JPH08500978A - ２−ケト−ｌ−グロン酸製造のための改善された酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼＡは、アスコルビン酸（ビタミンＣ）の前駆体である２−ケト−Ｌ−グロン酸を製造するのに使用する酵素であり、その変異体を部位特異的変異処理により得た。得られた変異体は改善された触媒活性、増強された発現レベルおよび／または向上した熱安定性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 ２−ケト−Ｌ−グロン酸製造のための改善された酵素 発明の分野 本願発明は、部位特異的変異処理の結果として、改善された工業的に有用な酵 素の変異体に関する。より詳しくは、本発明は天然に存するＤＫＧレダクターゼ の類縁体である、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸（２，５−ＤＫＧ）レダクタ ーゼＡの変異体に関する。変異体は２，５−ＤＫＧを立体選択的にアスコルビン 酸（ビタミンＣ）の前駆体２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）へ転換させる 、改善された触媒能を有する。さらに、変異体はイン・ビボ発現レベルの増加お よび／または熱安定性の改善も示す。 発明の背景 世界中の人々の健康意識の広がりのため、ビタミンＣの需要が増加した。さら に、アスコルビン酸の需要に寄与するのは、これが広く食物保存において抗酸化 剤として使用されることにある。この需要を満足するためのひとつのアプローチ 法は、アスコルビン酸の中間体である２−ＫＬＧの生産の増加である。この中間 体２−ＫＬＧは酸性または塩基性触媒下の環化によって容易にアスコルビン酸へ 転換させることができる。これはアスコルビン酸と比較してより大きな安定性お よび棚寿命を有する。従って、アスコルビン酸を直接製造するより、その後に転 換させるための２−ＫＬＧを蓄積する方がより実際的である。 多くの第１群の微生物、エルウィニア（Erwinia）、アセトバクター（Acetoba cter ）およびグルコノバクター（Gluconobacter）は２，５−ＤＫＧをＤ−グル コースから製造し得る。第２群のミクロコッカス、スタフィロコッカス、シュー ドモナス、バチルスおよびシトロバクター微生物と同様、細菌コリネフォルムか らの微生物（コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（B revibacterium ）、およびアルスロバクター(Arthrobacter))は、第１群の微生物 により産生された２，５−ＤＫＧを２−ＫＬＧへと転換させることができる。 ２−ＫＬＧを産生するために、このように適当な微生物を共醗酵させることは、 エルウィニア属およびコリネバクテリウム属の両方の関連する特性を単一の微生 物内で組み合わせることにより単純化されている（アンダーソンら、サイエンス ２３：１４４（１９８５））。これはコリネバクテリウム属内の２，５−ＤＫＧ を２−ＫＬＧへ転換させる２，５−ＤＫＧレダクターゼの同定によって完成され た。このレダクターゼの遺伝子をその後、クローン化し、そしてエルウィニア・ ヘルビコラという腸内細菌のファミリーの細菌内に発現させた。この細菌はＤ− グルコースを２，５−ＤＫＧへと一段回の醗酵で転換させる細菌である。得られ た組換え細菌株は、２，５−ＤＫＧレダクターゼを中枢酵素として有し、Ｄ−グ ルコースを２−ＫＬＧへと単一醗酵工程にて転換させる（ラザルスら、フォース ・エイエスエム・コンフ・ジェネット・モレック・ビオール・インダスト・マイ コロオルグ（Fourth ASM Conf.Genet.Molec.Biol.Indust.Microorg.）１８７− １９３（１９８９））。 単一醗酵工程における２，５−ＤＫＧレダクターゼの触媒効率の改善は、２− ＫＬＧの産生を増加させる確実な方法である。さらに、精製した２，５−ＤＫＧ レダクターゼＡは増加した触媒活性を有し、２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの インビトロ工程にて用いられる。例えば、固体支持体上へ純化酵素を固定化して 、２−ＫＬＧの連続産生が可能となる。 以下のミカエリスーメンテンの式、： Ｋm Ｋcat Ｅ＋Ｓ ← ＥＳ → Ｅ＋Ｐ によれば酵素の反応の効率はＫmおよびＫcatの２つの速度パラーターにより測定 し得る。触媒速度定数Ｋcatはまた代謝回転数としても知られ、酵素−基質（Ｅ Ｓ）複合体の解離の指標となる。これはまた、酵素（Ｅ）の活性部位につき、単 位時間当たりの、基質分子（Ｓ）がＥＳ複合体を経て生成物（Ｐ）へ転換される 最大数を示す。Ｖmaxは酵素が基質で飽和されている際の酵素が触媒する還元の 最大速度もしくは比率を示す。従って、Ｖmaxは飽和基質濃度では一定であり、 基質濃度の増加によっても変化しない。飽和基質濃度におけるＫcatは、Ｖmaxと 全酵素濃度［Ｅ_T］に対して以下の式の関係を有する： Ｖmax＝Ｋcat［Ｅ_T］。ミカエリス定数ＫｍはＥＳ複合体の解離定数と等しい。 従って、ＫｍはＥＳ複合体の強度の指標となる。Ｋｍが低い場合には複合体は強 く、より結合しているのが好ましいが、Ｋｍが高い場合には複合体は弱く、より 結合しにくい。Ｋｃａｔ／Ｋｍの比は特異性定数と呼ばれ、酵素の基質に対する 特異性、即ち酵素分子についての基質に対する触媒効率を示す。特異性定数が大 きいほど、酵素に対する基質として好ましいものである。 ２−ＫＬＧの大きな収量はエルウィニア属のごとき適当なホスト株（２，５− ＤＫＧ産生株）に発現されたコリネバクテリウム２，５−ＤＫＧレダクターゼ（ ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ、または２，５−ＤＫＧレダクターゼＩＩとして 知られている）により得られている（アンダーソンら、サイエンス２３０：１４ ４（１９８５）；ミラーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー ２６２：９０１６（１９８７））。これらの結果は２，５−ＤＫＧレダクターゼ Ａの２，５−ＤＫＧに対する特異性定数が低いのにももかかわらず、得られてい る。コリネバクテリウムは天然には２，５−ＤＫＧに遭遇することはないため、 この化合物が２，５−ＤＫＧレダクターゼＡに対して弱い基質であることは驚く べきことではない。 ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡに対するこの低い特異性定数は、より大きな特 異性定数を２，５−ＤＫＧに対して有する第２のホモロガスなコリネバクテリウ ム２，５−ＤＫＧレダクターゼ（２，５−ＤＫＧレダクターゼＢ、または２，５ −ＤＫＧレダクターゼＩとして知られている）と対照的である（ソノヤマとコバ ヤシ、ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・テクノロジー６５：３１１ （１９８７））。さらに、両方の２，５−ＤＫＧレダクターゼは、より大きな特 異性定数をその既知の基質に対して有するいくつかの既知のアルドースおよびケ トーレダクターゼとホモロガスである。かかる知見は、２，５−ＤＫＧレダクタ ーゼＡの活性部位が２，５−ＤＫＧを２−ＫＬＧへ触媒的に転換させるのに最適 な形状にはなっていないことを示す。従って、単一醗酵工程における２，５−Ｄ ＫＧレダクターゼＡの特異的活性を最適化するために、部位特異的変異処理によ るア ミノ酸置換を酵素の活性部位にて行わなくてはならない。 酵素の速度定数の改善に加えて、部位特異的変異処理はアミノ酸の置換、削除 もしくは挿入によって構造的安定性を増加させることができる。以下は構造的に 安定化させる変異処理の例である。新しいジスルフィド結合を導入して共有結合 の架橋を蛋白質の異なった部位の間にかけることは、バクテリオファージＴ４ラ イソザイムの熱安定性（マツムラら、ネイチャー３４２：２９１−２９３）、バ クテリオファージλレプレッサーの熱安定性（サウエルら、バイオケミストリー ２５：５９９２−５９９８（１９８６））、大腸菌（E.Coli）ジヒドロフォレー トレダクターゼの熱安定性（ビラフランカら、バイオケミストリー２６：２１８ ２（１９８７））およびスブチリシンＢＰＮ’（パントリアノら、バイオケミス トリー２６：２０７７−２０８２（１９８７））の熱安定性を改善するための手 段として報告されている。結晶解析により蛋白質の三次元構造を解析して、ジス ルフィド結合を導入するための２つのシステインを挿入する部位を決定するコン ピュータープログラムがある（パボら、バイオケミストリー２５：５９８７−５ ９９１（１９８６））。これらの結合は大きなスケールのコンフォメーションは 壊さないが、局部のコンフォメーションを安定化させる。 α−ヘリックス構造内においてアラニンでグリシンをアミノ酸置換すると、バ クテリオファージλリプレッサーの熱安定性（ヘクトら、プロテインス：ストラ クチャー、ファンクション、ジェネティクス１：４６−４６（１９８６））およ びバチルス・ステアロサーモフィラスの中性プロテアーゼの熱安定性（イマナカ ら、ネイチャー３２４：６９５−６９７（１９８６））が増加することが報告さ れている。バクテリオファージＴ４ライソザイムでは融点Ｔｍの上昇はプロリン でアラニンを、およびアラニンでグリシンを置換する２つのアミノ酸置換によっ て得られる（マットヒューら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ ミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー８４：６６６３−６６６７（１９８７） ）。蛋白質の疎水性のコア部にあるアミノ酸を、チロシンのごとき芳香族残基と 置換することは、特に芳香族側鎖の先住クラスター近辺の部位においてそうする ことが、熱安定性を促進することが、カナマイシンヌクレオチジルトランスフェ ラ ーゼ（リアオら、バイオケミストリー８３：５７６−５８０（１９８６））およ びバクテリオファージλレプレッサー（ヘクトら、バイオケミストリー８１：５ ６８５−５６８９（１９８４））で知られている。 発現ベクター内の転写および翻訳調節配列は、細菌における蛋白質の高レベル 産生の鍵となる要因である。大腸菌ＴｒｐバクテリオファージλＰ_L、大腸菌ｌ ａｃ ＵＶ５およびＴrp−laｃＵＶ５フュージョン（Ｔａｃ）プロモーターは最 も頻繁に使用される原核細胞のプロモーターの仲間である（デボアら、プロシー ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー ８０：２１−２５（１９８３））；サンブルックら、「モレキュラー・クローニ ング」コールド・スプリング・ハーバー・プレス（１９８９）レマウトら、ジー ン１５：８１−９３（１９８１）。プロモーターからの転写誘導に際して特定の 蛋白質を高発現させられるか否かを知る方法はない。メッセージの翻訳効率、ｍ ＲＮＡの安定性および蛋白質固有の安定性は高レベルの発現には主な要因となる 。従って、蛋白質が変異処理をされている場合はいつでも、その発現レベルに影 響を与えることができる。 所望の配列を有する合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的変異処 理によって、選択されたヌクレオチドを所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列 内に置換、削除もしくは挿入し得る。組み替えＤＮＡ手法は所望の変異体を合成 配列を標的配列へ置換して導入して得るのに用いられる。糸状バクテリオファー ジから単離された複製オリジンを含有するプラスミドの発現（ビエリアとメッシ ング、メソッズ・イン・エンザイモロジ−１５３：３（１９８７））によってフ ラグメントを、自律増殖し得るプラスミドの単一ストランド内へクローニングす ることができる。かかるプラスミドの使用により、プラスミドからのＤＮＡフラ グメントを糸状バクテリオファージベクター内へサブクローニングする繁雑な作 業が除かれる。部位特異的変異処理のキットは市販されている。 天然の酵素と異なる性質を有する２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体は有 用である。特に、改善された触媒活性、向上された熱安定性および増強された発 現レベルがこの酵素の商業的有用性を発展させるのに有用である。 残念なことに、蛋白質が実質的に配列または構造に相同性を有する領域を共有 していない限り、１の蛋白質で好ましい変異に基づき、他の蛋白質をコード化す る配列のいずこを変化させれば蛋白質の性質を改善することができるかについて の予測を、蛋白質間で一般化することはできない。従って、変化させようとする 特定の蛋白質の、正確な構造的および機能的性質の解析が必要である。これによ って所望の性質、例えば触媒活性、熱安定性または発現の増加のごとき、を得る ためにどのアミノ酸を変えるべきかということを判断する。 本発明は酵素的に活性な原核生物由来２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体 を提供する。２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの構造の分析を、該酵素を変化させ て得られる変異体の安定性、発現、および／または活性を増強するために、行っ た。この酵素をコード化する遺伝子の部位特異的変異処理を、変異体を作成する ためにデザインした。 発明の概要 本発明は特定の変化を有する２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ変異体およびこれ らの蛋白質を産生するための材料および方法を、その産生に有用な変化させた微 生物およびセルラインと同様に提供する。他の観点においては、本発明は修飾し た２，５−ＤＫＧレダクターゼの発現、構築およびその産生を、修飾した２，５ −ＤＫＧレダクターゼをコード化するＤＮＡを含有するクローニングベクターと 共に提供する。 野生型２，５−ＤＫＧレダクターゼＡを、部位特異的変異処理を用い、２，５ −ＤＫＧレダクターゼＡのコード領域内部の選択された部位に変化を生じさせ得 る１本鎖プラスミドを用いて修飾する。この方法では、変異は２，５−ＤＫＧレ ダクターゼＡをコード化する単離されたＤＮＡ内に導入され、ＤＮＡの発現にあ たって２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ内の先に決定しておいた部位において少な くとも１のアミノ酸が変化したものとなっている。この方法を使用して、変異を ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡをコード化する単離したＤＮＡ内へ導入し、この ＤＮＡの転写にあたって、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡのｍＲＮＡ内の予め決 定しておいた部位において少なくとも１のヌクレオチドの置換を生じさせるもの であ る。 本発明の修飾した２，５−ＤＫＧレダクターゼおよびコード配列は、改善され た安定性、発現および／または触媒活性を示し、異なるＫmおよびＶmax値を有す る。 図面の簡単な説明 図１は２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ遺伝子の発現ベクターを示す。 図２は２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体を産生させるための発現ベクタ ーを示す。 図３は２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの概略モデル図である。 発明の詳細な説明 規定 本明細書において「野生型」２，５−ＤＫＧレダクターゼＡは２，５−ＤＫＧ を立体選択的に２−ＫＬＧに転換させるよう触媒し得る蛋白質をいう。野生型酵 素は、本発明に説明する修飾を施す前の酵素である。かかる酵素はＡＴＣＣ株番 号３１０９０のコリネバクテリウム属から、米国特許第５，００８，１９３（参 考として本明細書に含まれる）に記載のごとくに得られる。 上記「野生型」２，５−ＤＫＧレダクターゼＡに対して「変異体」とは、もと の２，５−ＤＫＧレダクターゼＡと関連するアミノ酸配列を有し、２，５−ＤＫ Ｇを２−ＫＬＧに転換させるという、実質的に同じ酵素活性を有する。しかしな がら、変異体は１またはそれ以上のアミノ酸の置換、削除もしくはアミノ酸残基 の挿入を有する。これらの残基は活性部位残基を含有することが最も確からしい 蛋白質の領域を予測するためのある特定のアプローチを用いて選択される。一つ のアプローチには２，５−ＤＫＧレダクターゼＡが８本鎖α／βバレル構造であ るとする２次構造の予測を含む。いくつかの修飾が、野生型酵素と比して２，５ −ＤＫＧを立体選択的に２−ＫＬＧに転換させるための、より改善された性質を 有する酵素の変異体をコード化するよう遺伝子を修飾するために行われる。 当業者には、本明細書において議論されている多くの化合物、例えば蛋白質お よびサッカライドの酸性誘導体、が周囲の環境に基づき様々なイオン化状況にあ ることは周知であり、例えば液体内または、固体に製造された場合に調製時の液 体の外にある場合は異なる。例えば、「グルコン酸」のごとき言葉を使用するに は、関連する有機分子のすべてのイオン化状況を含むものと考えなくてはならな い。すなわち、例えば「Ｄ−グルコン酸」および「Ｄ−グルコネート」は両方、 同じ有機部分を示し、特別なイオン化状況にあることを特定するものではない。 Ｄ−グルコン酸は非イオン化状態で存在し得、そして例えばナトリウム、カリウ ムもしくは他の塩としても入手し得る。化合物が発表された際、イオン化または 非イオン化形態のいずれかに特定することは、当業者には文脈から明らかである かまたは不適切である。このように、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ蛋白質それ 自身およびその様々な変異体はｐＨに基づいて様々なイオン化状態で存在し得る 。これら全てのイオン化状況は「２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ」および「２， ５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体」の語にて表現される。 「発現ベクター」は、含有させようとするＤＮＡを、該配列を発現させ得る他 の配列に操作可能なようにリンクさせて、発現させ得るベクターである。明白に 述べられてはいないが、発現ベクターはホスト生物内でエピソームとしてまたは 染色体ＤＮＡのインテグラル部位として複製可能でなくてはならないことを意味 する。明らかに複製能が欠損していれば操作不可能である。併せて、「発現ベク ター」はまた機能的にも規定する語である。一般に、ＤＮＡ組み替え技術におけ る発現ベクターの使用はしばしば「プラスミド」の形態で行われる。プラスミド は環状２本鎖ＤＮＡ分子または環状１本鎖ＤＮＡのいずれかを示し、線状バクテ リオファージ由来の複製オリジンを有する。これらのＤＮＡ分子は、そのベクタ ー形において、染色体に結合していない。通常使用される他の効果的なベクター にはファージおよび非環状ＤＮＡがある。本明細書において「プラスミド」と「 ベクター」の語はしばしば交換可能であるように使用している。しかしながら本 発明においてベクターには、プラスミド以外の形状の発現ベクターであって、等 価な機能を有することが認識されているもの、または今後認識されるものも含む ものとする。 「組み替えホスト細胞」、「ホスト細胞」、「細胞」、「培養細胞」等は、本 発明の組み替えベクターにより形質転換されたまたは、形質転換しようとされて いる個々の細胞、セルライン、細胞培養物および収穫した細胞を示すのに交換可 能に使用する。この言葉にはまた、ベクターの由来となる細胞も含む。 「形質転換」という語はホストのＤＮＡ内容物を変える全ての工程を示す。こ の語には、カルシウムホスフェートまたはＤＥＡＥデキストラン誘導トランスフ ェクション、電気泳動、核注入、ファージ注入またはＤＮＡ吸収のための当業者 に知られている他の方法のごときインビトロ形質転換法を含む。 「アミノ酸」および「アミノ酸類」のごときは全ての天然に存在するＬ−α− アミノ酸を示す。この言葉にはノルロイシン、オルニチンおよびホモシステイン を含む。アミノ酸は１文字又は３文字標記にて示す： Ａｓｐ Ｄ アスパルチン酸 Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン Ｔｈｒ Ｔ スレオニン Ｌｅｕ Ｌ ロイシン Ｓｅｒ Ｓ セリン Ｔｙｒ Ｙチロシン Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸 Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｐ プロリン Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン Ｇｌｙ Ｇ グリシン Ｌｙｓ Ｋ リシン Ａｌａ Ａ アラニン Ａｒｇ Ｒ アルギニン Ｃｙｓ Ｃ システイン Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン Ｖａｌ Ｖ バリン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン Ｍｅｔ Ｍ メチオニン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン アミノ酸は化学的組成物およびその側鎖の性質により分類することができる。 アミノ酸をおおまかに２つに分けると、荷電と非荷電に分けられる。これらの群 のそれぞれはアミノ酸をより正確に分けるためサブグループに分けることができ る： Ｉ．荷電アミノ酸 酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸 塩基性残基：リシン、アルギニン、ヒスチジン ＩＩ．非荷電アミノ酸 親水性残基：セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン 脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン 非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン 芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン 機能もしくは安定性の実質的な変化は表１に記載したものより保存性の少ない 置換を選択することによって得られる。即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプ チドのバックボーン構造、例えばシートもしくはヘリックス構造、（ｂ）標的部 位における分子の荷電または疎水性または（ｃ）側鎖のかさ高さ、を保持する効 果がより顕著に異なる残基を選択するのである。一般に大きな変化をもたらすこ とが予期される置換には、（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはスレオニル基 で、疎水性基例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニルバリルもしくは アラニル基を（によって）置換する；（ｂ）システイニルまたはプロリル基で、 他の残基を（によって）置換する；（ｃ）正荷電側鎖、例えばリシル、アルギニ ルもしくはヒスチジル基で電気陰性基、例えばグルタミルまたはアスパルチル基 を置換する；または、（ｄ）かさ張る側鎖を有する残基、例えばファニルアラニ ル基で側鎖を有さないグリシル基のごとき基を置換することを含む。 一般的方法 細胞の形質転換、ベクターの構築、プローブによるハイブリダイゼーション、 部位特異的変異処理の実行および同様の処理に使用されるほとんどの方法は、変 異体の選択と同様、当業者には広く行われているものである。殆どの研究者は、 特定の条件および手法を記載している標準的な文献に親しい（実施例参照、サム ブルックら、モラキュラークローニング：実験室の手法、コールドスプリング・ ハーバー・プレス（１９８９））。以下のパラグラフにさらなる指標を示す。 ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの発現 完全な機能を有する遺伝子を、コード配列を形質転換しようとするホスト細胞 内で操作可能なようにプロモーターおよびリボゾーム結合部位を含有する適当な 発現ベクターと連結する。現在の業界において、市販の多くのプロモーション／ コントロール系があり、そして本発明に用い得る適当な原核細胞ホストも多く市 販されている。同様のホストはクローニングおよび発現にも使用できる、という のは原核細胞が一般にＤＮＡ配列のクローニングに好ましいからである。２−Ｋ ＬＧ産生は、かかる微生物系にて行う方法が最も容易である。大腸菌（E.coli） Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ番３１４４５）はクローニングホストとして特に有用 である。他の使用可能な微生物株には大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３ １５３７番）および大腸菌ＤＨ−１（ＡＴＣＣ３３４８９番）のごとき大腸菌株 を含む。発現のためには、上述の株と同様、大腸菌Ｗ３１００（Ｆ−λ−，プロ トトロフィックＡＴＣＣ２７３２５）、バチルス・スブチルスのごときバチラス 属および、サルモネラ・チフィムリウムまたはセラティア・マルセサンスのごと き他の腸内細菌類、および様々なシュードモナス属を用いてもよい。特に好まし いホスト群にはグルコースまたは他の通常入手し得る代謝物を２，５−ＤＫＧへ 転換することのできる培養物を含む。かかるホストの例はアセトバクター属、グ ルコノバクター属、アセトモナス属およびエルウィニア属が含まれる。これらの 属の分類および序列は、同じまたは同様の株でもしばしば異なる名前が付与され ることがある。例えば実施例で用いているアセトバクター・セリナスはグルコノ バクター・セリナスと呼ばれることもある。特定のホストの例には、これには限 定されないが、エルウィニア・ヘルビコラＡＴＣＣ２１９９８番（同様にアセト モナス・アルボセサマエ、米国特許３，９９８，６９７参照）；アセトバクター （グルコノバクター）オキシダンス亜種マラノゼン、ＩＦＯ３２９２，３２９３ ＡＴＣＣ９９３７番；アセトバクター（グルコノバクター）セリナスＩＦＯ３２ ６３ＩＦＯ３２６６；グルコノバクター・リビギノウス、ＩＦＯ３２４４；アセ トバクター・フラグムＡＴＣＣ２１４０９番；アセトバクター（アセトモナス） サブオキシダンス亜種インダストリアスＡＴＣＣ２３７７６番が挙げられる。 一般に、プラスミドの発現またはクローニングベクターもしくは、ホスト細胞 と共存可能な種から単離した複製および調節配列を含有する接合プラスミドをこ れらのホストと共に用いる。ベクターは最初から複製オリジンと同様、形質転換 した細胞のフェノタイプの選択が可能になるようなマーカー遺伝子を含む。例え ば、大腸菌は代表的にはｐＢＲ３２２を用いて形質転換されるが、これはある大 腸菌の株から誘導されたものであり（ボリバーら、ジーン２：９５（１９７７） ）、ｐＢＲ３２２にはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、 従って形質転換された細胞の同定が容易である。発現に使用するには、ｐＢＲ３ ２２プラスミド、または他の微生物プラスミドはさらにプロモーターを含有する あるいは含有するように修飾しなくてはならず、これは微生物においてそれ自身 の蛋白質の発現に使用されるものである。これらのプロモーターのうちで最もし ばしば組み替えＤＮＡの構築に使用されるのには、β−ラクタマーゼ（ペニシリ ナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャンら、ネイチャー２７３：６１ ５（１９７８）；イタクラら、サイエンス１９８：１０５６（１９７７）；ゴデ ルら、ネイチャー２７３．６１５（１９７８））２８１．５４４（１９７９）） ）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゴデルら、ヌクレイック・ アシッズ・リサーチ８：４０５７（１９８０）；ＥＰＯ願番００３６７７６号） である。 一方、これらは最もしばしば使用されるものであるが、他の微生物プロモーター 類もまた発見され、使用されている。そのヌクレオチド配列に関する詳細は報告 されており、当業者であればこれらを操作可能な関係となるよう、形質転換ベク ター内の遺伝子とつなげることができる（ジーベンリストら、セル２０：２６９ （１９８０））。 適当な切断および連結によって、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡをコード化す るＤＮＡ配列を上述のベクター内へ上記のごとき方法で含ませ得る。不必要なま たは抑制配列の全てを除き、原核細胞の酵素をその後精製してもよく；またはそ のままのあるいは破壊した細胞を触媒として直接用いてもよい。またこれに代わ って、ホストが一旦形質転換されれば、グルコースまたは他の適当な代謝物をす べて所望の２−ＫＬＧ産生物へ転換させることができるように選択してもよい。 ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの野生型プラスミドＤＮＡおよび変異型プラス ミドＤＮＡの両方を酵素の発現のためにホスト内へ形質転換する。組み替えたホ スト細胞を酵素発現に好ましい条件下で培養する。通常、抗生物質の存在による 選択圧力をかける。抗生物質に対する抵抗性はベクターによりコードされている 。このような条件下での培養によって、酵素の収量は野生型酵素を親細胞が産生 する場合より増加する。これは、親生物を形質転換する場合にも当て嵌まる。 変異処理のためのベクター構築 アンダーソンらはプラスミドｐｔｒｐｌ−３５の構築について、米国特許第５ ，００８，１９３号（参考として本明細書に含む）に開示するが、これはクロー ン化したＤＫＧレダクターゼＡ遺伝子を大腸菌ｔｒｐプロモーター（図１）の制 御の下に含有する。２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体の構築および分析が 容易となるような、２，３のマイナーな修飾をしたこのプラスミドの誘導体を構 築した。この修飾は以下に示した。最終的に得られたプラスミドの構築物をｐＳ Ｓｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡと命名し、図２に示した。 Ａ）さらなる変異処理の研究が容易になるよう、２，５−ＤＫＧレダクターゼ Ａの構造遺伝子を３つの新しい制限酵素部位を含有するように変異させた。この ３つの部位は「サイレント」すなわち得られるＤＫＧレダクターゼＡ蛋白質のア ミノ酸配列に変化を及ぼさないものである。 Ｂ）ｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡ内のプロモーターは、デ・ボエルらによ って開示された（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・ サイエンス・ユーエスエー８０：２１−２５（１９８３））ｔａｃＩＩプロモー ターであり、ｐｔｒｐｌ−３５のｔｒｐプロモ一ターではない。これは、ｌａｃ レプレッサーへの結合部位を含有するｔｒｐプロモーターであり、ｌａｃレプレ ッサーを発現する細胞内における遺伝子の発現を制御し得る。 Ｃ）プラスミドは１本鎖糸状ファージｆ１からの複製オリジンを含有するよう 、さらに変異処理されている。プラスミド内にこのＤＮＡ配列を使用することは 、プラスミドの１本鎖を産生させて配列決定、変異処理を行うための手段として 当業者にはよく知られている。 部位特異的変異処理 所望の修飾を選択した後、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡをコード化するＤＮ Ａ配列を、該酵素のアミノ酸配列中の予め決定した位置の選択したアミノ酸をコ ード化するヌクレオチドを置換するための部位特異的変異処理に付した。 部位特異的変異処理の好ましい方法としては、野生型酵素をコードするＤＮＡ 配列を、バクテリオファージから誘導された複製オリジンを含有する組み替えプ ラスミド内へクローン化することによって行う。その後、適当なプライマーを用 いて特定の部位で、例えば保存的アミノ酸交換を生ずるような残基の改変を行う 。限定されたミスマッチ部位の領域を除いて、所望の配列と相補的な合成オリゴ ヌクレオチドプライマーを、プラスミドベクター内の１本鎖野生型２，５−ＤＫ ＧレダクターゼＡ配列に相補的な配列を有する鎖の合成のためのプライマーとし て用いる。得られる２本鎖ＤＮＡをホスト細菌内へ形質転換する。形質転換した 細菌の培養物を寒天プレート上へ塗布し、プラスミドを含有する単一細胞由来の コロニーを形成させる。理論上は、５０％のコロニーが変異体を含有するプラス ミドからなり；５０％が元の配列を有するプラスミドである。コロニーを放射線 標識化した合成プライマーと、プローブと完全に合致する変異体プラスミドのみ がハイブリダイズし得る厳しい条件下でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ し たコロニーをかきとり、培養し、変異体プラスミドＤＮＡを回収した。 野生型２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ遺伝子の変異体の変異処理のための部位の 選択 変異処理のための部位の選択を決定的にするのは、野生型酵素の２次および３ 次構造の予測である。２次構造の予測は以下の方法により行い得る。最初に、２ ，５−ＤＫＧレダクターゼＡおよびＢ、そして５つの他のホモロガスな酵素（プ ロスタグランジンＦ合成酵素、ウシ水晶体とラット水晶体のアルドースレダクタ ーゼ、ヒト肝臓アルデヒドレダクターゼ、およびカエル眼水晶体からのｐ−クリ スタリン）を、保存されている残基の数をあきらかにするために並べる。第２に 、配列を、いくつかの当業者にはよく知られている構造解析アルゴリズム（シュ ーとファスマン、アドバンスト・エンザイモロジー４７：４５−１４８（１９７ ８）；ガーニエルら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１２０： ９７−１２０（１９７８）；ウイルモットとトーントン、ジャーナル・オブ・モ レキュラー・バイオロジー、２０３：２２１−２３２（１９８８）；カープラス とシュルツ、ナチュールビッセンシャフテン、７２：２１２−２１４（１９８５ ）；アイセンベルグら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・ オブ・サイエンス・ユーエスエー８１：１４０−１４４（１９８４）；ローズと ロイ、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ・ユーエスエー７７：４６４３−４６４７（１９８０））にかける。これらの予 測をまとめ、比較検討した結果、酵素の２次構造の大まかなモデルとして８本の α／βバレルからなる構造を得た。この２次構造の予測は近年に解析された、８ 本のα／βバレルの折り畳みを有する他のホモロガスな酵素の構造と同じである （ランデューら、ネイチャー３５５：４６９−４７２（１９９２）；ウイルソン ら、サイエンス２５７：８１−８４（１９９２））。 バレル構造は２つの成分から成っている。第１の成分はコアとなる８つの平行 なねじられたベータ鎖で、バレル内に桶板のように密集している。このバレル構 造を囲んでいるのが第２の成分の８本のアルファヘリックスであり、ベータ鎖と 様々な長さのループを介して結合している。この８本のα／βバレル構造はトリ オースホスフェートイソメラーゼ（ＴＩＭ）バレル型と、この構造が最初に認め られた酵素の名前で呼ばれている。α／βバレルの折り畳みのパターンは、結晶 構造の分かっている１７の酵素で認められている。実際、既知の酵素の約１０％ はその構造がα／βバレルである（ファーバーとペツコ、ティーアイビーエス１ ５（１９９０年６月）。１７個の既知のα／βバレル酵素は共通のα／βコアを 有している；基質および補因子特異性はベータ鎖とアルファヘリックスを結合し ている様々なループから生じる。 アルドースレダクターゼのファミリーに対する２次構造予測（上記）に基づい て提案される２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの２次構造モデルの概略を図３に示 す。図３ではベータ鎖を矢印で、アルファヘリックスをシリンダーで示す。２次 構造の予測されている部品をつなぐポリペプチド鎖の領域は、構造が未特定であ るとして示されている。ＮおよびＣ末端はそれぞれ３４および１７アミノ酸分伸 長していた。ＴＩＭ−バレル酵素におけるこのような伸長は、しばしばバレルの 頂上もしくは底へ折り返されるアルファヘリックスを形成する。ベータシートの Ｃ末端における８つのループのいくつかのサブセット（図３の上方）および、Ｃ −末端の「テイル」（２６２位から２７８位）は、他のＴＩＭバレル型酵素と同 じく酵素の活性部位を有すると考えられる。大まかなモデルであるにもかかわら ず、この構造は活性部位ループに存在する残基に焦点を当てることにより、酵素 の合理的な操作に大きく寄与する。ループおよび「テイル」近辺のさらなる残基 が活性部位の位置部を担っている可能性のあることは明らかである。 酵素の活性部位を含有するアミノ酸についてのこのような情報は、問題となっ ている酵素の実際の三次元形状の知識によっても得ることができ、この知識はｘ 線結晶解析またはＮＭＲにより得ることができる。２，５−ＤＫＧレダクターゼ の場合には、かかる構造に関する情報は未だ報告されていない。従って、このよ うな状況下においての代替戦略として、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡのモデル として上述のα／βバレルモデルを用い、活性部位であると仮定されるループに 認められる残基に限って単一アミノ酸置換が生じ得ると限定した。 このアプローチによって、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの基質結合部位であ る３つの表面ループが同定された。これらのループは１６５−１６８位、１８７ −１９８位および２２４−２３４位に存する。１２個の２，５−ＤＫＧレダクタ ーゼＡ変異体のセットをこれらのループ内にて作成した。このセットには２，５ −ＤＫＧレダクターゼＢ配列からの可能なポイント置換の殆ど全てを含む。これ らの変異体の多くは、アミノ酸にマイナーなもしくは保存的変化を有する場合で も２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへ変化させる活性の低下を主に示した。変異体 のうちの１つで、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ配列の１９２位のグルタミンを アルギニンに置換したものは、２，５−ＤＫＧを２−ＫＬＧに転換させる能力が 改善されていた。この変異体を「Ｑ１９２Ｒ」と名付け、詳細は実施例２に記載 した。 １２個の変異体をアセトバクター・セリナス内に発現させ、２，５−ＤＫＧか ら２−ＫＬＧへの転換のアッセイを、粗細胞溶菌物の段階で行った。以下の表２ には１２個の２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ変異体の、野生型２，５−ＤＫＧレ ダクターゼＡおよび２，５−ＤＫＧレダクターゼＢに対する活性の比較を示す。 表２のアッセイは以下の表３に従って行った。粗溶菌物の段階でのＱ１９２Ｒの 増加した活性は、ｐＢＲ３２２コントロール溶菌物に認められる高レベルの背景 レダクターゼ活性のため幾分不明瞭であるにもかかわらず、有意であり、再現性 のあるものである。表２のｐＢＲ３２２、野生型酵素およびＱ１９２Ｒのデータ は３つの異なる溶菌アッセイの結果の平均値である。これらの溶菌物における背 景レダクターゼ活性が単一の添加物の寄与によるものであると仮定すると、デー タはＱ１９２Ｒ変異体が２，５−ＤＫＧに対しては野生型酵素の２倍の活性を有 することを示す。精製したＱ１９２Ｒの速度定数の解析により、この酵素からは 野生型２，５−ＤＫＧレダクターゼＡに対して改善されたＫｍおよびＶｍａｘ値 が得られた。実施例５参照。従って、Ｑ１９２Ｒは天然酵素に対して特異性（Ｋ ｍ）および代謝回転速度（Ｖmax）の両方において改善されていることになる。 上述と同様の方法によって、Ｃ−末端「テイル」もまた、活性部位であると認 められた。２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの最後の８個のアミノ酸残基の前でポ リペプチド鎖が終了するよう、先端を切断した変異体をデザインした。この変異 体はよく発現し、そして補因子結合部位も保存されていたが、表２に示すように ２，５−ＤＫＧを基質として用いた場合には全く不活性であった。この手法によ ってＣ−末端「テイル」が２，５−ＤＫＧの結合ポケットを有するものと推測さ れる。 指標としてα／βバレルモデルを使用しなければ、単一アミノ酸置換が可能な 全てに対するランダムな検索が必要となる。例えばその場合、２，５−ＤＫＧレ ダクターゼＢ様活性を２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの枠組みへ補充するには、 酵素間の違いを反映すると、かかる酵素１７０個を構築し、アッセイすることが 必要となる。 置換されたメチル基によるかさ高さの増加を受け入れ得る、アルファヘリック ス内のグリシン残基は、アラニン残基と安定性強化のために置換される。チロシ ン、フェニルアラニンおよびトリプトファンのごとき芳香族アミノ酸残基を、酵 素内の芳香族クラスターの近辺に導入することもまた、本発明の範囲に含まれる 。これらの追加された芳香族残基は、酵素の該芳香族残基の導入された部位を安 定化する一方、全体のコンフォメーションをゆがめることはない。 蛋白質の特定の部位の変異は細菌内における蛋白質の発現を上昇させる。現時 点においては、どの変異が発現を強化させるのかを予測することは不可能である 。しかしながら、翻訳効率の因子、ｍＲＮＡ安定性および増強された蛋白質の安 定性が高レベルの発現の鍵となる役割を担っていることが知られている。 他の多くのポイント変異が、１から４の狭い間隔内でのアミノ酸置換群内で行 われ得る。変異体のうち安定して折り畳まれ得るものは、１６５−１６８ループ 、１８７−１９８ループ、２２４−２３４ループおよびＣ−末端「テイル」（２ ６２−２７８）に含まれるものに限られ、野生型酵素と有意に異なる活性を示す 。このことは、これらのループおよびテイル領域が酵素の活性部位であることの さらなる確証にもなる。 本明細書で提案されている変異はいくつでも単一の変異と組み合わせ得る。明 らかに、ある位置における特定の置換によって、その特定の変異体の同じ位置に おける他のアミノ酸との交換は排除される。 以下の実施例は本発明を説明し、当業者が同じものを作成し、使用するための 助けとなる。この実施例は本発明の範囲をいかなる観点からも制限しようとする ものではない。 実施例１ 変異処理のためのプラスミドｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡの構築 プラスミドｐｔｒｐｌ−３５のアリコートをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素で消化し、その結果生じた１６９０塩基対断片をアガロースゲル電気泳 動により精製した。そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクター Ｍ１３ｍｐ１９にこの断片を結合させた。その結果生じた組み換えファージ（Ｍ １３ｍｐ１９．ＤＫＧＲＡと呼ばれる）を用いて、充分な変異処理のための一本 鎖鋳型形態ファージを単離した。その鋳型を３つのオリゴヌクレオチドで変異処 理して、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ遺伝子に３つの新規制限酵素切断部位を 導入した。それらの部位はそのＤＮＡ配列に１つの新規制限切断部位を導入した が、そのＤＮＡ配列がコード化する蛋白質のアミノ酸配列は、遺伝子コードにお ける縮合のためそのまま変わらなかったという点で、これらの部位は全て「サイ レント」であった。導入したその３つの変異誘発オリゴヌクレオチドおよびその 変化は以下の通りである：１）オリゴヌクレオチドＸｂａＡは配列 に１つの新規ＸｂａＩ部位を導入する；２）オリゴヌクレオチドＡｐａＡは配列 位に１つの新規ＡｐａＩ部位を導入する；および３）オリゴヌクレオチドＫｐｎ アミノ酸の後ろの終止コドン（ＴＧＡ）の直後に１つの新規ＫｐｎＩ部位を導入 する。変異処理の反応および条件は本質的には実施例２の変異体Ｑ１９２Ｒの構 築のものと同様であった。変異処理反応後、厳しい条件下での変異誘発オリゴヌ クレオチドペのハイブリダイゼーションにより陽性プラクを同定し、２，５−Ｄ ＫＧレダクターゼＡ断片のコード化した領域全体を順に配列し、変異を確認した 。 以下の断片の３通りの結合のようにプラスミドｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡ Ａを構築した：１）上述の変異処理したファージＭ１３ｍｐ１９．ＤＫＧＲＡの ＥｃｏＲＩからＨｉｎｄＩＩＩまで、これは２，５−ＤＫＧレダクターゼＡをコ ードする遺伝子を含む；２）プラスミドｐｔａｃ６（ｐｔａｃ６はプラスミドｐ ｔｒｐＩ−３５に相当するが、これにはデ・ボエル（ｄｅ Ｂｏｅｒ）ら、（プ ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエ スエー８０、２１−２５（１９８３））で記載されたようにｐｔｒｐｌ−３５で 見いだされたｔｒｐプロモーターの代わりにｔａｃプロモーターを含む）のＰｓ ｔｌからＥｃｏＲＩまでの断片（８５０塩基対）、および３）プラスミドｐ６９ ０のＨｉｎｄＩＩＩからＰｓｔＩまでの〜４０００塩基対ベクター断片。ｐ６９ ０プラスミドは、バクテリオファージｆ１のゲノムのＲｓａＩ／ＤｒａＩ制限断 片（ヌクレオチド５４８９−５９４６）を有するプラスミドｐＢＲ３２２の誘導 体であり、ＰｖｕＩＩ部位に挿入された一本鎖ＤＮＡ複製起点を含む。 上述される３つの断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、精製した。そし ておよそ等モル比で結合させ、これを用いてコンピーテントな大腸菌細胞を形質 転換した。その結果生じたコロニーを制限地図により分析して正確な構造を同定 し、これをｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡと名付けた（図２）。 実施例２ ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ遺伝子の部位特異的変異処理 Ａ．変異処理のための鋳型ＤＮＡの調製 プラスミドｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡを有する大腸菌細胞（ＸＬ１−ブ ルー株、ストラタジン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を 対数期初期までＬＢ培地中で増殖させ（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、 モレキュラー・クローニング：実験の手引き、コールド・スプリング・ハーバー ・プレス、Ａ．１（１９８９））、ヘルパーファージＶＣＳ−Ｍ１３（ストラタ ジン）で感染させた。ヘルパーファージでの感染により、一本鎖形態プラスミド ｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡがパッケージされ、分泌するのに必要とされる 因子が提供される。感染した細胞を３７℃で振とうさせながら一中夜増殖させ、 次の日、ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＳＭ２４ローターを用い１００００ｒｐｍ で１０分間遠心分離し、その細胞を除去した。パッケージされたプラスミドを含 有する上澄みを保持し、細胞ペレットを捨てた。１／４体積の２．５Ｍ ＮａＣ ｌ、２０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を添加し、パッケージされたプラ スミ ドを沈降させた。添加した後、その混合物を室温で２０分間保持し、その沈澱物 を遠心分離により回収した。 その沈澱物をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ） ０．４ｍｌに溶解し、さらに同体積のクロロホルム：フェノール５０：５０で何 回か続けて抽出して精製した。各々の抽出後、その水（上）相を保持した。氷冷 したエタノール２体積で純粋なプラスミドを沈降させた。その沈澱物を遠心分離 により回収し、ＴＥ緩衝液に溶解した。１ミリリットル当たりの一本鎖ＤＮＡが １ＯＤ₂₆₀＝４０μｇと換算できることを用いて、２６０ｎｍで光学吸光度を測 定することによりプラスミドの濃度を定量した。ＴＥでプラスミドの濃度を１ｍ ｌ当たり１μｇに調節した。 Ｂ．オリゴヌクレオチドプライマーのリン酸化 合成オリゴヌクレオチドを合成し、以下のようにしてリン酸化した：オリゴヌク レオチドを１ｍｌ当たり５．０ＯＤ₂₆₀単位濃度まで希釈した。そしてオリゴヌ クレオチド２．５μｌを１０ｘキナーゼ緩衝液（１ＭトリスｐＨ８．０、１００ ｍＭ ＭｇＣｌ₂、７０ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭ ＡＴＰ）３μｌ、 水２５μｌおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニュー・イングランド・バイ オラブズ（Ｂｉｏｌａｂｓ））２単位と組み合わせた。混合物を３７℃で１５分 間培養し、その後７０℃で１０分間加温することによりキナーゼ酵素を失活させ た。 Ｃ．変異処理反応 キナーゼプライマー６μｌを鋳型ＤＮＡＩμｇおよび１０ｘＲＢ緩衝液（７０ ｍＭトリス、ｐＨ７．５、５０ｍＭメルカプトエタノール、５５０ｍＭ ＮａＣ ｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）２．５μｌと組み合わせ、総体積を１０．５μｌ にした。その混合物を６５℃で５分間加温することにより、そのプライマーを鋳 型にアニールし、その後３０分間以上かけて室温まで徐冷した。 １０ｘＲＢ緩衝液１．５μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ１μｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ（ ジチオトレイトール）１μｌ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングラン ド・バイオラブズ）１μｌをアニールした混合物に添加した。１０分後、１Ｍ Ｍｇ Ｃｌ₂１μｌ、５ｍＭ ｄＮＴＰ′ｓ（等モルのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ 、およびｄＴＴＰの混合物）１μｌおよびクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ） （ＤＮＡ ポリメラーゼＩの大きな断片、ニュー・イングランド・バイオラブ）０．５μｌ を添加し、その混合物を１５℃で一中夜培養した。 次の日、凍結コンピテント大腸菌ＭｕｔＬ細胞を反応混合物のアリコートで形 質転換し、これを抗生物質選択（１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、５０μ ｇ／ｍｌアンピシリン）を含む寒天プレートに塗布した。変異体プラスミドを有 するコロニーを厳しい条件下でのオリジナル変異誘発オリゴヌクレオチドへのハ イブリダイゼーションにより始めに同定した（ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、プロシー ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー ８２：１５８５−１５８８（１９８８））。その後、変異体プラスミドをセクシ ョンＡにおいてと同様にして一本鎖形態で調製し、そのプラスミドの直接ＤＮＡ 配列解析により確認した（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレ ーション、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）シーケンシング・キット）。実 施例５において示されるように、その結果生じた変異体Ｑ１９２Ｒ ２，５−Ｄ ＫＧレダクターゼＡは野生型２，５−ＤＫＧレダクターゼＡと比較して、触媒活 性が改善された。 実施例３ アセトバクター・セリナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｃｅｒｉｎｕｓ）におけ る野生型２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの発現 報告されているように（ビルス（Ｗｉｒｔｈ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ ｔ．２１６（１）：１７５−１７７（１９８９年３月））、ジーンパルサー（Ｇ ｅｎｅｐｕｌｓｅｒ）装置（バイオラッド・コーポレーション（ＢｉｏｒａｄＣ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて、電気めっきによりプラスミドＤＮＡをアセ トバクターセリナス（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９１４０）に導入した。細胞を１００ ｍｌ ＬＢ培地中で対数期中期（ＯＤ₅₅₀〜０．２−０．８）まで増殖させ、ソ ーバルＳＳ−３４ローターで４℃で５分間５０００ｒｐｍにて遠心分離すること により回収した。その細胞を１／２体積の氷冷した電気めっき緩衝液（３００ｍ Ｍスクロース、７ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、および１ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂）で再度懸濁させ、再び遠心分離によりペレットにし、最後に１／２０ 体積の電気めっき緩衝液で再度懸濁させて、使用時ま氷上に保存した。 プラスミドＤＮＡ（０．１〜１．０μｇ）を、調製したアセトバクター細胞０ ．８ｍｌ含有の０．４ｃｍ電気めっきキュベット（バイオラッド・コーポレーシ ョン）に添加した。その細胞とＤＮＡをキュベット中で混合し、電気めっきする 前に１０分間氷冷した。その細胞およびＤＮＡへ、２５ｕＦコンデンサーをセッ トする２５００ｍＶでのシングル・パルスをかけ、すぐに新しいＬＢ培地で３． ０ｍｌに希釈した。そしてその希釈された細胞を３０℃で２時間振とうして回収 した。形質転換した細胞のアリコート（１０−１００μｌ）を選択培地（５０μ ｇ／ｍｌアンピシリンおよび１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有のＬＢ寒 天プレート）に塗布し、そのプレートを３０℃で一中夜増殖させた。 実施例４ 変異体Ｑ１９２Ｒおよび野生型２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの精製 形質転換されたアセトバクター・セリナス細胞のシングル・コロニーを抗生物 質（１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリン） 含有の２Ｘ Ｙ Ｔ培地（サムブルークら、モレキュラー・クローニング：実験の 手引き、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、Ａ．３（１９８９））２０ ０ｍｌｓ中において３０℃で一中夜増殖させた。その細胞を遠心分離（ソーバル ＧＳ３ローターで８０００ｒｐｍで１５分間）により回収し、凍結保存した。そ の後その細胞を１／５体積の溶菌緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５０ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）、２ｍｇ／ｍｌリゾチーム） で解凍し、氷上で２時間溶菌した。溶菌された細胞を以前と同様にして再度遠心 分離し、粗細胞抽出物を含有するその上澄みを保持した。 ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ蛋白質をＤＥＡＥセルロースのクロマトグラフ ィーにより粗細胞抽出物から精製した。ＤＥＡＥセルロース（ファットマン（Ｗ ｈａｔｍａｎ）ＤＥ−５２ブランド）はｐＨ７．０の２５ｍＭトリスで前平衡化 した。総量５．０ｍｌのゲルを、使い捨てのプラスチッククロマトグラフィーカ ラ ムに注ぎ、粗細胞抽出物を適用した。全ての抽出物がカラムに密着した後、カラ ム２本分の体積の２５ｍＭトリスｐＨ７．０でそのカラムを洗浄し、その後１本 分の体積の０．３Ｍ ＮａＣｌ含有の２５ｍＭトリスｐＨ７．０で浣浄した。そ して最後に０．６Ｍ ＮａＣｌ含有の２５ｍＭトリスｐＨ７．０で２，５−ＤＫ ＧレダクターゼＡ蛋白質を溶出させた。その調製物の蛋白質濃度をビシンコニン 酸法（メソッズ・イン・エンザイモロジー１８２：６０−６２（１９９０））に より定量し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により純度を調べた。 実施例５ 野生型および変異体Ｑ１９２Ｒ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの反応特性 野生型および変異体Ｑ１９２Ｒ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ酵素の調製物の 、基質２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの還元能に関して、速度的な特徴を調べ た。０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ含有の５０ｍＭトリスｐＨ７．０、一定量の酵素（ １５−２０ｍｇ）および２〜１４ｍＭの様々な量の基質からなる総体積１ｍｌを 用いてアッセイを行った。２５℃でアッセイを行い、３４０ｎｍ波長の吸光度低 下（これは補助因子ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ＋への酸化を示す）を測定すること により基質の還元速度を分光光度的に測定した。 速度パラメーターＶｍａｘおよびＫｍを決定するために、周知のミカエリスの 式によりエプソン・デスクトップ・コンピューターでエンジフィット・ソフトウ エアー・パッケージ（Ｅｎｚｆｉｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ）（バ イオソフト（Ｂｉｏｓｏｆｔ）、ケンブリッジ、英国）を用いて、そのデータを 分析した。野生型２，５−ＤＫＧレダクターゼＡは、２，５−ＤＫＧ基質に対し て１分間、蛋白質１ミリグラム当たり７．８μモルというＶｍａｘ値を有し、一 方でＱ１９２Ｒ変異体は１４．０というＶｍａｘ値を有し、１．８倍改善された 。この基質に対して、野生型酵素のＫｍまたはミカエリス定数は２８ｍＭであり 、一方でＱ１９２Ｒ変異体のＫｍは２１ｍＭであった。このことより、野生型酵 素についての特異性定数（ｋｃａｔ／Ｋｍ）１４０Ｍ^-1ｓ^-1が導かれ、そしてＱ １９２Ｒ変異体についての特異性定数３３５Ｍ^-1ｓ^-1が導かれ、２．４倍改善さ れた。 実施例６ インビボ発現が増加した２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体 ２，５−ＤＫＧレタクターゼＡの野生型酵素と等価な活性を有するにもかかわ らず、アセトバクター発現ホストにおける蛋白質の蓄積量が増加する２，５−Ｄ ＫＧレダクターゼＡの変異体を見いだした。「ＨＳ１」と命名したこの変異体は 、３つのアミノ酸変化を含む：アスパラギンは２位でスレオニンと置換し、スレ オニンは５位でセリンと置換し、そしてセリンは７位でバリンと置換する。この 変 の３７塩基オリゴヌクレオチドにより行った。変異処理反応のステップは実質的 にはＱ１９２Ｒ変異体を構築した概略と同様であった。 以下の表３は、２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ配列を含まない制御プラスミド であるプラスミドｐＢＲ３２２、野生型遺伝子を発現しているプラスミドである ｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡ、またはＨＳ１変異体を含むｐＳＳｔａｃ．Ｄ ＫＧＲ．ＡＡＡ．ＨＳ１のいずれかを有するアセトバクター・セリナスの粗細胞 ライゼートのアッセイの結果を示す。２，５−ＤＫＧレダクターゼＡおよびＱ１ ９２Ｒ変異体蛋白質を精製するセクションで記載したようにして、粗細胞抽出物 を調製した。３つの細胞培養について結果を示す。 粗細胞ライゼートのこれらのアッセイでは、アセトバクター・セリナス細胞自 体からのバックグラウンド・レダクターゼを数える必要がある。ｐＢＲ３２２培 養では、この活性が示され、「％野生型活性」を算出するために、この値は他の 値から差し引かれる。 ０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、固定量の２，５−ＤＫＧ（１０ｍＭ）、および粗細 胞ライゼート５０μｌを含有する総体積１．０ｍｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．０ 中で、前述のようにして測定を行った。 ｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡ．ＨＳ１を有する培養細胞は、発現レベルで 野生型プラスミドｐＳＳｔａｃ．ＤＫＧＲ．ＡＡＡ含有の培養細胞を越えて２０ −３０％の増加を示す。発現におけるこの増加は、ｍＲＮＡ安定性の変化、メッ セージの翻訳レベル、蛋白質安定性、またはあるこれらの影響の組み合わせが原 因となっているかもしれない。 実施例７ 熱安定性が高まった２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体 アセトバクター発現ホストにおいて熱安定性が高まった２，５−ＤＫＧレダク ターゼＡ変異体を発見する。この変異体は２つのアミノ酸変化を含む：５５位で アラニンはグリシンと置換し、そして５７位でアラニンはグリシンと置換する。 を有する塩基オリゴヌクレオチドにより支配される。変異処理反応におけるステ ップは実質的にはＱ１９２Ｒ変異体を構築した概略と同様である。 実施例８ 活量が低下した２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ変異体 ２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの転換で大幅な活量低下を示す変異体形態の ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡが発見された。変異処理反応におけるステップは 実質的にはＱ１９２Ｒ変異体を構築した概略と同様であった。以下の塩基オリゴ ヌクレオチドは、アセトバクター発現ホストにおいて活性低下を示すそのような 変異体の合成を支配した：１９１位にグリシンの代わりにアラニンが置換したＧ のオリゴヌクレオチド； １９３位でグリシンが欠落したＧ１９３欠損変異体を構築するための、配列 １９４位にリシンの代わりにアルギニンが置換したＫ１９４Ｒ変異体を構築する クレオチド； １９５位にチロシンの代わりにセリンが置換したＹ１９５Ｓ変異体を構築するた レオチド； １６７位にアラニンの代わりにチロシンが置換したＡ１６７Ｙ変異体を構築する クレオチド； １６８位にチロシンの代わりにフェニルアラニンが置換したＹ１６８Ｆ変異体を のオリゴヌクレオチド； １６９位にグルタミンの代わりにプロリンが置換したＱ１６９Ｐ変異体を構築す ヌクレオチド； ２２５位にリシンの代わりにロイシンが置換したＫ２２５Ｌ変異体を構築するた レオチド； ２２７位にフェニルアラニンの代わりにセリンが置換したＦ２２７Ｓ変異体を構 オリゴヌクレオチド； ２２８位にバリンの代わりにスレオニンが置換したＶ２２８Ｔ変異体を構築する ヌクレオチド； ２２９位にバリンの代わりにプロリンが置換したＶ２２９Ｐ変異体を構築するた クレオチド；および２７１位に終止コドンを有するトランケイション（ｔｒｕｎ ｃａｔｉｏｎ）変異体を構築するための、配列 本発明の目的または初めの特色から逸脱しなければ、この発明が提出される分 野の当業者らに明瞭なように、上で詳細に開示した形態より他の形態で本発明を 具体化してもよい。それゆえに、上述した本発明の特定の具体例は、全ての点で 本発明を限定するものではなく例として考えなければならない。本発明の範囲は 先の記述に含まれる実施例に制限されるのではなく、添付したクレームの中に記 載されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:02） (72)発明者 ハーレ、マーク アメリカ合衆国19405ペンシルベニア州ブ リッジポート、コロンバス・ストリート 641番 (72)発明者 アンダーソン、スティーブン アメリカ合衆国08540ニュー・ジャージー 州プリンストン、スプリングデール・ロー ド158番 (72)発明者 パワーズ、デイビッド・ビー アメリカ合衆国08873ニュー・ジャージー 州サマセット、ライラック・レーン15番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 改善された２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの転換能を有する２，５−Ｄ ＫＧレダクターゼＡの変異体。 ２． ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡのアミノ酸配列中、１６５、１６６、１６ ７、１６８、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９ ４、１９５、１９６、１９７、１９８、２２４、２２５、２２６、２２７、２２ ８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２６２、２６３、２６ ４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７ ３、２７４、２７５、２７６、２７７および２７８位からなる群から選択される 位置に１つのアミノ酸置換を有する第１項記載の変異体。 ３． １９２位にアミノ酸置換を有する第１項記載の変異体。 ４． １９２位にアルギニン残基を有する第３項記載の変異体。 ５． 改善された２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの転換能を有する２，５−Ｄ ＫＧレダクターゼＡの変異体をコードする遺伝子である、少なくとも１つの変異 されたコドンを含有する構造遺伝子を有するＤＮＡ構造。 ６． 変異されたコドンが、コドン１６５、１６６、１６７、１６８、１８７、 １８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、 １９７、１９８、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、 ２３１、２３２、２３３、２３４、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、 ２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、 ２７６、２７７および２７８からなる群から選択されるコドンの１つであり、コ ドンの変異の結果２，５−ＤＫＧレダクターゼＡのアミノ酸配列中、１６５、１ ６６、１６７、１６８、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１ ９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、２２４、２２５、２２６、２ ２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２６２、２ ６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２ ７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７および２７８位からなる群から 選択される位置の１つのアミノ酸が置換される第５項記載のＤＮＡ構造。 ７． 変異されたコドンが１９２位のコドンであって、コドンの変異の結果２， ５−ＤＫＧレダクターゼＡの１９２位のアミノ酸が置換される第５項記載のＤＮ Ａ構造。 ８． コドン変異の結果、１９２位がアルギニンに置換される第７項記載のＤＮ Ａ構造。 ９． 発現能が増強されている２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ変異体。 １０． ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの２、５および７位にアミノ酸置換を有 する第９項記載の２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ変異体。 １１． ２位にアスパラギンを、５位にスレオニンを、そして７位にセリンを有 する第１０項記載の変異体。 １２． 発現能が増強されている２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ変異体をコード する遺伝子である、少なくとも１のヌクレオチド置換を含有する構造遺伝子を有 するＤＮＡ構造。 １３． コドン２、５および７内にヌクレオチド置換を有し、この変異の結果２ ，５−ＤＫＧレダクターゼＡの２、５および７位のアミノ酸が置換される第１２ 項記載のＤＮＡ構造。 １４． ヌクレオチド置換の結果、２位がアスパラギン、５位がスレオニンおよ び７位がセリンとなる第１３項記載のＤＮＡ構造。 １５． 第５、６、７、８、１２、１３または１４項のいずれかに記載のＤＮＡ 構造を含有する発現ベクターで形質転換されたホスト細胞。 １６． 細菌である第１５項記載のホスト細胞。 １７． 細菌がエルウィニア属である第１６項記載のホスト細胞。 １８． 細菌がグルコノバクター属である第１６項記載のホスト細胞。 １９． 細菌がアセトバクター属である第１６項記載のホスト細胞。 ２０． 細菌がアセトバクター・セリナス（ＩＦＯ３２６３）である第１９項記 載のホスト細胞。 ２１． 発現ベクターがプラスミドである第１４項記載のホスト細胞。 ２２． プラスミドがpSStac.DKGR.AAA.HS1である第２１項記載のホスト細胞。 ２３． 改善された熱安定性を有する２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ変異体。 ２４． ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの５５位と５７位にアミノ酸置換を有す る第２３項記載の変異体。 ２５． ５５位と５７位がアラニンである第２４項記載の変異体。 ２６． 改善された熱安定性を有する２，５−ＤＫＧレダクターゼＡ変異体をコ ードする遺伝子である、少なくとも１の変異されたコドンを含有する構造遺伝子 を有するＤＮＡ構造。 ２７． 変異されたコドンがコドン５５および５７であり、この変異の結果２， ５−ＤＫＧレダクターゼＡの５５位と５７位のアミノ酸が置換される第２６項記 載のＤＮＡ構造。 ２８． コドン変異の結果、５５位と５７位がアラニンとなる第２７項記載のＤ ＮＡ構造。 ２９． 改善された２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの転換能、増強された発現 能および改善された熱安定性を有する２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体。 ３０． ２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの１９２、２、５、７、５５および５７ 位にアミノ酸置換を有する第２９項記載の変異体。 ３１． １９２位にアルギニンを、２位にアスパラギンを、５位にスレオニンを 、７位にセリンを、および５５位と５７位にアラニンを有する第３０項記載の変 異体。 ３２． 改善された２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの転換能、増強された発現 能および改善された熱安定性を有する２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの変異体を コードする遺伝子である、少なくとも６つのコドンの変異を含有する構造遺伝子 かを有するＤＮＡ構造。 ３３． 変異されたコドンがコドン１９２、２、５、７、５５および５７であり 、コドンの変異の結果２，５−ＤＫＧレダクターゼＡの１９２、２、５、７、５ ５および５７位のアミノ酸が置換される第３２項記載のＤＮＡ構造。 ３４． コドン変異の結果、１９２位がアルギニン、２位がアスパラギン、５位 がスレオニン、７位がセリンおよび５５位と５７位がアラニンとなる第３３項記 載のＤＮＡ構造。 ３５． 第３２、３３、または３４項記載のＤＮＡ構造を含有する発現ベクター で形質転換されたホスト細胞。 ３６． 細菌である第３５項記載のホスト細胞。 ３７． 細菌がエルウィニア属である第３６項記載のホスト細胞。 ３８． 細菌がグルコノバクター属である第３６項記載のホスト細胞。 ３９． 細菌がアセトバクター属である第３６項記載のホスト細胞。 ４０． 細菌がアセトバクター・セリナス（ＩＦＯ３２６３）である第３９項記 載のホスト細胞。 ４１． 発現ベクターがプラスミドである第３５項記載のホスト細胞。