutant de cette souche, on entend toute bactérie modifiée naturellement ou artificiellement. Les dérivés de cette souche peuvent être obtenus par les techniques connues de modification telles que rayonnement ultraviolet, rayons X, agents mutagènes ou génie génétique. Ces techniques sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans SAMBROOK et al., 1989, chapitre 15.
La souche de Bacillus sp. 720/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection, Université de Gand, Laboratoire de Microbiologie-K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgique) conformément au Traité de Budapest sous le numéro LMG P-14798 le 9 juin 1994. L'invention concerne une culture isolée et purifiée de la souche de Bacillus sp. 720/1 et une culture dérivée ou mutée de celle-ci.
La souche de la présente invention a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques : bactérie Gram positif, aérobie, qui se présente sous la forme de bâtonnet, elle forme une endospore. Elle est oligosporogène.
L'invention concerne également l'isolement et la fourniture d'une molécule d'ADN comprenant la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) qui code pour la xylanase mature de Bacillus sp.
720/1 (LMG P-14798) ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
De préférence cette molécule d'ADN comprend tout le gène de la xylanase de Bacillus sp. 720/1. Par tout le gène de la xylanase (SEQ ID NO : 10), on entend au moins le (ou les) promoteur (s) de transcription, la (ou les) séquence (s) signal, la séquence de nucléotides codant pour la xylanase mature et le (ou les) terminateur (s) de transcription.
La séquence complète de nucléotides codant pour la xylanase mature, ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 3),
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est donnée à la figure 1 (figures la et Ib).
Habituellement, la molécule d'ADN, selon l'invention, comprend au moins la séquence de nucléotides (SEQ ID N0 : 5) qui code pour le précurseur de la xylanase ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. Cette séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) comprend la séquence de nucléotides (SEQ ID N0 : 2) codant pour la xylanase mature de Bacillus sp. 720/1 (LMG P-14798) et sa séquence signal (préséquence) (SEQ ID NO : 8). De préférence, cette molécule d'ADN comprend tout le gène de la xylanase de Bacillus sp. 720/1 et, de manière particulièrement préférée, la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 10).
La séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 10) est constituée de, dans le sens amino-carboxy et de gauche à droite, la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 11) qui comprend le promoteur de la xylanase, la séquence de nucléotides de la préséquence (SEQ ID NO : 8), la séquence de nucléotides de la xylanase mature (SEQ ID NO : 2) et la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 12) qui comprend le terminateur de la xylanase. La figure 2 (figure 2a et figure 2b) représente la séquence de nucléotides du gène codant pour la xylanase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 13).
L'invention concerne également une xylanase mutée obtenue par modification de la séquence de nucléotides du gène qui code pour la xylanase définie ci-dessus. Les techniques d'obtention de telles xylanases mutées sont connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans MOLECULAR CLONING-a laboratory manualSAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989, chapitre 15.
La présente invention concerne également un vecteur d'expression ou vecteur d'intégration chromosomique contenant une molécule d'ADN, telle que définie ci-dessus. Habituellement, le vecteur d'expression ou le vecteur d'intégration chromosomique contient une molécule d'ADN qui comprend le gène qui code pour la xylanase ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci. De préférence le vecteur d'expression ou le vecteur d'intégration chromosomique contient la molécule d'ADN qui comprend la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 10) qui code pour la xylanase de Bacillus sp. 720/1 ou une séquence modifiée dérivée de celle-ci.
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La présente invention concerne également des souches recombinantes dans lesquelles le gène codant pour la xylanase est introduit par les techniques de génie génétique. Le gène peut être introduit sur un plasmide par un vecteur d'expression ou intégré dans le chromosome de l'hôte en une ou plusieurs copies par un vecteur d'intégration chromosomique.
L'invention concerne également les souches de microorganismes différentes de l'organisme producteur de départ, dans lesquelles les nucléotides codant pour la xylanase sont introduits par transformation, soit sous forme intégrée dans l'ADN chromosomique, soit sous forme autoréplicative (plasmide).
L'invention concerne la souche transformée de Bacillus comprenant la molécule d'ADN qui contient le gène de structure qui code pour la xylanase mature de Bacillus sp. 720/1. De préférence, la souche transformée de Bacillus est une souche de Bacillus licheniformis ou une souche de Bacillus sp. 720/1.
L'invention concerne la souche transformée de Bacillus comprenant le vecteur d'expression ou le vecteur d'intégration chromosomique qui comprend cette molécule d'ADN. De préférence, la souche transformée de Bacillus est une souche de Bacillus licheniformis. De préférence, également, la souche transformée de Bacillus est une souche de Bacillus sp. 720/1.
La présente invention concerne également la xylanase produite par une souche transformée telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé pour la production d'une xylanase comprenant la culture d'une bactérie aérobie capable de produire la xylanase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de la xylanase ainsi obtenue. Ce milieu de culture peut être solide ou liquide.
De préférence le milieu de culture est liquide. De préférence la bactérie aérobie est une souche de Bacillus ou un dérivé de cette souche capable de produire la xylanase.
La présente invention concerne également un procédé pour la production d'une xylanase comprenant la culture de la souche de Bacillus sp. 720/1 ou un dérivé de cette souche capable de
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produire la xylanase dans un milieu nutritif approprié contenant des sources de carbone et d'azote et des sels minéraux sous condition d'aérobiose et la récolte de la xylanase ainsi obtenue.
L'invention concerne également un procédé pour la préparation d'une xylanase à partir d'un organisme recombinant, le procédé comprenant l'isolement d'un fragment d'ADN codant pour la xylanase, l'insertion de ce fragment d'ADN dans un vecteur approprié, l'introduction de ce vecteur dans un hôte approprié ou l'introduction de ce fragment d'ADN dans le chromosome d'un hôte approprié, la culture de cet hôte, l'expression de la xylanase et la récolte de la xylanase. L'hôte approprié est choisi généralement parmi le groupe constitué des microorganismes Escherichia coli, Bacillus ou Aspergillus. Habituellement, l'hôte est choisi parmi les Bacillus. De préférence, l'hôte est choisi parmi les microorganismes du genre Bacillus (aérobies).
De manière particulièrement préférée, l'hôte est choisi parmi les microorganismes Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus alcalophilus, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens ou Bacillus sp. 720/1.
De bons résultats ont été obtenus lorsque l'hôte pour l'expression de la xylanase selon la présente invention est une souche recombinante dérivée de Bacillus licheniformis, et de préférence la souche de Bacillus licheniformis SE2 delapl. La souche de Bacillus licheniformis SE2 delapl est décrite dans la demande de brevet européen 0 605 040.
L'invention concerne également une xylanase produite, de façon hétérologue, par un microorganisme du genre Bacillus.
Habituellement, le microorganisme du genre Bacillus contient un gène codant pour une protéase alcaline lorsqu'il est à l'état sauvage. De préférence ce microorganisme est une souche de Bacillus licheniformis comprenant la molécule d'ADN qui comprend la séquence de nucléotides qui code pour la xylanase de Bacillus sp. 720/1. De manière particulièrement préférée, le gène codant pour la protéase alcaline a été enlevé par délétion de cette souche de Bacillus. Cette souche est de préférence la souche de Bacillus licheniformis SE2 delapl.
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Par produite de façon hétérologue, on entend une production qui n'est pas effectuée par le microorganisme naturel, c'est-àdire le microorganisme qui contient à l'état sauvage le gène qui code pour la xylanase.
Les conditions de culture de ces bactéries telles que composants du milieu nutritif, paramètres de culture, température, pH, aération, agitation, sont bien connues de l'homme du métier.
Les techniques de récolte de la xylanase sont bien connues de l'homme du métier et sont choisies selon les utilisations envisagées de la xylanase. Habituellement, on emploie la centrifugation, la filtration, l'ultrafiltration, l'évaporation, la microfiltration, la cristallisation ou une combinaison de l'une ou l'autre de ces techniques telle qu'une centrifugation suivie d'une ultrafiltration.
La xylanase peut ensuite être purifiée, si nécessaire et selon les utilisations envisagées. Les techniques de purification d'enzymes sont bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'un sel, tel que le sulfate d'ammonium, ou de solvant, tel que l'acétone ou un alcool.
La xylanase peut également être séchée par atomisation ou lyophilisation.
La présente invention concerne également des compositions enzymatiques comprenant la xylanase selon l'invention et au moins un additif. Ces additifs sont connus de l'homme du métier et sont choisis selon l'utilisation envisagée de la composition. Ils doivent être compatibles avec la xylanase et ne pas affecter l'activité enzymatique de la xylanase. Habituellement, ces additifs sont des stabilisants de l'enzyme, des agents de conservation et des agents de formulation.
Les compositions comprenant la xylanase de la présente invention peuvent être utilisées sous forme solide ou liquide.
La xylanase est formulée selon les utilisations prévues.
Des stabilisants ou des agents de conservation peuvent également être ajoutés aux compositions enzymatiques comprenant la xylanase selon l'invention. Par exemple on peut stabiliser la xylanase
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par l'addition de propylène glycol, d'éthylène glycol, de glycérol, d'amidon, de xylane, d'un sucre tel que du glucose et du sorbitol, d'un sel tel que du chlorure de sodium, du chlorure de calcium, du sorbate de potassium et du benzoate de sodium ou d'un mélange de deux ou plusieurs de ces produits. De bons résultats ont été obtenus avec du propylène glycol. De bons résultats ont été obtenus avec du sorbitol.
La xylanase selon l'invention a des débouchés multiples dans diverses industries, telles que, par exemples, les industries alimentaires, les industries pharmaceutiques ou les industries chimiques.
La xylanase peut notamment être utilisée en boulangerie. Un exemple d'une utilisation d'une xylanase en boulangerie est, en particulier, décrit dans la demande de brevet international WO 94/04664.
La xylanase peut notamment être utilisée pour le traitement de la pâte à papier. La xylanase de la présente invention est notamment efficace sur la pâte venant du bois d'eucalyptus.
La xylanase peut notamment être utilisée en alimentation animale. Un exemple d'une utilisation d'une xylanase en alimentation animale est, en particulier, décrit dans la demande de brevet européen 0507723.
La figure 1 (figure la et figure lb) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 3) codant pour la xylanase mature ainsi que sa traduction en acides aminés.
La figure 2 (figure 2a et figure 2b) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 13) du gène codant pour la xylanase ainsi que sa traduction en acides aminés.
La figure 3 représente la carte de restriction du plasmide pUBR2002.
La figure 4 représente la carte de restriction du plasmide pUBR-720X1.
La figure 5 représente la carte de restriction du plasmide pUBR-720X11.
La signification des abréviations et symboles utilisés dans ces figures est rassemblée dans le tableau suivant.
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<tb>
<tb>
Symbole <SEP> Signification
<tb> Abréviation
<tb> OriEC <SEP> origine <SEP> de <SEP> réplication <SEP> dans <SEP> E. <SEP> coli
<tb> REP <SEP> protéine <SEP> nécessaire <SEP> pour <SEP> la <SEP> réplication
<tb> Ori+ <SEP> origine <SEP> de <SEP> réplication <SEP> du <SEP> brin <SEP> +
<tb> Ori-origine <SEP> de <SEP> réplication <SEP> du <SEP> brinAmpR <SEP> gène <SEP> apportant <SEP> la <SEP> résistance <SEP> à <SEP> l'ampicilline
<tb> KmR <SEP> gène <SEP> apportant <SEP> la <SEP> résistance <SEP> à <SEP> la <SEP> kanamycine
<tb> BlmR <SEP> gène <SEP> apportant <SEP> la <SEP> résistance <SEP> à <SEP> la <SEP> bléomycine
<tb> 5'720XYL <SEP> séquence <SEP> 5'située <SEP> en <SEP> amont <SEP> de <SEP> la <SEP> séquence <SEP> codant
<tb> pour <SEP> la <SEP> xylanase
<tb> 3'720XYL <SEP> séquence <SEP> 3'située <SEP> en <SEP> aval <SEP> de <SEP> la <SEP> séquence
<SEP> codant
<tb> pour <SEP> la <SEP> xylanase
<tb> 720XYL <SEP> séquence <SEP> codant <SEP> pour <SEP> la <SEP> xylanase <SEP> de <SEP> Bacillus
<tb> sp. <SEP> 720/1
<tb>
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1 Isolement et caractérisation de la souche de Bacillus sp. 720/1
La souche de Bacillus sp. 720/1 a été isolée d'un échantillon de sol, prélevé en Argentine, sur un milieu nutritif gélosé et sélectionnée pour sa capacité de dégrader un dérivé coloré du xylane connu sous le nom de l'AZCL-xylane et vendu par la Société MEGAZYME.
Cette souche a été mise en culture à 37 C dans le milieu de croissance LBS/C dont la composition est la suivante : son de blé 10 g/l, TRYPTONE (DIFCO) 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaCl 10 g/l, Na2C03 5,3 g/l, NaHC03 4,2 g/l.
Le carbonate et le bicarbonate de sodium sont stérilisés séparément, puis ajoutés aseptiquement aux autres composants du milieu stérile. Le milieu gélosé contient en outre 20 g/l d'agar.
La souche de la présente invention a été identifiée par ses caractéristiques biochimiques : bactérie Gram positif, aérobie
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qui se présente sous le forme de bâtonnet, elle forme une endospore. Elle appartient donc au genre Bacillus.
Les cellules végétatives de cette souche en culture sur le milieu LBS/C gélosé à 37 C ont une forme de bacille de taille 0,8 x 3,0-5 um. La mobilité des cellules végétatives est positive.
Après une croissance de 13 jours à 37 C sur le milieu TSA gélosé, l'observation microscopique révèle la présence de sporanges. Le milieu TSA gélosé contient 15 gll de TRYPTONE (DIFCO), 5 gll de peptone de soja ; 5 gll de NaCl et 15 g/1 de gélose.
La souche est oligosporogène.
Le test de la catalase est positif en présence de 10 r. (v/v) de peroxyde d'hydrogène. Le test de l'oxydase est positif en présence de 1 r. (p/v) de tétraméthyl-1, 4-phénylène-diammoniumdichlorure.
Cette souche est aérobie, c'est-à-dire qu'elle se développe en aérobiose. Elle ne se développe pas en anaérobiose, c'est-àdire sous une atmosphère de 84 X (v/v) N2'8 r. (v/v) C02, 8 % (v/v) H2 à 37 C. L'abréviation % (v/v) représente un pourcentage exprimé en volume par volume.
Cette souche n'est pas thermophile. Elle présente un développement normal après incubation en milieu LBS/C gélosé à 20 C, 30 C, 37 C et 45 C, par contre elle ne se développe pas à 50 C et 55 C, ni à 10 C.
Elle présente un développement normal après incubation en milieu LBS/C gélosé en présence de NaCl aux concentrations de 2,0 X (p/v) et de 3,5 % (p/v), présente un développement faible en présence de 5,0 % (p/v) et de 7,0 % (p/v) de NaCl.
L'abréviation % (p/v) représente un pourcentage exprimé en poids par volume.
La souche de Bacillus sp. 720/1 n'acidifie pas le glucose.
La souche de Bacillus sp. 720/1 a été identifiée au moyen de la galerie API 50 CHB et de la galerie API 20 E en suivant les instructions d'utilisation du fournisseur (API SYSTEM, France).
La souche de Bacillus sp. 720/1 utilise le glycérol, le
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N-acétylglucosamine, l'arbutine, le citrate, la galactose, l'amygdaline, le melibiose et hydrolyse la gélatine. Ces caractéristiques différencient nettement la souche de Bacillus sp. 720/1 d'une souche de Bacillus pumilus. En effet, une souche de Bacillus pumilus ne présente aucune de ces caractéristiques.
La souche de Bacillus sp. 720/1 a également été identifiée au moyen du système BIOLOG (USA). La banque de données analysant les résultats de ce système donne un score de 0,564 pour le Bacillus coagulans, de 0,097 pour le Bacillus subtilis, de 0,057 pour le Bacillus licheniformis et de 0,00 pour le Bacillus pumilus. Ces caractéristiques différencient nettement la souche de Bacillus sp. 720/1 d'une souche de Bacillus coagulans, d'une souche de Bacillus subtilis, d'une souche de Bacillus licheniformis et d'une souche de Bacillus pumilus.
La bactérie isolée appartient donc au genre Bacillus, aucune espèce connue n'a pu être determinée.
La souche de Bacillus sp. 720/1 a été déposée à la collection nommée BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection) sous le numéro LMG P-14798.
Exemple 2 Production de la xylanase par le Bacillus sp. 720/1
La souche de Bacillus sp. 720/1 est mise en culture sur boîte de Pétri contenant un milieu LBS/C, gélosé, à 37 Oc durant 48 heures (culture A).
Puis, à partir de la culture A, on réalise une culture dans un milieu LB/C liquide dont la composition est identique à celle du milieu LBS/C mais sans son de blé, à 37 Oc durant 24 heures sous agitation orbitale à raison de 250 révolutions par minute (culture B) avec une amplitude d'environ 2,54 cm.
500 ml de la culture B sont ensuite transférés dans un fermenteur de 20 l contenant 14 l de milieu LBS/C. Le pH est laissé libre, la vitesse d'agitation et le debit d'air insufflé dans le fermenteur sont tels que la pression partielle en oxygène dissous dans le milieu de culture ne soit pas inférieur à 30 % de la saturation.
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Après 72 heures de culture à 37 C, on sépare la xylanase et la biomasse cellulaire par centrifugation (BECKMAN J21, rotor JA10) à 8 000 tours par minute pendant 30 minutes. La xylanase produite par la souche de Bacillus sp. 720/1 est extracellulaire.
Puis on sépare les matières insolubles résiduelles de la xylanase, à partir du surnageant de centrifugation, par microfiltration (cartouche KROS FLOII 0,2 p de porosité, Société MICROGON).
On lave le rétentat de microfiltration avec 1 l d'eau déminéralisée. On effectue ce lavage trois fois.
Ensuite, on concentre, environ 20 fois, le perméat de cette microfiltration par ultrafiltration sur une cartouche PALL MICROZA SIP 1013 en polysulfone, ayant un seuil de coupure de 6 kD (Société PALL).
On mesure l'activité enzymatique sur le rétentat (produit R) et sur le perméat (produit P) d'ultrafiltration obtenus.
Une unité enzymatique de la xylanase (IU) est définie comme la quantité d'enzyme qui, à un pH de 8,0, à une température de
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50 C et en présence de xylane, catalyse la libération d'équivalents glucose à raison de 1 vmole de glucose par minute (uM/minute).
La mesure de l'activité enzymatique xylanase est réalisée selon le protocole décrit par BAILEY, BIELY et POUTANEN, J. BIOTECHNOLOGY, 1992,23, pages 257-270 ; à l'exception que le tampon citrate-phosphate cité par BAILEY et al. a été remplacé par le tampon Tris (hydroxyméthylaminoéthane)-HCl, 50 mM (pH de 8,0).
On ajoute au rétentat d'ultrafiltration (produit R) suffisamment de polyéthylène glycol (polyéthylène glycol de MERCK référence 807490) pour obtenir une concentration de 40 x (p/p).
Après solubilisation du polyéthylène glycol, on incube la solution obtenue 30 minutes à 25 C.
Puis, on centrifuge la solution, contenant le polyéthylène glycol et la xylanase, 10 minutes à 8 000 tours par minute (centrifugeuse BECKMAN J21, rotor JA10). On élimine le surnageant de centrifugation. On ajoute au culot de centrifugation
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suffisamment d'une solution de NaCl (0,9 X v/v) pour retrouver le volume initial du rétentat mis en oeuvre (produit R).
Ensuite, on ajoute à cette suspension contenant la xylanase et du NaCl suffisamment d'acétone pour arriver à une concentration de 40 % (v/v). On incube cette suspension acétonique durant 45 minutes à 4 C.
Après cette incubation, on centrifuge cette suspension acétonique 10 minutes à 8 000 tours par minute (BECKMAN J21, rotor JA10).
On conserve le surnageant de centrifugation. A ce surnageant de centrifugation, on ajoute de l'acétone à une concentration de 80 % (v/v). On incube cette suspension acétonique 45 minutes à 4 C.
Après cette incubation, on centrifuge cette suspension acétonique 10 minutes à 8 000 tours par minute (BECKMAN J21, rotor JA10).
On conserve le culot de centrifugation. Celui-ci est mis en suspension dans un volume suffisant d'une solution de NaCl 0,9 X (v/v) pour être solubilisé (produit N).
Exemple 3 Purification de la xylanase
Une fraction du rétentat d'ultrafiltration (produit N) obtenu à l'exemple 2, est conditionnée par passage sur colonne de chromatographie de perméation sur gel (colonne BIO-RAD ECONOPAC 10DG) équilibrée avec un tampon Bis-Tris (bis (2-hydroxyéthyl)imino-tris (hydroxyméthyl) méthane) 20mM, pH 6,2 (tampon A). On obtient ainsi une solution nommée produit X.
1 ml de la solution produit X est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation S SEPHAROSE HP 16/10 (PHARMACIA) préalablement équilibré avec le tampon A. Le débit est de 2,5 ml par minute, avec une élution isocratique pendant 10 minutes, suivie d'un gradient de concentration en NaCl (de 10 à 50 minutes, la teneur en NaCl passe de 0 à 0,7 M). Un pic unique est détecté pendant le gradient, correspondant à l'élution de la xylanase.
On recueille les fractions contenant l'activité xylanase
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(solution A).
On vérifie que ces fractions contiennent de la xylanase en déposant 10 pl de chaque fraction sur un milieu gélosé comprenant du xylane (milieu contenant 0,5 g/l d'AZCL-xylane, tampon TRIS 50 mM (pH = 8,0) et 15 gll d'agar). Un halo se forme autour des fractions qui contiennent de la xylanase.
Exemple 4 Séquence d'acides aminés
La séquence d'acides aminés de la xylanase de la présente invention est indirectement déterminée à partir de la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 10) du gène qui code pour cette xylanase, dont l'obtention est décrite à l'exemple 14. Ceci est réalisé à l'aide du programme d'ordinateur IntelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (Release #5. 4) d'IntelliGenetics, Inc. USA.
La figure 2 (figure 2a et figure 2b) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 10) du gène codant pour la xylanase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 13).
La xylanase est synthétisée sous forme d'un précurseur, Le précurseur de la xylanase contient 248 acides aminés (SEQ ID NO : 4). On identifie la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 5) codant pour le précurseur de la xylanase ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 6).
On identifie la préséquence de la xylanase synthétisée sous forme d'un précurseur. Il s'agit d'une séquence de 27 acides aminés (SEQ ID NO : 7). On identifie la séquence de nucléotides correspondante (SEQ ID NO : 8).
Ensuite, on identifie la séquence en acides aminés de la
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xylanase mature. La xylanase mature contient 221 acides aminés (SEQ ID NO : 1).
La figure 1 (figure la et figure lb) représente la séquence de nucléotides (SEQ ID NO : 2) codant pour la xylanase mature ainsi que sa traduction en acides aminés (SEQ ID NO : 3).
Exemple 5 Distribution en acides aminés
La distribution en acides aminés de la xylanase mature, déterminée à partir de la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 1)
<Desc/Clms Page number 16>
de la xylanase (exemple 4), est résumée dans le tableau 1.
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<tb>
<tb>
TABLEAU <SEP> 1
<tb> Symbole <SEP> Acides <SEP> aminés <SEP> Nombre <SEP> %
<tb> (en <SEP> poids <SEP> moléculaire)
<tb> N <SEP> asparagine <SEP> 25 <SEP> 11,6
<tb> Y <SEP> tyrosine <SEP> 13 <SEP> 8,6
<tb> T <SEP> thréonine <SEP> 18 <SEP> 7,4
<tb> S <SEP> serine <SEP> 19 <SEP> 6,7
<tb> l <SEP> isoleucine <SEP> 14 <SEP> 6,4
<tb> V <SEP> valine <SEP> 14 <SEP> 5,6
<tb> G <SEP> glycine <SEP> 24 <SEP> 5,5
<tb> W <SEP> tryptophane <SEP> 7 <SEP> 5,3
<tb> K <SEP> lysine <SEP> 10 <SEP> 5,2
<tb> R <SEP> arginine <SEP> 8 <SEP> 5,1
<tb> 0 <SEP> glutamine <SEP> 9 <SEP> 4,7
<tb> D <SEP> acide <SEP> aspartique <SEP> 10 <SEP> 4,7
<tb> L <SEP> leucine <SEP> 10 <SEP> 4,6
<tb> E <SEP> acide <SEP> glutamique <SEP> 8 <SEP> 4,2
<tb> F <SEP> phénylalanine <SEP> 7 <SEP> 4,2
<tb> p <SEP> proline <SEP> 7 <SEP> 2,8
<tb> M <SEP> méthionine <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 7
<tb> A <SEP> alanine <SEP> 8 <SEP> 2,
<SEP> 3
<tb> H <SEP> histidine <SEP> 4 <SEP> 2,2
<tb> C <SEP> cystéine <SEP> 1 <SEP> 0,4
<tb> B <SEP> acide <SEP> aspartique/
<tb> asparagine <SEP> 0 <SEP> 0,0
<tb> X <SEP> inconnu <SEP> 0 <SEP> 0,0
<tb> Z <SEP> glutamine
<tb> acide <SEP> glutamique <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0
<tb>
Exemple 6 Estimation du poids moléculaire
On estime, par calcul, le poids moléculaire de la xylanase à partir de la séquence en acides aminés de la forme mature de la
<Desc/Clms Page number 17>
xylanase, comme décrit à l'exemple 4.
On déduit par calcul un poids moléculaire de 24698,61 Daltons.
Exemple 7 Détermination du poids moléculaire
On effectue sur la solution A contenant la xylanase, telle qu'obtenue à l'exemple 3, une concentration sur un dispositif CENTRICON 10 kD (AMICON).
100 ul de la solution concentrée sont déposés sur une colonne de chromatographie de perméation sur gel SUPERDEX 75 HR 10/30 (PHARMACIA). La colonne a été préalablement calibrée au moyen des marqueurs de poids moléculaire (PHARMACIA) GEL FILTRATION LMW calibration kit code 17-0442-01. L'élution a lieu à 0,25 ml/minute au moyen d'un tampon CAPSO (acide 3- (cyclo- hexylamino) -2-hydroxy-1-propane sulfonique) 25mM, pH 9,2 additionné de NaCl 0, 2M.
Le chromatogramme obtenu montre un pic unique correspondant à l'activité xylanase. On en déduit un poids moléculaire apparent de la protéine d'environ 13,5 kD.
On effectue également sur la fraction issue de ce pic unique une électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Le système de gel utilisé est le système PHASTSYSTEM de PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY, avec des gels contenant un gradient de polyacrylamide de 10-15 X (v/v). Les conditions d'électrophorèse sont celles prey items par le fournisseur. On utilise comme témoin les marqueurs de poids moléculaire PHARMACIA LMW (Low Molecular Weight), référence 17-0446-01. Les marqueurs mis en oeuvre sont la phosphorylase b (94 kD), l'albumine (67 kD), l'ovalbumine (43 kD), la carboanhydrase (30 kD), l'inhibiteur de la trypsine (20,1 kD) et l'alpha-lactalbumine (14,4 kD).
Une coloration au bleu de Coomassie fait apparaître un polypeptide d'un poids moléculaire d'environ 25,7 kD.
Exemple 8 Estimation du point isoélectrique
On estime le point isoélectrique de la xylanase à partir de
<Desc/Clms Page number 18>
la séquence en acides aminés de la forme mature de la xylanase, comme décrit à l'exemple 4.
Le point isoélectrique estimé tient compte de tous les acides aminés présents dans la protéine, comme si cette protéine était dénaturée.
On déduit un point isoélectrique de 7,46 pour la xylanase, sous sa forme dénaturée.
Exemple 9 Détermination du point isoélectrique
On dépose une fraction de la solution A, telle qu'obtenue à l'exemple 3, sur une colonne de chromatofocalisation MONO P 5/20 (PHARMACIA) en suivant les recommandations du fournisseur, et préalablement équilibrée avec un tampon diéthanolamine 25 mM, pH 9,9.
La colonne est éluée au moyen de la solution d'ampholytes POLYBUFFER 96 (PHARMACIA) diluée 10 fois dans l'eau déminéralisée.
Le pH de la fraction contenant l'activité xylanase est de 9,5.
On vérifie que cette fraction contient la xylanase en déposant 10 ul de celle-ci sur un milieu gélosé comprenant du xylane (milieu contenant 0,5 gll d'AZCL-xylane, tampon TRIS 50 mM (pH = 8,0) et 15 g/1 d'agar). Un halo, qui se présente sous la forme d'une zone d'hydrolyse de l'AZCL-xylane, se forme autour de la fraction qui contient la xylanase.
On réalise sur une fraction de la solution A, telle qu'obtenue à l'exemple 3, une focalisation isoélectrique.
Pour réaliser cela, on réhydrate le gel PHARMACIA DRYIEF par
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un mélange constitué de 2 ml d'eau déminéralisée, de 150 pl de produit BIOLYTE 8-10 (BIORAD) et de 75 pl de produit PHARMALYTE 8-10,5 (PHARMACIA). On dépose environ 200 nanogrammes de protéines (fraction de la solution A) sur le gel. On suit le protocole décrit par le fournisseur.
On en déduit que la xylanase a un point isoélectrique légèrement supérieur à 9,6, point isoélectrique du marqueur le plus élevé mis en oeuvre.
<Desc/Clms Page number 19>
Le point isoélectrique observé expérimentalement est représentatif de la charge de surface de la protéine sous sa forme native.
Exemple 10 Profil d'activité en fonction du pH pour la xylanase produite par la souche naturelle (Bacillus sp. 720/1)
On mesure, selon la méthode décrite à l'exemple 2, l'activité enzymatique de la xylanase en présence de xylane, à une température de 50 C et à différents pH (de 5,6 à 10,35) dans différents tampons choisis pour obtenir le pH souhaité. On met en oeuvre la solution de xylanase, telle qu'obtenue à l'exemple 2 (produit N).
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 2.
Au cours de cet essai l'activité enzymatique maximale a été mesurée pour l'échantillon placé à un pH d'environ 6,2 et à une température d'environ 50 C durant 15 minutes. Par définition on a donc attribué à cet échantillon une activité enzymatique relative de 100 X.
Cet exemple montre que la xylanase selon l'invention développe une activité enzymatique de plus de 70 X de l'activité enzymatique maximale dans une gamme de pH compris entre environ 5,6 et environ 9,5.
<Desc/Clms Page number 20>
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<tb>
<tb>
TABLEAU <SEP> 2
<tb> pH <SEP> Tampon <SEP> utilisé <SEP> Activité <SEP> relative
<tb> (50 <SEP> mM) <SEP> X
<tb> 5,6 <SEP> Tris-maléate <SEP> 85
<tb> 6,2 <SEP> Tris-maléate <SEP> 100
<tb> 6,8 <SEP> Tris-maléate <SEP> 96
<tb> 7,5 <SEP> Tris-maléate/Tris <SEP> * <SEP> 88
<tb> 8,7 <SEP> Tris/Capso <SEP> * <SEP> 92
<tb> 9,5 <SEP> Capso/Caps <SEP> * <SEP> 76
<tb> 10 <SEP> Caps <SEP> 50
<tb> 10,35 <SEP> Caps <SEP> 19
<tb>
Tris = tris (hydroxyméthyl) aminométhane Tris-maléate = tampon formé de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (50 mM) et d'acide maléique (50 mM) dont la proportion entre les composants est choisie en fonction du pH souhaité, le pH étant ajusté au moyen de NaOH (1 M).
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Capso = acide 3- (cyclohexylamino)-2-hydroxy-l-propane sulfonique Caps = acide 3- (cyclohexylamino)-l-propane sulfonique Le symbole * signifie que la valeur obtenue est la moyenne des mesures effectuées au même pH mais obtenues avec les deux tampons.
Exemple 11 Effet du pH sur l'activité de la xylanase produite par la souche de Bacillus sp. 720/1 en aide au blanchiment de la pâte de résineux
On prépare trois suspensions aqueuses d'une pâte de pin (en provenance de la société SCA) ayant 2,5 % (en poids de matière sèche) de consistance et ayant un indice Kappa initial de 17.
On ajuste le pH de ces suspensions à pH 5 avec H2S04' le étape : étape à l'enzyme (étape X)
On dilue la solution nommée produit N, telle qu'obtenue à l'exemple 2, avec de l'eau déminéralisée pour obtenir une solution d'enzyme ayant une activité enzymatique de 25 UI/ml
<Desc/Clms Page number 21>
(comme décrit à l'exemple 2).
On ajoute cette solution d'enzyme, contenant la xylanase, à une suspension de pâte de pin de telle sorte que la suspension de pâte soit traitée au moyen de 5 UI/g de pâte sèche
Aux deux autres suspensions de pâte de pin, on ajoute de l'eau déminéralisée à la place de la solution d'enzyme dans des proportions identiques.
Puis on incube les trois suspensions pendant 2 heures à 50 C sans agitation.
2e étape : étape au chlore (étape C)
Ensuite, chaque suspension de pâte, ainsi obtenue, est soumise à un traitement de blanchiment qui consiste en une chloration avec de l'eau chlorée. Ce traitement a lieu sur une pâte ayant une consistance de 3 X en poids de matière sèche.
Pour cela, on ajoute à la suspension de pâte traitée enzymatiquement et à une suspension de pâte non traitée enzymatiquement une quantité de chlore de 2,89 (= 0,17 x 17) X (poids/poids de pâte sèche). On ajoute à l'autre suspension de pâte non traitée enzymatiquement une quantité de chlore de 3,40 (0,20 x 17) X (poids/poids).
On incube les 3 suspensions pendant 1 heure à température ambiante. Puis, on lave la pâte avec 40 volumes d'eau déminéralisée.
3e étape : étape à la soude (étape E)
Ensuite, on effectue une extraction alcaline qui consiste à ajouter 2 x (poids/poids de pâte sèche) de NaOH aux trois suspensions obtenues ci-dessus et qui ont une consistance de 5 x en poids de matière sèche.
On incube les trois suspensions pendant 1 heure 30 à une température de 60 oC. Puis, on lave la pâte avec 40 volumes d'eau déminéralisée et on la récupère sous forme de feuille à une blancheur d'environ 45 0 ISO (+1- 3 0 ISO).
On mesure l'indice Kappa des trois feuilles obtenues.
L'indice Kappa est relatif à la mesure de la quantité de lignine présente dans la pâte. L'indice Kappa est un nombre qui représente le volume (en millilitre) d'une solution de perman
<Desc/Clms Page number 22>
ganate de potassium 0,1 N (KMn04) consommé par un gramme de pâte sèche dans les conditions spécifiées et en suivant les procédures décrites dans la norme TAPPI (Technical Committee of the Association of the Pulp and Paper industry) #T236cm-85 (1985).
Le degré ISO est relatif à la mesure de brillance du papier obtenu à partir de la pâte. Cette valeur est un facteur de la réflectance du papier obtenu à partir de la pâte dans les conditions spécifiées et en suivant les procédures décrites dans la norme ISO (The International Organization for Standardization) #2469 publiée dans la norme #ISO 2470-1977 (F) en complément de la norme #2470.
On réalise quatre essais identiques à l'exception de la mise à pH initiale à pH 5. En effet, on réalise quatre essais avec une suspension aqueuse de pâte de pin dont le pH a été ajusté respectivement à pH 6, à pH 7, à pH 8, à pH 9 au lieu de pH 5.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 3.
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<tb>
<tb>
TABLEAU <SEP> 3
<tb> Quantité <SEP> d'enzymes
<tb> mises <SEP> en <SEP> oeuvre <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> (UI/g)
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> chlore
<tb> mis <SEP> en <SEP> oeuvre
<tb> (% <SEP> en <SEP> poids/poids
<tb> de <SEP> pâte <SEP> sèche) <SEP> 2,89 <SEP> 2,89 <SEP> 3,40
<tb> pH <SEP> initial <SEP> Indice <SEP> Kappa
<tb> 5 <SEP> 4, <SEP> 63 <SEP> 5,01 <SEP> 4,18
<tb> 6 <SEP> 3, <SEP> 81/4, <SEP> 11
<tb> 7 <SEP> 3,81 <SEP> 5,01 <SEP> 4,06
<tb> 8 <SEP> 3, <SEP> 55/4, <SEP> 21
<tb> 9 <SEP> 3, <SEP> 71 <SEP> 4,91 <SEP> 4,07
<tb>
Le symbole/signifie que la suspension de pâte n'a pas été
<Desc/Clms Page number 23>
testée.
Ces résultats montrent que la xylanase selon l'invention
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permet une réduction d'environ 15 à 20 X de la quantité de chlore pour une pâte blanchie à 45 ISO. De plus, ces résultats sont obtenus aussi bien à un pH alcalin qu'à un pH acide. Ces bons résultats sont également obtenus à un pH d'environ 9.
Cet exemple montre que la xylanase selon l'invention présente une activité dans une large gamme de pH. En effet, la xylanase selon l'invention est active dans une gamme de pH compris entre environ 5 et environ 10. Elle est particulièrement active pour des valeurs de pH supérieures ou égales à environ 6.
Elle est particulièrement active pour des valeurs de pH inférieures ou égales à environ 9.
Exemple 12 Effet de la température sur l'activité de la xylanase produite par la souche de Bacillus sp. 720/1 en aide au blanchiment de la pâte de résineux
On reproduit l'exemple 11 avec 5 suspensions de pâte de résineux à pH 8. L'étape de traitement enzymatique est réalisée à un pH de 8 et à différentes températures (55,60 et 65 C).
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4.
<Desc/Clms Page number 24>
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<tb>
<tb>
TABLEAU <SEP> 4
<tb> Quantité <SEP> d'enzymes
<tb> mises <SEP> en <SEP> oeuvre <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> (UI/g)
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> chlore
<tb> mis <SEP> en <SEP> oeuvre
<tb> (% <SEP> en <SEP> poids/poids
<tb> de <SEP> pâte <SEP> sèche) <SEP> 2,89 <SEP> 2,89 <SEP> 3,40
<tb> Température'C <SEP> Indice <SEP> Kappa
<tb> 55 <SEP> 3, <SEP> 89 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> 60 <SEP> 3, <SEP> 64 <SEP> 4,77 <SEP> 4,09
<tb> 65 <SEP> 3,49 <SEP> / <SEP> /
<tb>
Le symbole/signifie que la suspension de pâte n'a pas été testée.
On observe que la pâte est blanchie à environ 45 ISO.
Ces résultats montrent que l'indice Kappa des échantillons de pâte traitée enzymatiquement reste largement inférieur à l'indice de l'échantillon non traité enzymatiquement.
Cet exemple montre que la xylanase selon l'invention est active dans une large gamme de température. Elle est active à une température d'environ 65 C.
Cet exemple montre également que la xylanase selon l'invention est stable à une température d'environ 60 OC.
Exemple 13 Activité de la xylanase produite par la souche de Bacillus sp.
720/1 en aide au blanchiment de la pâte d'eucalyptus dans la séquence ECF
Pour cet exemple, on met en oeuvre une pâte d'eucalyptus venant de la société CEASA MILL (Espagne). La pâte est traitée en suivant une séquence ECF ("Elemental Chlorine Free"), c'est-à-dire que la succession d'étapes constituant la séquence
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ne fait pas appel à du chlore élémentaire. le étape : étape à l'oxygène (étape 0)
La pâte est traitée par un procédé mettant en oeuvre de l'oxygène tel que décrit dans le brevet U. S. 4,462, 864, de telle sorte qu'une pâte ayant un indice Kappa initial de 12,3 et un degré ISO initial de 33,4 est obtenue.
Deux suspensions aqueuses sont préparées à partir de cette pâte traitée par l'oxygène ayant une consistance de 4 X en poids de matière sèche.
On ajuste le pH de ces suspensions à pH 9 avec HCl.
2e étape : étape à l'enzyme (étape X)
On dilue la solution nommée produit N, telle qu'obtenue à l'exemple 2, avec de l'eau déminéralisée pour obtenir une solution d'enzyme ayant une activité enzymatique de 25 UI/ml.
On ajoute cette solution d'enzyme, contenant la xylanase, à une suspension de pâte de pin de telle sorte que la suspension de pâte soit traitée au moyen de 10 UI/g de pâte sèche.
Aux deux autres suspensions de pâte de pin, on ajoute de l'eau déminéralisée à la place de la solution d'enzyme.
Puis on incube les 3 suspensions pendant 1 heure 30 minutes à 50 C sans agitation.
3e étape : étape au dioxyde de chlore (étape D)
Ensuite, chaque suspension de pâte, ainsi obtenue, est soumise à un traitement de blanchiment qui consiste en une chloration avec du dioxyde de chlore. Ce traitement a lieu sur une pâte ayant une consistance de 3 x en poids de matière sèche.
Pour cela, on ajoute à la suspension de pâte traitée enzymatiquement et à une suspension de pâte non traitée enzymatiquement une quantité de dioxyde de chlore de 0, 6 % (poids/poids de pâte sèche). On ajoute à l'autre suspension de pâte non traitée enzymatiquement une quantité de dioxyde de chlore de 1 % (poids/poids).
On incube les 3 suspensions pendant 30 minutes à 50 C.
Puis, on lave la pâte avec 40 volumes d'eau déminéralisée.
4e étape : étape à la soude et au peroxyde d'hydrogène (étape E/P)
<Desc/Clms Page number 26>
Ensuite, on effectue une extraction alcaline qui consiste à ajouter 1,8 X (poids/poids de pâte sèche) de NaOH et 0,5 % (poids/poids de pâte sèche) de peroxyde d'hydrogène aux trois suspensions obtenues ci-dessus et qui ont une consistance de 12 % en poids de matière sèche.
On incube les trois suspensions pendant 1 heure 30 à une température de 70 C. Puis, on lave la pâte avec 40 volumes d'eau déminéralisée.
5e étape : étape au dioxyde de chlore (étape D)
Ensuite, chaque suspension de pâte, ainsi obtenue, est soumise de nouveau à un traitement de blanchiment qui consiste en une chloration avec du dioxyde de chlore. Ce traitement a lieu sur une pâte ayant une consistance de 12 %.
On ajoute à ces trois suspensions une quantité de dioxyde de
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chlore de 0, 5 X (poids/poids de pâte sèche).
On incube les 3 suspensions pendant 2 heures à 75 C. Puis, on lave la pâte avec 40 volumes d'eau déminéralisée.
6e étape : étape à la soude et au peroxyde d'hydrogène (étape E/P)
Ensuite, on effectue une extraction alcaline qui consiste à ajouter 0,6 X (poids/poids de pâte sèche) de NaOH et 0,3 X (poids/poids de pâte sèche) de peroxyde d'hydrogène aux trois suspensions obtenues ci-dessus et qui ont une consistance de 12 % en poids de matière sèche.
On incube les trois suspensions pendant 1 heure 30 à une température de 70 C. Puis, on lave la pâte avec 40 volumes d'eau déminéralisée.
7e étape : étape au dioxyde de chlore (étape D)
Ensuite, chaque suspension de pâte, ainsi obtenue, est soumise à un traitement de blanchiment qui consiste en une chloration avec du dioxyde de chlore. Ce traitement a lieu sur une pâte ayant une consistance de 12 %.
On ajoute à ces trois suspensions une quantité de dioxyde de chlore de 0,3 % (poids/poids).
On incube les 3 suspensions pendant 2 heures 30 minutes à 75 C. Puis, on lave la pâte avec 40 volumes d'eau déminéralisée
<Desc/Clms Page number 27>
et on la récupère sous forme de feuille.
On mesure le degré ISO des trois feuilles obtenues.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 5.
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<tb>
<tb>
TABLEAU <SEP> 5
<tb> Quantité <SEP> d'enzymes
<tb> mises <SEP> en <SEP> oeuvre <SEP> à <SEP> l'étape <SEP> 2 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> en <SEP> UI/g
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> dioxyde
<tb> de <SEP> chlore <SEP> mis <SEP> en <SEP> oeuvre <SEP> 0,6 <SEP> 0,6 <SEP> 1,0
<tb> à <SEP> l'étape <SEP> 3 <SEP> en <SEP> X <SEP> (poids/poids)
<tb> de <SEP> pâte <SEP> sèche)
<tb> 0 <SEP> ISO <SEP> 88,5 <SEP> 85, <SEP> 5 <SEP> 87, <SEP> 9
<tb>
EMI27.2
Cet exemple montre que la xylanase selon l'invention est efficace sur la pâte d'eucalyptus. De plus, elle ne nécessite aucun ajustement de pH, puisqu'elle présente l'avantage d'être active au pH de la pâte, c'est-à-dire à un pH d'environ 9.
Cet exemple montre également qu'en comparaison de ce qui est obtenu sans xylanase, l'utilisation de la xylanase selon l'invention entraîne une augmentation de la brillance d'au moins 3"ISO pour une quantité de CI02 fixée.
Cet exemple montre également que l'utilisation de la xylanase selon l'invention permet de réduire la quantité de ClO d'environ 4 à 5 kg/tonne de pâte, ce qui représente environ 25 à 30 Z de la quantité totale de Cl02 nécessaire.
Exemple 14 Détermination de la séquence nucléotidique et protéique de la xylanase de Bacillus sp. 720/1 1. Extraction de l'ADN chromosomique à partir de la souche de Bacillus sp. 720/1 A partir de la culture B, telle qu'obtenue à l'exemple 2, une culture de 200 ml de la souche de Bacillus sp. 720/1 est réalisée en milieu LB/C durant 16 heures à 37 C. Le milieu LB/C
<Desc/Clms Page number 28>
est identique au milieu LBS/C, décrit à l'exemple 1, sans l'addition de son de blé.
Lorsque cette culture est réalisée et qu'elle est en phase stationnaire, elle est centrifugée (BECKMAN J 21, rotor JA10) à 5 000 tours par minute pendant 10 minutes. Le culot de centrifugation ainsi obtenu est repris dans 9 ml de tampon TRIS-HCl (tris (hydroxyméthyl) aminométhane acidifié avec HCl 0,1 M), à un pH de 8, EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) 0,1 M, NaCl 0,15 M contenant 18 mg de lysozyme, la suspension ainsi obtenue est incubée 15 minutes à 37 C.
Le lysat ainsi obtenu est ensuite traité par 200 ul d'une solution de RNAse à 10 mg/ml pendant 20 minutes à 50 C. 1 ml d'une solution de SDS (sodium dodécyl sulfate) à 10 X (p/v) est alors ajoutée à ce lysat. Ensuite on incube ce lysat durant 30 minutes à 70 C.
Puis le lysat est refroidi aux environs de 45 C, on y ajoute ensuite 0,5 ml d'une solution de protéinase K (vendue par BOEHRINGER Mannheim) à 20 mg/ml (préparée extemporanément).
Le lysat est incubé à 45 C sous agitation manuelle jusqu'à l'obtention d'une solution transparente.
On effectue à partir de cette solution transparente plusieurs extractions au phénol sous les conditions et en suivant les procédures décrites dans Molecular Cloning-a laboratory manual-SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS-second edition, 1989, à la page E. 3, jusqu'à l'obtention d'une interface propre, comme cela y est décrit.
L'ADN est précipité par 20 ml d'éthanol. Le précipité est récupéré par centrifugation à 5 000 tours par minute (BECKMAN J21, rotor JA10) pendant 5 minutes, puis mis en suspension dans 2 ml de tampon TE à pH 8,0 (10 mM TRIS-HC1, lmM EDTA à pH 8,0).
Cette suspension contient l'ADN chromosomique.
2. Construction du vecteur pUBR2002
Le vecteur pUBR2002 (E. coli-Bacillus subtilis) a été obtenu à partir du plasmide pBR322 qui est vendu par la société BIOLABS (CLONTECH LABORATORIES catalogue nO 6210-1).
On construit deux oligonucléotides synthétiques par la
<Desc/Clms Page number 29>
technique décrite dans BEAUCAGE et al. (1981), Tetrahedron Letters, 22, pages 1859-1882 et en utilisant des P-cyanoéthyl phosphoramidites dans un appareil de BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER.
Les séquences de ces deux oligonucléotides sont les suivantes : SEQ ID NO : 14 5'-CCCCCCTACGTAGCGGCCGCCCCGGCCGGTAACCTAGGAAGTCAGCGCCCTGCACC-3' et SEQ ID NO : 15 5'-CCCCCCTACGTAGGCCGGGGCGGCCGCGGTTACCTAGGGCCTCGTGATACGCCTAT-3'
Ces deux oligonucléotides sont utilisés pour effectuer une amplification par PCR à partir du plasmide pBR322 selon la technique décrite dans Molecular Cloning, a laboratory ManualSAMBROOK et al., second edition, 1989, pages 14.18-14. 19.
Le fragment amplifié par PCR contient le réplicon E. coli limité par les sites de restriction SnabI.
Le fragment SnabI-SnabI d'environ 2,8 kpb (kpb = 1000 paires de bases) est ligaturé avec le vecteur pUB131 (décrit dans la demande de brevet européen 0 415 296) qui a préalablement fait l'objet d'une digestion avec SnabI.
La technique de la ligation est décrite par SAMBROOK et al (pages 1.68-1. 69). Toutes les ligations réalisées dans les exemples de cette demande ont été effectuées en suivant cette technique.
La ligation ainsi obtenue est transformée dans des cellules d'E. coli MC1061 [CLONTECH LABORATORIES, catalogue n C-1070-1] par électroporation (SAMBROOK et al, pages 1.75-1. 81). Les cellules transformées sont mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 100 ug/ml d'ampicilline et 10 ug/ml de kanamycine, à 37 C pendant environ 18 heures.
Après croissance, les colonies isolées sont soumises à une analyse par restriction, analyse décrite dans Molecular Cloning, a laboratory Manual-MANIATIS et al., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, pages 374-379.
On obtient une souche dont on extrait le vecteur qui est dénommé pUBR2002 (figure 3).
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3. Construction d'une collection de gènes de Bacillus sp. 720/1
A partir de la suspension le contenant, l'ADN chromosomique est clivé partiellement par l'enzyme de restriction Sau3AI. Les conditions de restriction sont celles décrites par SAMBROOK et al. (pages 5.28-5. 32), à part que ces conditions de restriction sont augmentées d'un facteur 10, afin d'obtenir une quantité d'ADN suffisante pour les étapes de purification suivantes.
Le rapport entre la quantité d'ADN mise en oeuvre et la quantité d'enzyme est ajusté afin d'obtenir un maximum de fragments de taille comprise entre 4 et 7 kpb (kpb : 103 paires de bases).
L'ensemble des fragments ainsi obtenus est ensuite soumis à une électrophorèse en gel d'agarose (0,8 x p/v), comme décrit par SAMBROOK et al., pages 6.01-6. 19, et les fragments de taille comprise entre 4 et 7 kpb sont isolés et purifiés par la méthode de filtration suivie d'une centrifugation décrite dans ZHU et al., Bio/Technology 3,1985, pages 1014-1016.
Les fragments d'ADN ainsi purifiés sont ensuite ligaturés (selon la méthode décrite par SAMBROOK et al. (pages 1.68-1. 69) avec le plasmide pUBR2002 (E. coli-Bacillus subtilis), préalablement coupé au site BamHI et déphosphorylé comme décrit par SAMBROOK et al. (pages 1.60-1. 61).
La ligation ainsi obtenue est transformée dans des cellules de E. coli MC1061 par électroporation (SAMBROOK et al., pages 1.75-1. 81).
4. Criblage de la collection de gènes
Les cellules transformées de E. coli sont mises en culture sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 0,8 g/1 d'AZCL-xylane et 100 ug/ml d'ampicilline, durant environ 24 heures à 37 C. On isole une colonie présentant une zone d'hydrolyse.
Le plasmide présent dans cette colonie est extrait et isolé par la technique de la lyse alcaline décrite dans SAMBROOK et al., pages 1.25-1. 28.
On effectue une analyse par restriction (SAMBROOK et al., page 1.85). Cette analyse indique que le fragment d'ADN obtenu
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qui contient le gène de la xylanase a une taille d'environ 3,5 kpb (kpb = 1 000 paires de bases). Il est porté par le vecteur pUBR2002 qui a été ligaturé.
On obtient ainsi le plasmide pUBR-720X1 (figure 4).
5. Clonage d'un fragment chromosomique contenant le gène de la xylanase
Le plasmide pUBR-720Xl est digéré par des enzymes de restriction aux sites SwaI et SpeI. Le gène de la xylanase est ainsi obtenu sur un fragment d'ADN SwaI-SpeI d'environ 1,5 kpb.
Ce fragment d'ADN SwaI-SpeI est soumis à un traitement avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase (SAMBROOK et al., pages F. 2-F. 3).
La préparation d'ADN ainsi obtenue est ligaturée avec le vecteur pUBR2002, qui a été préalablement digéré avec EcoRV et déphosphorylé.
La ligation est ensuite transformée dans des cellules d'E. coli MC1061 par électroporation.
Les souches transformées sont sélectionnées sur boîte de Pétri contenant le milieu LB (Luria-Bertani) gélosé, 0,8 g/1 d'AZCL-xylane (MEGAZYME) et 100 ug/ml d'ampicilline, après croissance à 37 C pendant environ 24 heures.
Les colonies présentant une zone d'hydrolyse sont isolées.
Elles sont soumises à une analyse par la technique de la lyse alcaline (SAMBROOK et al., pages 1.25-1. 28).
Puis les souches transformées sont soumises à une analyse par restriction (MANIATIS et al., 1982, pages 374-379). Cette analyse par restriction montre que le plasmide isolé, pUBR-720Xll (figure 5), contient le gène de la xylanase sur un fragment d'environ 1,5 kpb de l'ADN chromosomique du Bacillus sp. 720/1.
Le plasmide pUBR-720X11 est ensuite utilisé pour transformer les cellules d'E. coli JM109 (CLONTECH LABORATORIES catalogue nO C1005-1) par la technique au CaCl2 (SAMBROOK et al., pages 1.82-1. 84).
Les cellules transformées de E. coli sont cultivées sur boîte de Pétri contenant le milieu LB gélosé, 0,8 g/l d'AZCL-xylane et 100 pg/ml d'ampicilline. Après croissance à
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37 C pendant environ 24 heures, on observe une zone d'hydrolyse autour des colonies. Ceci montre que les cellules transformées de E. coli expriment bien la xylanase.
La technique permettant de déphosphoryler les fragments d'ADN ou de linéariser les vecteurs est décrite par SAMBROOK et al. (pages 1.60-1. 61).
On isole une colonie présentant une zone d'hydrolyse. Le plasmide présent dans cette colonie est extrait et isolé par la technique de la lyse alcaline.
On établit la séquence de la xylanase à partir de la méthode décrite dans SAMBROOK et al. pages 13.15 et 13.17 (figure 13.3B) en utilisant le plasmide pUBR-720X11 comme matrice.
Pour initier la détermination de la séquence, des oligonucléotides synthétiques sont préparés pour s'hybrider avec le plasmide pUBR2002. Les séquences de ces oligonucléotides synthétiques sont les suivantes : SEQ ID NO : 16 5'-ACGAGGAAAGATGCTGTTCTTGTAAATGAGT-3' et SEQ ID NO : 17 5'-TACCTTGTCTACAAACCCC-3'
Le reste de la séquence est déterminé par l'utilisation d'autres oligonucléotides synthétiques en se basant sur les parties de la séquence nouvellement déterminées.
La séquence de nucléotides du gène complet qui code pour la xylanase (SEQ ID NO : 10) est ainsi obtenue (figure 2). Le gène de la xylanase est obtenu comme un fragment d'environ 1,5 kpb.
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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES : (i) DEPOSANT : (A) NOM : SOLVAY (Société Anonyme) (B) RUE : rue du Prince Albert, 33 (C) VILLE : Bruxelles (E) PAYS : Belgique (F) CODE POSTAL : 1050 (G) TELEPHONE : (02) 509.61. 11 (ii) TITRE DE L'INVENTION : xylanase, microorganismes la produisant, molécule d'ADN, procédés de préparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 17 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk (B) ORDINATEUR : IBM PC compatible (C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS : MS-DOS (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 221 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (v) TYPE DE FRAGMENT : fragment interne (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME :
Bacillus (B) SOUCHE : 720/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 1 : Gln Ile Val Thr Asp Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr
1 5 10 15 Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His
20 25 30 Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe
35 40 45 Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly
50 55 60
<Desc/Clms Page number 34>
Asn Met Ser Ile Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala
65 70 75 80 Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr
85 90 95 Ile Val Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys
100 105 110 Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu
115 120 125 Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys GIn Tyr
130 135 140 Trp Ser Val Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser 145 150 155 160 Asn His Phe Arg Ala Trp Glu Asn
Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met
165 170 175 Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala
180 185 190 Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr
195 200 205 Ile Ser Asn Asp Glu Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn
210 215 220 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 663 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 2 :
CAAATCGTCA CCGACAATTC CATTGGCAAC CACGATGGCT ATGATTATGA ATTTTGGAAA GATAGCGGTG GCTCTGGGAC AATGATTCTC AATCATGGCG GTACGTTCAG TGCCCAATGG
EMI34.1
AACAATGTTA ACAACATATT ATTCCGTAAA GGTAAAAAAT TCAATGAAAC ACAAACACAC CAACAAGTTG GTAACATGTC CATAAACTAC GGAGCCAACT TCCAACCAAA TGGTAATGCG TATTTATGCG TCTATGGTTG GACTGTTGAC CCTCTTGTCG AATATTATAT TGTCGACAGT
<Desc/Clms Page number 35>
TGGGGCAACT GGCGTCCACC AGGAGCAACG CCTAAGGGGA CCATCACTGT TGATGGAGGA 360 ACATATGATA TCTACGAGAC TCTTAGAGTC AATCAACCCT CCATTAAGGG GATTGCCACA 420 TTTAAACAAT ATTGGAGTGT TCGAAGATCG AAACGCACGA GTGGCACGAT TTCTGTCAGC 480 AACCACTTTA GAGCGTGGGA AAACTTAGGG ATGAATATGG GGAAAATGTA TGAAGTCGCG 540 CTTACTGTAG AAGGCTATCA AAGTAGCGGA AGTGCTAATG TATATAGCAA TACACTAAGA 600 ATTAACGGTA ACCCTCTCTC AACTATTAGT AATGACGAGA GCATAACTTT
GGATAAAAAC 660 AAT 663 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 663 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 3 :
CAA ATC GTC ACC GAC AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT 48 Gln Ile Val Thr Asp Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr
1 5 10 15 GAA TTT TGG AAA GAT AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT 96 Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His
20 25 30
EMI35.1
GGC GGT ACG TTC AGT GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ATA TTA TTC 144 Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe 35 40 45 CGT AAA GGT AAA AAA TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT 192 Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly 50 55 60 AAC ATG TCC ATA AAC TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG 240 Asn Met Ser Ile Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala
65 70 75 80 TAT TTA TGC GTC TAT GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT 288 Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr
85 90 95
<Desc/Clms Page number 36>
ATT GTC GAC AGT TGG GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG 336 Ile Val Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys
100 105 110 GGG ACC ATC ACT GTT GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT 384 Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu
115 120 125 AGA GTC AAT CAA CCC TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT 432 Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr
130 135 140 TGG AGT GTT CGA AGA TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC 480 Trp Ser Val Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser 145 150 155 160 AAC CAC TTT AGA GCG TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG 528 Asn His Phe Arg Ala Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met
165 170 175 TAT GAA GTC GCG CTT ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT 576 Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala
180 185 190 AAT
GTA TAT AGC AAT ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT 624 Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr
195 200 205 ATT AGT AAT GAC GAG AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT 663 Ile Ser Asn Asp Glu Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn
210 215 220 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 248 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine (v) TYPE DE FRAGMENT : fragment interne (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME : Bacillus (B) SOUCHE : 720/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :
SEQ ID NO : 4 :
Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe - 25-20-15
<Desc/Clms Page number 37>
Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala Gln Ile Val Thr Asp - 10-5 1 5
Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe rrp Lys Asp
10 15 20
Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His Gly Gly Thr Phe Ser
25 30 35
Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys
40 45 50
Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly Asn Met Ser Ile Asn
55 60 65 Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Cys Val Tyr
70 75 80 85 Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp
90 95 100 Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys Gly Thr Ile Thr Val
105 110 115 Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gln Pro
120 125 130
Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser
Val Arg Arg
135 140 145
Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Asn His Phe Arg Ala
150 155 160 165 Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lvs Met Tyr Glu Val Ala Leu
170 li5 180 Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn
185 190 195 Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr Ile Ser Asn Asp Glu
200 205 210 Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn
215 220 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 744 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire
<Desc/Clms Page number 38>
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 5 :
ATGAGACAAA AGAAATTGAC GTTGATTTTA GCCTTTTTAG TTTGTTTTGC ACTAACCTTA 60 CCTGCAGAAA TAATTCAGGC ACAAATCGTC ACCGACAATT CCATTGGCAA CCACGATGGC 120
EMI38.1
TATGATTATG AATTTTGGAA AGATAGCGGT GGCTCTGGGA CAATGATTCT CAATCATGGC 180 GGTACGTTCA GTGCCCAATG GAACAATGTT AACAACATAT TATTCCGTAA AGGTAAAAAA 240 TTCAATGAAA CACAAACACA CCAACAAGTT GGTAACATGT CCATAAACTA CGGAGCCAAC 300 TTCCAACCAA ATGGTAATGC GTATTTATGC GTCTATGGTT GGACTGTTGA CCCTCTTGTC 360 GAATATTATA TTGTCGACAG TTGGGGCAAC TGGCGTCCAC CAGGAGCAAC GCCTAAGGGG 420 ACCATCACTG TTGATGGAGG AACATATGAT ATCTACGAGA CTCTTAGAGT CAATCAACCC 480 TCCATTAAGG GGATTGCCAC ATTTAAACAA TATTGGAGTG TTCGAAGATC GAAACGCACG 540 AGTGGCACGA TTTCTGTCAG CAACCACTTT AGAGCGTGGG AAAACTTAGG GATGAATATG 600 GGGAAAATGT ATGAAGTCGC GCTTACTGTA GAAGGCTATC AAAGTAGCGG AAGTGCTAAT 660 GTATATAGCA ATACACTAAG AATTAACGGT AACCCTCTCT CAACTATTAG TAATGACGAG
720 AGCATAACTT TGGATAAAAA CAAT 744 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 744 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 6 :
ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC TTT TTA GTT TGT TTT 48 Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe - 25-20-15 GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA CAA ATC GTC ACC GAC 96 Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala Gln Ile Val Thr Asp - 10-5 1 5
<Desc/Clms Page number 39>
AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT GAA TTT TGG AAA GAT 144 Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe Trp Lys Asp
10 15 20 AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT GGC GGT ACG TTC AGT 192 Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His Gly Gly Thr Phe Ser
EMI39.1
25 30 35 t GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ATA TTA TTC CGT AAA GGT AAA AAA 240 Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys 40 45 50 TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT AAC ATG TCC ATA AAC 288 Phe Asn Glu Thr Gln Thr His
Gln Gln Val Gly Asn Met Ser Ile Asn
55 60 65 TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG TAT TTA TGC GTC TAT 336 Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Cys Val Tyr
70 75 80 85 GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT ATT GTC GAC AGT TGG 384 Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp
90 95 100 GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG GGG ACC ATC ACT GTT 432 Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys Gly Thr Ile Thr Val
105 110 115 GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT AGA GTC AAT CAA CCC 480 Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gln Pro
120 125 130 TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT TGG AGT GTT CGA AGA 528 Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg
135 140 145 TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC AAC CAC TTT AGA GCG 576 Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Asn His Phe Arg Ala
150 155 160 165 TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG TAT GAA GTC GCG CTT 624 Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala Leu
170 175 180 ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT AAT GTA TAT AGC AAT 672 Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn
185 190 195 ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT ATT AGT AAT GAC GAG 720 Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr Ile Ser Asn Asp Glu
200 205 210
<Desc/Clms Page number 40>
AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT 744 Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn
215 220 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 27 acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide (v) TYPE DE FRAGMENT : fragment interne (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME : Bacillus (B) SOUCHE : 720/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :
* SEQ ID NO : 7 : Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe - 25-20-15 Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala - 10-5 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 81 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 8 : ATGAGACAAA AGAAATTGAC GTTGATTTTA GCCTTTTTAG TTTGTTTTGC ACTAACCTTA 60 CCTGCAGAAA TAATTCAGGC A 81 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 9 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 81 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire
<Desc/Clms Page number 41>
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 9 :
ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC TTT TTA GTT TGT TTT 48 Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe - 25-20-15 GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA 81 Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala - 10-5 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 10 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 1513 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 10 :
AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 180 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC TCATTCATAC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360 TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420 AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCAAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTAA TGAGACAAAA GAAATTGACG TTGATTTTAG CCTTTTTAGT 660 TTGTTTTGCA
CTAACCTTAC CTGCAGAAAT AATTCAGGCA CAAATCGTCA CCGACAATTC 720 CATTGGCAAC CACGATGGCT ATGATTATGA ATTTTGGAAA GATAGCGGTG GCTCTGGGAC 780
<Desc/Clms Page number 42>
AATGATTCTC AATCATGGCG GTACGTTCAG TGCCCAATGG AACAATGTTA ACAACATATT 840
EMI42.1
ATTCCGTAAA GGTAAAAAAT TCAATGAAAC ACAAACACAC CAACAAGTTG GTAACATGTC 900 CATAAACTAC GGAGCCAACT TCCAACCAAA TGGTAATGCG TATTTATGCG TCTATGGTTG 960 GACTGTTGAC CCTCTTGTCG AATATTATAT TGTCGACAGT TGGGGCAACT GGCGTCCACC 1020 AGGAGCAACG CCTAAGGGGA CCATCACTGT TGATGGAGGA ACATATGATA TCTACGAGAC 1080 TCTTAGAGTC AATCAACCCT CCATTAAGGG GATTGCCACA TTTAAACAAT ATTGGAGTGT 1140 TCGAAGATCG AAACGCACGA GTGGCACGAT TTCTGTCAGC AACCACTTTA GAGCGTGGGA 1200 AAACTTAGGG ATGAATATGG GGAAAATGTA TGAAGTCGCG
CTTACTGTAG AAGGCTATCA 1260 AAGTAGCGGA AGTGCTAATG TATATAGCAA TACACTAAGA ATTAACGGTA ACCCTCTCTC 1320 AACTATTAGT AATGACGAGA GCATAACTTT GGATAAAAAC AATTAAAAAT CCTTATCTCT 1380
EMI42.2
TTCGGTTCAG TTCTCATTAT TTTCAAATAA CCTCCCGGTT GGATCTTTTC CAACGGGAGG 1440 TTTTATTGGA AAGGTTAAGT ATAGTATACT CCGATTCCAT CCAGAGGAAT GCTTGAAACA 1500 CCTCCGTCAC TAG 1513 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 11 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 619 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 11 :
AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 180 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC TCATTCATAC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360 TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420
<Desc/Clms Page number 43>
AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCAAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTA 619 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 12 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 150 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 12 : TAAAAATCCT TATCTCTTTC GGTTCAGTTC TCATTATTTT CAAATAACCT CCCGGTTGGA 60 TCTTTTCCAA CGGGAGGTTT TATTGGAAAG GTTAAGTATA GTATACTCCG ATTCCATCCA 120 GAGGAATGCT TGAAACACCT CCGTCACTAG 150 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 13 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 1513 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN génomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 13 :
AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 180 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC TCATTCATAC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360
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TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420 AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCAAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTA ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC 652
Met Arg Gln Lys Lys Leu Thr Leu Ile Leu Ala
- 25-20 TTT TTA GTT TGT TTT GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA 700 Phe Leu Val Cys Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu Ile Ile Gln Ala - 15-10-5 CAA ATC GTC ACC GAC AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT 748 Gln Ile Val Thr Asp Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr
1 5 10 15 GAA TTT TGG AAA GAT AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT 796 Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His
20 25 30 GGC GGT ACG TTC AGT GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ATA TTA TTC 844 Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gln Trp Asn Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe
35 40 45
EMI44.1
CGT AAA GGT AAA AAA TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT 892 Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Val Gly 50 55 60 AAC ATG TCC ATA AAC TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG 940 Asn Met Ser Ile Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gln Pro Asn Gly
Asn Ala
65 70 75 80 TAT TTA TGC GTC TAT GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT 988 Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr
85 90 95 ATT GTC GAC AGT TGG GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG 1036 Ile Val Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys
100 105 110 GGG ACC ATC ACT GTT GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT 1084 Gly Thr Ile Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu
115 120 125 AGA GTC AAT CAA CCC TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT 1132 Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr
130 135 140
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TGG AGT GTT CGA AGA TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC 1180 Trp Ser Val Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser 145 150 155 160 AAC CAC TTT AGA GCG TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG 1228 Asn His Phe Arg Ala Trp
Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met
165 170 175 TAT GAA GTC GCG CTT ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT 1276 Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala
180 185 190 AAT GTA TAT AGC AAT ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT 1324 Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Arg Ile Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr
195 200 205 ATT AGT AAT GAC GAG AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT TAAAAATCCT 1373 Ile Ser Asn Asp Glu Ser Ile Thr Leu Asp Lys Asn Asn
210 215 220 TATCTCTTTC GGTTCAGTTC TCATTATTTT CAAATAACCT CCCGGTTGGA TCTTTTCCAA 1433 CGGGAGGTTT TATTGGAAAG GTTAAGTATA GTATACTCCG ATTCCATCCA GAGGAATGCT 1493 TGAAACACCT CCGTCACTAG 1513 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 14 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 56 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (oligonucléotide synthétique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 14 : CCCCCCTACG TAGCGGCCGC CCCGGCCGGT AACCTAGGAA GTCAGCGCCC TGCACC 56 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 15 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 56 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (oligonucléotide synthétique)
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(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 15 : CCCCCCTACG TAGGCCGGGG CGGCCGCGGT TACCTAGGGC CTCGTGATAC GCCTAT 56 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 16 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 31 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (oligonucléotide synthétique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 16 : ACGAGGAAAG ATGCTGTTCT TGTAAATGAG T 31 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO : 17 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 19 paires de bases (B) TYPE : acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (oligonucléotide synthétique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 17 : TACCTTGTCT ACAAACCCC 19