JPH08502406A - 抗生物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 式（Ｉ）： ［式中、Ｒ及びＲ¹はＨ又はＣＯＣＨ₃であり得、但しＲ¹がＣＯＣＨ₃の場合にはＲはＣＯＣＨ₃である］で示される化合物を開示する。優れた抗真菌活性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗生物質発明の開示 本発明は、下記の式 ［式中、Ｒ及びＲ¹はＨ又はＣＯＣＨ₃であり、但しＲ¹がＣＯＣＨ₃の場合にはＲ はＣＯＣＨ₃である］ で示される化合物に関する。該化合物は抗微生物特性を有し、Ｒ及びＲ¹がＨの 場合には抗真菌剤として特に効果的である。本発明は、カビ（真菌）感染を抑制 するための前記化合物の使用も包含する。 Ｒ及びＲ¹がＨである化合物（化合物Ｉ−Ａ） は、Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｓの培養によって得られる。Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｓは、同時に出願された係属中の 出願第０７／９６２，５４８号（出願人整理番号１８８５３、米国特許第５，３ ０４，４８５号）の対象となっている。Ｒが−ＣＯＣＨ₃でありＲ¹がＨである化 合物（化合物ＩＢ）、又はＲ及びＲ¹が−ＣＯＣＨ₃である化合物（化合物ＩＣ） は、化合物ＩＡを後述のように適当なアセチル化剤と反応させることによって製 造し得る。 第１図は化合物ＩＡのプロトン核磁気共鳴スペクトルである。 第２図は化合物ＩＢのプロトン核磁気共鳴スペクトルである。 第３図は化合物ＩＣのプロトン核磁気共鳴スペクトルである。 本発明の化合物は薄く色がついた固体であり、下記のスぺクトル特性を有する ことを特徴とする。化合物ＩＡの紫外スペクトルデータ： ＭｅＯＨ中２５μｇ／ｍｌで、λ_max：２７５ｎｍ（ε＝１３，１００） ２０μ１の１．０Ｎ ＮａＯＨを含むＭｅＯＨ中、２５μｇ／ｍｌで、λ_max ：２０７ｎｍ，２８７ｎｍ（ε＝１７， ３００），３０６ｎｍ（ε＝１９，０ ００） ２０μｌの１．０Ｎ ＨＣＩを含むＭｅＯＨ中、２５μｇ／ｍｌで、λ_max： ２７６ｎｍ（ε＝１７，３００）化合物ＩＡの赤外スペクトルデータ： ２９２９，２７９７，１７２３（Ｃ＝Ｏ ），１６６６（Ｃ＝Ｏ），１６３０（Ｃ＝Ｏ），１４６０，１３９８，１１７６ ，１０３７ｃｍ^-1 質量スペクトルデータ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ ２１２で、電子衝撃（ＥＩ）モード、９０ｅＶで 質量スペクトルを記録した。正確な質量測定は、ペルフルオロケロセン（ＰＦＫ ）を内部標準として用いて高分解能（ＨＲ−ＥＩ）で実施した。 化合物ＩＡの分子量は４０８である（Ｃ₂₃Ｈ₃₆Ｏ₆の計算値４０８．２５１２ ；測定値４０８．２５１５）。 化合物ＩＢ（Ｒ＝ＣＯＣＨ₃、Ｒ¹＝Ｈ）の分子量は５３４である（Ｃ₂₉Ｈ₄₂Ｏ₉ の計算値５３４．２８２９；測定値５３４．２８３２）。 化合物ＩＣ（Ｒ及びＲ¹＝ＣＯＣＨ₃）の分子量は５７６ である（Ｃ₃₁Ｈ₄₄Ｏ₁₀の計算値５７６．２９３５；測定値５７６．２９４６）。ＮＭＲスペクトルデータ ¹³Ｃ ＮＭＲスペクトル 化合物ＩＡ、ＩＢ及びＩＣの¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎ ｉｔｙ ５００ ＮＭＲスペクトロメーターで、ＣＤ₂Ｃｌ₂中、１２５ＭＨｚ、 室温及び低温で記録した。室温では交換広幅化（ｅｘｃｈａｎｇｅ−ｂｒｏａｄ ｅｎｉｎｇ）が原因で、化合物ＩＡでは幾つかの共鳴が観察されなかった。トリ アセテート（化合物ＩＢ）でも二つが観察されなかったが、テトラアセテート（ 化合物ＩＣ）では総てが観察され、共鳴の一部で広幅化が示された（下記の星印 ）。−５０℃では、化合物ＩＡは２３の共鳴を有する主要配座異性体を一つ含む 複数の平衡状態を示した。２５℃でのトリアセテート（化合物ＩＢ）及びテトラ アセテート（化合物ＩＣ）の溶液スペクトルは、それぞれ約７：５及び３：１の 比で二つの配座異性体母集団のみを示した。 多量成分及び少量成分の各配座異性体（後者は括弧内）の共鳴を表示する。化 学シフトは、５３．８ｐｐｍでの溶媒ピークを内部標準として用いて、ゼロｐｐ ｍのテトラメ チルシラン（ＴＭＳ）と比較してのｐｐｍで示す。 化合物ＩＡの¹³Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ＣＤ₂Ｃｌ₂；２３℃；明白な配座異性 体は一つ）： ２３個の炭素のうち１７個だけが観察される。他の６個は交換広幅化されている 。 化合物ＩＡの¹³Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ＣＤ₂Ｃｌ₂；−５０℃；複数の平衡； 主要配座異性体は一つ）： ２３という炭素数は、ＨＲＭＳによって導出された分子式Ｃ₂₃Ｈ₃₆Ｏ₆と合致す る。 化合物ＩＢ（トリアセテート）の¹³Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ＣＤ₂Ｃｌ₂；−２ ５℃；約７：５の比率の配座異性体混合物）： ＨＲＭＳによって導出された分子式Ｃ₂₉Ｈ₄₂０₉と合致して、多量成分及び少量 成分（括弧内）の各配座異性体の２９個の総ての炭素が観察される。 化合物ＩＣ（テトラアセテート）の¹³Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ＣＤ₂Ｃｌ₂；２ ５℃；明白な配座異性体は一つ）： 分子式Ｃ₃₁Ｈ₄₄Ｏ₁₀と合致して、３１個の総ての炭素が観察される。 化合物ＩＣ（テトラアセテート）の¹³Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ＣＤ₂Ｃｌ₂；− ２５℃；約３：１の比率の配座異性体混合物）： 多量成分及び少量成分（括弧内）の各配座異性体の３１個の総ての炭素が観察さ れる。 ＊ 広幅〜極めて広幅の信号。 ¹Ｈ ＮＭＲスペクトル 化合物ＩＡ、ＩＢ及びＩＣの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを第１図、第２図及び第 ３図に示す。アセテートスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ５００ Ｎ ＭＲスペクトロメーターで、ＣＤ₂Ｃ１₂中、５００ＭＨｚ、−２５℃で記録した 。化合物ＩＡのスペクトルはＣＤ₃ＣＯＯＤ中で２５℃で記録した。化学シフト は、δ５．３２（ＣＤ₂Ｃｌ₂）及びδ２．０３（ＣＤ₃ＣＯＯＤ）の溶媒ピーク を内部標準として用いて、ゼロｐｐｍのＴＭＳに対するｐｐｍで示されている。 本発明の化合物は抗菌特性を有する。化合物ＩＡは、糸状菌類及び酵母に対す る抗真菌剤として特に有用である。該化合物は特に、病原性カビ感染を引き起こ す微生物、例えばＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉ ｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ 、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃｒｙ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔ ｒｏ ｐｉｃａ１ｉｓ 、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａ ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ等に対して効果がある。この特性は 、抗真菌量の化合物ＩＡを含む組成物を、真菌を抑制すべき部分、対象又は被験 者に投与することによって、有効に使用し得る。従って、抗真菌効果量の化合物 ＩＡを含む組成物及び真菌抑制のための該組成物の使用は、本発明の側面に含ま れる。本発明の特に好ましい側面は、医薬的に許容し得る担体中の組成物、及び 治療効果量の化合物の投与によりカビ感染を抑制するための前記組成物の使用で ある。抗菌特性には、細菌、特にＢａｃｉｌｌｉに対する活性も含まれる。しか しながら、最も有用な抗菌活性は、真菌類に対する化合物ＩＡの活性である。 本発明の主要化合物である化合物Ｉ−Ａ、即ちＲ及びＲ¹がＨを示す化合物は 天然の産物であり、ブダペスト条約に従いＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２に寄託されて受託番号ＡＴＣＣ ７４ １５７を付与された本出願 人の培養コレクションＳｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ ＭＦ ５６７２を培養することによって有利に生成される。 ヘラジカの糞から分離され、Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ であると同定された真菌は、下記のコロニー特性及び形態的特性を有する： 温度２０℃、相対湿度９５％、蛍光下明周期１２時間でひき割りカラスムギ寒 天（Ｄｉｆｃｏ）上にコロニーが、１４日で３４〜３７ｍｍに到達し、中心部は フェルト状に密集又はまばらな密綿毛状、縁部は均一で水中、乾燥、つやなし、 薄い灰色〜黒っぽい暗緑色がかった灰色、薄いくすんだ灰色（Ｐａｌｅ Ｓｍｏ ｋｅ Ｇｒａｙ）、濃い灰色がかった暗緑色（Ｄｅｅｐ Ｇｒａｙｉｓｈ Ｏｌ ｉｖｅ）、鉄灰色（Ｉｒｏｎ Ｇｒａｙ）、黒っぽい暗緑色〜黒（Ｄａｒｋ Ｏ ｌｉｖｅ−Ｂｌａｃｋ）（英大文字単語の色の呼称はＲｉｄｇｗａｙ，Ｒ．１９ １２，Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｏｍｅｎｃ１ａｔｕｒｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に拠る）、接種材料源に由来する顕著な薄色の セクターをしばしば形成、セクターは薄い暗緑色がかった黄色〜桃色がかった暗 緑色、Ａ ｖｅｌｌａｎｅｏｕｓ、濃い暗緑バフ色（Ｄｅｅｐ Ｏｌｉｖｅ Ｂｕｆｆ）、 逆はぼんやりした暗緑色がかった灰色〜灰色、桃色がかった灰色又は黄色のセク ター。滲出物及び臭い無し。 同じ条件下の麦芽抽出物寒天（Ｄｉｆｃｏ）上のコロニーは、１４日間で２６ 〜２８ｍｍに到達し、フェルト状に密集、まばらな密綿毛状になる、乾燥、つや なし、縁部は均一、水中下、白色、薄い灰色〜ぼんやりした暗緑色がかった灰色 、薄いくすんだ灰色（Ｐａｌｅ Ｓｍｏｋｅ Ｇｒａｙ）、くすんだ灰色（Ｓｍ ｏｋｅ Ｇｒａｙ）、灰色がかった暗緑色（Ｇｒａｙｉｓｈ Ｏｌｉｖｅ）、無 色のセクターの形成、逆は暗い灰色〜ほぼ黒、黄色〜灰色がかったセクターあり 。滲出物及び臭い無し。 同じ条件下のひき割りトウモロコシ寒天（Ｄｉｆｃｏ）上のコロニーは、１４ 日間で８〜１２ｍｍに到達し、色及び外観は麦芽酵母抽出物寒天上のコロニーと 類似しているが、より透明。 この株のコロニー及び別のＳｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ種のコロニーは、特に反 復トランスファーの後では、変異し弱毒化したセクターを形成する傾向が強い。 これらのセク ターは通常、色がより薄く、ストロマ及び／又は偽子実層（ｐｓｅｕｄｏｔｈｅ ｃｉａ）を分化させる能力が喪失又は低下している。 偽子実層の子嚢果。偽子実層はひき割りカラスムギ寒天上で１０〜２１日で明 白になり、４〜５週間で成熟。偽子実層、単一、密生又は集密的、包埋状、上部 １０〜６０％が表面から突出、直径１００〜４００μｍ、球状〜ほぼ球状、微小 頂端乳頭毛、小穴なし（ｎｏｎ−ｏｓｔｉｏｌａｔ）、無毛、不透明、黒。偽子 実層は培養中にしばしば瀕死状態となり、４〜８週間では完全には成熟できない 。成長はしばしば子嚢始原細胞及び側糸の形成だけで停止する。子殻薄く、１〜 ３細胞の厚さ、ｔｅｘｔｕｒａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ。子殻細胞、等径、直径３ 〜８μｍ、ＫＯＨ中で灰色〜暗いオリーブがかった灰色。子嚢豊富、偽子実層の 腔の底部から発生、二被嚢（ｂｉｔｕｎｉｃａｔｅ）、八胞子、円筒形、直線又 はやや湾曲、幅広の丸い頂端、１１０〜１６０×１５〜２１μｍ、底部から短い 茎にかけて急激な先細、基底茎の長さ５〜１０ｐｍｍ。側糸豊富、子嚢の間に点 在、糸状、幅１〜３μｍ、隔膜あり、子嚢とほぼ同じ長さ。子嚢胞子、子嚢内で 二列（ｂｉｓｅｒｉａｔ ｅ）、３２〜４２×６〜９μｍ、四細胞、隔膜で収斂、丸い頂端を有する末端細 胞、円筒形〜ｄｏｌｉｆｏｒｍの中枢細胞、各細胞は薄いかすかな側方発芽スリ ットを具備、子嚢胞子全体が薄い屈折性ヒアリン鞘で包囲されている、細胞は子 嚢から取り出すとしばしば分離する、ＫＯＨ中で黒っぽい暗緑色〜褐色がかった 灰色。 化合物ＩＡの製造は、Ｓ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ７４１５７を、後 述の条件下で適当な栄養培地中で、実質的な量の抗真菌活性が発酵ブロス中に検 出されるまで培養し、適当な溶媒で菌糸体増殖から抽出することにより活性成分 を回収し、所望の成分を含む溶液を濃縮し、次いで濃縮物質をクロマトグラフィ ーでの分離にかけて、化合物Ｉ−Ａを培養培地中に存在する他の代謝産物から分 離することにより実施し得る。 炭素源としては、大まかに言って、グルコース、フルクトース、マンノース、 マルトース、ガラクトース、マンニトール及びグリセロール、他の糖類及び糖ア ルコール、澱粉及び他の炭水化物、もしくは炭水化物誘導体、例えばデキストラ ン、セレロース、並びに複合栄養物、例えばカラスムギ粉、ひき割りトウモロコ シ、アワ、トウモロコシ等 が挙げられる。培地中で使用する炭素源の正確な量は、培地中の別の成分にも依 存するが、通常は培地の０．５〜１５重量％の量の炭水化物を使用するとよい。 これらの炭素源は個々に使用でき、あるいはこの種の炭素源を同一培地中で数種 類組み合わせてもよい。後述のように、特定の炭素源が好んで使用される。 窒素源としては、アミノ酸、例えばグリシン、アルギニン、トレオニン、メチ オニン等、アンモニウム塩、及び複合的な源、例えば酵母加水分解物、酵母自己 分解物、酵母細胞、トマトペースト、大豆粗挽き粉、カゼイン加水分解物、酵母 抽出物、トウモロコシ煎じ液（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒｓ）、蒸留 残可溶性物質（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ ｓｏｌｕｂｌｅｓ）、粉にした綿実のし めかす（ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ ｍｅａｌ）、肉抽出物等が挙げられる。これら 種々の窒素源は、単独で又は組合わせて、培地の０．０５〜５重量％の範囲の量 で使用し得る。 培養培地に混入し得る栄養無機塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシ ウム、カルシウム、ホスフェート、スルフェート、クロリド、カーボネート及び 類似のイオンを与えることができる常用の塩が挙げられる。その他に、コ バルト、マンガン、鉄、モリブデン、亜鉛、カドミウム等のような微量金属も挙 げられる。 適当な固体及び液体の生成培地の代表例は下記の表に示す通りである。代表的 な播種培地もこれに含まれる。 前記培地のうちの一つ、液体培地である培地ＭＯＦは、化合物ＩＡを最大の収 率で生成することが判明した。所望の化合物の生成では通常、培養物をまず播種 培地で増殖させ、次いで培地増殖物を生成培地に接種する。生成培地は固体培地 又は液体培地であってよい。 化合物ＩＡの生成の実施では、培養物Ｓ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ ＭＦ ５６７ ２，ＡＴＣＣ ７４１５７の凍結菌糸体を、表１（ＫＦ播種培地）に示すような ｐＨ５〜８、 好ましくはｐＨ７の栄養播種培地に接種する。次いで、播種フラスコを撹拌しな がら、約１５℃〜約３０℃、好ましくは約２５℃の温度で約２〜１５日間、好ま しくは３〜５日にわたり、約５０％の相対湿度でインキュベートする。増殖物が 豊富になった時点、通常は３〜５日目で、増殖物を化合物ＩＡの生成のための生 成培地に接種し得る。 適当であれば、菌糸体をより多く製造するために、新しい播種培地に培養増殖 物の一部を接種し、次いで類似の条件下で、但し時間を短縮してインキュベート することにより、播種培地中で第二段階の発酵を実施し得る。得られた増殖物は 次いで、固体であってもよいが好ましくは液体の生成培地に接種し得る。 固体培地で生成を実施する時は、播種物（ｓｅｅｄ）の一部を通常の方法で固 体培地に接種し、得られた培地を静止条件下で、好ましくは温度２５℃、相対湿 度５０％で７〜２５日間、好ましくは１１〜１４日間インキュベートする。 発酵ブロスのＨＰＬＣ又はＴＬＣにより培養期間が終了したと判定されたら、 生成物を回収し、その後分離する。二次代謝産物は、メタノール５０％水溶液、 メタノール、 酢酸エチル、メチルエチルケトン、又は０．２％トリフルオロ酢酸で酸性化した ブタノールと共に、２５℃で１時間、２２０ｒｐｍで振盪することにより抽出し 得る。次いで前記混合物を濾過にかけて固体を除去し、濾液中に生成物を得る。 該濾液を減圧下で濃縮し、粗生成物を残渣として得る。 発酵を液体培地で実施する時は、種子の一部を通常の方法で液体培地に接種し 、得られた培地を撹拌しながら、好ましくは温度２５℃、相対湿度５０％で４〜 ２５日間、好ましくは１１〜１４日間インキュベートする。 発酵ブロスを硫酸でｐＨ３．０に酸性化し、次いで同量の酢酸エチル又はメチ ルエチルケトンを加え、得られた混合物を２５℃で１時間にわたり２２０ｒｐｍ で振盪する。有機溶媒を除去し、残りの菌糸体水相を更に何回か再抽出し、抽出 物を一緒にまとめ、まとめた抽出物を減圧にかけて化合物ＩＡを残渣として得る 。別の適当な抽出溶媒としては、酢酸エチル、０．２％トリフルオロ酢酸で酸性 化したブタノール、アセトン及びメタノールが挙げられる。 固体又は液体発酵の生成物残渣を、好ましくはシリカゲルでのクロマトグラフ ィーによって分離する。シリカベー スの逆相、デキストランゲル等を使用してもよい。 分離の実施では、抽出物を濃縮して生成物含有油を得、これを非極性炭化水素 と極性アルコールとの間で分配して非極性不純物を除去する。分配用の好ましい 溶媒は、ヘキサン及びメタノールである。アルコール抽出物を濃縮乾固して粗生 成物を得る。該生成物は、ヘキサン／酢酸エチル／酢酸を溶離剤として用いてシ リカゲルクロマトグラフィーで精製し得る。次いで適当な画分をプールし、濃縮 し、更に精製する。更に精製する時は高速向流クロマトグラフィーが有用である 。この方法では、ヘキサン７部／酢酸エチル３部／メタノール５部／ｐＨ６．９ の０．０２５Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄水溶液５部からなる溶媒系の同量の上方相及び下方 相に不純生成物を溶解する。下方相で完全に満たした多層コイルの末尾に試料を 適用し、順方向で８００ｒｐｍの回転速度でカラムの底部から頂部まで上方相で 溶離し、画分を回収する。所望の生成物を回収すべく適当な画分をプールする。 Ｒが−ＣＯＣＨ₃でありＲ¹がＨである化合物ＩＢ、並びにＲ及びＲ¹が両方と もＣＯＣＨ₃である化合物ＩＣは、化合物ＩＡを適当なアセチル化剤、好ましく は無水酢酸と反 応させることにより製造し得る。別のアセチル化剤、例えばハロゲン化アセチル 又は活性化酢酸エステル、例えば２，４，５−トリクロロフェニルエステルを使 用してもよい。反応はピリジンのような溶媒中で生起させ得る。通常は、トリア セテート及びテトラアセテートの両方が得られ、これらを分離用高圧液体クロマ トグラフィーで分離し得る。 アセチル化は、ピリジンのような溶媒中の化合物ＩＡの溶液にアセチル化剤を 加え、得られた混合物を室温で数時間撹拌して、化合物ＩＡのトリアセテートと テトラアセテートとの混合物を得ることにより実施し得る。前記反応混合物は減 圧下で濃縮し、油性残渣をアセトニトリルに溶解して、分離用ＨＰＬＣで分離し 精製する。前記アセトニトリル溶液はカラムにかけ、アセトニトリル６０％／水 ４０％中０．１％Ｈ₃ＰＯ₄の移動相を用いて溶離する。室温で約２０ｍｌ／分の 溶離速度で、２７５ｎｍで検出するとよいことが判明した。所望の生成物を回収 するためには、次いで適当な画分をプールし、アセチル化生成物を塩化メチレン で抽出し、脱水し、脱水溶液を真空下で濃縮し得る。 抗真菌剤、特に抗カビ剤としての化合物ＩＡの有用性は、真菌類に対する最小 阻止濃度（ＭＩＣ）及び最小殺真菌濃 度（ＭＦＣ）を決定するためのブロス微量希釈（ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ） アッセイで化合物ＩＡについて実証し得る。既知の化合物に対する耐性／感受性 、動物毒性、源及び臨床的重要性を有するために選択した真菌パネルに対するこ の種のアッセイでは、化合物Ｉが極めて高い活性を有することが判明した。化合 物ＩＡは、確立された抗真菌剤であるアムホテリシンＢが必要とする濃度の約十 分の一の濃度で効果を示すことが判明した。別の特定の微生物に対しては更に大 きな効果を示す。 微量ブロス希釈アッセイでは、Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天（ＳＤ Ａ）上の酵母培養物をストリーキングし、３５〜３７℃で２４〜４８時間インキ ュベートし、その後３〜５の特徴的コロニーを選択し、新しいプレートに移し、 同様の条件下でインキュベートすることにより、微生物を選択した。再増殖物か ら３〜５のコロニーを選択し、１０ｍｌのＹＭブロス（Ｄｉｆｃｏ）に懸濁し、 ２２５ｒｐｍで振盪しながら３５〜３７℃で４時間インキュベートした。４時間 ブロス培養物を光学的に８６％の透過率になるよう濃度を１〜５×１０⁶ｃｆｕ ／ｍｌとし、これを更にＹＮＢＤ（１％デキストロース含有酵母窒素ベース） 中で１：１００に希釈し、接種材料として使用するために１〜５×１０⁴ｃｆｕ ／ｍｌの濃度にした。検査化合物である化合物ＩＡ及び対照化合物は、１０％Ｄ ＭＳＯ中５１２μｇ／ｍｌのストック溶液として調製し、該溶液７５μ１を、９ ６ウェルＵ字底部微量滴定プレートの列１の各ウェルに導入した。次いで、列１ の化合物を逐次二倍に希釈して、１２８μｇ／ｍｌ〜０．０６μｇ／ｍｌの濃度 にした。 次いで、希釈化合物が入っているプレートに７５μｌ／ウェルの適当な微生物 を接種し、３５〜３７℃で４８時間インキュベートし、２４時間のインキュベー ション後にＭＩＣ（最小阻止濃度）の決定を行った。各微生物の増殖及び生殖不 能検査並びに化合物の生殖不能検査も実施した。 ２４時間目のＭＩＣの記録後、微量滴定プレートを静かに振盪して細胞を再懸 濁させた。９６ウェル微量滴定プレートの各ウェルから、ＳＤＡを入れた単一リ ザーバー接種プレートに、１．５μｌの試料を移した。接種したＳＤＡ及び対応 する微量滴定プレートを３５〜３７℃で２４時間インキュベートした。Ｃｒｙｐ ｔｏｃｏｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの場合は、ＭＩＣを記録してから４８時 間後 にＳＤＡプレートの接種を行い、４８時間インキュベートしてからＭＦＣの読取 りを行った。ＭＦＣは増殖を生起させないか又は４コロニー以下の増殖を生起さ せる、化合物の最小濃度である。 化合物ＩＡは糸状真菌類の増殖を阻止するためにも有用である。このような使 用は、下記の検査でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏ ｘｙｓｐｏｒｕｍ 、Ｒｈｉｚｏｍｉｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｚｅａｅ 等について明らかにされ得る。 糸状真菌類の接種物は、ジャガイモデキストロース寒天上に維持したストック プレートの表面を湿潤無菌ポリエステルスワブでこすり取ることにより調製する 。胞子及び菌糸体は次いで１０ｍｌの無菌ジャガイモデキストロースブロスに懸 濁し、６６０ｎｍで７０％の透過率に調整する。 抗真菌物質の生成に関して検査すべき試料を６．２ｍｍ濾紙ディスクに適用し （２５μｌ／ディスク）、２４℃で風乾する。検査すべき試料が未精製ブロスの 場合は、適用の前に遠心分離にかけてもよい。次いで無菌条件を用いて、検査す べき物質を担持しているディスクを播種済みアッセイプレートに適用し、試料を ２５％無菌ジメチルスルホキシド水溶液（２５μｌ／ディスク）で再湿潤する。 次いでアッセイプレートを２８℃又は３７℃で２４時間インキュベートする。イ ンキュベーション後、阻止ゾーンを測定する。増殖の様相も観察する。化合物Ｉ Ａが真菌微生物の増殖を効果的に阻止していることが知見される。 本発明の化合物は細菌に対する抗菌活性も有する。従って、糸状真菌類につい て上述した方法と類似の方法でアッセイを実施すると、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ ｂｔｉｌｉｓ が検査微生物の場合に阻止ゾーンが観察される。 以下の実施例は本発明を明らかにするものであって、本発明を制限するもので はない。 実施例 Ｉ 本出願人の培養コレクションに含まれているＳｐｏｒｏｍｉｅｌｌａ ａｕｓ ｔｒａｌｉｓ ＭＦ ５６７２の凍結植物菌糸体を、２５０ｍｌ無バッフル三角 フラスコ内の５４ｍｌのＫＦ播種培地（表１）に接種した。該播種フラスコを、 ５ｃｍ行程（ｔｈｒｏｗ）の回転振盪機で、２２０ｒｐｍで、温度２５℃、相対 湿度５０％で３日間インキュベートした。 前記３日培養増殖物のうち２ｍｌずつを、８０個の２５ ０ｍｌフラスコに入れた発酵生成培地である培地ＭＯＦに接種し、該接種済み培 地を静止条件下で、温度２５℃、相対湿度５０％で１１日間インキュベートした 。 １１日後、各フラスコに酢酸エチル５０ｍｌを加え、該混合物を室温で２時間 、２２０ｒｐｍで撹拌し、その後セライトパッドで濾過して、２５．３ｇの酢酸 エチル抽出物を得た。 前記抽出物を減圧下で油状になるまで濃縮し、該油状物質を６５０ｍｌのヘキ サン溶媒と２００ｍｌのメタノールとの間で分配した。メタノール層を真空下で 濃縮乾固させて３．５４ｇの未精製抗生化合物（化合物ＩＡ）を得、これをヘキ サン／１％酢酸含有酢酸エチルに最終量１７．７ｍｌで溶解した。得られた溶液 のうち１５．３ｍｌ（３．０４ｇの化合物ＩＡ含有）を、ヘキサン／１％酢酸含 有酢酸エチル（３：２）で平衡化した３７７ｇシリカゲル６０（０．０４０〜０ ．０６３ｍｍ、２３０〜４００メッシュ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）カラム５ｃｍ×４５ ｃｍに適用した。該カラムを同じ溶液で１５ｍｌ／分で溶離し、２４ｍｌずつの 画分を回収した。生成物に富んだ画分を分析ＨＰＬＣで決定した（Ｐｈｅｎｏｍ ｅｎｅｘ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ ５ ＯＤＳ ３０、１５ｃｍ×４．６ｍｍ、アセトニトリル５５％／濃Ｈ₃ＰＯ₄ でｐＨ６．９に調整した０．０２５Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄水溶液４５％からなる移動相 で５５℃で流速１ｍｌ／分で溶離し、２７５ｎｍで検出）。 未精製画分プールを真空下で濃縮して４１０ｍｇの黄色油状物質を得、これを １０ｍｌの酢酸エチルに溶解した。該溶液のうち３ｍｌを濃縮乾固させ、高速向 流クロマトグラフィー（Ｐ．Ｃ．Ｉｎｃ．，１１８０５ Ｋｉｍ Ｐｌａｃｅ， Ｐｏｔｏｍａｃ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡから入手した向流クロマトグラフを 使用）で更に精製した。ヘキサン７部／酢酸エチル３部／メタノール５部／ｐＨ ６．９の０．０２５Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄水溶液５部からなる溶媒系の上方相２ｍｌと 下方相２ｍｌとに試料を溶解した。試料は、前記溶媒系の下方相で完全に満たし た＃１４分析多層コイル（Ｐ．Ｃ．Ｉｎｃ．）の末尾に適用した。次いでコイル を、溶媒系の上方相で、カラムの末尾から頂部まで、順方向で８００ｒｐｍの回 転速度で３ｍｌ／分で溶離し、７．５ｍｌずつの画分を回収した。画分５３〜６ ４から、４１ｍｇに及ぶ精製された化合物ＩＡが得られた。 化合物ＩＡは上述のスペクトル特性を有していた。 化合物ＩＡの元素分析は下記の通りである： Ｃ₂₃Ｈ₃₆Ｏ₆の計算値：６７．６５％Ｃ、８．８２％Ｈ、０％Ｎ。測定値：６７ ．３１％Ｃ、８．２４％Ｈ、＜０．０２％Ｎ 実施例 II 化合物ＩＡのトリアセテート（ＩＢ）及びテトラアセテート（ＩＣ） ２０．４ｍｇの化合物ＩＡをピリジン０．５ｍｌに溶解し、これに無水酢酸０ ．５ｍｌを加え、得られた混合物を室温で３．７５時間撹拌してアセテート生成 物を得た。前記反応混合物は次いで真空下で濃縮乾固させた。得られた残渣をア セトニトリル５ｍｌに溶解し、該溶液を減圧下で濃縮した。得られた混合物をア セトニトリル１ｍｌに溶解し、分離ＨＰＬＣカラム（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐａｒｔ ｉｓｉｌ １０ ＯＤＳ、２２ｍｍ×２５ｃｍ）にかけ、０．１％Ｈ₃ＰＯ₄含有 アセトニトリル６０％／水４０％からなる移動相を用いて室温で２０ｍｌ／分で 溶離し、２７５ｎｍで検出して、生成物を分離した。８ｍｌずつの画分が回収さ れた。トリアセテートを含んでいることが判明した画分２６〜２９をプールし、 プールした画分を３２ｍｌの塩化メチレンで抽出した。該塩化メチレン溶液を無 水硫酸ナトリウムで脱水し、脱水溶液を真空下で濃縮乾固させて、８ｍｇのトリ アセテート（化合物ＩＢ）を得た。テトラアセテートを含んでいることが判明し た画分３３〜３６を同様に処理して１１ｍｇのテトラアセテート（化合物ＩＣ） を得た。 実施例 III 各々が５００ｍｇの化合物ＩＡを含む１０００個の圧縮錠剤を下記の組成物で 製造する： グラム 化合物ＩＡ ５００ 澱粉 ７５０ 含水二塩基リン酸カルシウム ５０００ ステアリン酸カルシウム ２．５ 微粉砕した材料を十分に混合し、１０％澱粉ペーストで顆粒化する。得られた 顆粒を乾燥し、錠剤状に圧縮する。 実施例 IV 各々が２１０ｍｇの化合物ＩＡと２９０ｍｇの化合物ＩＣとを含む１０００個 の硬質ゼラチンカプセルを下記の組成物で製造する： 化合物 グラム 化合物ＩＡ（２１０）及びＩＣ（２９０） ５００ 澱粉 ２５０ ラクトース ７５０ タルク ２５０ ステアリン酸カルシウム １０ 材料をブレンドして均質混合物を調製し、二つの部分か らなる硬質ゼラチンカプセルに充填する。 実施例 Ｖ ２５０ｍｌの注射可能溶液を、一般的な方法により下記の組成物で製造する： デキストロース １２．５ｇ 水 ２５０ｍｌ 化合物ＩＡ ４００ｍｇ 材料をブレンドし、その後滅菌して使用する。 Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｓの分離 ヘラジカ糞の試料をまず流水で十分に洗浄し、次いで約０．７５ｇの試料をブ レンダーで均質化し、１５０ｍｌの無菌蒸留水に再懸濁した。この懸濁液から１ ：１０希釈物を調製し、種々の量（０．１〜０．５ｍｌ）の希釈物及び出発懸濁 液をＤＰＹ（デキストロース−ペプトン−酵母抽出物）プレートにプレーティン グした。ＤＰＹ培地の組成（１ｌ当たり）は下記の通りである： 成分 量 デキストロース ５．０ｇ ぺプトン １．０ｇ 酵母抽出物 ２．０ｇ ＮＨ₄ＯＨ １．０ｇ Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．０ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ ０．５ｍｌの１％溶液 雄牛胆汁（乾燥ウシ胆汁） ５．０ｇ プレートを２４℃で３〜７日間インキュベートし、増殖コロニーをジャガイモ デキストロース寒天（Ｄｉｆｃｏ）プレートに移した。これらの新しいプレート を２４℃で１週間インキュベートした後、試料から分離した総ての培養物を形態 学的に比較した。発酵実験用の株を選択した。これらの株の一つは後にＭＦ５６ ７２と命名され、化合物ＩＡを生成する発酵で使用した。この培養物はＡｍｅｒ ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ ７４ １５７で登録された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 7/62 7432−4Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＫ，ＵＡ (72)発明者 ジヤコベ，ロバート・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08735、ラバレツテ、ウエストモント・ア ベニユー・230 (72)発明者 ヘルムス，グレゴリー・リー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08816、フアンウツド、シヤデイ・レー ン・66 (72)発明者 ヘンセンズ，オツトー・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07701、レツド・バンク、リバー・プラザ、 アレクサンダー・ドライブ・65 (72)発明者 マンダーラ，シユザンヌ・ミラー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07090、ウエストフイールド、ヒル・トツ プ・ロード・2054 (72)発明者 ジヨーンズ，イー・トレイシー・ターナー アメリカ合衆国、カリフオルニア・92075、 ソラナ・ビーチ、ハイランド・ドライブ・ 805 (72)発明者 マルテイン，イザベル スペイン国、エー・28005・マドリード、 ロザリオ・ストリート、７ (72)発明者 ロジルスキー，ウオルター アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07735、クリフウツド・ビーチ、ノース・ コンコース・949

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の式 ［式中、Ｒ及びＲ¹はＨ又はＣＯＣＨ₃であり、但しＲ¹がＣＯＣＨ₃の場合にはＲ はＣＯＣＨ₃である］ で示される化合物。 ２．Ｒ及びＲ¹がＨである請求項１に記載の化合物。 ３．抗真菌量の請求項１に記載の化合物を生物学的に不活性の担体と混合したも のを含む抗真菌組成物。 ４．担体が医薬的に許容し得る担体である請求項３に記載の組成物。 ５．非ヒト患者の増殖を抑制すべき部位に抗真菌効果量の請求項１に記載の化合 物を投与することからなる真菌増殖抑制方法。 ６．請求項１に記載の化合物を治療効果量投与することからなる非ヒト患者の真 菌感染を抑制する方法。 ７．請求項１に記載の化合物の製造方法であって、同化可能な炭素源及び窒素源 を含む栄養培地でＳｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ ＡＴＣＣ ７４１５７培養物を好 気培養し、そこから前記化合物を分離することからなる方法。