JPH08502245A

JPH08502245A - 天然および非天然ペプチド配列を含むペプチジル活性ケトンインヒビター

Info

Publication number: JPH08502245A
Application number: JP6506506A
Authority: JP
Inventors: ジマーマン，マリー・ピー; ビッセル，ユージン・アール; スミス，ロバート・イー
Original assignee: プロトテック・インコーポレーテッド
Priority date: 1992-08-20
Filing date: 1993-08-18
Publication date: 1996-03-12
Also published as: EP0667854A1; AU5019093A; EP0667854A4; ATE180772T1; EP0667854B1; US5374623A; WO1994004172A1; DE69325178T2; CA2142839A1; DE69325178D1

Abstract

(57)【要約】次式：（式中、BはHまたはN-末端アミノ酸窒素のためのアミノ酸遮断基であり；R₁はP₂がフェニルアラニン（Phe）、ロイシン（Leu）、チロシン（Tyr）およびバリン（Val）およびこれらの置換された類似物、特にTyr（OMe）からなる群から選択されるα−アミノ酸の残基であるように場合により保護されたα−アミノ酸側鎖であり；R₂はP₁がアラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、ヒスチジン（His）、ホモフエニルアラニン（HPhe）、フェニルアラニン（Phe）、オルニチン（Orn）、セリン（Ser）およびトレオニン（Thr）ならびにこれらの置換された類似物からなる群から選択されるα−アミノ酸の残基であるように場合により保護されたα−アミノ酸側鎖であり；Xはフェノキシ、置換フェノキシおよびヘテロフェノキシからなる群から選択されるフッ素不含有脱離基であり；EおよびGは炭素より陰性度が強い一つ以上の原子であり；Dは水素、メチルまたは置換メチルである）で表されるプロテイナーゼ阻害剤を用いた医療症状を治療する方法。

Description

【発明の詳細な説明】天然および非天然ペプチド配列を含むペプチジル活性ケトンインヒビター発明の背景本発明は、ペプチジルケトンインヒビターに関し、さらに詳しくはシステインプロテアーゼ、特にカテプシンＢおよびＬおよびそれらの原始的酵素対照物をin vivoで支配するペプチジルケトンインヒビターに関する。カテプシンＢおよびＬは通常の蛋白分解に関与するシステイニルプロテアーゼである。それらは一般に細胞のリソソームに存在する。これらの酵素がリソソーム外に見い出される場合、合成基質技術や天然の内因性インヒビターを用いることによって調べると、それらの酵素が、リューマチ様関節炎、変形性関節症、ニュ」ーモシステイスカリニ症、住血吸虫感染症、クルーズトリパノソーマ症、ブルーストリパノソーマ症、クリチジアフユジクラタ（crithidia fusiculata）、マラリア、歯周疾患、転移腫瘍、異染性白質萎縮症、筋ジストロフィーなどのような多数の病的状態において原因となる役割を演じて関係している。特に、カテプシンＢタイプの酵素とリューマチ様関節炎との関連は下記文献において示唆されている。バン・ノールデンとエバート著、“Z-Phe-Ala-CH₂Fによるシステインプロテアーゼの選択的抑制は、繊維芽細胞および破骨細胞によるコラーゲンの分解を抑制する”、178 Biochemical and Biophysical Research Communications 178；リフキン、ベルニロ、クリークナー、アウスマン、ロゼンバーグおよびツインマーマン著，“分離された破骨細胞中のカテプシンＢおよびＬ活性”179 Bi ochemical and Biophysical Research Communications 63；グリンデ著、“チオールプロテイナーゼインヒビター、Z-Phe-Phe-CHN₂およびZ-Phe-Ala-CHN₂は分離されたラット肝細胞におけるリソソームの蛋白分解を抑制する”、757 Biochimi ca et Biophysica Acta 15；メイソン、バーソロミューおよびハードウイック著，“ヒト組織中の活性システインプロテイナーゼのプローブとしてのべンジルオキシカルボニル〔¹²⁵ Ｉ〕イオドチロシルアラニルジアゾメタンの使用”，263 Biochem．J．945；バン・ノールデン、スミスおよびラズニック著，“関節炎ラット膝関節のシステインプロテイナーゼ活性および選択的全身性インヒビター、 Z-Phe-Ala-CH₂Fの効果”，15 J．Rheumatol．1525；および、バン・ノールデン、フォーゲルおよびスミス著、“全ラット膝関節の未固定、未脱灰のクリオスタット切片におけるカテプシンＢ活性の存在部位および細胞光度測定分析”，37 J．Histochemistry and Cytochemistry 617。カテプシンＢと変形性関節症との関連は、デレイス、エックハルトおよびバエズ著、“骨吸収におけるシステインプロテイナーゼの関連のin vivoおよびin vitroの証拠”，125Biochemi cal and Biophysical Research Communications 441中で示唆され、カテプシンＢとニューモシステイスカリニとの関連はヘイス、スツベリフィールド、マックブライドおよびウイルソン著， “ニューモシステイスカリニ感染症の進行に伴うラット肺のシステインプロテイナーゼ含量の変化”，59 Infection and Immun ity 3581；において示唆され、システインプロテイナーゼと住血吸虫感染症との関連は、コーヘン、グレゴレット、アミリ、アルデイプ、ライリーおよびマッケロウ著，“コンピューターモデルの助けによって選ばれたプロテアーゼインヒビターによる寄生虫の組織侵入阻害”，30 Biochemistry 11221において示唆されている。システインプロテイナーゼとクルーズトリパノソーマ症、ブルース卜リパノソーマ症およびクリチジアフユジクラタ症との関連は、アシャル、ハリス、ロバート、ヒーリーおよびシャオ著、“トリパノソーマのアルカリペプチダーゼの基質特異性およびインヒビター感受性”、1035 Biochimica et Biophysica Ac ta 293および／または、アシャル、アングリカおよびシャオ著、“ペプチジルフルオロメチルケトンによるトリパノソーマの消散”、170 Biochemical and Biop hysical Research Communications 923において示唆されている。システインプロテイナーゼとマラリアとの関連は、ローゼンタール、ウオリッシュ、パルマーおよびラズニック著、“熱帯性マラリア原虫システインプロテイナーゼのペプチドインヒビターの抗マラリア効果”、88 J．Clin．Invest．1467および、ローゼンタール、リーおよびスミス著、“ビンスクマラリア原虫（Plasmodium Vinckei ）システインプロテイナーゼの抑制はネズミのマラリアを治癒させる”（印刷中）において示唆されている。カテプシンＢと転移腫瘍の関連は、スミス、ラズニック、バーデイック、チョー、ローズおよびバラチアン著、““ペプチジルフルオロメチルケトンによるヒト腫瘍カテプシンＢアイソザイムの時間依存性不活化の蛍光印刷技術を用いた映像化”、8 Anti-cancer Research 525において示唆されている。カテプシンＢとがんとの関連は、ゴードンおよびマウラッド著、2 Blood Coagulation and Fibrinolysis 735において示唆されている。カテプシンＢと歯周疾患との関連は下記の文献に示唆されている。コックス、チョー、エレイおよびスミス著、“歯肉溝の分泌液中のプロテアーゼの測定のための簡易な蛍光および色素法”，25 J．Periodont．Res．164；ウイット、ラジャバ、ヘイノおよびソルサ著、“歯肉のバクテロイデス属菌のプロテアーゼは培養された歯肉の繊維芽細胞の細胞表面および基質の糖蛋白を分解し、コラーゲナーゼおよびプラスミノーゲン活性因子の分泌を誘発する”、57 Infection and Immun ity 213；クニマツ、ヤマモト、イチマル、カトーおよびカトー著、“大人の慢性歯周病および実験に基づく歯周病患者由来の歯肉溝分泌液のカテプシンＢ，ＨおよびＬ活性”、25 J Periodont Res 69；ベイトン、ラドフォードおよびネイラー著、“歯周疾患または歯肉炎のヒトの孤立性歯周位置由来の歯肉溝分泌液のプロテアーゼ活性”、35 Archs oral Biol．329；コックスおよびエレイ著、“ いろいろな７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン基質およびプロテアーゼインヒビターを用いた炎症を起こしたヒト歯肉のシステインおよびセリンプロテイナーゼ活性に関する予備的研究”、32 Archs oral Biol．599；および、アイゼンハウアー、ハッチンソン、ジェイブおよびマクドナルド著、“歯肉炎患者の歯肉溝分泌液のカテプシンＢ様プロテアーゼの同定”，62 J Dent Res 917。カテプシンＢと異染性白質萎縮症との関連は、フォン・フィグラ、ステッケル、コナリー、ハシリクおよびシャウ著、“進行の遅い異染性白質萎縮症の異質性、システインプロテイナーゼのインヒビターの効果”、39 Am J Hum Genet．371に示唆されており；カテプシンＢと筋ジストロフィーとの関連は、バレンチン、ウイナンド、プラウダン、モイス、ドラウンタ、コーネガイおよびクーパー著、“ デユシェーヌ筋ジストロフィーの動物モデルとしてのイヌのＸ−連鎖筋ジストロフィー：レビュー”、42 Am J Hum Genet 352において示唆されており；カテプシンＢとライノウイルスとの関連は、コット、オーア、モンゴメリー、サリバンおよびウエストン著、“ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃの発現および精製 ”、182 Eur．J．Biochem．547において示唆されており；カテプシンＢと腎疾患との関連は、バリコス、オコナー、コルテツ、ウーおよびシャー著、“システインプロテイナーゼインヒビター、Ｅ−６４は糸球体腎炎の実験モデルで蛋白尿を減少させる”、155 Biochemical and Biophysical Researc Communications 1318中で示唆されており；カテプシンＢと多くの硬化症との関連は、ダルマン、ラッシュマン、クーンおよびレイナウアー著、“脂肪酸またはドデシル硫酸ナトリウム塩によるラット骨格筋由来の多触媒性プロテイナーゼの活性化”、228 Biochem ．J． 171において示唆されている。多くのシステインプロテイナーゼインヒビターが同定されているが、それらのほとんどが in vivo の使用では欠点を有している。特に、抑制の可逆性、特異性の欠如および体から早急に一掃されることのような欠点は先行インヒビターと密接に関連している。例えば、微生物の産物であるアンチパイン（antipain）およびロイペプチン（leupeptin）は、システインプロテイナーゼの有効な、しかし可逆性のインヒビターであり（マクコーネル等著、33 J．Med．Ｃｈｅｍ．86- 93；サザーランド等著、110 Biochem．Biophys．Res．Commun．332-38）、また、ある種のセリンプロテイナーゼを抑制する（ウメザワ著、45 Meth．Enzymol． 678-95）。化合物Ｅ６４およびその類似体はより選択的なインヒビターである（例えば、バレット等著、201 Biochem．J．189-98およびグリンデ著、701 Bioche m ．Biophys．Acta．328-33参照）が、in vivo使用のためには循環系からあまりに早く消失してしまう（ハシダ等著、91 J．Biochem．1373-80）。システインプロテイナーゼインヒビターの最も有望なタイプは、インヒビターを標的酵素の活性位置に特異的に誘導するペプチド配列に融合した適当なα−脱離基をもった活性カルボニルを有する。一旦活性位置の内側につくと、インヒビターのカルボニルはシステインのチオレートアニオンにより攻撃されてヘミアセタールを生成する。もし、α−脱離基がそのとき脱離すると、酵素とインヒヒター間の結合は永続的となり酵素は不可逆的に不活化される。特定の酵素を不活化するにあたってインヒビターの有用性は、従って、ペプチド部分の“鍵と鍵穴”適合ばかりでなく、α−脱離基をインヒビターの他部に保持させている結合の反応性にも依存する。この脱離基はヘミチオアセタール中間体の分解において硫黄原子の１，２−移動を経由する分子内置換に対してのみ反応性があることは重要である。活性カルボニル、適当なα−脱離基および標的酵素の活性位置にインヒビターを特異的に誘導するのに有効なペプチド配列を有するシステインプロテイナーゼに関する先駆的研究は、参照によって本明細書に組み入れられている、ラズニックの米国特許第４，５１８，５２８号に開示されている。この特許は、選択性および有効性においてシステインプロテイナーゼの新規なインヒビターとしてペプチジルフルオロメチルケトンを確立した。ラズニックの記載し合成したフルオロメチルケトンは、下式により示される化合物を含む：ここで、Ｒ₁およびＲ₂は独立に、水素原子、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６の置換アルキル、アリールおよびそのアルキル基が炭素数１〜４のアルキルアリールから選ばれる基；ｎは１〜４の整数；Ｘはペプチド末端保護基；Ｙはアミノ酸または１〜６のアミノ酸からなるペプチド鎖である。フェノール残基を用いるペプチジルケトンインヒビターは、ペプチジルフルオロケトンに類似している。従来知られているとおり、酸素原子は大きさおよび電気陰性度においてフッ素原子と最も似通っている。さらに、酸素原子が芳香環に結合すると、この電気陰性度の値は炭素のｓｐ２の電子吸引効果によりさらに近くなる。α−ケトフルオライドに対するα−ケトフェノールの誘導効果は、α− 水素原子のｐｋａによって測定すると、実験誤差の範囲で同等と思われる。種々の病気状態とシステインプロテイナーゼインヒビターとの一般的な関連は知られているが、先行技術には、初めてラズニックによって記載されたタイプの特異的なインヒビターを用いる特異的な治療法を明らかにしたものはない。従って、リソソーム外のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ活性を特徴とする種々の病気状態を治療する方法に対する必要性が存在する。本発明はこの必要性に向けられるものである。発明の要約本発明を簡略に述べると、リソソーム外のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ活性によって特徴づけられる内科的状態を治療する方法が提供される。特に、in vivo適用に特に効果的であることが示されている一群のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬインヒビターが開示される。本発明において用いられる特定の化合物に関し、好適な化合物は下記式を有する：ここで、ＢはＨであるか、またはＮ−末端アミノ酸チッ素の保護基であり；Ｒ₁はＰ₂アミノ酸残基上の場合により保護されたα−アミノ酸側鎖であって、その際、Ｐ₂アミノ酸残基がフェニルアラニン（Phe）、ロイシン（Leu）、チロシン（Tyr）およびバリン（Val）並びに、特にTyr（0Me）を含むそれらの置換類似体からなる群から選ばれた一種のα−アミノ酸の残基となるように選ばれ；Ｒ₂はＰ₁アミノ酸残基上の場合により保護されたα−アミノ酸側鎖であって、その際、Ｐ₁アミノ酸残基がアラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glｕ）、ヒスチジン（His）、ホモフェニルアラニン（HPhe）、フェニルアラニン（Phe）、オルニチン（Orn）、セリン（Ser）およびスレオニン（Thr）並びにそれらの置換類似体からなる群から選ばれた一種のα−アミノ酸の残基となるように選ばれ；Ｘはフェノキシ、置換フェノキシおよびヘテロフェノキシからなる群から選ばれるフッ素原子を有しない脱離基であり；ＥおよびＧは炭素原子よりさらに電気陰性度の高い原子で、ＥおよびＧはカルボニルまたはヒドラゾンにおけるように、二重結合によりペプチド鎖と結合している同一原子でもよく、または単結合によりペプチド鎖とそれぞれ結合している２つの別の原子であってもよく；そして、Ｄは水素原子、メチルまたは置換メチルである。本発明の１つの目的はリソソーム外のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ活性を特徴とする内科的状態を治療する方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は in vivo 適用に特に有効な一群のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬインヒビターを提供することにある。本発明のさらなる目的および利益は下記の説明から明らかとなるであろう。好適な態様の記述本発明の原理の理解を促進するために、参照が好適な態様に対してなされ、また説明するために特定の用語が用いられるかもしれない。しかし、そのことによって、本発明の範囲を限定する意図は全くない。本発明の変更または改良、ここに説明する本発明の原理のさらなる応用は当業者にとって容易に考えつくことである。本発明は、リソソーム外のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬによって特徴づけられる内科的状態を治療する方法に関する。本発明の１つの特徴は、in vivo 適用に特に有効であることが示されている一群のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬインヒビターが開示されていることである。本発明のインヒビターは一般的に下記式により表すことができる：Ｂ--(Ｐ)x−−ＣＨ₂Ｘ式中、ＢはＮ−末端アミノ酸のためのアミノ酸保護基であり、各（Ｐ）ｘは場合により保護されたα−アミノ酸残基であり、そしてＸは脱離基である。慣習とおりまたはこの中で用いられているとおり、アミノ酸残基はＰ₁，Ｐ₂等と指定されることができる。ここで、Ｐ₁は脱離基に最も近いアミノ酸残基であり、Ｐ₂はＰ₁に隣接し、保護基により近いアミノ酸残基に関する等。従って、ジペプチドインヒビターの場合、Ｐ₂は保護基に最も近いアミノ酸残基である。さらに具体的には、本発明において用いられる化合物は下記式の化合物である。ここで、ＢはＨであるか、またはＮ−末端アミノ酸チッ素の保護基であり；Ｒ₁はＰ₂アミノ酸残基上の場合により保護されたα−アミノ酸側鎖であって、その際、Ｐ₂アミノ酸残基がフェニルアラニン（Phe）、ロイシン（Leu）、チロシン（Tyr）およびバリン（Val）並びに、特にTyr（OMe）を含むそれらの置換類似体からなる群から選ばれた一種のα−アミノ酸の残基となるように選ばれ；Ｒ₂はＰ₁アミノ酸残基上の場合により保護されたα−アミノ酸側鎖であって、その際、Ｐ₁アミノ酸残基がアラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、ヒスチジン（His）、ホモフェニルアラニン（HPhe）、フェニルアラニン（Phe）、オルニチン（Orn）、セリン（Ser）およびスレオニン（Thr）並びにそれらの置換類似体からなる群から選ばれた一種のα−アミノ酸の残基となるように選ばれ：Ｘはフェノキシ、置換フェノキシおよびヘテロフェノキシからなる群から選ばれるフッ素原子を有しない脱離基であり；ＥおよびＧは炭素原子よりさらに電気陰性度の高い原子で、ＥおよびＧはカルボニルまたはヒドラゾンにおけるように、二重結合によりペプチド鎖と結合している同一原子でもよく、または単結合によりペプチド鎖とそれぞれ結合している２つの別の原子であってもよく；そして、Ｄは水素原子、メチルまたは置換メチルである。Ｎ−末端アミノ酸チッ素のためのアミノ酸保護基Ｂに関しては、多くの適当なペプチド末端保護基が知られている。例えば、Ｅ．グロスおぼびＪ．マイエンホウファー（編）、The Peptides第３巻に明らかにされている末端保護基は本発明の使用に一般的に適当である。好適な保護基はＮ−モルフォリンカルボニルおよび内因性鎮痛作用または抗炎症作用を有するプロピオン酸誘導体の誘導体を含んでいる。内因性鎮痛作用または抗炎症作用を有する保護基の例は、ギルマン、グッドマン、ギルマン著、The Pharmacological Basis of Therapeutics第６版、マクミラン、第２９章に見いだすことができる。この中に定義されているように、ペプチド末端保護基はアミノ酸またはペプチド鎖のいずれかに結合している。１つの特に有効な保護基は下に示す４−モルフォリニルカルボニル保護基である。４−モルフォリニルカルボニルＰ₂アミノ酸上の側鎖に関しては、結合するＰ₂アミノ酸がフェニルアラニル（ Phe）、ロイシル（Leu）、チロシル（Tyr）およびバリル（Val）アミノ酸残基、並びに、特にTyr（OMe）を含むそれらの置換類似体からなる群の一員であるような側鎖が選ばれる。Ｐ₂アミノ酸上の種々の側鎖の広範囲のテストにより、この群の側鎖がここに述べられているような in vivo 適用のための優れた安全性および効力を提供することが確認された。この優れた安全性と効力は先行技術からは予測することはできず、しかも広範囲の実験の後にのみ確立されたものである。そのようなアミノ酸残基を形成するための適当な側鎖は、次の基を含む。Ｐ₁アミノ酸上の側鎖に関しては、結合するＰ₁アミノ酸がアラニル（Ala）、アルギニル（Arg）、アスパルチル（Asp）、グルタミル（Glu）、ヒスチジル（H is）、ホモフェニルアラニル（HPhe）、フェニルアラニル（Phe）、オルニチル（Orn）、セリル（Ser）およびスレオニル（Thr）並びに、チアゾールおよびアミノチアゾールのようなそれらの任意置換類似体からなる群の一員であるような側鎖が選ばれる。先行技術からヒスチジルのイミダゾールを他のヘテロ環に効能の損失なしに置換できることが認識されるべきである。さらに、アルギニンのアミジン塩基に対する多くの変更が一般に知られている。従って、２〜５の鎖長の炭素原子を有し、チッ素原子、酸素原子または硫黄原子を含む全ての五または六員環のヘテロ環は本発明の目的のためのＰ₁アミノ酸残基の置換類似体と考えられる。加えて、アミノ酸残基のエステルおよびアミド誘導体はin vivo適用のためのインヒビターの適性に不利な影響を与えることなく用いることができることが知られている。従って、上述のアミノ酸残基、特にアスパラギン酸およびグルタミン酸残基のエステルおよびアミド誘導体は本発明の範囲の置換類似体に含まれることを意図される。再び、Ｐ₁アミノ酸上の種々の側鎖の広範囲のテストにより、この群の側鎖がここに述べられているようなin vivo 適用のための優れた安全性および効力を提供することが確認された。この優れた安全性と効力は先行技術からは予測することはできず、しかも広範囲の実験の後にのみ確立されたものである。Ｐ₁アミノ酸に適当な側鎖は次のものを含む。本発明の脱離基に関しては、そのような脱離基は、フェノキシ、置換フェノキシおよびヘテロフェノキシからなる群から選ばれる。特に、フッ素原子を有しない脱離基が好適である。脱離基としてフェノールを用いる場合、使用できるフェノールの集団にはアスピリンおよびアスピリン様薬剤、サルチル酸メチル、アセトアミノフェンおよび他の誘導体のような抗炎症薬を含む。明らかに、このような抗炎症薬をプロスタグランジン産生、および／または苦痛を減ずるために放出させことは或る情況においては有益である。特定の用途のための適当なフェノキシ、置換フェノキシおよびヘテロフェノキシ脱離基の選択は、当業者にとって過度の実験なしに行うことができる。酵素とインヒビターとの反応の過程において、インヒビターのカルボニルはｓｐ３と再融合し（rehybridizes）て、酵素のチオール官能性とケタール中間体を生成することに留意されたい。この反応の酸性条件下で、他のケタールがケトンを経由するか、またはケタールーケータル交換によってこの中間体と交替することができる。従って、本発明のペプチジルインヒビターのカルボニルはケタールに置き換えることができる。同様にヒドラゾン、ヘミケタール、オキシム、イミン、シアンヒドリン、エノールエーテル、エナミン、ヘミチオケタール、などの他の化合物もカルボニル等価物と考えられ、カルボニルの代わりに、またはこれらの抑制反応の酸性条件下でカルボニルを与えるために置換することができる。そのような誘導体の使用は、抑制剤の生物学的利用能を改良するため、またはマスキング機能の疎水性に依存して細胞膜の通過を防止するための助けとなることもできる。一旦最適なペプチド配列が同定されると、アミド結合の等配置置換（isosteri c replacements）を有する化合物の開発および合成は、現在、生物学的に活性なペプチドの開発に於ける標準的プラクテイスである。従って、本発明はペプチド配列中に１ケ以上の修飾アミド結合を有する化合物も、二次的酵素加水分解が防止され、配座および結合が保持されるかぎり、含んでいる。そのような修飾のリストとしては、カルテンブロン著、33 J．Med．Chem.，838を参照のこと。加えて、他のハロゲンメチルケトンについてジョウダンによって報告されているとおり、Ｐ₁チッ素原子と置換したヒドラジンを有するインヒビターもまたクレームに含まれる。実施例１４−モルフォリンカルボニル−アミノ酸エステル類調製の概略の手順ＴＨＦ（１００ｍｌ）中、アミノ酸ベンジルエステルのｐＴＳＡ塩（２４．１２ｍｍｏｌ）に４−モルフォリンカルボニルクロライド（アルドリッチ社）２４．１２ｍｍｏｌを添加し、続いてＮ−メチルモルフォリン（４８．２４ｍｍｏｌ）を添加する。その混合液を室温で一晩中攪拌し、その後、１００ｍｌの１Ｎ塩酸に注ぎ入れ、酢酸エチル（２００ｍｌ）で抽出し、重炭酸ナトリウム飽和溶液（１００ｍｌ）およびブライン（４０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、最後に蒸発させてモルフォリンカルボニルベンジルエステルを得る。酢酸エチルを溶媒とし、水素（３０ｐｓｉ）、炭素上の１０％パラジウムで還元して遊離の酸を得る。実施例２（４−モルフォリニルカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ホモフェニルアラニル−（２−カルボキシメチル）フェノキシメチルケトン（ＭＵ−Ｐｈｅ −ＨＰｈｅ−Ｏ−Ｐｈ）１００ｍｌのＴＨＦ中、−１５℃で、４−モルフォリンカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（８．３ｍｍｏｌ）溶液に、１当量（０．９１３ｍｌ）のＮ−メチルモルフォリンを、続いてイソブチルクロロフォルメート（８．３ｍｍｏｌ、１．０８ｍｌ）を添加する。１０分間反応させた後、ホモフェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（８．４ｍｏｌ、１．９４ｇ）を添加し、続いて別の１当量（０．９１３ｍｌ）のＮ−メチルモルフォリンを添加する。反応液を徐々に室温になるようにし、一晩中攪拌する。反応液を１００ｍｌ塩酸（１Ｎ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（２００ｍｌ）で抽出し、５０ｍｌ塩酸（１Ｎ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×１００ｍｌ）およびブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて３．５０ｇ（９３％）の白い泡状物を得る。その泡状物を５０ｍｌメタノールおよび７．８ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解させる。５時間後、溶液を濃縮してガムにし、水で希釈して酢酸エチルで抽出する。水分画をその後１ＮのＨＣｌで中和し、酢酸エチルで抽出する。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、乾燥するまで濃縮して白色固体（２．６５ｇ、７８％、融点８８〜９６℃）を得る。Ｎ−保護ぺプチジル遊離酸のＮ−保護ぺプチジルブロモメチルケトンへの転化の概略の手順４−モルフォリンカルボニルーフェニルアラニルーホモフェニルアラニン（２．００ｇ、４．５ｍｍｏｌ、−１５℃）の溶液に、１当量（０．４９５ｍｌ、４．５ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルフォリンを添加する。その後、混合液に１当量（０．５８３ｍｌ）のイソブチルクロロフォルメートを添加する。混合液をこの温度で１０分間攪拌し、その後、濾紙を通して、供給者（アルドリッチ社）の指示に従い、４．３ｇのジアザルド（Diazald）から調製されるジアゾメタンのエーテル性溶液に添加する。一晩中攪拌後、反応液を水（２×５０ｍｌ）、飽和重炭酸ナトリウム（５０ｍｌ）およびブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄ 上で乾燥させ、濾過し、乾燥状態になるまで蒸発させる。カラムクロマトグラフィー（１５０ｇ、ＣＨＣｌ₃：イソプロパノール、９：１）による精製で、５．２５ｐｐｍにおけるジアゾメチル水素吸収により特徴づけられる純ジアゾメチルケトンを得る。ブロモメチルケトンへの転化酢酸中臭化水素３０％溶液の１ｍｌを１ｍｌのメチレンクロライドで希釈し、 −１５℃にある、２５ｍｌのメチレンクロライド中の４−モルフォリンカルボニルーフェニルアラニルーホモフェニルアラニルジアゾメチルケトン溶液に滴下して添加する。１０分後、ＴＬＣモニターが、出発物質の消失を示す（Ｒｆ０．３５；シリカゲル、ＣＨＣｌ₃：イソプロパノール、９：１）。反応液を１５０ｍｌの水に注ぎ入れ、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出する。まとめた有機分画をブライン（２×５０ｍｌ）、重炭酸ナトリウム（２×５０ｍｌ）および再度ブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ₂ ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮して、６６０ｍｇのブロモメチルケトン（３．８２ｐｐｍにおけるＮＭＲプロトン吸収により特徴づけられる、８６％の固体泡状物）を得る。フェノキシメチルケトンの調製１ｍｌのＤＭＦ、０．５ｍｌのサリチル酸メチルおよび１ｇ（２．２ｍｍｏｌ）の（４−モルフォリンカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニル−ホモフェニルアラニルブロモメチルケトンの入ったフラスコに、フッ化カリ（２３０ｍｇ）を添加する。反応液をその後、冷却し、クロロフォルムおよびイソプロパノール（９：１）の溶液で希釈し、シリカゲルを通してフッ化カリを除去する。濾液を乾燥するまで蒸発させ、クロマトグラフ（７５ｇシリカゲル、ＣＨ₂ Ｃｌ₂：メタノール、９：１）にかけて０．９ｇ（７９％）の固体のフェノキシメチルケトン、融点１１５〜１２１℃を得る。実施例３ｔ−ブチルカルバミル−Ｌ−アルギニル−（２−カルボキシメチル）フェノキシメチルケトン実施例２に従う方法で、フッ化カリ（４０ｍｇ）を４２ｍｇのＢＯＣ−Ａｒｇ −ＣＨ₂Ｂｒおよびサリチル酸メチル（８００ｍｇ）に添加する。反応液をアルゴン下１１分間で６２゜に加熱し、冷却し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮し、エーテルから沈殿させる。生成物は、Ｒｆ値０．５（シリカゲル、ＣＨＣｌ₃：イソプロパノール、８：２）で、カテプシンＢの抑制に関してＺ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＦＫの５倍の有効性を有する。実施例４ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−アラニル−ブロモメチルケトン（ＢＯＣ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ブロモメチルケトン）０℃の、９ｍｌメチレンクロライド中のｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−２−カルバモイル−ジアゾケトン（１．８ｇ）５ｍＭ）に、２．５ｍｌの３０％臭化水素−酢酸（アルドリッチ社）をメチレンクロライドで５．５ｍｌに希釈した溶液を滴下させながら添加する。この添加には２時間を要し、このとき、ＴＬＣは出発物質の消失を示す（Ｒｆ０．３９）。反応液を３００ｍｇの固体の重炭酸ナトリウムを添加して０℃に冷却する。水（５ｍｌ）を添加し、混合液を３０ｍｌのメチレンクロライドで抽出する。有機分画を１５ｍｌの水で先浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、真空下に濃縮して１．５ｇ（７５％）の粗ブロマイド生成物を得る。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：酢酸エチル、１：１）により、１ｇの純ブロモケトンを得る（融点１２９〜１３０ ℃、Ｒｆ０．４７）、ＮＭＲ（ＣＨＣｌ₃）δ１．３３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７Hz）、１．４０（ｓ，９Ｈ）、３．１０（ｄ，Ｊ＝１４Hz）、４．００（ｓ，２Ｈ）、４．４０（ｍ，１Ｈ）、４．８１（ｍ，１Ｈ）、５．１５（ｍ，１Ｈ）、６．７０（ｍ，１Ｈ）、７．４５（ｍ，５Ｈ）。実施例５Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラニルブロモメチルケトン（Ｚ−Ａ１ａ−ブロモメチルケトン）このブロモケトンは、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２−カルバモイル−ジアゾケトンを出発物質として用いるほかは実施例４のブロモケトンの方法で製造する。次の結果が得られる：収率４０％、Ｒｆ０．４８，融点７２〜７５℃、ＮＭＲ（ＣＨＣｌ₃）δ１．４３（ｄ，３Ｈ，J＝７Ｈｚ）、４．０６（ｓ，２Ｈ）、４．６６（ｍ，１Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、７．２６〜７．３５（ｍ，５Ｈ）。実施例６Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−アラニン−２−メトキシカルボニルフェノキシメチルケトン実施例４のブロモケトン（５００ｍｇ）１．２ｍＭ）をフッ化カリ（１３７ｍｇ、２．４ｍＭ）、サリチル酸メチル（３５７ｍｇ，２．３ｍＭ）および２．８ｍｌのＤＭＦとアルゴン下で３５℃で１時間混合する。反応混合液を５０ｍｌの酢酸エチルで希釈し、有機部を水（３×２５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、１ｇに濃縮する。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：酢酸エチル、１：１、Ｒｆ０．４６５）による精製で３０６ｍｇのＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−アラニン−２−メトキシカルボニルフェノキシメチルケトン（５６％）を得る。融点１０２．９〜１０６．６℃、ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．４０（ｓ，９Ｈ）、１．４５（ｄ，３Ｈ）、３．０９（ｍ，１Ｈ）、３．９５（ｓ，３Ｈ）、４．５５（ｄ，２Ｈ）、５．１０（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ，ｍ／ｅ（４８５，ＭＨ⁺）。実施例７Ｎ−ＢＯＣ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−フェノキシメチルケトンこの化合物は、試薬の濃度がＢＯＣ−Ｐｈｅ−Ａ１ａ−ブロモケトン（１２０ｍｇ、０．２９ｍＭ）、フッ化カリ（１５０ｍｇ）２．５ｍＭ）、フェノール（１８０ｍｇ、１．９ｍＭ）およびＤＭＦ（０．５ｍｌ）であることのほかは、実施例６の化合物と同じ方法で製造する。反応収率８５％；融点１１７．５℃；ＭＳｍ／ｅ（４２７．３０，ＭＨ⁺）；ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．４０〜１．５０（ｄ，Ｊ＝８Hz）、１．４２（ｓ，９Ｈ）、３．１０（ｄ，２Ｈ）、４．４０（ｍ，１Ｈ）、４．７５（ｓ，２Ｈ）、４．５０〜５．５０（ｍ，４Ｈ）、６．５０〜７．５０（ｍ，１０Ｈ）。実施例８Ｚ−Ａｌａ−フェノキシメチルケトンこの化合物は、試薬の濃度がブロモケトン（３００ｍｇ、０．８８ｍＭ）、フッ化カリ（１００ｍｇ）０．１７ｍｍｏｌ）、０．３ｍｌの乾燥ＤＭＦおよびサリチル酸メチル（２６０ｍｇ）、１ｍｍｏｌ）であるほかは、実施例６の化合物と同じ方法で製造する。混合液をアルゴン下に１０分間、９８℃に加熱し、０℃ まで冷まし、１０ｍｌの水で希釈し、５ｍｌの酢酸エチルで抽出する。有機層を１０ｍｌの水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮して、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル、１：１）、シリカゲルで精製し、Ｒｆ０．４２の生成物を集める。カラムクロマトグラフィー後の収率は１５０ｍｇ（４６％）である。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．５７（ｄ，３Ｈ，J＝７Ｈｚ）、４．０５（ｓ，３Ｈ）、４．６６（ｓ，２Ｈ）、４．９２（ｍ，１Ｈ）、５．２１（ｓ，２Ｈ）、６．０５（ｍ，１Ｈ）、６．６０〜８．１０（ｍ，８Ｈ）。ＭＳｍ／ｅ（３７１，ＭＨ⁺ ）。分析値：Ｃ（６３．７２），Ｈ（５．６５）、Ｎ（４．３３）；計算値：Ｃ（６４．６８），Ｈ（５．６９）、Ｎ（３．７７）。実施例９モルフォリンカルボニルフェニルアラニル−２−アミノイソ酪酸メチルフェノキシケトンの合成２−アミノイソ酪酸メチルエステル塩酸塩の合成１２５ｍｌメタノール中の２−アミノイソ酪酸に、１２５ｍｌの塩酸飽和メタノールを添加する。当初の混合物は溶液となり、反応器を密封して室温で一晩中攪拌する。翌日、反応液をはじめは何も加えないで、その後トルエンを用いて蒸発させて固体を得る。モルフォリンカルボニル−２−アミノイソ酪酸の合成２００ｍｌのＴＨＦ中のモルフォリンカルボニルフェニルアラニン（３．６ｇ，０．０１３ｍｏｌ）をアルゴン下に−２０℃まで冷却する。１当量のＮ−メチルモルフォリンと、続いて１当量のイソブチルクロロフォルメートを添加して、反応液をアルゴン下に１０分間攪拌する。メチルアラニンメチルエステルの塩酸塩を混合液に添加し、続いて１．２当量のＮ−メチルモルフォリンを添加する。反応液をゆっくりと室温に戻し、一晩中、攪拌する。反応液を同じ容量の１Ｎ塩酸に注ぎ入れ、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出する。まとめた抽出物を重炭酸ナトリウム水溶液（２×５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させて白色固体、融点１７４〜１８８℃のメチルエステルを得る。酸への転化モルフォリンカルボニル−２−アミノイソ酪酸メチルエステル（５．６５ｍｍｏｌ）を６ｍｌ（１Ｎ）の水酸化ナトリウムを含む６０ｍｌのメタノールに溶解させ、アルゴン下に一晩中攪拌する。その後、反応液を濃縮し、酢酸エチルで希釈し、７ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウムを含む水（５０ｍｌ）で抽出する。その水を中和し、酢酸エチルで抽出し、その後、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮して白色固体、融点１６２〜１６６℃を得る。得られた酸を既に実施例２で説明したようにして、２−カルボメトキシフェノキシメチルケトンに変換する。このインヒビターのカテプシンＢの比較抑制価は、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＣＨ₂ Ｆの０．２倍である。実施例１０ペプチジルメチルフルオロケトンケタールの合成：Ｍｕ−Ｐｈｅ−ＨＰｈｅフルオロメチルケトンのケタールの合成エチレングリコール（25ml）を窒素気流下に、１時間140℃で加熱することにより脱水する。次いで、温度を70℃まで下げ、pTSA1.8gを加え、続いてMu-Phe -HPheメチルフルオロケトン310mg（0.69ミリモル）を添加した。１時間後、シリカゲルにおいてTLC（CHCl₃：MeOH，9:1）を行うと、出発物質Rf 0.396の上部に生成物Rf 0.433を示した。反応物をその二倍量の重炭酸ナトリウムおよび氷へ注入する。得られる混合物を酢酸エチル50mlで2回抽出する。合わせた有機層をブラインで洗い、MgSO₄上で乾燥し、濃縮すると固体泡状物を得る。生成物をクロマトグラフィー（シリカゲル200g，CHCl₃：イソプロパノール，9:1）にかけると、高収率のケタールが得られ、これはフッ素NMRにおいて一本の三重項（-221.35 ppm）によりケトンを含まないことを示した（ケトン三重項 220.55ppm）。実施例11 P₁における修飾したアルギニン誘導体の調製：Mu-Phe-δ-（4，6-ジメチル-2- ピリミジル）オルニチンメチルエステルの合成。 250mlの丸底フラスコに100mlTHF中のMu-Phe-OH 1.08ミリモルを入れた。溶液をアルゴン下に-20゜まで冷却し、N-メチルモルホリン１当量およびイソブチルクロロホルメート１当量を加えた。10分後に、δ-（4，6-ジメチル-2-ピリミジル）オルニチンメチルエステル塩酸塩（ギルバート（Gilbert）およびレアリー（Leary），Biochemistry，Vol．14，pp．5194-99の方法で調製）を加えて、次いでN-メチルモルホリン１当量以上を加えた。翌日、反応物を水へ注入し、酢酸エチルで抽出する。有機層を乾燥（Na₂S0₄）し、濃縮すると、白色固体130mgが得られた。Rf（CHCl₃：イソプロパノール，8:2）＝0.43。この物質を普通の方法で１N水酸化ナトリウム１当量で鹸化し、実施例2におけるようにフェノキシケトンにする。実施例12 驚くほど効果的なプロテイナーゼ阻害剤の測定ヒト肝臓から精製されたカテプシンBは、エンザイムシステムズプロタクツ（Enzyme Systems Products）（カナダ、ダブリン）から得られた。この実施例で使用される酵素の活性は、50mmリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.2，5mm DTT， 2mmEDTAにおいて、基質としてZ-Leu-Arg-Arg-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクルマリン（Z-Leu-Arg-Arg-AFC）を用いて、30℃にて50mU/mlであった。カテプシンBの検定は以下の条件下に行った：酵素貯蔵溶液5μlを30分間リン酸塩緩衝液435μｌとともにプレインキュベートし、酵素を活性化した。20mm貯蔵基質溶液（ジメチルホルムアミド中）9μlを添加し、活性化酵素と混合した。活性はパーキン-エルマーLS-5B分光蛍光計（励起 -400nm，発光 -505nm）によりモニターした時の遊離AFCの放出により追跡された。ここに記載した阻害剤は、DMF中の20mm貯蔵溶液において調製された。各阻害剤の5μlアリコートを酵素へ添加し、2分後に基質を混合物へ添加した。効力はカテプシンB標準阻害剤、Z-Phe-Ala-CH₂F（比較効力＝1.0）の活性と比較して測定された。フェニルアラニン（Phe）、ロイシル（Leu）、チロシル（Tyr）、バリル（Val ）およびTyr（OMe）を含むこれらの置換された類似物からなる群から選択される P₂アミノ酸における側鎖を有する阻害剤は、カテプシンBに対し特に有効であった。さらに、アラニル（Ala）、アルギニル（Arg）、ヒスチジル（His）、ホモフェニルアラニル（HPhe）、フェニルアラニル（Phe）、オルニチル（Orn）、セリル（Ser）、トレオニル（Thr）、チアゾールおよびアミノチアゾールならびに4，6 -ジメチルまたは4，6-ジヒドロキシピリミジルを含むその修飾物、およびこれらの置換された類似物もまた特に有効であった。このような試験された化合物の比較効力は、一般に2.0〜10.0であり、いくつかの化合物では25.0以上の比較効力が観察されている。阻害剤のこの比較的小さなクラスの構成員、すなわち上述の基から選択されるP₁およびP₂アミノ酸側鎖を有するものの効力は、代わりの側鎖を有する阻害剤の効力と比較して驚くほど高かった。実施例13 Mu-Phe-HPhe-0-Phを用いたリューマチ性関節炎の治療 DBA/Lacマウスに、0日目および21日目においてフロイント完全アジュバントに乳化したひな鳥コラーゲンII型200μｇを注射した。Mu-Phe-HPhe-0-Phをエタノール溶液に懸濁し、次いでこれを10%（水性）まで希釈し、21日目から49日目に屠殺するまで10mg/kg/日の投与量で胃管栄養により投与した。関節炎の程度を、 21日目から始まって7日毎に大まかに評価した。アジュバント誘因関節炎の骨の病変におけるMu-Phe-HPhe-0-Phの経口投与の効果は、骨炭化、骨膜増殖、骨侵食、関節間隔狭窄および骨破壊を調べることにより測定された。すべての病変を尺度0（正常組織）から3（深刻なまたは著しい変化）で評価した。計算した値は平均値±１標準誤差（平均値に対する）であった。Mu-Phe-HPhe-0-Phで処理された動物の“骨病変程度”の値は、各パラメーターについて対照動物の値より著しく（p<0.05）低かった。アジュバント誘因関節炎の組織学的観点におけるMu-Phe-HPhe-0-Phの経口投与の効果は、炎症、局部性潰瘍、脛部関節軟骨破壊、骨破壊および骨膜増殖を調べることにより測定された。炎症を浮腫および細胞湿潤の程度に基づいて、尺度0 （炎症なし）から3（重度）で点数を付けた。局部性潰瘍軟骨破壊を、亜軟骨下層に現れる局部破壊を有する関節軟骨表面の割合として測定した。脛部関節軟骨破壊を亜軟骨の破壊を有する関節接合表面の割合として測定した。計算した値は平均値±１標準誤差（平均値に対する）であった。Mu-Phe-HPhe-0-Phで処理された動物の“組織的方面”の値は、各パラメーターについて対照動物の値より著しく（p<0.05）低かった。実施例14 Mu-Leu-HPhe-0-Phを用いたリューマチ性関節炎の治療 DBA/Lacマウスに、0日目および21日目においてフロイント完全アジュバントに乳化したひな鳥コラーゲンII型200μｇを注射した。Mu-Phe-HPhe-0-Phを緩衝化食塩水に懸濁し、次いでこれを21日から35日に屠殺するまで投与した。3mg/kg/日〜25mg/kg/日の投与量を用い、毎日の投与量は各試験期間にわたって一定に保った。関節炎の程度を、21日目から始まって7日目毎に大まかに評価した。アジュバント誘因関節炎における骨病変の程度におけるMu-Phe-HPhe-0-Phの経口投与の効果は、骨炭化、骨膜増殖、骨侵食、関節間隔狭窄および骨破壊を評価することにより測定された。すべての病変を尺度0（正常組織）から3（深刻なまたは著しい変化）で点数を付けた。計算した値は平均値±１標準誤差（平均値に対する）であった。Mu-Phe-HPhe-0-Phで処理された動物の“骨病変程度”は、試験された各パラメーターについて対照動物の値より著しく（p<0.05）低かった。実施例15 Mu-Tyr（OMe）-HPhe-0-Phを用いたリューマチ性関節炎の治療ラットに、0日目においてアジュバントを注射し、そしてアジュバント注射の時点から32日目の屠殺までの間、粉砕飼料中のMu-Tyr（OMe）-HPhe-0-Phで処理した。病気の間にわたって、動物を平均的臨床スコアの観点から評価し、これから導かれる一連の臨床的に観察されたパラメーターを標準化してグラフ表示を容易にした。平均の手足容積もまた病気の間にわたって標準化ユニットを用いて測定した。研究の最後に、動物グループを屠殺しそしてX線分析により評価した。 Mu-Tyr（OMe）-HPhe-0-Phで処理されたラットの平均臨床スコアは、未処理動物についてのスコアより著しく低かった。同様に、平均手足容積もまた著しく低かった。この実施例はアジュバント誘因関節炎におけるMu-Tyr（OMe）-HPhe-0-P hの有益な効果を示す。実施例16 Mu-Phe-HPhe-0-Phを用いた骨関節炎の治療 10日間にわたって¹⁴Ｃ−テトラサイクリンを注射することにより若い成長中のラットの骨を放射能標識化した。次いで、骨の吸収量を尿中に排泄される放射能の量として毎日測定した。対照排泄の10日後に、試験化合物を３日間皮下注射し、テトラサイクリンの毎日の排泄におけるこれらの効果を測定した。試験化合物を濃度25mg/mlでDMSO/PEGに溶かし、一日一回皮下注射で容量2ml/kgにて注射した。テトラサイクリン排泄により測定された場合に、Mu-Phe-HPhe-O-Phはインビボにおいて骨吸収を阻害した。効果は、カルシトニンの最大投与量のものと同じ程優れていた。阻害の作用開始は迅速であり、最大効果は投与開始後２４時間だけ生じた。実験の最後に、病変は注射部位で視認可能であった。組織学的評価により、上層の皮膚および下層の筋肉層へ延びる皮下脂肪層の広範囲な炎症が明らかであった。組織壊死もまた観察された。実施例17 Mu-Leu-HPhe-O-Phを用いた骨関節炎の治療 10日間にわたって¹⁴Ｃ−テトラサイクリンを注射することにより若い成長中のラットの骨を放射能標識化した。次いで、骨吸収の量を尿中に排泄される放射能の量として毎日測定した。対照排泄の10日後に、試験化合物を3日間皮下注射し、テトラサイクリンの毎日の排泄におけるこれらの効果を測定した。試験化合物を濃度25mg/mlでDMSO/PEGに溶かし、一日一回皮下注射で容量2ml/kgにて注射した。テトラサイクリン排泄により測定されたように、Mu-Leu-HPhe-O-Phはインビボにおいて骨吸収を阻害した。効果は、カルシトニンの最大投与量のものとほぼ同じ程優れていたが、Mu-Phe-HPhe-O-Phのものと全く同じほど優れてはいなかった。ここでも阻害の作用開始は迅速であり、最大効果は投与開始後２４時間だけ生じた。実験の最後に、病変は注射部位で視認可能であった。組織学的評価により、上層の皮膚および下層の筋肉層へ延びる皮下脂肪層の広範囲な炎症が明らかであった。組織壊死もまた観察された。実施例18 Mu-Phe-HPhe-O-Phを用いた骨関節炎の治療新生児マウスの⁴⁵Ca²⁺標識化骨（頭蓋冠）を培養基に保持した。副甲状腺ホルモン刺激⁴⁵Ca²⁺放出速度における試験化合物の効果を24時間にわたって測定した。骨吸収の阻害剤（最大濃度にて）は、ほぼ70%までこの速度を阻害することが予想される。残りの阻害することができない⁴⁵Ca²⁺放出の性質は知られていないが、しかし媒体との⁴⁵Ca²⁺の化学的交換を表すであろう。Mu-Phe-HPhe-O-Phはジメチルスルホキシドに溶かし、これは濃度＜0.1%でインキュベーション中に存在させた。 Mu-Phe-HPhe-O-Phは濃度に対応して吸収を阻害した。阻害曲線の形は、⁴⁵Ca²⁺ 放出の速度の50%が1μm阻害剤て阻害され、一方100μmでさらに２０％が阻害される二相式のようであった。IC₅₀値は阻害剤の最初の相に基づいて計算された。実施例19 Mu-Leu-HPhe-O-Phを用いた骨関節炎の治療新生児マウスの⁴⁵Ca²⁺標識化骨（頭蓋冠）を培養基に保持した。副甲状腺ホルモン刺激⁴⁵Ca²⁺放出速度における試験化合物の効果を24時間にわたって測定した。骨吸収の阻害剤（最大濃度にて）は、ほぼ70%までこの速度を阻害することが予想される。残りの阻害することができない⁴⁵Ca²⁺放出の性質は知られていないが、しかし媒体との⁴⁵Ca²⁺の化学的交換を表すであろう。Mu-Leu-HPhe-O-Phはジメチルスルホキシドに溶かし、これは濃度＜0.1%でインキュベーション中に存在させた。 Mu-Leu-HPhe-O-Phは濃度と対応して吸収を阻害した。阻害曲線の形は、⁴⁵Ca²⁺ 放出の速度の50%が1μm阻害剤で阻害され、一方100μmでさらに20%が阻止される二相式のようであった。IC₅₀値は阻害の最初の相に基づいて計算された。実施例20 Mu-Tyr（OMe）-HPhe-O-Phを用いた骨関節炎の治療新生児マウスの⁴⁵Ca²⁺標識化骨（頭蓋冠）を培養基に保持した。副甲状腺ホルモン刺激⁴⁵Ca²⁺放出速度における試験化合物の効果を24時間にわたって測定した。骨吸収の阻害剤（最大濃度にて）は、ほぼ70%までこの速度を阻害することが予想される。残りの阻害することができない⁴⁵Ca²⁺放出の性質は知られていないが、しかし媒体との⁴⁵Ca²⁺の化学的交換を表すであろう。Mu-Tyr（OMe）-HPhe-O-P hはジメチルスルホキシドに溶かし、これは濃度＜Ｏ．１％でインキュベーション中に存在させた。 Mu-Tyr（OMe）-HPhe-O-Phは濃度に対応して吸収を阻害した。阻害曲線の形は、⁴⁵Ca²⁺放出の速度の50%が1μm阻害剤で阻害され、一方100μmでさらに20%が阻害される二相式のようであった。IC₅₀値は阻害の最初の相に基づいて計算された。実施例21 Z-Phe-Ala-O-Phを用いた骨関節炎の治療新生児マウスの⁴⁵Ca²⁺標識化骨（頭蓋冠）を培養基に保持した。副甲状腺ホルモン刺激⁴⁵Ca²⁺放出速度における試験化合物の効果を24時間にわたって測定した。骨吸収の阻害剤（最大濃度にて）は、ほぼ70%までこの速度を阻害することが予想される。残りの阻害することができない⁴⁵Ca²⁺放出の性質は知られていないが、しかし媒体との⁴⁵Ca²⁺の化学的交換を表すであろう。Z-Phe-Ala-O-Phはジメチルスルホキシドに溶かし、これは濃度＜0.1%でインキュベーション中に存在させた。 Z-Phe-Ala-O-Phは濃度に対応して吸収を阻害した。阻害曲線の形は、⁴⁵Ca²⁺放出の速度の50%が1μm阻害剤で阻害され、一方100μmでさらに20%が阻害される二相式のようであった。IC₅₀値は阻害の最初の相に基づいて計算された。実施例22 Mu-Tyr（OMe）-HPhe-O-Phを用いた骨関節炎の治療新生児マウスの⁴⁵Ca²⁺標識化骨（頭蓋冠）を培養基に保持した。副甲状腺ホルモン刺激⁴⁵Ca²⁺放出速度における試験化合物の効果を24時間にわたって測定した。骨吸収の阻害剤（最大濃度にて）は、この速度をほぼ70%まで阻害することが予想される。残りの阻害することができない⁴⁵Ca²⁺放出の性質は知られていないが、しかし媒体との⁴⁵Ca²⁺の化学的交換を表すであろう。Mu-Tyr（OMe）−HPhe-O- Phはジメチルスルホキシドに溶かし、これは濃度＜0.1%でインキュベーション中に存在させた。 Mu-Tyr（OMe）-HPhe-O-Phは、マウス頭蓋冠においてIC₅₀はほぼ40nmで吸収を阻害することがわかった。阻害曲線の形は簡単ではなく（他のシステインプロテアーゼ阻害剤で観察されたようには）、そしてIC₅₀値は阻害の最初の相に対するものとして計算した。実施例23 Mu-Phe-HPhe-O-Phを用いたマラリアの治療プラスモジウムファルシパルム（P.falciparum）およびプラスモジウムビンクケイ（P.vinckei）の可溶性抽出物を調製し、そしてたんぱく質分解活性を蛍光性ぺプチド基質Z-Phe-Arg-AFCを用いて検定した。対照サンプルの活性をMu- Phe-HPhe-O-Phの複数の濃度の存在下の活性と比較した。活性が50%まで阻害された濃度（IC₅₀）を計算した。 Mu-Phe-HPhe-O-Phはプラスモジウムファルシパルムおよびプラスモジウムビンクケイの両方の活性を阻害した。それぞれIC₅₀値3.0nmおよび5.1nmが得られた。実施例 24 Mu-Leu-HPhe-O-Phを用いたマラリアの治療プラスモジウムファルシパルムおよびプラスモジウムビンクケイの可溶性抽出物を調製し、そしてたんぱく質分解活性を蛍光性ぺプチド基質Z-Phe-Arg-AF Cを用いて検定した。対照サンプルの活性をMu-Leu-HPhe-O-Phの複数の濃度の存在下の活性と比較した。活性が50%まで阻害された濃度（IC₅₀）を計算した。 Mu-Leu-HPhe-O-Phはプラスモジウムファルシパルムおよびプラスモジウムビンクケイの両方の活性を阻害した。それぞれIC₅₀値0.42nmおよび15nmが得られた。実施例 25 Mu-Phe-Arg（NO₂）-O-Phを用いたマラリアの治療プラスモジウムファルシパルムおよびプラスモジウムビンクケイの可溶性抽出物を調製し、そしてたんぱく質分解活性を蛍光性ぺプチド基質Z-Phe-Arg-AF Cを用いて検定した。対照サンプルの活性をMu-Phe-Arg（NO₂）-O-Phの複数の濃度の存在下の活性と比較した。活性が50%まで阻害された濃度（IC₅₀）を計算した。 Mu-Phe-Arg（NO₂）-O-Phはプラスモジウムファルシパルムおよびプラスモジウムビンクケイの両方の活性を阻害した。それぞれIC₅₀値2.4nmおよび110nmが得られた。実施例 26 Mu-Tyr（OCH₃）₂-HPhe-O-Phを用いたマラリアの治療プラスモジウムファルシパルムおよびプラスモジウムビンクケイの可溶性抽出物を調製し、そしてたんぱく質分解活性を蛍光性ぺプチド基質Z-Phe-Arg-AF Cを用いて分析した。対照サンプルの活性をMu-Tyr（OCH₃）₂-HPhe-O-Phの複数の濃度の存在下の活性と比較した。活性が50%まで阻害された濃度（IC₅₀）を計算した。 Mu-Tyr（OCH₃）₂-HPhe-O-Phはプラスモジウムファルシパルムおよびプラスモジウムビンクケイの両方の活性を阻害した。それぞれIC₅₀値8.5nmおよび18n mが得られた。実施例 27 Mu-Phe-HPhe-メチルサリチレートを用いたマラリアの治療プラスモジウムファルシパルム（P.falciparum）の可溶性抽出物を調製し、そしてたんぱく質分解活性を蛍光性ぺプチド基質Z-Phe-Arg-AFCを用いて、ローゼンタール（Rosenthal）、ウォーリッシュ（Wollish）、パルマー（Palmer）およびラスニック（Rasnick）、“プラスモジウムファルシパルムシステインプロテイナーゼのぺプチド阻害剤の抗マラリア作用（Antimalarial Effects of PeptideInhibitors of a Plasmodium falciparum Cysteine Proteinase）”、88 ，J，Clin.Invest.1467に記載しているように検定した。対照サンプルの活性をM u-Phe-HPhe-メチルサリチレートの複数の濃度の存在下における活性と比較した。活性が50%まで阻害された濃度（IC₅₀）を計算した。 Mu-Phe-HPhe-メチルサリチレートはプラスモジウムファルシパルムの活性を阻害した。42nmのIC₅₀値が得られた。実施例 28 Mu-Phe-HPhe-O-Phを用いた歯肉炎の治療歯肉の炎症における阻害剤の効果は、実験的歯肉炎の発生を予防するためのその能力を研究することにより研究された。健康な歯肉および歯周病のない20人の健康な被験者を募った。被験者は開始前に口腔衛生指導および歯石取りを受けた。試験位置は上側第一および第二臼歯および小臼歯における正中面寄り頬側の窪みであった。これらの歯の歯肉の縁を覆うためにアクリル製の遮蔽具を作り、口腔衛生の間に試験および対照位置をブラッシングしないようにこれを装着した。３週間の試験期間の間、被験者は下側の歯と上側前方のみをブラッシングし、そしてブラッシングの間この遮蔽具を装着するように言われている。10人の被験者は左サイドを試験位置として使い、右サイドは対照位置とした。他の被験者はサイドを逆にし、被験者は自分自身を対照とした。32番目のＧＣＦサンプルを開始時点、および1,2,3,4,週間目における臨床測定の前に採取した。カテプシンBおよびL 同様物の活性についてこれらを検定した。歯肉炎指数（GI）、歯肉炎浸出指数（ GBI）およびプラーク指数（PLI）の臨床的測定を、0,1,2,3および4週目に試験および対照位置で行った。開始時点の測定に続いて、阻害剤とプラシボを試験および対照位置に置き、１週間コーパック（Coe-pak）を用いてシールした。阻害剤とプラシボをコード化して判別できないようにした。 GI，GIBおよびPLIならびにシステインプロテイナーゼレベルを試験および対照位置で比較した。Mu-Phe-HPhe-O-Phを使用すると試験位置で試験したすべてのパラメーターが低下することが見られた。したがって、Mu-Phe-HPhe-O-Phは歯肉炎のような歯周病の治療に有効であることがわかる。上述の実施例には、開示したプロテイナーゼをリューマチ性関節炎、骨関節炎、マラリアおよび歯肉炎を含む特定の医療症状を治療するのに使用することを開示していることが示されている。このようなインビボの適用における化合物の驚くべき効果は先行技術から断定されておらず、広範囲な実験を行った後にのみ測定された。ここに開示した基本的組成物および方法を変えることなく特定の医療症状へ本発明を適合させるために多数の変化を行うことができることは理解される。それゆえ、本発明が上述の実施例に詳細な説明および記載されているとはいえ、同じものが例示としてであり特性を制限するものではないと考えるべきである。好ましい実施態様が示され、記載されており、本発明の精神に適合する変化および変形は保護されるべきであることが望ましいことは理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/55 ＡＥＢ // Ｃ０７Ｃ 237/22 9547−4ＨＣ０７Ｋ 5/065 8318−4ＨＡ６１Ｋ 37/64 ＡＥＢＡＣＫ (72)発明者スミス，ロバート・イーアメリカ合衆国カリフォルニア州94550, リヴァーモア，エスコンディド・サークル 574

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程：（ａ）次式：（式中、 BはHまたはN-末端アミノ酸窒素のためのアミノ酸遮断基であり：Ｒ₁はＰ₂アミノ酸残基における場合により保護されたα-アミノ酸側鎖であり、Ｐ₂アミノ酸残基がフェニルアラニン（Phe）、ロイシン（Leu）、チロシン（T yr）およびバリン（Val）およびこれらの置換された類似物、特にTyr（0Me）からなる群から選択されるα-アミノ酸の残基であるように選択され：Ｒ₂はＰ₁アミノ酸残基における場合により保護されたα-アミノ酸側鎖であり、Ｐ₁アミノ酸残基がアラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン酸（A sp）、グルタミン酸（Glu）、ヒスチジン（His）、ホモフェニルアラニン（HPhe ）、フェニルアラニン（Phe）、オルニチン（Orn）、セリン（Ser）およびトレオニン（Thr）ならびにこれらの置換された類似物からなる群から選択されるα- アミノ酸の残基であるように選択され；Ｘはフェノキシ、置換フェノキシおよびヘテロフェノキシからなる群から選択されるフッ素不含有脱離基であり；ＥおよびＧは炭素より陰性度が強い原子であり、その際ＥおよびＧはカルボニルまたはヒドラゾンにおけるように、二重結合によりペプチド鎖へ結合した同じ原子でもよく、または単結合によりペプチド鎖へ各々結合した二つの別の原子でもよく；Ｄは水素、メチルまたは置換メチルである）で表される化合物またはその薬剤上許容されうる塩を用意し；（ｂ）前記化合物を医療患者へ伝達することからなるリソソーム外カテプシンＢおよび／またはカテプシンＬにより特徴づけられる医療症状の治療方法。２．前記化合物が薬剤上許容されうる担体と共に医療患者へ伝達される請求項１の方法。３．リソソーム外カテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ活性により特徴づけられる前記医療症状がリューマチ性関節炎である請求項１の方法。４．リソソーム外カテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ活性により特徴づけられる前記医療症状が骨関節炎である請求項１の方法。５．リソソーム外カテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ活性により特徴づけられる前記医療症状がマラリアである請求項１の方法。６．リソソーム外カテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ活性により特徴づけられる前記医療症状が歯周病である請求項１の方法。７．Ｒ₂がＰ₁アミノ酸残基がホモフェニルアラニンの残基であるようなＰ₁アミノ酸における場合により遮断された側鎖である請求項１の方法。８．Ｂが４-モルホリニルカルボニル遮断基である請求項１の方法。９．Ｒ₂がＰ₁アミノ酸残基がホモフェニルアラニンの残基であるようなＰ₁アミノ酸残基における場合により遮断された側鎖である請求項８の方法。 10．Ｒ₂がアラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、ヒスチジン（His）、ホモフェニルアラニン（HPhe）、フェニルアラニン（Phe）、オルニチン（Orn）、セリン（Ser）およびトレオニン（Thr ）からなる群から選択されるα-アミノ酸の残基の場合により遮断された複素環式類似物、特にチアゾールおよびアミノチアゾール、である請求項８の方法。 11．ＸがＲ₂にも結合しているフッ素不含有脱離基である請求項１の方法。 12．Ｄがメチルまたは置換メチル基である請求項１の方法。 13．Ｘが複素環式脱離基である請求項１の方法。 14．Ｐ₁窒素に対するヒドラジン置換を有する請求項１の方法。 15．次式：（式中、Ｂは４-モルホリニルカルボニル遮断基であり；各（Ｐ）_yは場合により保護されたα-アミノ酸残基であり；ｙは０から３の数であり；Ｒ₂はＰ₁アミノ酸残基がホモフェニルアラニンの残基であるようなＰ₁アミノ酸残基における側鎖であり；Ｘは脱離基であり；ＥおよびＧは炭素より陰性度が強い原子であり、その際ＥおよびＧはカルボニルまたはヒドラゾンにおけるように、二重結合によりペプチド鎖へ結合した同じ原子でもよく、または単結合によりペプチド鎖へ各々結合した二つの別の原子でもよく；Ｄは水素、メチルまたは置換メチルである）で表される化合物またはその薬剤上許容されうる塩からなるカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ阻害剤。 16．ＸはＲ₂にも結合しているフッ素不含有脱離基である請求項１５のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ阻害剤。 17．Ｄはメチルまたは置換メチルである請求項15のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ阻害剤。 18．Ｘは複素環式脱離基である請求項15のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ阻害剤。 19．Ｐ₁窒素に対するヒドラジン置換を有する請求項15のカテプシンＢおよび／またはカテプシンＬ阻害剤。