JPH08500970A

JPH08500970A - ヒストリチクス菌からのコラゲナーゼ産生に応答性の遺伝子の分子クローニング

Info

Publication number: JPH08500970A
Application number: JP6502521A
Authority: JP
Inventors: リン，ヒュン−チ; レイ，シャオ−ピン
Original assignee: トライジェン，インコーポレーテッド
Priority date: 1992-06-22
Filing date: 1993-06-22
Publication date: 1996-02-06
Also published as: EP0654084A1; AU4644793A; WO1994000580A1; EP0654084A4; CA2138948A1

Abstract

(57)【要約】非天然型および天然型のヒストリチスク菌コラゲナーゼをコードする挿入部を含むベクターを担っている遺伝子工学的に操作されたE.coli。コラゲナーゼをコードする組換えＤＮＡセグメントは形質転換細胞により効率よく発現され、酵素的に活性で、免疫学的に交差反応性のコラゲナーゼをもたらす。遺伝子工学的操作により産生されたコラゲナーゼは膵島の分離、内皮細胞の分離、分散した腫瘍細胞の分離、あるいは“椎間板ヘルニア”の治療に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒストリチクス菌からのコラゲナーゼ産生に応答性の遺伝子の分子クローニング背景本発明は、ヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）コラゲナーゼをコードする遺伝情報の単離及びクローニング及び適する宿主内でのその遺伝情報の発現に関する。特に、この発明は、ヒストリチクス菌ゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量を有する型を含むヒストリチクス菌コラゲナーゼの型をコードする遺伝情報の単離及びクローニングに向けられている。要旨本発明によれば、ヒストリチクス菌コラゲナーゼの酵素活性及び抗原性を有するポリペプチドをコードする組換えＤＮＡセグメントが提供される。しかしながら、このポリペプチドは、天然のヒストリチクス菌コラゲナーゼ、即ち、ヒストリチクス菌ゲノムの自然発現により産生され続いてヒストリチクス菌から精製されるコラゲナーゼと区別可能である。ここでは非天然型と言うことにする本発明のこのポリペプチドは、ヒストリチクス菌ゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量を有する。特許請求する組換えＤＮＡセグメントは、ヒストリチクス菌由来のプロモーターを含む。このプロモーターは独立して作動し、特許請求するＤＮＡセグメントが前記プロモーターの制御の下に転写されるのを可能にして、特許請求する組換えＤＮＡセグメントの外部にあるプロモーターが機能することなしに特許請求するポリペプチドを産生する。特許請求する組換えＤＮＡセグメントは、更に、特許請求する非天然の、つまり高分子量のポリペプチドよりも低い分子量を有する、コラゲナーゼ活性を有する天然ポリペプチドを発現することができる。本発明は、更に、特許請求する組換えＤＮＡセグメントを含みかつ宿主細胞を形質転換して特許請求する非天然ポリペプチドを産生することができるベクターを提供する。本発明者らは、形質転換された宿主細胞内の特許請求する組換えＤＮＡセグメントの発現がその宿主細胞の株によって決定されるということを見出した。従って、本発明のベクターで形質転換された異なる大腸菌宿主細胞が提供される。宿主細胞株の１つは、コラゲナーゼ活性と抗原性を有する本発明の非天然ポリペプチドを産生する。この宿主細胞によって産生されるコラゲナーゼ活性を有するポリペプチド全体のうち５０重量％を超えるものが非天然高分子量ポリペプチドを含む。本発明は、更に、本発明のベクターで形質転換された他の大腸菌宿主細胞を提供する。これら宿主細胞は、コラゲナーゼ活性と抗原性を有しかつ１１０，０００の分子量を有するポリペプチドを産生する。これら細胞によって産生されるコラゲナーゼ活性を有するポリペプチドの５０重量％を超えるものが１１０ｋｄコラゲナーゼを含む。本発明の他の側面は、ヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物に関連する。１つの試料は、コラゲナーゼの非天然型を含む。本発明の実質的に精製された他の調製物は、１１０ｋｄの分子量を有するコラゲナーゼを含む。これら型のコラゲナーゼは、本発明のベクターで形質転換された異なる株の大腸菌宿主細胞に由来する。更に、本発明に従って遺伝子操作された大腸菌宿主細胞により産生されるコラゲナーゼを用いる方法が提供される。これら方法は、結合組織の消化及び包埋細胞の放出、膵臓組織から分散された膵島の単離、血管からの内皮細胞の単離、及び分散した腫瘍細胞を単離するための腫瘍の解離などに適している。この方法は、次の２工程を含む： (1) 分散すべき組織を、本発明の実質的に精製された遺伝子操作コラゲナーゼを含有する緩衝溶液中で約２５〜３９℃で振とうしながらインキュベートし、包埋細胞を放出及び分散させ；そして (2) その分散した細胞を組織破片から分離する。組織破片から分散細胞を分離する工程は、典型的には、密度勾配遠心分離法により行われる。遺伝子操作した本発明のヒストリチクス菌コラゲナーゼは、髄核のヘルニア（椎間板ヘルニア）の円板内（intradiscal）治療方法に用いてもよい。この方法は、次の工程を含む： (1) 特許請求する実質的に精製された遺伝子操作コラゲナーゼを含有する無菌の緩衝溶液を調製し；そして (2) その特許請求する実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する無菌の緩衝溶液を髄核に注入する。本発明のこれら及びその他の特徴、側面、及び効果は、以下の説明、添付の請求の範囲、及び添付図面を参照することによってより良好に理解されるであろう。図面図１は、無傷１２５ｋｄコラゲナーゼの発現プラスミドを得るためのクローニング戦略の略図である。図２は、大腸菌株ＤＨ５α内でのコラゲナーゼの発現を示す。図３は、コラゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列決定用のプラスミドｐＣＴ６及びｐＣＴ７の構築を示す。図４は、１２５ｋｄコラゲナーゼをコードする遺伝子の部分的ＤＮＡ配列を決定するのに用いた種々のクローンを示す。図５は、１２５ｋｄコラゲナーゼ遺伝子の転写終結シグナルである。図６ａは、市販のコラゲナーゼと比較した１２５ｋｄコラゲナーゼのクマシーブルー染色ゲルであり；図６ｂは、市販のコラゲナーゼと比較したｌ２５ｋｄコラゲナーゼのウェスタンブロットである。図７は、レーン１に、プラスミドｐ７０を含有する大腸菌株ＤＨ５αからの培養培地のクマシーブルー染色ゲルを示し；レーン２は、培養培地からの精製１２５ｋｄコラゲナーゼのクマシーブルー染色ゲルである。図８は、プラスミドｐＣＴ１１．１０の制限酵素地図である。図９は、ＩＰＴＧがｐＣＴ１１．１０を保持する大腸菌ＤＨ５αからの組換えコラゲナーゼの発現を誘発しないことを示すクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図１０は、ｐＲＳ２１及びｐＣＴ８Ｂから産生した組換えコラゲナーゼのウェスタンイムノブロットの比較である。図１１ａは、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥであり；図１１ｂは、イムノブロットであり、いずれも大腸菌内で産生した組換えコラゲナーゼの細胞内局在性を示している。図１２は、組換え１１０ｋｄコラゲナーゼと天然産生１１０ｋｄコラゲナーゼの精製及び比較のクマシーブルー染色及びイムノブロットの結果を示す。詳細な説明本発明者らは、ヒストリチクス菌の遺伝子を大腸菌内にクローン化した。このクローン化遺伝子、即ち、本発明の組換えＤＮＡセグメントは、大腸菌内でポリペプチドとして産物を発現できる。大腸菌内で発現されたその産物は、抗コラゲナーゼ抗体と免疫反応性であるタンパク質の形でも検定可能なコラゲナーゼ活性、即ち、コラーゲン消化の形でも検出可能である。それが挿入される大腸菌宿主に依存して、4.9キロベースを有する同じ組換えＤＮＡセグメントが翻訳されると、以下の実施例３及び１１に記載するように、コラゲナーゼ活性を有する幾つかのポリペプチドを産することが見出された。特許請求する本発明による組換えＤＮＡセグメントで形質転換された大腸菌株ＤＨ５αは、特に、コラゲナーゼ活性と抗原性を有する、天然のヒストリチクス菌コラゲナーゼと区別可能なポリペプチドを産生した。この非天然ポリペプチドの明確に異なる特徴は、それがヒストリチクス菌ゲノミックコード配列の自然配列によって測定された翻訳産物よりも高い分子量を有することであった。自然発現によって測定されたヒストリチクス菌コラゲナーゼは、コラゲナーゼをコードするＤＮＡセグメントを保持する遺伝子ベクターが導入されていないヒストリチクス菌により直接に産生されるコラゲナーゼの型である。以下の実施例で記載するように、種々の商業的供給業者から購入したヒストリチクス菌の天然コラゲナーゼは、本発明の非天然コラゲナーゼと同じサイズの分子量を有しない。実施例８に詳述するように、特許請求する組換えＤＮＡセグメントは、ヒストリチクス菌由来のプロモーターを含むことが見出された。以下に記載するように、コラゲナーゼをコードする本発明の4.9ｋｂ組換えＤＮＡフラグメントは、大腸菌内で独立に機能するクロストリジウムプロモーターを含んだ。特許請求する組換えＤＮＡセグメントは、本発明の非天然コラゲナーゼよりも低いコラゲナーゼ活性と分子量を有するポリペプチドを発現することが見出された。実施例に記載するように、特許請求するＤＮＡセグメントから発現される天然及び非天然コラゲナーゼの相対比は、本発明のベクターを介して特許請求するＤＮＡセグメントで形質転換される大腸菌宿主細胞に従って変動する。ヒストリチクス菌からＤＮＡを単離した後、クロストリジウムＤＮＡを含有するｐＲＫ２９０ライブラリーを構築して（実施例１）そのコラゲナーゼ遺伝子をスクリーニングした。挿入したコラゲナーゼ遺伝子の特徴を制限酵素分析によって明らかにした（実施例２）。実施例４でコラゲナーゼ遺伝子の更なる特徴付けを行った。そこでは、その挿入物を順次欠失させたプラスミドｐＣＴ６及びｐＣＴ７内に反対の挿入方向で配置した。２５５１塩基対を配列決定した。完全ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１に示す。このＤＮＡ配列がクロストリジウムコラゲナーゼ遺伝子を含むことの更なる確認を実施例５及び６に示す。大腸菌内でのクロストリジウムコラゲナーゼ遺伝子の発現には、クロストリジウムＤＮＡを保持する適するプラスミド又は他のベクターでの宿主大腸菌細胞の形質転換又は形質移入及びその形質転換細胞によって産生するコラゲナーゼの検出を要する。米国特許出願第０７／４９８，９１９号に記載された形質転換及びコラゲナーゼ検出を行う標準的方法を用いて、本発明者らは、実施例３、７、９、１０及び１１において、形質転換宿主細胞内での特許請求した組換えＤＮＡセグメントの発現を宿主細胞の株によって確認する。実施例３は、約２％の形質転換大腸菌可溶性タンパク質が、抗コラゲナーゼ抗体でのイムノブロッティングにより、ウェスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色でコラゲナーゼであったことを証明している。実施例８に記載するように、大腸菌内でのコラゲナーゼ発現の制御が、ヒストリチクス菌由来の特許請求したＤＮＡセグメントを含む独立プロモーターの制御下のものであることが見出された。本発明者らは、以下の実施例１０に記載するように、形質転換大腸菌細胞から及びこれら細胞を生育させた培養培地から天然及び非天然のコラゲナーゼを産生させて精製した。細胞からのこれら酵素の精製は、当該技術分野で既知の標準的方法を包含するものであった。本発明者らは、意外にも、これら形質転換細胞が生育した発酵ブロス中に大量のコラゲナーゼを見出した。その観察に基づいて、実質的に純粋な非天然コラゲナーゼ及び１１０ｋｄコラゲナーゼの調製物を得るためのコラゲナーゼ精製戦略を立てた。形質転換細胞から精製した組換えコラゲナーゼのコラーゲン消化活性は、細胞から精製した組換えコラゲナーゼの活性とほぼ等しいことが分かった（実施例１０の表１）。精製組換え非天然コラゲナーゼのコラーゲン消化活性を、市販の天然型精製コラゲナーゼと比較した（実施例１１の表２）。組換えコラゲナーゼは、ウォーシントン（Worthington）・ケミカル、シグマ・ケミカル、及びカルバイオケム（CalBiochem）から得た天然コラゲナーゼよりも活性が５０％から１００％高かった。特許請求するＤＮＡセグメントを含有する遺伝子操作大腸菌により産生された精製組換え非天然又は組換え天然１１０ｋｄコラゲナーゼは、コラーゲンを消化することが望まれるあらゆる応用に用いることができる。組織から細胞を単離又は放出する特定の応用には：(1)細胞膜及び他の必須の特徴を破壊することなく結合組織を消化して包埋細胞を放出すること；(2)内皮細胞を単離すること；(3) 腫瘍を解離すること；及び(4)髄核のヘルニア（椎間板ヘルニア）の円板内治療；が含まれる。実施例１２に示すように、本発明の精製１１０ｋｄ組換えコラゲナーゼは、トリプシンと組み合わせると、ヒト伏在静脈から内皮細胞を単離するのに効果的であった。標的組織及び動物に依存して、本発明の方法を用いて解離組織試料を得るための組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）、又は天然クラスIIコラゲナーゼ、又は中性プロテアーゼの量は変動してもよい（ウォルターズ（G.H.J.Wolters），“An Analysis of theRole of Colla genase and Protease in the EnzymaticDissociation of the Rat Pancreas for Islet Isolation”，Diabetologia,35:735-742(1992)）。本発明の組成物及び方法において組換えコラゲナーゼと共に要する中性プロテアーゼのタイプ及び量は、標的組織に依存して変動してもよい。本発明の方法を用いて組織を消化又は解離するのに、粗製又は精製天然コラゲナーゼ以外のプロテアーゼを、組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）を含む組成物に用いてもよい。実施例以下の実施例は説明のためだけであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。実施例１無傷１２５ｋｄコラゲナーゼをコードする遺伝子のクローニング及びスクリーニング無傷１２５ｋｄコラゲナーゼをコードする遺伝子の方向は、米国特許出願第０７／４９８，９１９号において確認された。以下の実施例４及び５に記載するように、遺伝子の終点をその遺伝子の配列決定によって確認し、Ｂｇｌ II部位に密接していることが分かった。上の情報によって規定されるように、2.5ｋｂＤＮＡフラグメントが、最初のＥｃｏＲＩ部位から２番目のＥｃｏＲＩ部位を通過してＢｇｌ II部位に伸びていた。2.5ｋｂＤＮＡフラグメントは、約１２５ｋｄの分子量を有するコラゲナーゼをコードするには十分なサイズではない。それには、約4.4ｋｂを要する。従って、より多くのコラゲナーゼ遺伝子配列を同定しようと、新たなライブラリーを調製した。これは、Ｂｇｌ IIライブラリーの構築を包含した。ゲノミックＤＮＡからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような小さなプラスミドに直接にＢｇｌ IIフラグメントをクローン化しようと試みた。本発明者らは、１２５ｋｄの分子量においてコラゲナーゼバンドを同定したが、独立の２実験を包含する第２スクリーニングでは、その分子量は６８ｋｄのようであった。本発明者らは、ｐＲＫ２９０（ハース（Haas，D．），Experientia，39:1199( 1983)）の如き低コピー数（細胞当たり１〜１０コピー）の他のプラスミドを用いた。これにより、全縁コラゲナーゼ遺伝子をクローニングすることができた。しかしながら、Ｂｇｌ IIフラグメントをｐＵＣ８の如き小さなプラスミドにクローニングする困難さが残った。にも拘らず、本発明者らは、全縁コラゲナーゼ遺伝子を組み込んだそのようなｐＵＣ８プラスミドの構築を達成した。Ａ．ヒストリチクス菌からのＤＮＡ単離ヒストリチクス菌ＡＴＣＣ２１０００をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た。この細菌を含有する紙製の錠剤をまずＴＹＥブロス（培養培地１リッター当たり１５ｇトリプシン、１０ｇ酵母エキス、及び５ｇＮａＣｌ）中に４℃で３０分間時々振とうさせながら浸した。この細胞懸濁液をＴＹＥアガープレート上に塗って嫌気性条件下で３７℃で生育させた。単一のコロニーを拾って５０ｍｌＴＹＥブロス中で生育させ、嫌気性条件下で３７℃で生育させた。遠心分離によって細胞を採集して、ＴＥＳ（０．１Ｍトリス（ｐＨ8. ０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、及び０．１５ＭＮａＣｌ）中に再懸濁した。この細胞懸濁液を４回凍結及び融解することによって細胞を部分的に溶解した。次いで、ＳＤＳ及びプロナーゼＫを添加してそれぞれ０．５％及び２００μｇ／ｍＬの最終濃度にした。ベックマンＪ２−２１遠心分離機での１０，０００ｒｐｍで４℃３０分間の遠心分離によって細胞破片を除去した。上澄み液を等容量のフェノール−クロロホルムで３回抽出して、ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させた。このＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動に付し、臭化エチジウムの添加後に蛍光を既知の濃度スタンダードの蛍光と比較することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。精製クロストリジウムＤＮＡの平均サイズは、０．６％アガロースゲルでの電気泳動によって測定して３０ｋｂ及び４０ｋｂであった。Ｂ．クロストリジウムＤＮＡを含有するｐＲＫ２９０ライブラリーの構築精製ヒストリチクス菌染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ IIで消化した。エタノール沈殿の後、消化ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁した。適当量の消化ＤＮＡを、前もってＢｇｌ IIで開裂してアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＲＫ２９０と連結した。連結は４℃で１６時間行った。この連結ＤＮＡを記載されている通りに大腸菌株ＤＨ５α内に形質転換した。形質転換細胞をＴＹＥ−Ｔｃ（１リッター当たり１５ｇトリプトン、１０ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣｌ、及び１５ｍｇのテトラサイクリン）プレート上にプレートして３５℃一晩インキュベートした。Ｃ．コラゲナーゼ遺伝子のスクリーニングプレート当たり約１，０００コロニーを得た。約１０プレートを無傷コラゲナーゼ遺伝子についてスクリーニングした。簡単に説明すると、３５℃で１６時間のインキュベーションを行った後、乾燥したニトロセルロースペーパー（Ｓ＆Ｓ）をペトリ皿の上に置いてそれらコロニーを吸収した。そのニトロセルロースペーパーを注意してプレートから離して、調製したばかりのＴＹＥ−Ｔｃアガープレートに移し、そして３５℃で更に４時間インキュベートした。もとのプレートをマスタープレートとして４℃で貯蔵した。ニトロセルロースペーパーを注意してそのプレートから取り去って、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．２ＭＮａＣｌ、及び５％スキムミルク中に浸し、そして静かに振とうしてそのニトロセルロースペーパーから細菌細胞を除去した。このニトロセルロースペーパーをウサギ抗コラゲナーゼ抗体（米国特許出願第０７／４９８，９１９号の実施例２に詳述されている）と共に１：１０００の希釈度で５％スキムミルクと共に室温で１時間インキュベートし、０．２ＭＮａＣｌ及び１％トリトン（商標）Ｘ−１００を含有する０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次いでプロテインＡ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体と共に５％スキムミルクを含むＰＢＳ中１：１０００の希釈度で室温で１時間インキュベートした。ヤングとディビス（R.A.Young & R.W. Davis），“Efficient Isolation of Gen es byUsing Antibody Probes”，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80,1194-119 8 (1983)に記載された通りに、洗浄操作を繰り返してこのニトロセルロースペーパーをＰＢＳ中で４−クロロ−１−ナフトールとＨ₂Ｏ₂で発色させた。このニトロセルロース上の陽性シグナルの位置に対応するプレート上のアガロースの部分を取ってＴＹＥ−Ｔｃブロス中に再懸濁させた。低細胞密度に段階的に希釈した細胞懸濁液（プレート当たり３０〜１００細胞）をＴＹＥ−Ｔｃプレート上に再プレートし、第２スクリーニングを行って単一のコロニーを同定した。Ｐ７０と名付けられたこの１コロニーは強いシグナルを示した。これを採集してＴＹＥ−Ｔｃブロス中で生育させた。このコロニーの特徴を以下の実施例２及び３のように更に明らかにした。実施例２挿入ＤＮＡの制限酵素分析プラスミドＰ７０内のクロストリジウムＤＮＡの構成をより正確に特徴付けするために、Ｐ７０を更なる制限酵素分析に付した。プラスミドＰ７０からのＤＮＡを、記載された通りに調製した（マニアチス(Maniatis)）。精製ＤＮＡをＢｇｌ IIで消化してクローン化ＤＮＡ挿入物を放出させた。見掛けのサイズが４．９ｋｂのＤＮＡフラグメントをＢｇｌ II消化によってベクターｐＲＫ２９０から放出させた。Ｂｇｌ IIとＥｃｏＲＩを組み合わせてｐ７０を更に消化し、同じ酵素で消化したｐＢＢ１及びｐＲＳ２１と比較した。３つ全てのプラスミドは、同一の１．７ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ IIフラグメントを放出した。Ｐ７０及びｐＢＢｌのいずれも同一の０．８ｋｂＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを放出した。これら制限酵素分析は、３つ全てのプラスミドが共通のＤＮＡフラグメントを有し、Ｐ７０は２．４ｋｂＢｇｌ II−ＥｃｏＲＩフラグメントの余剰片を有したことを示唆した。実施例３大腸菌株ＤＨ５α内で産生されたコラゲナーゼの特徴付け免疫反応性タンパク質のサイズを調べるために、Ｐ７０を含有する細胞を遠心分離によって採集し、ゲル泳動用緩衝液中に再懸濁し、加熱し、ラエムリ（Laem mli, U.K.），“Cleavage ofStructural Proteins During the Assembly of the Head ofBacteriophage T4”，Nature, 227:680-685(1970)に記載された通りに７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけた。それらタンパク質をニトロセルロースペーパー上にエレクトロブロットして、米国特許出願第０７／４９８，９１９号（バーネット（W.H.Burnette），“Western Blotting: Electrophore tic Transfer ofProteins form SDS-polyacrylamide Gels to UnmodifiedNitroc ellulose and Radiographic Detection with Antibodyand Radioiodinated Prot ein A”，Anal. Biochem., 112, 195-203(1981)）のウサギ抗コラゲナーゼ抗体で検出した。Ｐ７０クローンからのコラゲナーゼの分子量は、予備染色したタンパク質スタンダードとの比較によって決定した。約１２５ｋｄ及びそれ未満の分子量を有する免疫反応性タンパク質バンドがＰ７０クローンから発現した。６８〜１００ｋｄの分子量を有する幾つかのバンドは、本発明者らが米国特許出願第０７／４９８，９１９号に記載したものと類似している。大腸菌株ＤＨ５αをプラスミドｐＵＣ８又はＰ７０でそれぞれ形質転換して２５０ｍｌフラスコ内の５０ｍｌのＴＹＥブロス中で生育させた。細胞を採取して、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）及び１ｍＭＰＭＳＦ中に再懸濁し、そして音波処理した。遠心分離によって細胞破片を除去した後、タンパク質濃度を測定して同量のタンパク質を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にのせて泳動させた。本発明の組換えＤＮＡセグメントの発現を図２に示す。パネルＡは、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１はプラスミドｐＵＣ８を保持する大腸菌株ＤＨ５αであり、レーン２はプラスミドＰ７０を保持する大腸菌株ＤＨ５αである。パネルＢは、Ｐ７０を保持する大腸菌株から調製した細胞抽出物のクマシーブルー染色（レーン１）及びイムノブロット（レーン２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ｐＵＣ８を保持する細胞ではなくプラスミドＰ７０を保持する細胞から調製した細胞抽出物では、非常に強いクマシーブルー染色タンパク質バンドが分子量２００キロダルトンと９７キロダルトンの間に可視化された。プラスミドＰ７０形質転換大腸菌株ＤＨ５αを５リッターバイオフロII発酵器（BioFloII Fermentor ）内で生育させてコラゲナーゼを産生させた。遠心分離によってそれら細胞を採取した後、細胞ペーストを−７０℃で貯蔵した。少量の細胞について更に処理して精製条件を決めた。音波処理及び澄明化した上澄み液をクマシーブルー染色及び抗コラゲナーゼ抗体でのイムノブロッティングによって試験し、図２のパネルＢに示した。クマシー染色バンドの位置は、免疫反応性タンパク質バンドと同じであった。従って、それは、２００ｋｄと９７ｋｄの間に存するクマシーブルー染色性バンドがコラゲナーゼであることを確認するものであった。いずれの生育条件の下でも、約２％の大腸菌可溶性タンパク質がコラゲナーゼであると判断された。実施例４コラゲナーゼ遺伝子の特徴付けＡ．ＤＮＡ配列決定戦略ヘニコフ（Henikoff, S.）（Methods in Enzymology,Unidirectional Digesti on With Exonuclease III in DNASequence Analysis, 155:156(1987)）により公表された非ランダムＤＮＡ配列決定戦略に僅かに手を加えて、ｐＢＢｌによりコードされる２．５ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ II ＤＮＡフラグメントの配列決定に用いた。２．５ｋｂＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ IIフラグメントをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のＢａｍＨＩ部位に反対方向に挿入することによってプラスミドｐＣＴ６とｐＣＴ７とを構築した。プラスミドｐＣＴ６とｐＣＴ７とを、Ｐ４２からの２．５ｋｂＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ IIフラグメントをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩ部位に挿入することによって構築した。プラスミドｐＣＴ６とｐＣＴ７は、図３に示すように反対の挿入方向を表わしている。一方向性欠失体（undirectionaldelet ion）を作るために、両プラスミドをまずＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで消化して、二本鎖ＤＮＡの凹んだ３’−ヒドロキシル末端と他端において突き出た３’−末端を作った。ＸｈｏＩにより作られたこの凹んだ３’−ヒドロキシル末端は、エンドヌクレアーゼIIIに感受性であり段階的に除去されたが、ＫｐｎＩにより作られた突き出た３’−末端は無傷のままであった。消化は、開裂部位から離れて標的ＤＮＡ配列の中に一方向で進行する。消化の度合いは時間によって制御した。異なる時間に採集したアリコートをＳ１ヌクレアーゼ消化に付した。この消化ＤＮＡサンプルをアガロースゲル電気泳動によって分析し、所望のサイズを有するＤＮＡフラグメントを含有するサンプルを同定した。クレノウＤＮＡポリメラーゼを添加して両ＤＮＡ末端を平滑にした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加してこのプラスミドを再環状化した。次いで、連結ＤＮＡを大腸菌株ＤＨ５α内に形質転換した。形質転換後、それら細胞をＴＹＥ−Ａｐプレート上にプレートして、３５℃で一晩生育させた。欠失の検査及び配列決定用ＤＮＡの調製のために、コロニーをランダムに拾い上げて５ｍｌのＴＹＥ−Ａｐブロス中で一晩生育させた。遠心分離によって一晩培養液から細胞を採集した。細胞ペレットをトリ−ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁してマニアチスに記載されたアルカリ法を用いることによって溶解した。エタノール沈殿後、ＤＮＡペレットを手短に乾燥してＴＥ（１０ｍＭトリス（ｐＨ８．２）、０．１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁した。欠失のサイズは制限酵素分析によって調べた。適当な欠失を有するクローンを同定してＲＮアーゼＡで更に処理した。ＲＮアーゼ消化後、そのＤＮＡを１０ＰＥＧ及び１．２５ＭＮａＣｌで沈殿させた。ＤＮＡペレットを１００％エタノールで洗浄しＴＥ緩衝液中に再懸濁した。この方法により調製したＤＮＡは、サンガーのジデオキシチェインターミネーション法（サンガー（Sanger, F.）及びカールソン（A.R. Cou lson），J.Molec. Biol. 94:441 (1975)）を用いるＤＮＡ配列決定に適していた。ＤＮＡ配列決定に用いたクローン及び得られた配列情報を図３に纏めた。ある場合には、プラスミドｐＣＴ１２．８を系統的に欠失させ、サブクローンを用いてこの配列の部分を決定した。プラスミドｐＣＴ１２．８は、Ｐ７０の４．９ｋｂＢｇｌ IIフラグメントをＢａｍＨＩで前処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）内に挿入することによって構築した。Ｂ．ＤＮＡ配列及び分析全部で２８０８塩基対の完全配列を配列番号：１に示す。このＤＮＡ配列は、通常、高比率のＡ及びＴヌクレオチド（６９％）と３１％に過ぎないＧ及びＣヌクレオチドを含有する。最初のＥｃｏＲＩ部位から２番目のＥｃｏＲＩ部位を通過して塩基対２８０８に位置するＴＡＡ終結コドンで終わるオープンリーディングフレームを同定した。９３６アミノ酸を含有する推定タンパク質配列を特定して配列番号：２に示した。この部分は、通常、殆どの他のタンパク質と比較して高度に荷電したアミノ酸（３０％）を含有する。図５に示すように、典型的な細菌性転写終結シグナル（GeneFunction in Prok aryotes，ベックウイズ（J. Beckwith）ら編，p.123, Cold Spring Harbor Labo ratory, Cold Spring Harbor,NY(1983)中のプラット（Platt, T.）及びベア（D. G. Bear）の報文）を転写終結シグナル（ＴＡＡ）から１１塩基対下流に同定した。このシグナルは、ステム−ロープ構造に続くＡ−Ｔに富む配列からなる。このデータは、このコラゲナーゼ遺伝子がこのステム−ロープ構造の下流のＡ−Ｔに富む域内で終了することを示唆した。実施例５従来のクローンのＤＮＡ配列比較従来の全てのクローンが、イムノブロット上でのそれらの移動度から判断して、同一の免疫反応性タンパク質バンドを産生したことは明らかであるが、微変異性の可能性を排除するものではなかった。もしも従来得られているクローンの間に微変異性が存在するとすれば、それは、ファン・バート（Van Wart）ら［REF］によって提案された、遺伝子重複及びその後の突然変異が異なるコラゲナーゼをもたらしたという概念を支持していたかも知れない。それらの同一性を確認するために、次の２つのＤＮＡ配列プロジェクトを行った：１）Ｐ６、Ｐ９、Ｐ４１、Ｐ４２、及びＰ５１の如き異なる挿入物を有するクローン間の配列の比較及び２）見たところ全てが同じ挿入サイズを有する従来得られた異なるもとの単離物間の配列の比較。多クローニング部位を両端に配置した（flanked）ＤＮＡ配列をフランキングユニバーサルプライマーを用いて配列決定した。平均１５０〜２００塩基対のクロストリジウムＤＮＡ配列を両末端から得た。配列を比較した後、１塩基対の相違も同定されなかった。この結果は、同じクラスのコラゲナーゼ中に相違点をもたらすことを司る手段としての遺伝子重複を支持しなかった。実施例６Ｐ７０由来のクローンのＤＮＡ配列と従来得られているクローンからの配列との比較Ｐ７０と従来得られている他のクローンの同一性を調べるため、多くのクローンを部分的に配列決定して比較した。クローンＰ７０からの０．７ｋｂＥｃｏＲＩ及び１．８ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢｇｌIIフラグメントをｐＵＣ１３又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローン化した。多クローニング部位を両端に配置したＤＮＡ配列をフランキングユニバーサルプライマーを用いて配列決定した。プラスミドｐＢＢ１、ｐＲＳ２１、及びＰ４１のフランキング配列を決定してＰ７０のサブクローンから得られた配列と比較した。相違点は認められなかった。この結果は、Ｐ７０がｐＢＢ１と同じＤＮＡフラグメントを有しかつ染色体上の同じところに位置することを示唆した。実施例７Ｐ７０のサブクローンから産生したコラゲナーゼとｐＲＳ２１から産生したコラゲナーゼとの比較Ｐ７０と先に記載した他のクローン間の同一性の特徴を更に明らかにするため、見たところ同じ挿入物を有するサブクローンから産生したコラゲナーゼ産物を比較した。Ｐ７０をＢｇｌ II及びＥｃｏＲＩで消化して、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで予備消化したｐＵＣ１８と連結した。連結ＤＮＡを大腸菌株ＤＨ５αに形質転換し、ＴＹＥ−Ａｐプレート上にプレートし、そして３５℃で一晩インキュベートした。１．７ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ II挿入物を含有しかつｐＲＳ２１と同じ挿入方向を有するクローンを同定し、ｐＣＴ８Ｂと名付けた。プラスミドｐＣＴ８Ｂ、ｐＲＳ２１、又はｐＵＣ１８のいずれかを含有する大腸菌株ＤＨ５αをＴＹＥ−Ａｐブロス中で３５℃で一晩生育させた。細胞を遠心分離により採集してＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動用緩衝液で崩壊させた。放出されたタンパク質を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけ、ニトロセルロースペーパーにエレクトロブロットした。免疫反応性バンドを先に記載した通りに検出して比較した。図１０のレーン１に示すように、ｐＵＣ１８を保持する大腸菌から産された溶解産物は、免疫反応性コラゲナーゼバンドをもたらさなかった。しかしながら、ｐＲＳ２１（レーン２）又はｐＣＴ８Ｂ（レーン３）を保持する大腸菌から産生したいずれの細胞溶解産物も、６８ｋｄの分子量を有する同一の免疫反応性タンパク質バンドを示した。これは両方のものが同じタンパク質を産生していることのあらわれである（レーン１０）。実施例８ヒストリチクス菌由来の独立プロモーターによる大腸菌内でのコラゲナーゼ発現の制御ＢａｍＨＩで予備消化したプラスミドｐＵＣ１３内にＰ７０からの４．９ｋｂＢｇｌ IIフラグメントをクローニングすることによってプラスミドｐＣＴ１１．１０を構築し図８に示した。このコラゲナーゼ遺伝子の転写方向は、Ｌａｃプロモーターと同じである。プラスミドｐＣＴ１１．１０を保持する大腸菌ＤＨ５αを５０ｍｌのＴＹＥ− Ａｐブロス中で１ｍＭＩＰＴＧと共に又はＩＰＴＧなしで３２℃で一晩振とう（１３０ｒｐｍ）しながら生育させた。細胞と上澄み液を遠心分離により分離した。この細胞と上澄み液を泳動用緩衝液と共に９５℃でインキュベートしてから、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけた。上澄み液及び細胞のもとの容量にそれぞれ等しい２０μｌ及び８０μｌを各レーンにのせ、図９に示した。クマシーブルー染色後の細胞抽出物のタンパク質プロフィールを図９のレーン１（ＩＰＴＧ含）及び２（ＩＰＴＧ不含）に示す。培養培地のタンパク質プロフィールを図９のレーン３（ＩＰＴＧ含）及び４（ＩＰＴＧ不含）に示す。ＩＰＴＧ含又はＩＰＴＧ不含では、細胞抽出物及び培養培地のいずれも組換えコラゲナーゼの発現にいかなる相違も示さなかった。強力なｌａｃプロモーター誘導物質であるＩＰＴＧは、コラゲナーゼの発現を増加させなかった。これで、４．９ｋｂＤＮＡフラグメントが、大腸菌内で独立に機能できるクロストリジウムプロモーターを含有することがさらに確認された。意外にも、図９のレーン３及び４に示すように、大量のコラゲナーゼが上澄み液中に発見された。のせた当量の上澄み液（２０μｌ）は、のせた当量の細胞（８０μｌ）の４分の１であったので、染色ゲルから判断して、８０％のコラゲナーゼが上澄み液中に存すると見積もられた。培養培地中でのコラゲナーゼの蓄積は、大腸菌細胞が培地の中にコラゲナーゼを分泌したことを示すものであった。これら細胞は、コラゲナーゼをコードする本発明の組換え遺伝子セグメントを含むこれら宿主細胞が生育した培養培地からコラゲナーゼを生産又は精製するのに簡単でコスト的に有効な方法を提供するという利益を有する。実施例９大腸菌内で発現されたコラゲナーゼの細胞内局在性異なる大腸菌コンパートメント内でのコラゲナーゼの細胞内局在性を調べた。プラスミドＰ７０を含有する大腸菌株ＤＨ５αをＴＹＥ−Ｔｃブロス中で３５℃ で５時間振とうしながら生育させた。遠心分離によって細胞を採集した。細胞ペレットを３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０％スクロース緩衝液中に再懸濁した。ライソザイム（７０マイクログラム／ｍｌ）及びＥＤＴＡ（２ｍＭ）を添加して４℃で３０分間インキュベートし、細胞壁を分解した。遠心分離によって周縁質画分を細胞質及び膜画分（ＣＭ画分）から分離した。これら周縁質画分とＣＭ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検査してクマシーブルー染色及びイムノブロット法によって検出した。図１１のパネルＡに示すように、クマシーブルー染色ゲル上に１２５ｋｄの分子量を有する明瞭なタンパク質バンドが周縁質画分中に見られ（レーン１）、そして細胞質画分中に僅かに見られた（レーン２）。図１１のパネルＢに示すように、多くの免疫反応性バンドがイムノブロットによって見られた。殆どのバンドが周縁質領域に存在した（パネルＢのレーン１）。これは、これらバンドに相当するタンパク質が内膜を通って分泌され周縁質域に蓄積することができることを示唆したものである。ゲルにのせた量に基づいて（周縁質画分は、ＣＭ画分と比較して半分の原液当量でのせた）、８０％の１２５ｋｄコラゲナーゼが周縁質領域に局在すると見積もられる。周縁質領域及び細胞質領域（レーン２）に存する免疫反応性バンドの比率は、各免疫反応性バンドの間で相違しているが、これらバンドの殆どは、見たところ、６８ｋｄの分子量を有するタンパク質バンドを除いては、周縁質領域にむしろ局在している。この６８ｋｄタンパク質は、むしろ細胞質領域内に存しており、周縁質領域には存していない。このことは、この６８ｋｄコラゲナーゼが内膜を通って効率的に輸送され得ないことを示唆している。この６８ｋｄタンパク質がｐＲＳ２１内で産生された６８ｋｄタンパク質と同一であるかは不明であるが、ｐＲＳ２１内で産生された６８ｋｄタンパク質は、周縁質領域内に分泌されることができなかった。これらデータは、大腸菌内で産生された１２５ｋｄの分子量を有するコラゲナーゼが、大腸菌の分泌メカニズムを利用して内膜を通って輸送され、周縁質領域内に蓄積され得ることを示している。実施例１０大腸菌細胞及び培養培地からのコラゲナーゼ生産と精製Ａ．大腸菌からのコラゲナーゼの生産プラスミドＰ７０を保持する大腸菌株Ｗ３１１０をニュー・ブルンスウィック（New Brunswick）・バイオフロ III発酵器中で生育させて、コラゲナーゼを生産した。発酵培地（ＦＭ，培地リッター当たりのグラム）は、ＫＨ₂ＰＯ₄，３．５；Ｋ₂ＨＰＯ₄，５．０；（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄，３．５；ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，３．５；酵母エキス，５；及びトリプトン，５からなる。５０％のグルコースを別々にオートクレーブに掛けリッター当たり１０ｍｌを添加した。ＣａＣｌ₂ 及びＺｎＣｌ₂の１Ｍストック溶液を調製して別々にオートクレーブに掛けリッター当たりそれぞれ２０μｌを添加した。Ｐ７０を保持する大腸菌株をＴＹＥ− Ｔｃ中で３０℃で一晩生育させた。この一晩培養液を発酵器内に直接接種した。ＯＤ６００が１６に等しい細胞密度に達した後、細胞を遠心分離によって採取して上澄み液と分離した。Ｂ．細胞からの精製細胞を遠心分離により採集して、１ｍＭＰＭＳＦを含む１０ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．５）中に再懸濁した。細胞を音波処理によって崩壊させ、破片を遠心分離により除去した。タンパク質を逐次硫酸アンモニウム沈殿（sequen tial ammonium sulfate precipitation）によって分画した。コラゲナーゼを含有する画分を１０ｍＭビス−トリス緩衝液（緩衝液Ａ）中に再懸濁して、同緩衝液に対して４℃ で一晩透析した。透析サンプルをまずＤＥ５２カラムクロマトグラフィーによって分画した。コラゲナーゼを含有する画分をプールして緩衝液Ａに対して透析した。透析サンプルをＱセファロースカラムクロマトグラフィーによって分画した。９８％を超える純度を得るには、ゲル濾過が必要であるかも知れない。出発原料中には多くの免疫反応性コラゲナーゼバンドが共存した。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで異なる分子量のコラゲナーゼをある程度まで分離することができた。以下の実施例１１に記載する実験では、コラゲナーゼの最も大きな型を用いた。Ｃ．培地からの精製意外にも、発酵ブロス中に大量のコラゲナーゼが検出された。培養培地からコラゲナーゼを採集及び精製できる可能性を評価するために、精製戦略を立てた。簡単に説明すると、遠心分離により細胞を除いた後に上澄み液を濃縮して、３０，０００分子量カットオフの中空繊維（アミコン（Amicon））を用いてダイア濾過（diafiltrate）した。濃縮した上澄み液を硫酸アンモニウム示差沈殿法（dif ferential precipitation）により分画した。コラゲナーゼを含有する画分を採集して、ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．５）中に再懸濁し、同緩衝液に対して透析した。透析サンプルをＤＥ５２カラム（ワットマン）上にのせてＮａＣｌで溶出させた。コラゲナーゼを含有する画分を採集してＱセファロースカラム（ファルマシア）で更に精製した。図７のレーン１は、プラスミドＰ７０を保持する大腸菌株Ｗ３１Ｉ０からの培養培地（レーン１）及びこの培養培地から精製したコラゲナーゼ（レーン２）のクマシーブルー染色ゲルを示す。細胞及び培養培地の両方から調製したコラゲナーゼのコラーゲン消化活性を比較した。培地から調製したコラゲナーゼは、細胞から調製したものの約２倍の活性を有した。Ｄ．細胞及び培地から精製したコラゲナーゼのコラーゲン消化活性細胞又は培養培地のいずれかから精製した本発明の組換えコラゲナーゼのコラーゲン消化活性を測定した。以下の実施例１１に記載する通りに活性を測定した。以下の表１はこれら活性を纏めたものである。この表の結果は、培地から精製したコラゲナーゼ活性が、細胞から精製した組換えコラゲナーゼの活性にほぼ等しいことを示している。実施例１１組換えコラゲナーゼとヒストリチクス菌により産生された天然コラゲナーゼとの比較Ａ．サイズ組換えコラゲナーゼの同定物をヒストリチクス菌により産生された天然コラゲナーゼと比較した。未精製及び精製天然型コラゲナーゼの両方を、シグマ、ベーリンガー・マンハイム・プロダクツ（コラゲナーゼＡ（ＣＨＳＡ）、コラゲナーゼＢ（ＣＨＳＢ）、コラゲナーゼＤ（ＣＨＳＤ））、ウォーシントン、及びカルバイオケムから購入した。異なる供給源のコラゲナーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、それらの分子量を調べた。典型的なクマシーブルー染色ゲル及びイムノブロットを図６に示す。図６は、組換えコラゲナーゼ（ＲＣＬ）と天然コラゲナーゼ間の比較を示す；パネルＡはクマシーブルー染色ゲルであり；パネルＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロットである。図６のレーンの割り当ては次の通りである：パネルＡ：レーン１，０．５μｇのロット１７ＲＣＬ；レーン２，２．５μｇのロット１７ＲＣＬ；レーン３，２．５μｇのＣＨＳＤ（ＢＭＢ）；レーン４，１０μｇのＣＨＳＤ；レーン５，２．５μｇのＣＨＳＢ；レーン６，１０μｇのＣＨＳＢ；レーン７，２．５μｇのＣＨＳＡ；及びレーン８，１０μｇのＣＨＳＡ。パネルＢ：レーン１，０．０１μｇのロット１７ＲＣＬ；レーン２，０．０５μ ｇのロット１７ＲＣＬ；レーン３，０．２μｇのＣＨＳＤ：レーン４，０．２μ ｇのＣＨＳＢ；及びレーン５，０．５μｇのＣＨＳＡ。本発明の精製組換えコラゲナーゼを、ベーリンガー・マンハイム社から得た市販のコラゲナーゼ（カタログ番号ＣＨＳＡ、ＣＨＳＢ、及びＣＨＳＤ）と比較した。異なる量のタンパク質を７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけた。ウェスタンブロット上のコラゲナーゼをウサギ抗コラゲナーゼ抗体で検出した。抗コラゲナーゼ抗体の調製は、米国特許出願第０７／４９８，９１９号に記載した。クマシーブルー染色によって多くのタンパク質が可視化できるが、染色性バンドの５０％を超えるものがコラゲナーゼ特異性抗体によって検出できない。最大型の組換えコラゲナーゼは、明らかに、ベーリンガー・マンハイムから得たコラゲナーゼのいかなる天然型よりも大きなサイズを示す。本発明の組換えコラゲナーゼとカルバイオケム、ウォーシントン、及びシグマから得た天然コラゲナーゼとの比較で、同一の結果が得られた。天然産物の最大コラゲナーゼ（１１０ｋｄ）に類似する組換えコラゲナーゼの型は、特別の大腸菌宿主（ＪＭ１０５株）内で定量的にかつムラなく産生することができた。Ｂ．活性異なる販売業者から市販されている精製天然コラゲナーゼのコラーゲン消化活性を、１２５ｋｄの分子量を有する精製組換えコラゲナーゼと比較した。コラーゲン消化活性は、メンドル（Mendl, I）ら，J. Clin. Invest., 32:1323(1953) に手を加えた方法に従って測定した。主要な変更は、１）用いた酵素の量を０．２又は０．４μｇに減少したこと、及び２）基質（タイプ１コラーゲン）濃度を１０ｍｇ／ｍｌに増加したことである。コラゲナーゼ活性は次のように定義される：１ユニットのコラゲナーゼ活性は、３７℃ で５時間インキュベーションした後にコラーゲンから放出されるＬ−ロイシンの１μモル当量に等しい。異なる精製コラゲナーゼの酵素活性を以下の表２に示す。組換えコラゲナーゼのコラーゲン消化活性は、天然型の精製コラゲナーゼのものよりも約２５〜１００％高かった。この結果は、本発明の組換えコラゲナーゼが天然コラゲナーゼよりも優れていることを明確に示唆している。実施例１２組換えコラゲナーゼ＋トリプシンでの内皮細胞単離大腸菌内で産生した本発明の精製組換えコラゲナーゼを用いてヒト伏在静脈から内皮細胞を採取した。ヒト伏在静脈を半分に分けて一方を０．１％タイプIIコラゲナーゼ（ウォーシントン）、０．５％ＢＳＡ、及びＰＢＳ／ＣＭＦで満たし、他方を０．０１％トリプシンを含むか又は含まない同緩衝液中の０．０４８％組換えコラゲナーゼで満たした。組換えコラゲナーゼ単独では、この静脈から内皮細胞を解放しなかった。ＲＣＬとトリプシンを組み合わせることにより、内皮細胞の収率は粗製コラゲナーゼに比較して２倍になった。これら結果は、本発明の組換えコラゲナーゼを一定濃度のトリプシンと組み合わせることによってより多くの内皮細胞が単離できることを証明した。これら結果は、異なる組織からの細胞単離に、天然コラゲナーゼを本発明の組換えコラゲナーゼと置き換えることが可能であることを更に示唆した。実施例１３組換えコラゲナーゼを含む酵素混合物を用いるラット膵島単離組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）、天然クラスIIコラゲナーゼ、及び中性プロテアーゼを含む組成物を作り、膵臓組織を分散させて膵島を放出させた。大腸菌から産生した約１１０，０００ダルトンの分子量を有する精製組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）を用いて、本発明の方法に従ってラット膵臓からラット膵島を採取した。天然クラスＩ及びIIコラゲナーゼ及び中性プロテアーゼは、ウォルターズ，“An Analysis of the Role of Collagenase and Protease in the Enzymatic Dissociation of the Rat Pancreas for IsletIsolation”，Dia betologia, 35:735-742(1992)に従って調製した。ラット膵臓の消化は、ウォルターズ(1992)の通りに行った。組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）、天然クラスIIコラゲナーゼ及び中性プロテアーゼを含む混合物は、粗製コラゲナーゼ調製物又は精製天然コラゲナーゼと中性プロテアーゼの組み合わせを用いた場合と同じラット膵島収率をもたらした。この混合物は、１０ｍｌ当たり、ＫＲＨ緩衝液（ウォルターズ，1992）２ｍｇのクラスＩ組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）、０．８ｍｇクラスII天然コラゲナーゼ、及び１００ユニットの中性プロテアーゼから構成された。同じ膵島収率を得るのに同じような消化時間を要することも観察された。これら結果は、実質的に精製された組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）を含む組成物は、膵臓組織を分散させて他の膵臓成分から膵島を放出させることを証明した。更に、組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）と他のプロテアーゼを含む組成物を用いて膵臓を消化した場合は、ウォルターズの1992年の文献に記載された他の組み合わせに比較して、膵島当たりより大きな膵島質量を有する膵島がより少なくなったことが観察された。本発明の方法を用いて膵臓を消化すると、本発明の組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）を含まない酵素組成物を用いた場合に比較して、膵島の完全性への損傷がより少なくなるように思われた。より大きな動物の膵臓消化から十分な膵島を得るには異なるロットの粗製コラゲナーゼ調製物が必要であることは知られている。従って、他の動物の膵臓消化から膵島調製物を得るには、組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）、又は天然クラスIIコラゲナーゼ、又は中性プロテアーゼの量は変動させることができる。組織消化に有用なタンパク質分解酵素の濃度を決定する手順は、ウォルターズ，19 92に例示されている。高度に精製した組換えコラゲナーゼ（配列番号：２）を含む組成物は、ヒトから膵島を単離する本発明の方法に用いることができる。本発明をある種の好ましい態様に関してかなり詳しく説明してきたが、他の態様も可能である。従って、補正した請求の範囲の精神及び範囲は、この好ましい態様の説明に限定されるべきではない。配列表配列番号：１配列の長さ：2817 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA(genomic) 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..2808 配列配列番号：２配列の長さ：936 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：3 配列の長さ：80 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA(genomic) 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 9/52 9152−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒストリチクス菌のコラゲナーゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードしているヒストリチクス菌由来のＤＮＡを含む組換えＤＮＡセグメントであって、該ポリペプチドは、ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量をもつ点で、ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物と区別できるものである、上記の組換えＤＮＡセグメント。２．転写されてｍＲＮＡを生成することができ、該ｍＲＮＡは翻訳されて請求項１のポリペプチドを生成することができる、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。３．転写されてｍＲＮＡを生成することができ、該ｍＲＮＡは翻訳されてヒストリチクス菌コラゲナーゼの抗原性を示す請求項１のポリペプチドを生成することができる、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。４．前記のＤＮΛセグメントがヒストリチクス菌由来のプロモーターを含み、それゆえ、該ＤＮＡセグメントは、宿主細胞のゲノムに組み込まれると、該ＤＮＡセグメントと無関係なプロモーターの作用を受けることなく、ヒストリチクス菌由来の該プロモーターの制御下で転写され得る、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。５．ヒストリチクス菌の構造遺伝子がコラゲナーゼ活性を有するポリペプチドをさらに発現することができ、該ポリペプチドは請求項１のポリペプチドよりも低い分子量をもつものである、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。６．宿主細胞を形質転換することができるプラスミドの中に請求項１のＤＮＡセグメントを組み入れてあるベクターであって、該プラスミドは薬剤耐性マーカーと複製起点の両方をもつプラスミドの群から選ばれたものである、上記のベクター。７．前記の宿主細胞が E．coli、Bacillus subtilis、ヒストリチクス菌、および酵母よりなる群から選ばれる、請求項６に記載のベクター。８．請求項６ベクターで形質転換された、コラゲナーゼ活性を有しかつヒストリチクス菌コラゲナーゼの抗原性を有するポリペプチドを産生する E．coli宿主細胞であって、該ポリペプチドは、ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量をもつ点で、ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物と区別できるものである、上記の E．coli宿主細胞。９．請求項６のベクターで形質転換された、コラゲナーゼ活性を有するポリペプチド類を産生する E．coli宿主細胞であって、産生された、コラゲナーゼ活性を有する総ポリペプチド類の約５０重量％以上がヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量をもつポリペプチドで占められている、上記の E．coli宿主細胞。 10．請求項６のベクターで形質転換された、コラゲナーゼ活性を有する分子量が約１１０，０００ダルトンのポリペプチドを産生する E．coli宿主細胞であって、約１１０，０００ダルトンの分子量の該ポリペプチドが、産生された、コラゲナーゼ活性を有する総ポリペプチドの約５０重量％以上を占めている、上記の E ． coli宿主細胞。 11．ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物。 12．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから精製された請求項10に記載の調製物。 13．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物。 14．ヒストリチクス菌のゲノミックコード配列の自然発現により測定された翻訳産物よりも高い分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物を含有する組成物。 15．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物を含有する組成物。 16．細胞膜および他の必要な構造を破壊せずに結合組織を消化して包埋細胞を放出させる方法であって、次の段階： (a) 請求項11の実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する緩衝溶液中で組織を約２５〜３９℃で振とうしながらインキュベートし、包埋細胞を放出および分散させること；および (b) 分散した細胞を組織破片から分離すること；からなる方法。 17．分散した細胞を組織破片から分離する段階を密度勾配遠心分離により行う、請求項16に記載の方法。 18．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物を用いる、請求項16に記載の方法。 19．分散した膵島を単離する方法であって、次の段階： (a) 請求項11の実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する緩衝溶液中で膵臓の組織を約２５〜３９℃で振とうしながらインキュベートし、膵島を放出および分散させること；および (b) 分散した膵島を組織破片から分離すること；からなる方法。 20．分散した膵島を分離する段階を密度勾配遠心分離により行う、請求項19に記載の方法。 21．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物を用いる、請求項19に記載の方法。 22．腫瘍を解離させる方法であって、次の段階： (a) 請求項11の実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する緩衝溶液中で腫瘍組織を約２５〜３９℃で振とうしながらインキュベートし、腫瘍細胞を解離および分散させること；および (b) 分散した腫瘍細胞を組織破片から分離すること；からなる方法。 23．分散した腫瘍細胞を分離する段階を密度勾配遠心分離により行う、請求項22 に記載の方法。 24．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E． coliから調製された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物を用いる、請求項22に記載の方法。 25．髄核のヘルニア形成の円板内治療方法であって、次の段階： (a) 請求項11の実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する無菌の緩衝溶液を調製すること；および (b) 実質的に精製されたコラゲナーゼを含有する無菌の緩衝溶液を髄核に注入すること；からなる方法。 26．Clostridium ＤＮＡを含むベクターを用いて形質転換した E．coliから調製された、約１１０，０００ダルトンの分子量を有するヒストリチクス菌コラゲナーゼの実質的に精製された調製物を用いる、請求項25に記載の方法。