JPH08503601A

JPH08503601A - 避妊用ワクチン

Info

Publication number: JPH08503601A
Application number: JP6501757A
Authority: JP
Inventors: プリマコフ，ポール; マイルズ，ダイアナ・ジー
Original assignee: ユニバーシテイ・オブ・コネチカツト
Priority date: 1992-06-12
Filing date: 1993-06-10
Publication date: 1996-04-23
Also published as: EP0646015A1; EP0646015B1; KR950701821A; ATE175357T1; AU4534893A; DE69322960D1; WO1993025233A1; DE69322960T2; CA2137077A1

Abstract

(57)【要約】本開示は、避妊の方法およびそのような方法において有用な組成物に関する。一つもしくは複数の精子表面蛋白質を哺乳類に対して投与する方法が開示されるが、この投与は免疫反応の刺激化において有効であり、これにより精子表面蛋白質に対して結合する抗体を、精子−卵子融合を回避させるもしくはその率を実質的に低減させるのに十分な力価において産生する。抗原性精子表面蛋白質ペプチドもこの目的のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】避妊用ワクチン背景雄および雌の動物を全精子細胞の抽出物で免疫化すると不妊症を引き起こすことが知られている（Ｔｕｎｇ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．ｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏｌ．，１：１４５−１５８（１９７９）、およびＭｅｎｇｅ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．ｏｆ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０：９３１−９３７（１９７９））。また、他の面では健常であるが、自発的に抗精子抗体を産生する男性および女性も不妊症である（Ｂｒｏｎｓｏｎ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｆｅｒｔ．ａｎｄＳｔｅｒｉｌ．，４２：１７１−１８３（１９８４））。決定的な精子抗体は知られていないが、これらの所見により、精子蛋白質は避妊用ワクチンの開発において有用であろうということが提案されるに至っている。哺乳類種においては精子蛋白質が卵子の透明帯に対する精子の付着における役割を担っていることが提案されている。マウスにおいては、精子表面のガラクトシルトランスフェラーゼが、アクローソーム−未処理精子の透明帯への結合において機能する付着蛋白質であることが示されている（”ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＦｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｅｄｓ．Ｓｈａｔｔｅｎ，Ｈ．，ａｎｄＳｈａｔｔｅｎ，Ｇ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ｐｐｓ．３７−７１（１９８９）、におけるＳｈｕｒ，Ｂ．Ｅ．，Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｓａｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｄｕｒｉｎｇｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）。ラットの精子においては、肝臓のアシアロ糖蛋白質レセプターに関連するガラクトースレセプター（ＲＴＧ−ｒ）が存在し、これは透明帯オリゴ糖に対する精子結合の際にそのレセプターのレクチン特性を介して機能することができる（Ａｂｄｕｌｌａｈ，Ｍ．およびＫｉｅｒｓｚｅｎｂａｕｍ，Ａ．Ｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１０８：３６７−３７５（１９８９））。ガラクトシルトランスフェラーゼとは区別される雄ブタの精子形質膜蛋白質（ＡＰ_z）、ならびにウサギの精子蛋白質もやはり精子−透明帯付着における役割を担っていることが報告されている（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｎ．およびＨｕｎｔ，Ｗ．Ｐ．，Ｇａｍ．Ｒｅｓ．，２３：１０３−１１８（１９８９）、およびＯ’Ｒａｎｄ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２９．２３１−２４０（１９８８））。モルモットの精子表面蛋白質ＰＨ−２０は、受精においては無くてはならない初期段階である卵子の細胞外被膜（透明帯）に対する精子付着における必須の機能を担っていることが示されている。ＰＨ−２０で免疫化させた雄および雌のモルモットにおいては１００％という有効な避妊効果が得られた。免疫化させた雌からの抗血清は高い力価を有し、精子抽出物中のＰＨ−２０を特異的に認識し、そしてインビトロにおいて卵子透明帯に対する精子付着を遮断した。この避妊効果は長期持続的かつ可逆的であり、免疫化させた雌を免疫化の後６−１５カ月の期間をおいて交尾させたところ徐々に受胎能を奪回した。第二のモルモット精子表面蛋白質であるＰＨ−３０もやはり避妊効果を示した。避妊用免疫原としてテストした他の精子蛋白質には、精子酵素ヒアルロニダーゼ、アクロシン、および乳酸デヒドロゲナーゼＣ−４がある。これらの酵素での雌動物の免疫化は受胎能における効果を全く示さないか、あるいは受胎能における部分的効果を示すかのいずれかであり、しかもこの効果はこれらの蛋白質を避妊用試薬として適当として評価するほど十分大きなものではなかった。モルモットにおけるＰＨ−２０の高い避妊効果は、精子表面における存在、強い免疫原性、および受精における主要な役割を含むこの蛋白質の数々の特性における依存するようである。哺乳類の精子−帯付着は多くの場合において種特異的である。他の哺乳類種からの精子は、アクローソーム反応の前もしくは後のいずれかに透明帯に対して結合することができるという点においてモルモットの精子に類似している。モルモット以外の種における受精のために必須な精子表面蛋白質の同定および単離は、これらの種における有効な免疫化のためのワクチンの開発ならびに長期持続的な避妊薬を提供するためには有用であろう。精子の付着蛋白質候補物の生物学的同定、単離、およびクローニングがなされていないということは、ヒトならびに他の哺乳類種のための有効な避妊用ワクチンの開発の際の研究者の妨げとなっていた。発明の要約本発明は、１種以上の精子表面蛋白質をある哺乳類に対して投与する避妊の方法に関する。精子表面蛋白質（もしくは同蛋白質の一部分）を、免疫反応の刺激化について有効な量において投与しそしてこのことにより精子−卵子融合を妨げるかもしくは実質的にその割合を低減するのに十分な力価で精子表面蛋白質に対して結合する抗体を産生させる。この蛋白質もしくは蛋白質断片は常法により精製することができるか、もしくは組換えＤＮＡ法により産生させることができる。本発明はまた、本明細書内に記載される方法における利用のための避妊用組成物にも関する。これらの組成物は精子表面蛋白質もしくはその蛋白質の一部分を含む。好ましい精子表面蛋白質はＰＨ−２０およびＰＨ−３０精子表面蛋白質である。図面の簡単な説明図１は、モルモットのＰＨ−２０蛋白質をコード化するＤＮＡの部分的制限地図、ならびに５つのｃＤＮＡクローンの相対的な位置を表す図である。図２は、ＰＨ−２０蛋白質をコード化するモルモットｃＤＮＡ配列、ならびに一文字コードにおいて表されるモルモットＰＨ−２０蛋白質の演鐸アミノ酸配列を表す図である。図３は、ＰＨ−２０蛋白質をコード化するマウスＤＮＡ配列を表す図である。図３において開示される配列は配列番号３および４として表わされる。図４Ａ−Ｂは、ヒトのＰＨ−２０蛋白質の一つの形態をコード化するヒトＤＮＡ配列、ならびに三文字コードにおいて表される演鐸アミノ酸配列を表す図である。図４において開示される配列は配列番号５および６として表わされる。図５Ａ−Ｂは、ヒトＰＨ−２０蛋白質の第二形態の一部分をコード化するヒトＤＮＡ配列、ならびに三文字コードにおいて表される演鐸アミノ酸配列を表す図である。図５において開示される配列は配列番号７および８として表される。図６は、モルモットのＰＨ−３０αサブユニットのＤＮＡ配列を表す図である。図６において開示される配列は配列番号９として表される。図７は、モルモットのＰＨ−３０αサブユニットのＤＮＡ配列を表す図である。図７において開示される配列は配列番号１０として表される。図８Ａ−Ｂは、モルモットＰＨ−３０のアミノ酸配列とディスインテグリン配列との比較を表す図である。図８は総計で３１本のペプチド配列を列挙してある。これらの配列は配列番号１１から配列番号４１まてとして配列表に連続して表される。発明の詳細な記載本発明は、受精にとって不可欠な精子表面蛋白質もしくはその一部分、ならびに避妊法におけるそれらの利用に関する。精子表面蛋白質は受精にとって不可欠であり、例えばその蛋白質に対するモノクローナル抗体もしくは精製された蛋白質に対して作成されたポリクローナル抗体は、それらが精子に対して結合したとすれば、その際にインビトロもしくはインビボにおける受精、あるいはインビトロにおける受精の任意の段階を阻害する。受精の過程は、二つの配偶子（精子と卵子）の結合もしくは融合、およびその後のそれらの核の融合により新規の生物体のゲノムを形成するものとして定義されている。表面蛋白質は精子の原型質膜および／または内部のアクロソーム膜内に存在することができる。それは蛋白質もしくは糖蛋白質であることができる。免疫化のために用いられる単離された表面蛋白質は免疫原性である完全な表面蛋白質もしくはその蛋白質の幾つかの部分（細胞の外側のもの）を含むことができる。好ましい精子表面蛋白質はＰＨ−２０およびＰＨ−３０精子表面蛋白質である。ＰＨ−２０およびＰＨ−３０の両遺伝子は精子細胞の表面に存在する蛋白質をコード化し、そして受精にとって不可欠である。一つの哺乳類種におけるＰＨ− ２０をコード化するＤＮＡは、テストした他の哺乳類すべてからのゲノムＤＮＡと交差反応性を示す（つまり、ハイブリッド形成が可能である）ことを決定した。他の哺乳類種におけるこれらの相同性の存在は予期せぬ発見である。というのは哺乳類の精子−透明帯付着は多くの場合において種特異的であるためである。同様にモルモットのＰＨ−３０ｃＤＮＡはヒトのゲノムＤＮＡとハイブリッドを形成する。免疫原の産生および精製避妊用免疫原としての利用のための精子表面蛋白質の産生のための好ましい方法は組換えＤＮＡ技術によるものである。この技術を使用する蛋白質の産生のためには、その蛋白質もしくはその蛋白質の免疫原性部分をコード化するＤＮＡを単離およびクローン化する必要がある。当業者は目的の遺伝子をクローン化するための試みにおいて使用することができる種々の研究法に熟知している。しかしながら、目的の単離蛋白質以外は何も得ていないという状態では、このような試みに妥当な確実性をもって成功するということは期待できない。この後に示される実施例１においては、出願人はモルモットのＰＨ−２０遺伝子をコード化するＤＮＡの単離およびクローニングを開示する。ＰＨ−２０遺伝子の３’−部分をコード化するＤＮＡを単離するのに使用した方法は、ＰＨ−２０蛋白質と反応するポリクローナル抗体でのｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングを伴うものであった。固定化（anchored）ＰＣＲを使用してこの遺伝子の５’部分を単離した。実施例２は、広域なスペクトラムの哺乳類ゲノムＤＮＡが、記載のハイブリッド形成条件下においてモルモットＰＨ−２０配列に対してハイブリッド形成するＤＮＡ配列を含むという驚くべき発見を開示する。実施例１および２において示される情報により、当業者は任意の哺乳類種からＰＨ−２０遺伝子を単離およびクローン化することができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは目的の哺乳類（例えば、ネコ、ウマ、イヌ、ウシなど）から単離された睾丸もしくは精子形成性細胞から調製される。これは時間のかかる方法ではあるが、技術的には簡単なものである。当業者は、この課題に取り組めば高い確立で成功に至るであろう。このようなＤＮＡライブラリーをその後、例えばラベル化したモルモットＰＨ −２０ＤＮＡプローブを使用してスクリーニングする。すべてのもしくは一部分のＰＨ−２０をコード化するＤＮＡについて、実施例２において記載されるもののようなハイブリッド形成条件下に、このようなプローブ配列に対してハイブリッド形成する能力による特性決定を行う。ハイブリッド形成によるラベル化およびスクリーニングの方法は当業者に非常によく知られている。陽性を示すクローンを分析し、そして全長のｃＤＮＡを常法により作製する。分析を行った７つの哺乳類の各々が交差ハイブリッド形成性配列を含むという出願人の教示の観点において、当業者はすべての哺乳類が交差ハイブリッド形成種を含むことを予期するであろう。以下により詳しく記載されるように、マウスおよびヒトＰＨ−２０遺伝子の単離およびクローン化を出願人が達成し得たのはまさにこの方法のおかげなのである。ＰＨ−２０蛋白質の免疫原領域をコード化するクローン化遺伝子もしくはその一部分を、そのコーディング領域を発現構築物を作製するために発現ベクター内に挿入することにより発現させることができる。このような発現ベクターは数多くのものが当業者に知られている。これらのベクターは目的の遺伝子のためのプロモーターならびに追加的な転写および翻訳シグナルを含む。真核性宿主細胞および原核性宿主細胞の両方のための発現ベクターが広範囲にわたって入手することができる。このＤＮＡ発現構築物を使用して適切な宿主細胞を形質転換させる。真核性宿主細胞、特に哺乳類におけるものが精子表面蛋白質の発現のために好ましい。例えば原核性細胞内において発現させる際に真核性蛋白質はしばしば折れ曲がってしまうという問題があることを見いだした。そのうえ、クローン化ＤＮＡからの真に生物学的に活性な真核性蛋白質の産生には、ジスルフィド結合形成、グルコシル化、フォスフォリル化、もしくは特異的蛋白質分解による開裂過程のような翻訳後修飾がしばしば必要とされるが、これらの過程は細菌細胞中においては実行されることがない。このことは膜蛋白質に関して特に当てはまる。精子表面蛋白質は宿主細胞の転写および翻訳構成成分を使用して産生される。適切な増殖および発現期間の後に宿主細胞培養物を溶菌し、そして精子表面蛋白質をこの溶菌液から精製する。溶菌緩衝液は典型的には非イオン性洗剤、プロテアーゼインヒビターなどを含む。可溶化させた細胞抽出物から精子表面蛋白質を、超遠心法、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動法などの物理学的および生物学的方法により精製および単離することができる。別の方法では、精子表面蛋白質をモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を使用する親和性クロマトグラフィーにより単離することができる（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．ｏｆＲｅｐｒｏｄ．３８：９２１−９３４（１９８８）、を参照せよ）。蛋白質を精製するためのこのような方法は当業者によく知られている。ＰＨ−２０遺伝子および遺伝子産物に関して先に概略を示す方法をＰＨ−３０遺伝子および遺伝子産物に対しても応用する。ＰＨ−３０精子表面蛋白質のαおよびβサブユニットをコード化するＤＮＡの単離を実施例５において記載する。先に記載のものに類似する方法を使用してモルモットＰＨ−３０蛋白質に相同な哺乳類蛋白質を単離および発現することができる。モルモットＰＨ−３０精子表面蛋白質をコード化するＤＮＡをプローブとして使用して他の哺乳類から相同配列を単離することができるということを高い確立をもって予測することができる。この予測は、モルモットのＤＮＡを使用してヒトゲノムＤＮＡ内における相同なＰＨ−３０の存在を同定したという事実に基づいている。先に述べたように全長を有する蛋白質も有用であるが、そのうえ精子表面蛋白質の抗原性部分も免疫原として有用である。抗原性断片は、例えば全長を有する蛋白質の蛋白質分解による消化により、およびその後の所望の断片の単離により作製することができる。別の方法ではモノマーのアミノ酸残基から出発する化学合成を使用して所望の断片を作製することができる。ＰＨ−３０蛋白質に関しては、特定の抗原性ドメンインが避妊用ワクチンにおける利用のための好ましい候補物である。以下に示す実施例の項目においてより詳細に論議されるように、ＰＨ−３０ βサブユニットはディスインテグリンとして知られるある種の蛋白質と比較すると高度に保存されているドメインを含む。このドメインに相同なもしくは実質的に相同なペプチド（もしくはその一部分）が本発明の避妊法における利用について好ましい。前文において使用される、実質的に相同な、は、ペプチドの少なくとも８０％のアミノ酸がＰＨ−３０ βディスインテグリンドメインの対応する部分と相同であることを意味する。ディスインテグリンはヘビの毒液内において見いだされ、そして例えばインテグリンとして知られるある種の血小板表面蛋白質に対して結合することが知られている。ディスインテグリンのインテグリンに対する結合は血液凝固を阻害することが示されている。このことに類推して、ＰＨ−３０ βディスインテグリンドメインに相当するペプチドは精子−卵子結合および融合において作用することが予測される。避妊用ワクチンいったん精子表面蛋白質を産生および精製したら、免疫化のための被検体に対して投与するための適切な担体と精子表面蛋白質とを配合させることによりワクチンを作製することができる。ワクチンは１種以上の精子表面蛋白質を含むことができる。本発明の精子表面蛋白質は免疫系の非特異的刺激化物を含むアジュバントと配合させることができる。アジュバントの適切な利用により外来性抗原（例えば、精子表面蛋白質）に対する強力な抗体を誘導することができる。アジュバントの作用は完全には理解されていないが、多くのアジュバントは二つの成分を混合させてある。一つのものは抗原を異化から保護する沈着物を形成するように設計された物質である。沈着物を形成する二つの方法とは、無機油もしくは酸化アルミニウム沈殿を使用するものである。フロインドの補助剤のような無機油に関しては、免疫原は油中水形乳液において調製する。酸化アルミニウムに関しては、免疫原を吸着させて沈殿を形成させるか、あるいは沈殿中に捕捉するかのいずれかである。別の輸送系にはリポソームもしくは合成界面活性剤がある。リポソームは免疫原が外側の脂質層内に取り込まれる際にのみ有効であり、捕捉された分子は免疫系により認識されないようになる。有効なアジュバントのために必要な第二の成分は免疫系を非特異的に刺激化するであろう物質である。これらの物質はリンホカインとして知られている多大な種類の可溶性ペプチドの産生を剌激化する。次にはリンホカインが直接的に抗原プロセッシング性細胞の活性を刺激化し、そして注射部位において局所的な炎症反応を引き起こす。リピッドＡ（ｌｉｐｉｄＡ）として知られるリポ多糖である成分が一般的に用いられる。リピッドＡは、リポ多糖と比較して毒性は非常に低いがリポ多糖分子の所望のアジュバント特性を依然として保持している数々の合成および天然形態において入手することができる。リピッドＡ成分はしばしばリポソームを使用して輸送される。非特異的刺激化物としてアジュバント中において一般的に使用される二つの細菌は、ボルダテルラペルト_ウスシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）およびミコバクテリウムトゥベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。全細菌として使用する場合には、これらは使用前に熱による死滅化を行う必要がある。Ｂ．ペルトゥスシスの免疫調節的媒介物質にはリポ多糖成分および百日咳毒素がある。百日咳毒素は既に精製されており、そして市販品として入手することができる。Ｍ．トゥベルクローシスは一般的には完全フロイントアジュバントにおいて見いだされる。Ｍ．トゥベルクローシスの最も活性な成分は数々の形態において入手することができるムラミルジペプチドに限定されている。免疫化（インキュベーションおよびブースター注射）免疫化する予定の被検体は反応能性免疫系を保持する任意の哺乳類であることができる。被検体哺乳類の例には、ヒトおよび家畜（例えば、イヌ、ネコ、ウマなど）、ならびに実験もしくは他の目的を意図する動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）がある。初期免疫のための適切な用量を決定する際には二つの異なる基準を考慮することが重要である。第一のものは最も強力な反応を達成するための至適用量であり、そして第二ものは有用なポリクローナル抗体の産生を誘導するであろう最低用量である。注射される物質の多くのものは適切な標的免疫細胞に達する以前に異化および除去されるであろう。この方法の効率は宿主因子、注射の経路、アジュバントの利用、および注射される表面蛋白質の固有特性によって変化するであろう。したがって、免疫系に輸送される有効用量は導入される用量にはほとんど関係ないことがあり、そしてその結果必須用量を経験的に決定する必要がある。これらの決定は当業者により簡単に行うことができる。第二注射および後のブースト注射は初期注射と類似する量もしくはそれを下回る量で投与することができる。注射の経路は三つの実際上の決定事項により左右され、それらの決定事項とは、１）どのくらいの容量が輸送されるべきか、２）どの緩衝液および他の成分を免疫原と共に注射すべきか、および３）どのくらい迅速に免疫原がリンパ管もしくは循環系内に放出されるべきか、である。例えばウサギに関しては、通常大容量の注射物を複数の皮下部位において投与する。マウスについては腹膜内注射に関して大容量のみが実行され得る。アジュバントもしくは粒子性物質が注射物内に含まれる場合には免疫原は静脈注射を介して輸送すべきではない。接種物の放出が緩慢であることが所望される場合には、注射は筋肉注射もしくは皮内注射のいずれかにより行うべきである。即時的放出のためには静脈内注射を使用せよ。初期抗体反応はしばしば非常に微弱であり、それは特に容易に異化されてしまう可溶性抗原が原因である。したがって、初期免疫化の後に第二注射もしくはブースター注射が必要とされる。感作被検体内に蛋白質を再導入させる前に遅延期間を置く必要がある。最低でも２もしくは３週間が推奨されるが、より広い間隔であっても可能である。第二および後続の注射に対する抗体反応はより強力である。抗体の高力価は達成されるものの、より重要なことは血清内に存在する抗体の性質および量が変化することである。これらの変化により高親和性の抗体が産生される。第二、第三、および後続の注射の間の間隔は変化させることができるが、通常では抗体の循環系内レベルが十分に下がって新規に注入される抗原が迅速に排除されることを妨げるようにその間隔を広げる必要がある。後続のブースター注射は、継続的な避妊のために低減されている循環性抗体を増加させることを必要とされるであろう。これらの注射のための実際の間隔は各々の種ごとに異なるであろう。しかしながら、当業者は精子表面蛋白質抗体の血清レベルをモニターすることによりこの間隔を決定することができる。他の態様においては、被検体に精子表面蛋白質に対する同種異系抗血清もしくはモノクローナル抗体を投与して避妊を達成することができる。同種異系抗血清は同じ種の他の固体内において作製し、その固体の血清から単離し、そして受容被検体内に注射するための適切な担体内において調製する。当業者は投与のためのモノクローナル抗体の調製および製剤のための方法を熟知している。本発明は、以下に示す実施例においてより詳細に説明される。実施例実施例１：モルモットＰＨ−２０ライブラリー構築物をコード化するＤＮＡの単離およびスクリーニングパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）濃度勾配液上の精子形成性細胞に富むモルモットの睾丸細胞の集団を精子形成性細胞の総ＤＮＡの単離のために用いた。ペレット化させた細胞を、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．６）、０．５％のＮＰ−４０、０．１４ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、および１０ｍＭのＶＲＣを含む０．５−１．０ｍｌの溶液中、バナジル−リボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）の存在下、洗剤で溶菌した。細胞破片をペレット化させた後、０．５倍容量の２×プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）緩衝液（２×＝０．２ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．３ＭＮａＣｌ、および２．０％ＳＤＳ）および２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫをこの上清に添加した。ポリＡ（ＰｏｌｙＡ）＋ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーにより総ＲＮＡから精製した。ｃＤＮＡを標準的な方法を使用して合成した。サイズ選択を行ったｃＤＡＮ（０．５−７ｋｂ）をラムダーｇｔ１１アームと連結させ、そしてＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社からのキットおよび実験計画書を使用してラムダーのコート蛋白質内に挿入した。増幅させていないライブラリーを、スクリーニングの目的で２０，０００プラーク／１５０ｍｍプレートの割合でプレートに撒いた。各プレートからの一枚のニトロセルロースフィルターに対して、親和性により精製したＰＨ−２０蛋白質に対して作製したウサギ抗−精製ＰＨ−２０ポリクローナル抗血清での免疫ブロットを行い（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３８：９２１−９３４（１９８８））、そして２ｍｇ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）蛋白質を含むＴＢＳＴ（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１／５００倍に希釈した。この大腸菌蛋白質はＹ１０９０細胞の一晩の培養物をペレット化させ、この細胞を最低限の容量のＴＢＳＴ内に再懸濁させ、そして液体窒素内に凍結させることにより調製した。解凍させた細胞を超音波処理にかけ、そしてＢＣＡ試薬（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ社）を使用して蛋白質濃度を決定した。６つの陽性プラークを抗−ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼを配位させた第二抗体（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ社）で検出した。プラーク−精製陽性クローンにより作製される融合蛋白質のサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での融合蛋白質を含む大腸菌抽出物の分析により決定したところ、１１８−１５７ｋＤの間で変化することが決定された。６つの陽性クローンからの挿入断片をｐＵＣ１９内にサブクローン化させ、そして少なくとも部分的な配列決定を行った。これらの挿入断片のうちの２つのものについて、それらから得られるアミノ酸配列における２つのＰＨ−２０トリプシンペプチドの配列の位置を決定することにより、それらがＰＨ−２０蛋白質をコードすることを確認した。これらの挿入断片（ｇｐＰＨ−２０−１、ヌクレオチド（ｎｔ）１０１６−２１５２、およびｇｐＰＨ−２０−２、ｎｔ１０１０ −２１２５、図１および２）の両方共は、長い読み取り枠（約９２５ｎｔ）、ストップコドン、３’未翻訳領域、およびポリＡテイルを含んでいた。したがってこれら２つの挿入断片を、ＰＨ−２０についてのｃＤＮＡの３’末端を表すものとして結論づけた。他の４つの抗体−陽性ラムダークローンはＰＨ−２０とは無関係であった。ＰＨ−２０ｃＤＮＡの５’部分を、Ｆｒｏｈｍａｎｅｔａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８−９００２（１９８８））の研究計画法に従う固定化ＰＣＲを利用してクローン化させた。精子形成性細胞からのポリＡ＋ＲＮＡ（１０μｌのｄＨ²Ｏ中の２μｇ）を６５℃において３分間加熱し、そしてその後４０μｌの総容量中の４μの１０×ＲＴＣ緩衝液（１×緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、４ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭＭｇＣｌ₂である）、および４μｌの各ｄＮＴＰ１０ｍＭ保存溶液（最終１ｍＭ）、２μｌの８０ｍＭリン酸ナトリウム（最終４ｍＭ）、１μｌ（４０単位）のＲＮａｓｉｎ（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ社）、４０ピコモルのＰＨ−２０特異的プライマー（ＰＨ−２０−ＲＴ）、１８単位のＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）、および４０μＣｉの３２Ｐ−ｄＣＴＰを添加することにより逆転写させた。４２℃における１時間のインキュベーションの後、１μｌの追加的なリバーストランスクリプターゼを添加し、そしてインキュベーションをもう１時間継続させた。ＰＨ−２０−ＲＴプライマーは、挿入断片ｐｇＰＨ−２０−１（図１）の５’末端から約２５０塩基下流にある１７のヌクレオチド（ｎｔ）オリゴマー（ｎｔ１２４２−１２５８、図２）であった。カラムクロマトグラフィーにより過剰量のＰＨ−２０−ＲＴから一本鎖ｃＤＮＡを分離させ、ポリＡテイルを付加させ、そして１．０ｍｌに希釈した。第二鎖合成およびＰＣＲ増幅は、１０μｌのリバーストランスクリプターゼ産物、２０ピコモル（ｄＴ）の１７アダプター、５０ピコモルのアダプター、および５０ピコモルのＰＨ−２０−ＡＭＰプライマーを含む１００μｌの反応物中、ＧｅｎｅＡｍｐキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を使用して実行した。ＰＨ−２０−ＡＭＰプライマーは、ＰＨ−２０−ＲＴプライマーの上流に位置する１７ｎｔオリゴマー（ｎｔ１２０２−１２１８、図２）であった。ＰＣＲ産物を未取り込みのプライマーから精製し、そして遊離ヌクレオチドをスピンカラムクロマトグラフィーにより精製した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ社からのカラム）。これをその後ＨｇｉＡＩおよびＳａｌＩで消化させ、ゲル精製にかけ、そしてＰｓｔＩおよびＳａｌＩで消化させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内に連結させた。主要ＰＣＲ産物は１．２ｋｂであり、そしてサザンブロット分析によりこのバンドがラベル化した挿入断片ｐｇＰＨ−２０−１とハイブリッド形成することを確認した。３つの別々の反応からの主要ＰＣＲ産物をクローン化し、そしてその３つの反応の各々からの一つづつの挿入断片の配列決定を行った（ｇｐＰＨ−２０−３、ｎｔ１−１１７５、ｇｐＰＨ−２０−４、ｎｔ２４−１１７５、およびｇｐＰＨ−２０−５、ｎｔ２９５−１１７５）。全ｃＤＮＡ配列および演鐸アミノ酸配列を、両方の鎖についてそれぞれの完全な配列決定を行った５つのｃＤＮＡ挿入断片（図２）から取得した。このｃＤＮＡ配列は３４５ｎｔの５’未翻訳領域、１５９０ｎｔの読み取り枠、および２０８ｎｔの３’未翻訳領域を含む。得られるアミノ酸配列は精製ＰＨ−２０から得られる全てのトリプシンペプチド配列を含み、これによりこのｃＤＮＡが本物のＰＨ−２０クローンであることが確認される。ハイブリッド形成実験により、モルモットのゲノムＤＮＡはＰＨ−２０のための単一の遺伝子を含むことが示された。コンピューターでの探索により、モルモットのＰＨ−２０アミノ酸配列と他の既知の配列とには有意な相同性が存在しないことが明らかにされた。実施例２：他の哺乳類種におけるＰＨ−２０相同物他の種のゲノムＤＮＡにおいてＰＨ−２０遺伝子の相同物が存在するか否かを決定するために交配種のサザンブロットを実行した。ゲノムＤＮＡをモルモット、ラット、ウサギ、マウス、およびハムスターの脾臓から、洗剤溶菌−プロテイナーゼＫ消化により単離した。他のＤＮＡサンプル（例えば、ヒト、サル、およびニワトリ）はＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔＨｅａｌｔｈＣｅｎｔｅｒにおける他の研究者により提供された。サケの精子およびウシの胸腺からのＤＮＡはＳｉｇｍａ社より購入し、そしてＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））中、１ｍｇ／ｍｌにおいて再構成した。全ての種のＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素で切断し、そして１％アガロースゲル上で分離した。サザン転移（Ｓｏｕｔｈｅｒｎｔｒａｎｓｆｅｒ）はナイロン膜上への毛細管転移（ｃａｐｉｌｌａｒｙｔｒａｎｓｆｅｒ）により実行した。この膜を６×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、２５０ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１％のＳＤＳ、および５０ｍＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７．４）を含んでなる溶液中、６５ ℃で１−２時間予備ハイブリッド形成を行わせた。この膜を予備ハイブリッド形成用緩衝液プラス２× １０⁶ｃｐｍ／ｍｌプローブ中、５５℃において一晩ハイブリッド形成させた。プローブはランダムヘキサマー法により調製した。このブロットを３×５分間２ ×ＳＳＣ＋１．０％ＳＤＳ中で室温下において、２×３０分間２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で５０℃の室内において、そして２×３０分間１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で６０℃において洗浄した。このブロットをプラスチック製ラップで包み、そして強調用スクリーンを含むフィルムに対して７０℃下において露出させた。このブロットをラベル化ｇｐＰＨ−２０−３とｇｐＰＨ−２０−２との混合物で探索した。サザンブロットにより約１０ｋｂの地点において、ニワトリＤＮＡに関しては微弱なハイブリッド形成バンドが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、およびヒトＤＮＡに関しては強力なハイブリッド形成バンドが示された。そのうえ、ウシおよびサルＤＮＡに関してもハイブリッド形成が観察された。実施例３：マウスＰＨ−２０をコード化するＤＮＡの単離ポリＡ＋ＲＮＡをマウス球状精子細胞から単離し、そしてこれを用い、常法を使用してラムダ−Ｊ内でｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーをラベル化した全長のモルモットＰＨ−２０ｃＤＮＡプローブを使用してスクリーニングした。このプローブはまずモルモットのポリＡ＋ＲＮＡを単離することにより作製した。オリゴ−ｄＴプライマーをポリ（Ａ）領域（ｔｒａｃｔ）に対してハイブリッド形成させ、そしてリバーストランスクリプターゼを使用して第一ｃＤＮＡ鎖を作製した。２つのオリゴヌクレオチドの最初のものはモルモットＰＨ−２０の５’未翻訳領域の一部分に対して相補的なものであり、そして２つ目のものは３’未翻訳領域に対して相補的なものであり、これらをこの反応混合物に添加し、そして完全なコーディング領域を含む全長の二本鎖ＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応により作製した。この反応の産物は１．５−１．６ｋｂの間の二本鎖ＤＮＡ断片であった。この断片をクローン化させ、そしてクローン化させた断片を分析してそれが実際にモルモットＰＨ−２０蛋白質をコード化していることを確認した。ラベル化プローブをこのクローンから常法により作製した。マウスｃＤＮＡライブラリーを、先に記載のモルモットプローブを使用してスクリーニングした。陽性クローンを同定した。この２つのクローンは約１５００塩基対のＤＮＡを表す。いずれのクローンもｃＤＮＡの５’部分からの配列を含んでいなかった。陽性クローンの内の一つの５’末端に対して相補的な一連のプライマーを使用する固定化ＰＣＲを使用して、マウス遺伝子の５’部分をクローン化した。この配列を図３に示す。実施例４：ヒトＰＨ−２０をコード化するＤＮＡの単離ヒトＰＨ−２０をコード化するＤＮＡを、ラムダーｇｔ１１内においてヒト睾丸ライブラリーをスクリーニングすることにより単離およびクローン化させた。このライブラリーを９０ｍｍプレートあたり約３，０００プラークの密度においてプレート培養した。ファージプラークを二重検定法用の二枚のフィルターに転移させ、そして２本の放射活性ラベル化させたＤＮＡプローブ、マウスＰＨ−２０ｃＤＮＡ、およびモルモットＰＨ−２０ｃＤＮＡの混合物でスクリーニングした。より具体的にはモルモットのプローブは、先に記載のラベル化させた全長のモルモットＰＨ−２０プローブであり、そしてマウスクローンはマウスｃＤＮＡの５端からの配列を欠く２つのマウスクローンの内の一つであった。２つのプローブの混合物とハイブリッド形成する陽性プラークを選択しそして精製した。このｃＤＮＡ挿入断片をサブクローン化させ、そしてＤＮＡ配列を標準的な方法を使用して決定した。２つのｃＤＮＡクローンが得られた。この２つのものの各々は異なる形態のヒトＰＨ−２０をコード化していた。一方のヒトクローンをＨ１８（図４）と表示し、そしてもう一方のものをＨ１６（図５）と表示する。Ｈ１８は５１０のアミノ酸からなる読み取り枠、ならびに短い５’および３’ 未翻訳領域を含む全長クローンである。Ｈ１８の読み取り枠中においてコード化される蛋白質はモルモットのＰＨ−２０に対して５９％相同であり、そして７４％類似している（保存性置換基を含む）。Ｈ１６はヒトＰＨ−２０のカルボキシル末端部分をコード化する部分的な長さのクローンである。Ｈ１６内のヌクレオチド１はＨ１８内のヌクレオチド８１４に相当する。ヌクレオチド１−７８１からのＨ１６の配列はヌクレオチド８１４ −１５９４からのＨ１８の配列に相同であり、ヌクレオチド７８２で開始してヌクレオチド１６７５まで続くＨ１６の配列は、ヌクレオチド１５９５で開始してヌクレオチド１６９６まで続く配列とは異なる。コード化されるＰＨ−２０蛋白質の観点からすると、Ｈ１６によりコード化される部分的蛋白質はアミノ酸２３６−４９６（Ｈ１８配列に基づきアミノ酸番号を付してある）の間にあるＨ１８によりコード化される蛋白質に対して相同である。したがってＨ１６はアミノ酸４９７−５１１をコード化し、そしてＨ１８はアミノ酸４９７−５１０をコード化し、そしてこれらの配列は各々の残基を異にしている。ヒトＰＨ−２０の発現および精製ＰＨ−２０のための全長クローン（Ｈ１８）を２つの大腸菌発現ベクター、ｐＭＡＬ−ｐおよびｐＭＡＬ−ｃ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）内にサブクローン化させた。両方のベクターにおいてＰＨ−２０を融合蛋白質として作製するが、Ｎ−末端融合の相手は大腸菌のマルトース結合性（ＭＢＰ）蛋白質である。ｐＭＡＬ−ｐにおいては、コード化されるＭＢＰ（これは通常ではペリプラズム蛋白質である）はその蛋白質にとっての通常のシグナル配列を有し、そのシグナル配列はＭＢＰ−ＰＨ−２０融合において生じ、そしてペリムラズムを標的としている。ペリプラズムへとうまく輸出されることができる融合蛋白質にとっては、この位置は、ジスルフィド結合が形成され（１２のシステインがヒトＰＨ−２０内に存在する）、より高い免疫原である可能性のある蛋白質を産生するという利点を有する。ｐＭＡＬ−ｃにおいては、ＭＢＰのためのシグナル配列は存在せず、そして融合蛋白質は細胞質内に見いだされ、そしてジスルフィド結合を形成していない。ヒトＰＨ−２０はｐＭＡＬ−ｐおよびｐＭＡＬ−ｃの両方から産生される。しかしながらｐＭＡＬ−ｐを保持する株においては産生されるｈＰＨ−２０の量は低く、一方でｐＭＡＬ− ｃを保持する株においては産生されるＰＨ−２０の量が多い（この融合蛋白質はクーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の大腸菌抽出物内の主要バンドである）。ヒトＰＨ−２０融合蛋白質を精製するためには、ＭＢＰ−ＰＨ− ２０融合蛋白質をアミロース樹脂（これに対してＭＢＰが結合する）に対して結合させ、そしてマルトースで溶出させる。実施例５：ＰＨ−３０精子表面蛋白質をコード化するＤＮＡの単離本実施例はＰＨ−３０精子表面蛋白質をコード化するＤＮＡの単離を開示する。本実施例の主題物質はＢｌｏｂｅｌｅｔａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ３５６：２４８（１９９２））により既に発表されている。成熟ＰＨ−３０蛋白質はαおよびβサブユニットを有する二量体蛋白質である。成熟ＰＨ−３０蛋白質は、Ｐｒｉｍａｋｏｆｆｅｔａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：１４１−１４９（１９８７））により記載されるように親和性精製を行った。単離に続き、サブユニットをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてシュレイヒャーおよびシュエルエリュートラップ（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌｅｌｕｔｅｒａｐ）を使用して電気溶出を行った。アミノ−末端および内部ペプチド配列をＰＨ−３０のαおよびβサブユニットから、それらが受精能を有する（成熟）精子上に生じる際に決定した（Ｂｌｏｂｅｌｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１１：６９−７８（１９９０）、を参照せよ）。Ｎ−末端ペプチド配列を決定するためには、溶出させた蛋白質を還元し、そして逆相ＨＰＬＣにより精製した。αサブユニットの内部ペプチド配列については溶出させた上で還元した蛋白質をＨＰＬＣ前にトリブシンで開裂させた。ペプチドの配列を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の気相配列決定機を使用して自動エドマン分解法により決定した。 αサブユニットについては、決定された配列は、ＹＣＴＧＱＳＧＫＣＰＬＤＴＹＫＱＤＧ（配列番号２４）、およびＡＬＦＡＡＩＱＩＰＨＧＤＤ（配列番号３０）であった。これらの２つのペプチド配列を使用してモルモット睾丸ｃＤＮＡにおける組み込み式（ｎｅｓｔｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための変成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このプライマーの同一性および組み合わせはＢｌｏｂｅｌｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ３５６：２８４（１９９２））においてより具体的に特定されている。組み込み式ＰＣＲ産物である３０８ヌクレオチドのバンドをサブクローン化させ、配列決定を行い、そして既に決定されているペプチド配列をコード化することが示された。その後組み込み式ＰＡＣＥ実験計画を実行して成熟ＰＨ−３０のαの３’配列を完成させ、そして成熟Ｎ−末端のペプチド配列を確認した。増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、ゲネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ．社）を用いて精製し、そして直接的な配列決定を行った。両方の鎖共について約１７５ヌクレオチドの間隔を開けてあるプライマーを用いて配列決定を行ったところ、２つの異なる初期ＲＡＣＥ反応からの第二反応産物は相同であった。このＰＣＲ産物の演鐸アミノ酸配列は、既に決定されているペプチド配列を含むことを見いだした。αサブユニット配列の残りの部分を、ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）実験計画（ＦｒｏｈｍａｎおよびＭａｒｔｉｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１：１６５−１７０（１９８９））の組み込み式高速増幅法により作製した。ＰＨ−３０のαサブユニットの演鐸配列を図６に示した。αサブユニットのヌクレオチド配列は、２８９アミノ酸をコード化する一つの読み取り枠を含む。βサブユニットの配列を類似する様式において決定した。ペプチド配列を、Ｎ−末端ペプチド配列を作製した以外は αサブユニットについて記載したようにして決定し、βサブユニットをイモビロン（ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）膜上に転移させた。内部ペプチド配列を作製するためには、溶出させた蛋白質を臭化シアンもしくはＶ８プロテアーゼで切断し、電気泳動にかけ、そしてイモビロン上に転移させた。別の方法では、溶出させた蛋白質をＣＮＢｒおよびトリプシンで順次消化させ、その後逆相ＨＰＬＣを行った。これらの方法により決定されたペプチド配列は、ＳＮＰＶ＿ＧＮＮＲＶＥＱＧＥＤＣＤＣＧＳＱＥＥＣＱＤＴＣ（配列番号２２）、ＡＱＧＰ（配列番号１６）、ＳＴＤＥＣＤＬＰＥＹＣＮＧＳＳＧＡＣＱＥＤＬ（配列番号１６）、ＭＧＳＶＤ＿ＦＥＱＬ＿ＴＫＮＤＩＴ＿Ｎ（配列番号２７）、Ａ＿ＧＡＳＮＷＫ（配列番号３１）、Ｍ＿ＩＹＡ＿ＩＳＧ（配列番号３１）、ＳＡＬ＿ＶＲ（配列番号３４）、Ｃ＿ＰＳ＿ＶＣＲ（配列番号３４）、およびＶＡＴＶ（配列番号３９）であった。ペプチドＳＮＰＶ＿ＧＮＮＲＶＥＱＧＥＤＣＤＣＧＳＱＥＥＣＱＤＴＣ（配列番号２２）およびＳＴＤＥＣＤＬＰＥＹＣＮＧＳＳＧＡＣＱＥＤＬ（配列番号１６）を使用して４本の変成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。変成プライマーを組み合わせて使用する組み込み式ＰＣＲにより１８５および２０６塩基対の２本の強いバンドが生じた。この２０６−塩基対断片をポリアクリルアミドゲルから切り出し、水で溶出させ、沈殿化させ、配列決定を行ったところ、ＰＨ−３０のβペプチド配列をコード化することを見いだした。これを３２Ｐでラベル化し、そしてこれを用いて高緊縮性ハイブリッド形成および洗浄条件を用いるモルモット精子形成性細胞ｃＤＮＡの発現ライブラリー（Ｌａｔｈｒｏｐｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：２９３９−２９４１（１９９０））の探索を行った。成熟ＰＨ−３０βプラス前駆体ドメインの４アミノ酸のすべてをコード化する一つのクローンを５００，０００のプラークの内から同定し、そして約２００ヌクレオチドの間隔を開けてあるプライマーでＰＣＲ増幅化させたＤＮＡ断片を使用して直接的に配列決定を行った。この配列を、第一鎖のモルモット睾丸ｃＤＮＡからのＰＣＲにより増幅させた成熟ＰＨ− ３０βの両方の鎖の配列を決定することにより確認した。ＰＨ−３０βサブユニットの演鐸ｃＤＮＡ配列を図７に示す。βサブユニットのヌクレオチド配列は、３５３アミノ酸をコード化する一つの読み取り枠を含む。ほとんどのウイルス性融合蛋白質はＮ末端もしくはポリペプチド内のいずれかに「融合ペプチド」を含んでおり、この配列はウイルス一族内では高度に保存されるが、ウイルス一族間では保存されない。融合ペプチドは、（１）常に膜固定化サブユニット内に位置しており、（２）比較的疎水性であり、そして（３）大半のかさばった疎水性残基が一方の面に存在する「偏った」αヘリックスとして形成することができる。少なくともある事例においては、融合ペプチドが膜表面と相互作用を行う際にヘリックス構造が採用される。ヘリックスの疎水性面はウイルス−細胞膜相互作用を成立することができ、そしてこれにより融合が導かれる。ＰＨ−３０αは内部融合ペプチドのこれらの基準のうちの３つ全てを満たす領域（図８ｂにおける残基９０−１１１）を含む。仮想的内部ウイルス融合ペプチドはその中心部にもしくはその付近にプロリン（複数）を有しており、同様にこの領域も予想されるヘリックスの中心内に２つのプロリンを有しており、プロリンは他の膜−相互作用的αヘリックスにおいて行うように折れ曲がり状態を生じるが、恐らくこの場合にもこれらのプロリンがこのような折れ曲がり状態を生じる原因になるものと思われる。ＰＨ−３０αのこの可能な融合ペプチドは、風疹ウイルスのＥ２糖蛋白質の可能な融合ペプチド（ＧＡＤＴＲＣＧＲＬＩＣＧＬＳＴＴＡＱＹＰＰＴＲ）（配列番号４２）に配列が類似する他のＰＨ −３０領域（図８ｂの残基８２−１０２）と重複している。ほとんどのウイルス性蛋白質は標的膜に対する結合ならびに融合という責務を担っている。成熟ＰＨ−３０βのＮ−末端の９０のアミノ酸は、精子−卵子融合の前に生じる膜結合段階において機能することができる仮想的インテグリン−結合性「ディスインテグリン」ドメインを含む。インテグリンｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対するフィブリノーゲン結合の競合的阻害により作用するヘビ毒液からの、短く（４９−８３アミノ酸）可溶性であり、そして高度に保存されている血小板凝固阻害剤の一族には、ビスタチン（ｂｉｓｔａｔｉｎ）（Ｓｈｅｂｕｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１５５０−２１５５６（１９８６））、バーバーリン（ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９３５９−９３６２（１９９１））、キストリン（ｋｉｓｔｒｉｎ）（Ｄｅｎｎｉｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：４０２２−４０２６（１９８１）、およびエキスタチン（ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）（Ｇａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１９８３２（１９８８））が含まれる。これらのインテグリンリガンドに対する精子ＰＨ−３０βの類似性により、これが卵子原型質膜上のレセプター、おそらくはインテグリンに対して結合することが示唆される。ほとんどのインテグリンはインテグリン共通結合配列ＲＧＤを含む。この配列における変化は、親和性（Ｇａｒｓｋｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：４０２２−４０２６（１９８９））、もしくは結合の特異性（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９３５９−９３６２（１９９１）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６５：３５９−３６２（１９９１））のいずれかを変化させる。しかしながら既知のインテグリンリガンドの内の半分はこのトリペプチドを含まないか、あるいは非ＲＧＤ配列を用いてインテグリンと相互作用を行うことができるか、のいづれかである。核磁気共鳴分析により、キストリンおよびエキスタチンのＲＧＤ配列はループの先端に存在し、そこでそれらは高親和性結合に必要な立体配座を確認すると考えられている。ＰＨ−３０βのディスインテグリンドメインが類似する三次現構造を採る場合には、配列ＴＤＡおよび追加的（奇数の）システインがこのようなループの先端を占め、そしてその後卵子の原形質膜上のインテグリンと相互作用を行うことができるのであろう。より長いヘビ毒液蛋白質ＨＲＩＢのディスインテグリンドメインは、配列ＥＳＥおよびこの位置における追加的システインを含む。２種類の間接的証拠により、ＰＨ−３０βが卵子原形質膜インテグリンに対して結合し、マウス卵子の蛋白質分解によりそれらの受精能力が減少し（ＣａｌａｒｃｏＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅＴｅｃｈ．１７：４０１−４１１（１９９１）、Ｂｏｌｄｔｅｔａｌ．，ＧａｍｅｔｅＲｅｓ．２３：９１−１０１（１９８９））、そして関連する卵子表面ポリペプチドの内の２つが、αおよび βインテグリンサブユニットに類似する９５Ｋおよび１５０Ｋの分子量を有し、そのうえミクロモル単位の濃度のＲＧＤ−含有性ペプチドがヒトもしくはハムスターの精子と、透明膜を欠くハムスター卵子との間の融合を阻害する、という仮説が支持される。ＲＧＤペプチドはこれらの精子上のＰＨ−３０相同物と、この相同物がＲＧＤ配列を含まないとしても競合することができるであるものと思われ、それはＲＧＤペプチドが非−ＲＧＤインテグリンリガンドの結合について競合することができるためである、という仮説が支持される。実施例６：ＰＨ−３０蛋白質の投与による避妊ワクチン接種モルモットの精子表面蛋白質ＰＨ−３０の同定および精製は、既にＰｒｉｍａｋｏｆｆｅｔａｌ．，（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：１４１（１９８７））により記載されている。本実施例は、雄および雌の両方のモルモットを精製したＰＨ−３０蛋白質で免疫化させる実験の結果、ならびに受精についての免疫化の効果を説明する。雌もしくは雄のハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）モルモット（第一注射の時期において約３００グラム（雌）もしくは６００−６５０グラム（雄））に、以下に記載する量のＰＨ−３０の注射を２本施した。ｍＡＢ−親和性クロマトグラフィーにより精子から精製されたＰＨ−３０は、ＳＤＳゲル上の精製蛋白質の銀染色を使用した際には検出可能な汚染物の存在を示さなかった。雌もしくは雄の免疫化に用いた各ＰＨ−３０調製物の純度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色により確認した。３ｍＭのオクチルグルコシド（ＯＧ）を含む０．３７５ｍｌのリン酸緩衝化食塩水中の親和性−精製ＰＨ−３０を、０．３７５ｍｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化させた。各動物の背中に０．５ｍｌの乳液の皮下注射を、そして後ろ脚に０．２５ｍｌの筋肉注射を施した。約１カ月後、ＰＢＳ中の同量のＰＨ−２０および３ｍＭのＯＧを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化させ、そしてこれを各動物における同じ部位に注射した（以下に記載する例外事項を採用してあり、雄１および３には一回の注射のみを施した）。対照用の雌および雄には同じスケジュールでそしてＰＢＳおよび３ｍＭのＯＧおよびＣＦＡもしくはＩＦＡを含むがＰＨ−３０を含まない同じ注射を施した。注射した雌を交尾させるために、最初の注射の約二カ月後にこれらの雌を雄と３週間にわたり同宿させた。各ケージには、一匹の雄（５７５−６００ｇ）、一匹の免疫化させた雌、および２−４匹の対照注射を施した雌を入れた。３週間後、雌を雄から分離し、妊娠している雌に子供を出産させ、そして子孫を計数した。対照注射を施したが妊娠しなかった雌は他の対照が妊娠しているケージ内に存在しており、このことにより免疫化させた雌と交尾した全ての雄は生殖能を有するものであったことが示された。注射を施した雄を交尾させるために、最初の注射後約４カ月後、注射を施した各雄を３週間２匹の雌（約６００グラム）と同宿させた。その後雌と雄とを分離し、そしてさらに５週間後に雌を屠殺し、そして胎児の計数を行った。これらの実験の結果を以下の表に示す。表１は免疫化させた６匹の雌のモルモットの結果であり４匹は生殖能を示した。対照注射を施した雌の結果では、３６匹の内の３４匹が生殖能を示した。す。表２は免疫化させた３匹の雄のモルモットの結果であり、３匹全てが生殖能を示さなかった。対照注射を施した雄の結果では５匹の内の５匹共が生殖能を示した。実施例７：卵子原形質膜に対する精子融合の阻害剤としてのＰＨ−３０ディスインテグリンペプチドの利用ＰＨ−３０βディスインテグリンドメインからのペプチドを、卵子原形質膜に対する精子の結合の阻害についてテストした。より具体的には２本の修飾化させたＰＨ−３０βペプチドをテストした。これら２本のペプチドは、ほとんどのヘビのディスインテグリン中の活性トリペプチドであるＲＧＤとディスインテグリンドメイン中の同じ位置内に存在する配列ＴＤＥを含む。テストした２本の修飾化ＰＨ−３０ペプチドは、ＳＴＤＥＣＤＬＫ（配列番号４３）およびＣＳＴＤＥＣ（配列番号４４）であった。２本のペプチドの内の最初のものは直線状ペプチドであり、そしてリシン残基（Ｋ）の添加により修飾されてアガロースビーズに対するこのペプチドの接合を容易にさせていた。２本のペプチドの内の第二のものは環状ペプチドであり、そしてシステイン残基（Ｃ）の添加により修飾されており、ジスルフィド形成による環化を可能にさせてあった。アミノ酸のランダム鎖を表す２本の対照ペプチドも融合阻害アッセイに含まれていた。対照ペプチドは、ＧＲＧＤＴＤ（配列番号４５）およびＧＲＧＥＳ（配列番号４６）であった。融合阻害アッセイを以下に示すように実行した。卵子をモルモットの卵巣から採取した。この卵子を組織培養培地で一晩インキュベートした。透明帯をプロテアーゼの混合物で除去した。透明帯を有さない卵子を明記されている濃度におけるペプチドと共に３０分間培養培地中でインキュベートした。雄のモルモットの副睾丸から採取した精子をインキュベーションにより能力付与させ、そしてアクロソームをＦｌｅｍｉｎｇおよびＹａｎａｇｉｍａｃｈｉ（ＧａｍｅｔＲｅｓ．４：２５３−２７３（１９８１））により記載されているように反応させ、そして卵子に添加し、そして１５分間インキュベートさせた。その後卵子を、精子を含まない培養培地に移し、そしてさらに１時間４５分の間インキュベートさせた。その後卵子を固定化させ、そしてＰｒｉｍａｋｏｆｆｅｔａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：１４１（１９８７））により記載されるように染色した。その後膨張している精子頭部の総数を計数した。膨張している精子頭部は、精子と卵子とが融合したことを示す。これらの観察に基づき、数々の指数を算出した。受精指数（Ｆ．Ｉ．）は、膨張している頭部の総数を卵子の総数で割ることにより決定する。受精率（Ｆ．Ｒ．）は、卵子が受精するパーセンテージである。パーセント阻害は、実験用ペプチドの受精指数を対照ペプチドの受精指数で割ることにより決定する。精子−卵子融合阻害アッセイから得られるデータを、以下に示す表３−６にまとめてある。これらの実験の結果により、ペプチドが存在しない場合と比較すると、透明帯を有さない卵子を対照ペプチドＧＲＧＥＳおよびＧＲＧＤＴＰとインキュベートする場合には精子−卵子融合の有意な阻害がみられないという結果になることが明らかに示される。ペプチドが存在しない場合のアッセイと対照ペプチドのアッセイとの間に観察される融合率は、対照ペプチドが存在する場合と類似しているもしくはより高かった（表３）。しかしながら、実験用ペプチドがＣＳＴＤＥＣおよびＳＴＤＥＣＤＬＫである場合には、ペプチドを添加しなかった場合（表４）もしくは対照ペプチドを添加した場合（表５）と比較するとより強く阻害された。受精指数が生物学的な正常値である、卵子あたり１つの精子という値付近である場合には、ＳＴＥＤＣＤＬＫは精子−卵子融合を９２％阻害し、そしてＣＳＴＤＥＣは８９％阻害した（表４）。これらのデータより、ＰＨ−３０βディスインテグリンドメインは精子− 卵子融合において重要なエピトープを表すことが結論づけられる。このエピトープに対して特異的に結合する抗体は、精子−卵子融合を遮断することが予想される。精子−卵子融合を阻害する能力を示さない対照ペプチド（ＧＲＧＥＳ）精子−卵子融合アッセイにおけるＴＤＥペプチドとペプチドを添加しない対照との比較精子−卵子融合アッセイにおける対照ペプチド（ＧＲＧＥＳ）、２本のＴＤＥペプチド、およびＲＧＤペプチドの比較等価物当業者は、慣例となっている実験と同様のものを使用して本明細書中に具体的に記載されている本発明の具体的態様に対する多くの等価物を突き止めることかできることを理解するであろうし、あるいは実際に突き止めることができるであろう。このような等価物は以下に示される特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。配列表（１）一般情報（ｉ）出願者：（Ａ）住所：ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ（Ｂ）街路名：２１３ＷｈｅｔｔｅｎＧｒａｄｕａｔｅＣｅｎｔｅｒ４３８ＷｈｉｔｎｅｙＲｏａｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎ（Ｃ）市：Ｓｔｏｒｒｓ（Ｄ）州：ＣＴ（Ｅ）国：ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：０６２９６（ｉｉ）発明の名称：避妊用ワクチン（ｉｉｉ）配列数：４６（ｉｖ）通信先住所：（Ａ）住所：Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｂｒｏｏｋ、Ｓｍｉｔｈ＆Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｐ．Ｃ．（Ｂ）街路名：ＴｗｏＭｉｌｉｔｉａＤｒｉｖｅ（Ｃ）市：Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ（Ｄ）州：ＭＡ（Ｅ）国：ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：０２１７３（ｖ）コンピューター解読可能形態：（Ａ）メディウムタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエアー：ＰａｔｅｎｔＩｎＲｅｌｅａｓｅ＃１．０Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５（ｖｉ）現在の出願者データ：（Ａ）出願番号０７／８９７，８８３（Ｂ）提出日：１９９２年６月１２日（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）弁護士／代理店の情報：（Ａ）氏名：Ｂｒｏｏｋ、ＤａｖｉｓＥ．（Ｂ）登録番号：２２，５９２（Ｃ）参照／協議番号：ＵＣＴ９０−０１ＡＡ（ｉｘ）テレコミュニケーション情報：（Ａ）電話：（６１７）８６１−６２４０（Ｂ）テレファックス：（６１７）８６１−９５４０（２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１５２（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名前／記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：３５５．．１９４１（ｘｉ）配列：配列番号１：（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５２９（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列：配列番号２：（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１２５（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名前／記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：３１３．．１８４８（ｘｉ）配列：配列番号３：（２）配列番号４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５１２（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列：配列番号４：（２）配列番号５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１６９５（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名前／記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１０９．．１６３５（ｘｉ）配列：配列番号５：（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０９（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列：配列番号６：（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１６７４（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名前／記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．８２５（ｘｉ）配列：配列番号７：（２）配列番号８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２７５（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列：配列番号８：（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１１０４（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号９：（２）配列番号１０についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１４６３（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１０：（２）配列番号１１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１１：（２）配列番号１２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１２：（２）配列番号１３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１３：（２）配列番号１４についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２７（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１４：（２）配列番号１５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１５：（２）配列番号１６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１６：（２）配列番号１７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１７：（２）配列番号１８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４３（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１８：（２）配列番号１９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４６（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１９：（２）配列番号２０についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４３（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２０：（２）配列番号２１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４９（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（２）配列番号２２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２２：（２）配列番号２３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２３：（２）配列番号２４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１９（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２４：（２）配列番号２５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２５：（２）配列番号２６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２６：（２）配列番号２７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４９（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２７：（２）配列番号２８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２８：（２）配列番号２９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４９（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号２９：（２）配列番号３０についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３０：（２）配列番号３１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４９（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３１：（２）配列番号３２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３２：（２）配列番号３３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３３：（２）配列番号３４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４８（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３４：（２）配列番号３５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３８（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３５：（２）配列番号３６についての情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：４７（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３６：（２）配列番号３７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３７：（２）配列番号３８についての情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３８：（２）配列番号３９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３９：（２）配列番号４０についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４０：（２）配列番号４１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１６（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４１：（２）配列番号４２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４２：（２）配列番号４３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：８（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４３：（２）配列番号４４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４４：（２）配列番号４５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４５：（２）配列番号４６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号４６：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１月３日【補正内容】先に記載のものに類似する方法を使用してモルモットＰＨ−３０蛋白質に相同な哺乳類蛋白質を単離および発現することができる。モルモットＰＨ−３０精子表面蛋白質をコード化するＤＮＡをプローブとして使用して他の哺乳類から相同配列を単離することができるということを高い確立をもって予測することができる。この予測は、モルモットのＤＮＡを使用してヒトゲノムＤＮＡ内における相同なＰＨ−３０の存在を同定したという事実に基づいている。先に述べたように全長を有する蛋白質も有用であるが、そのうえ精子表面蛋白質の抗原性部分も免疫原として有用である。抗原性断片は、例えば全長を有する蛋白質の蛋白質分解による消化により、およびその後の所望の断片の単離により作製することができる。別の方法ではモノマーのアミノ酸残基から出発する化学合成を使用して所望の断片を作製することができる。ＰＨ−３０蛋白質に関しては、特定の抗原性ドメンインが避妊用ワクチンにおける利用のための好ましい候補物である。以下に示す実施例の項目においてより詳細に論議されるように、ＰＨ−３０ βサブユニットはディスインテグリンとして知られるある種の蛋白質と比較すると高度に保存されているドメインを含む。このドメインに相同なもしくは実質的に相同なペプチド（もしくはその一部分）が本発明の避妊法における利用について好ましい。前文において使用される、実質的に相同な、は、ペプチドの少なくとも８０％のアミノ酸がＰＨ−３０ β ディスインテグリンドメインの対応する部分と相同であることを意味する。ディスインテグリンはヘビの毒液内において見いだされ、そして例えばインテグリンとして知られるある種の血小板表面蛋白質に対して結合することが知られている。ディスインテグリンのインテグリンに対する結合は血液凝固を阻害することが示されている。このことに類推して、ＰＨ−３０ βディスインテグリンドメインに相当するペプチドは精子−卵子結合および融合において作用することが予測される。したがって、免疫系に輸送される有効用量は導入される用量にはほとんど関係ないことがあり、そしてその結果必須用量を経験的に決定する必要がある。これらの決定は当業者により簡単に行うことができる。第二注射および後のブースト注射は初期注射と類似する量もしくはそれを下回る量で投与することができる。注射の経路は三つの実際上の決定事項により左右され、それらの決定事項とは、１）どのくらいの容量が輸送されるべきか、２）どの緩衝液および他の成分を免疫原と共に注射すべきか、および３）どのくらい迅速に免疫原がリンパ管もしくは循環系内に放出されるべきか、である。例えばウサギに関しては、通常大容量の注射物を複数の皮下部位において投与する。マウスについては腹膜内注射に関して大容量のみが実行され得る。アジュバントもしくは粒子性物質が注射物内に含まれる場合には免疫原は静脈注射を介して輸送すべきではない。接種物の放出が緩慢であることが所望される場合には、注射は筋肉注射もしくは皮内注射のいずれかにより行うべきである。即時的放出のためには静脈内注射を使用せよ。初期抗体反応はしばしば非常に微弱であり、それは特に容易に異化されてしまう可溶性抗原が原因である。したがって、初期免疫化の後に第二注射もしくはブースター注射が必要とされる。感作被検体内に蛋白質を再導入させる前に遅延期間を置く必要がある。最低ても２もしくは３週間が推奨されるが、より広い間隔であっても可能である。第二および後続の注射に対する抗体反応はより強力である。抗体の高力価は達成されるものの、より重要なことは血清内に存在する抗体の性質および量が変化することである。これらの変化により高親和性の抗体が産生される。第二、第三、および後続の注射の間の間隔は変化させることができるが、通常では抗体の循環系内レベルが十分に下がって新規に注入される抗原が迅速に排除されることを妨げるようにその間隔を広げる必要がある。核磁気共鳴分析により、キストリンおよびエキスタチンのＲＧＤ配列はループの先端に存在し、そこでそれらは高親和性結合に必要な立体配座を確認すると考えられている。ＰＨ−３０ βのディスインテグリンドメインが類似する三次現構造を採る場合には、配列ＴＤＡおよび追加的（奇数の）システインがこのようなループの先端を占め、そしてその後卵子の原形質膜上のインテグリンと相互作用を行うことができるのであろう。より長いヘビ毒液蛋白質ＨＲ１Ｂのディスインテグリンドメインは、配列ＥＳＥおよびこの位置における追加的システインを含む。２種類の間接的証拠により、ＰＨ−３０ βが卵子原形質膜インテグリンに対して結合し、マウス卵子の蛋白質分解によりそれらの受精能力が減少し（ＣａｌａｒｃｏＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅＴｅｃｈ．１７：４０１−４１１（１９９１）、Ｂｏｌｄｔｅｔａｌ．，ＧａｍｅｔｅＲｅｓ．２３：９１−１０１（１９８９））、そして関連する卵子表面ポリペプチドの内の２つが、αおよびβインテグリンサブユニットに類似する９５Ｋおよび１５０Ｋの分子量を有し、そのうえミクロモル単位の濃度のＲＧＤ−含有性ペプチドがヒトもしくはハムスターの精子と、透明膜を欠くハムスター卵子との間の融合を阻害する、という仮説が支持される。ＲＧＤペプチドはこれらの精子上のＰＨ−３０相同物と、この相同物がＲＧＤ配列を含まないとしても競合することができるであるものと思われ、それはＲＧＤペプチドが非−ＲＧＤインテグリンリガンドの結合について競合することができるためである、という仮説が支持される。実施例６：ＰＨ−３０蛋白質の投与による避妊ワクチン接種モルモットの精子表面蛋白質ＰＨ−３０の同定および精製は、既にＰｒｉｍａｋｏｆｆｅｔａｌ．，（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：１４１（１９８７））により記載されている。本実施例は、雄および雌の両方のモルモットを精製したＰＨ−３０蛋白質で免疫化させる実験の結果、ならびに受精についてこの免疫化の効果を説明する。雌もしくは雄のハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）モルモット（第一注射の時期において約３００グラム（雌）もしくは６００−６５０グラム（雄））に、以下に記載する量のＰＨ−３０の注射を２本施した。ｍＡＢ−親和性クロマトグラフィーにより精子から精製されたＰＨ−３０は、ＳＤＳゲル上の精製蛋白質の銀染色を使用した際には検出可能な汚染物の存在を示さなかった。雌もしくは雄の免疫化に用いた各ＰＨ−３０調製物の純度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色により確認した。３ｍＭのォクチルグルコシド（ＯＧ）を含む０．３７５ｍｌのリン酸緩衝化食塩水中の親和性−精製ＰＨ−３０を、０．３７５ｍｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化させた。各動物の背中に０．５ｍｌの乳液の皮下注射を、そして後ろ脚に０．２５ｍｌの筋肉注射を施した。約１カ月後、ＰＢＳ中の同量のＰＨ−３０および３ｍＭのＯＧを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化させ、そしてこれを各動物における同じ部位に注射した（以下に記載する例外事項を採用してあり、雄１および３には一回の注射のみを施した）。対照用の雌および雄には同じスケジュールでそしてＰＢＳおよび３ｍＭのＯＧおよびＣＦＡもしくはＩＦＡを含むがＰＨ−３０を含まない同じ注射を施した。注射した雌を交尾させるために、最初の注射の約二カ月後にこれらの雌を雄と３週間にわたり同宿させた。各ケージには、一匹の雄（５７５− ６００ｇ）、一匹の免疫化させた雌、および２−４匹の対照注射を施した雌を入れた。３週間後、雌を雄から分離し、妊娠している雌に子供を出産させ、そして子孫を計数した。対照注射を施したが妊娠しなかった雌は他の対照が妊娠しているケージ内に存在しており、このことにより免疫化させた雌と交尾した全ての雄は生殖能を有するものであったことが示された。注射を施した雄を交尾させるために、最初の注射後約４カ月後、注射を施した各雄を３週間２匹の雌（約６００グラム）と同宿させた。その後雌と雄とを分離し、そしてさらに５週間後に雌を屠殺し、そして胎児の計数を行った。これらの実験の結果を以下の表に示す。その後卵子を、精子を含まない培養培地に移し、そしてさらに１時間４５分の間インキュベートさせた。その後卵子を固定化させ、そしてＰｒｉｍａｋｏｆｆｅｔａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：１４１（１９８７））により記載されるように染色した。その後膨張している精子頭部の総数を計数した。膨張している精子頭部は、精子と卵子とが融合したことを示す。これらの観察に基づき、数々の指数を算出した。受精指数（Ｆ．Ｉ．）は、膨張している頭部の総数を卵子の総数で割ることにより決定する。受精率（Ｆ．Ｒ．）は、卵子が受精するパーセンテージでぁる。パーセント阻害は、実験用ペプチドの受精指数を対照ペプチドの受精指数で割ることにより決定する。精子−卵子融合阻害アッセィから得られるデータを、以下に示す表３−６にまとめてある。これらの実験の結果により、ペプチドが存在しない場合と比較すると、透明帯を有さない卵子を対照ペプチドＧＲＧＥＳおよびＧＲＧＤＴＰとインキュベートする場合には精子−卵子融合の有意な阻害がみられないという結果になることが明らかに示される。ペプチドが存在しない場合のアッセイと対照ペプチドのアッセイとの間に観察される融合率は、対照ペプチドが存在する場合と類似しているもしくはより高かった（表３）。しかしながら、実験用ペプチドＣＳＴＤＥＣおよびＳＴＤＥＣＤＬＫを添加した場合には、精子−卵子融合はペプチドを添加しなかった場合（表４）もしくは対照ペプチドを添加した場合（表５）と比較するとより強く阻害された。受精指数が生物学的な正常値である、卵子あたり１つの精子という値付近である場合には、ＳＴＥＤＣＤＬＫは精子−卵子融合を９２％阻害し、そしてＣＳＴＤＥＣは８９％阻害した（表４）。これらのデータより、ＰＨ−３０ βディスインテグリンドメインは精子−卵子融合において重要なエピトープを表すことが結論づけられる。このエピトープに対して特異的に結合する抗体は、精子−卵子融合を遮断することが予想される。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年６月１０日【補正内容】モルモットの精子表面蛋白質ＰＨ−２０は、受精においては無くてはならない初期段階である卵子の細胞外被膜（透明帯）に対する精子付着における必須の機能を担っていることが示されている。ＰＨ−２０で免疫化させた雄および雌のモルモットにおいては１００％という有効な避妊効果が得られた。免疫化させた雌からの抗血清は高い力価を有し、精子抽出物中のＰＨ−２０を特異的に認識し、そしてインビトロにおいて卵子透明帯に対する精子付着を遮断した。この避妊効果は長期持続的かつ可逆的であり、免疫化させた雌を免疫化の後６−１５カ月の期間をおいて交尾させたところ徐々に受胎能を奪回した（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３５：５４３−５４６（１９８８））。第二のモルモット精子表面蛋白質であるＰＨ−３０もやはり避妊効果を示した。避妊用免疫原としてテストした他の精子蛋白質には、精子酵素ヒアルロニダーゼ、アクロシン、および乳酸デヒドロゲナーゼＣ−４がある。これらの酵素での雌動物の免疫化は受胎能における効果を全く示さないか、あるいは受胎能における部分的効果を示すかのいずれかであり、しかもこの効果はこれらの蛋白質を避妊用試薬として適当と評価するほど十分なものではなかった。モルモットにおけるＰＨ−２０の高い避妊効果は、精子表面における存在、強い免疫原性、および受精における主要な役割を含むこの蛋白質の数々の具体的特性における依存するようである。哺乳類の精子−帯付着は多くの場合において種特異的である。他の哺乳類種からの精子は、アクローソーム反応の前もしくは後のいずれかに透明帯に対して結合することができるという点においてモルモットの精子に類似している。モルモット以外の種における受精のために必須な精子表面蛋白質の同定および単離は、これらの種における有効な免疫化のためのワクチンの開発ならびに長期持続的な避妊薬を提供するためには有用であろう。精子の付着蛋白質候補物の生物学的同定、単離、およびクローニングがなされていないということは、ヒトならびに他の哺乳類種のための有効な避妊用ワクチンの開発の際の研究者の妨げとなっていた。発明の要約本発明は、一つもしくは複数の精子表面蛋白質をある哺乳類に対して投与する避妊の方法に関する。精子表面蛋白質（もしくは同蛋白質の一部分）を免疫反応の刺激化について有効な量において投与し、そしてこのことにより精子−卵子融合を妨げるもしくは実質的にその割合を低減するのに十分な力価で精子表面蛋白質に対して結合する抗体を産生させる。この蛋白質もしくは蛋白質断片は常法により精製することができる、もしくは組換えＤＮＡ法により産生させることができる。本発明はまた、本明細書内に記載される方法における利用のための避妊用組成物にも関する。これらの組成物は精子表面蛋白質もしくはその蛋白質の一部分を含む。好ましい精子表面蛋白質はＰＨ−２０およびＰＨ−３０精子表面蛋白質である。図面の簡単な記載図１は、モルモットのＰＨ−２０蛋白質をコード化するＤＮＡの部分的制限地図、ならびに５つのｃＤＮＡクローンの相対的な位置を表す図である。図２は、ＰＨ−２０蛋白質をコード化するモルモットｃＤＮＡ配列、ならびに一文字コードにおいて表されるモルモットＰＨ−２０蛋白質の演鐸アミノ酸配列を表す図である。図３は、ＰＨ−２０蛋白質をコード化するマウスＤＮＡ配列を表す図である。図３において開示される配列は配列番号３および４として表わされる。図４は、ヒトのＰＨ−２０蛋白質のーつの形態をコード化するヒトＤＮＡ配列、ならびに三文字コードにおいて表される演鐸アミノ酸配列を表す図である。図４において開示される配列は配列番号５および６として表わされる。好ましい精子表面蛋白質は、ＰＨ−２０およびＰＨ−３０精子表面蛋白質である。ＰＨ−２０およびＰＨ−３０の両遺伝子は精子細胞の表面に存在する蛋白質をコード化し、そして受精にとって不可欠である。一つの哺乳類種におけるＰＨ− ２０をコード化するＤＮＡは、テストした他の哺乳類すべてからのゲノムＤＮＡと交差反応性を示す（つまり、ハイブリッド形成が可能である）ことを決定した。他の哺乳類種におけるこれらの相同性の存在は予期せぬ発見であり、というのは哺乳類の精子−透明帯付着は多くの場合において種特異的であるためである。同様にモルモットのＰＨ−３０ｃＤＮＡはヒトのゲノムＤＮＡとハイブリッド形成する。親和性精製したモルモットＰＨ−２０で免疫化させた雌のモルモットは少なくとも６カ月の間は完全に受胎不能であり、そしてそれらの血清はインビトロにおいて精子が卵子の透明帯に対して結合するのを遮断した。モルモットＰＨ−２０で免疫化した少数の雄モルモットは少なくとも７カ月の間は受胎不能であった（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３５：５４３−５４６（１９８８））。モルモットＰＨ−２０のαおよびβサブユニットの演鐸アミノ酸配列は互いに類似していることが明らかになり、このことにより進化的な関連性が示唆され、そして両者ともが大きなＮ−末端細胞外ドメインおよび小さな細胞質テイルを有するタイプ−Ｉ内在性膜蛋白質であることが示唆される。βサブユニットは卵子原形質膜上の仮想的レセプター（インテグリン、もしくはインテグリン一様）の結合において機能することができる仮想的インテグリン−結合性「ディスインテグリン」ドメインを含む（Ｂｌｏｂｅｌ．，Ｃ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５６：２４８−２５２（１９９２））。免疫原の産生および精製避妊用免疫原としての利用のための精子表面蛋白質の産生のための好ましい方法は組換えＤＮＡ技術によるものである。この技術を使用する蛋白質の産生のためには、その蛋白質もしくはその蛋白質の免疫原性部分をコード化するＤＮＡを単離およびクローン化する必要がある。当業者は目的の遺伝子をクローン化するための試みにおいて使用することができる種々の研究法に熟知している。しかしながら、目的の単離蛋白質以外は何も得ていないという状態では、このような試みに妥当な確実性をもって成功するということは期待できない。この後に示される実施例１においては、出願者はモルモットのＰＨ−２０遺伝子をコード化するＤＮＡの単離およびクローニングを開示する。ＰＨ−２０遺伝子の３’−部分をコード化するＤＮＡを単離するのに使用した方法は、ＰＨ−２０蛋白質と反応するポリクローナル抗体でのｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングを伴うものであった。固定化ＰＣＲを使用してこの遺伝子の５’部分を単離した。実施例２は、広域なスペクトラムの哺乳類ゲノムＤＮＡが、記載のハイブリッド形成条件下においてモルモットＰＨ−２０配列に対してハイブリッド形成するＤＮＡ配列を含むという驚くべき発見を開示する。後続のブースター注射は、継続的な避妊のために低減されている循環性抗体を増加させることを必要とされるであろう。これらの注射のための実際の間隔は各々の種ごとに異なるであろう。しかしながら、当業者は精子表面蛋白質抗体の血清レベルをモニターすることによりこの間隔を決定することができる。他の態様においては、被検体に精子表面蛋白質に対する同種異系抗血清もしくはモノクローナル抗体を投与して避妊を達成することができる。同種異系抗血清は同じ種の他の固体内において作製し、その固体の血清から単離し、そして受容被検体内に注射するための適切な担体内において調製する。当業者は投与のためのモノクローナル抗体の調製および製剤するための方法を熟知している。本発明は、以下に示す実施例においてより詳細に説明される。実施例実施例１：モルモットＰＨ−２０ライブラリー構築物をコード化するＤＮＡの単離およびスクリーニングパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）濃度勾配液上の精子形成性細胞に富むモルモットの睾丸細胞の集団を精子形成性細胞の総ＤＮＡの単離のために用いた。ペレット化させた細胞を、１０ｍＭのＴｒｌｓ（ｐＨ８．６）、０．５％のＮＰ−４０、０．１４ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、および１０ｍＭのＶＲＣを含む０．５−１．０ｍｌの溶液中、バナジル−リボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）の存在下、洗剤で溶菌した。細胞破片をペレット化させた後、０．５倍容量の２×プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）緩衝液（２×＝０．２ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．３ＭＮａＣｌ、および２．０％ＳＤＳ）および２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫをこの上清に添加した。したがってこれら２つの挿入断片を、ＰＨ−２０についてのｃＤＮＡの３’末端を表すものとして結論づけた。他の４つの抗体−陽性ラムダークローンはＰＨ− ２０とは無関係であった。ＰＨ−２０ｃＤＮＡの５’部分を、Ｆｒｏｈｍａｎｅｔａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８−９００２（１９８８））の研究計画法に従う固定化ＰＣＲを利用してクローン化させた。精子形成性細胞からのポリＡ＋ＲＮＡ（１０μｌのｄＨ²Ｏ中の２μｇ）を６５℃において３分間加熱し、そしてその後４０μｌの総容量中の４μの１０×ＲＴＣ緩衝液（１×緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、４ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭＭｇＣｌ₂である）、および４ μｌの各ｄＮＴＰ１０ｍＭ保存溶液（最終１ｍＭ）、２μｌの８０ｍＭリン酸ナトリウム（最終４ｍＭ）、１μｌ（４０単位）のＲＮａｓｉｎ（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ社）、４０ピコモルのＰＨ−２０特異的プライマー（ＰＨ−２０−ＲＴ）、１８単位のＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）、および４０μＣｉの³²Ｐ−ｄＣＴＰを添加することにより逆転写させた。４２℃における１時間のインキュベーションの後、１μｌの追加的なリバーストランスクリプターゼを添加し、そしてインキュベーションをもう１時間継続させた。ＰＨ−２０−ＲＴプライマーは、挿入断片ｐｇＰＨ−２０−１（図１）の５’末端から約２５０塩基下流にある１７のヌクレオチド（ｎｔ）オリゴマー（ｎｔ１２４２−１２５８、図２）であった。カラムクロマトグラフィーにより過剰量のＰＨ−２０−ＲＴから一本鎖ｃＤＮＡを分離させ、ポリＡテイルを付加させ、そして１．０ｍｌに希釈した。第二鎖合成およびＰＣＲ増幅は、１０μｌのリバーストランスクリプターゼ産物、２０ピコモル（ｄＴ）の１７アダプター、５０ピコモルのアダプター、および５０ピコモルのＰＨ−２０−ＡＭＰプライマーを含む１００μｌの反応物中、ＧｅｎｅＡｍｐキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を使用して実行した。ＰＨ−２０−ＡＭＰプライマーは、ＰＨ−２０−ＲＴプライマーの上流に位置する１７ｎｔオリゴマー（ｎｔ１２０２−１２１８、図２）であった。ＰＣＲ産物を未取り込みのプライマーから精製し、そして遊離ヌクレオチドをスピンカラムクロマトグラフィーにより精製した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ社からのカラム）。これをその後ＨｇｉＡＩおよびＳａｌＩで消化させ、ゲル精製にかけ、そしてＰｓｔＩおよびＳａｌＩで消化させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内に連結させた。この断片をクローン化させ、そしてクローン化させた断片を分析してそれが実際にモルモットＰＨ−２０蛋白質をコード化していることを確認した。ラベル化プローブをこのクローンから常法により作製した。マウスｃＤＮＡラィブラリーを、先に記載のモルモットプローブを使用してスクリーニングした。陽性クローンを同定した。この２つのクローンは約１５００塩基対のＤＮＡを表す。いずれのクローンもｃＤＮＡの５’部分からの配列を含んでいなかった。陽性クローンの内の一つの５’末端に対して相補的な一連のプライマーを使用する固定化ＰＣＲを使用して、マウス遺伝子の５’部分をクローン化した。この配列を図３に示す。実施例４：ヒトＰＨ−２０をコード化するＤＮＡの単離ヒトＰＨ−２０をコード化するＤＮＡを、ラムダ−ｇｔ１１内においてヒト睾丸ライブラリーをスクリーニングすることにより単離およびクローン化させた。このライブラリーを９０ｍｍプレートあたり約３，０００プラークの密度においてプレート培養した。ファージプラークを二重検定法用の二枚のフィルターに転移させ、そして２本の放射活性ラベル化させたＤＮＡプローブ、マウスＰＨ−２０ｃＤＮＡ、およびモルモットＰＨ−２０ｃＤＮＡの混合物でスクリーニングした。より具体的にはモルモットのプローブは、先に記載のラベル化させた全長のモルモットＰＨ−２０プローブであり、そしてマウスクローンはマウスｃＤＮＡの５端からの配列を欠く２つのマウスクローンの内の一つであった。２つのプローブの混合物とハイブリッド形成する陽性プラークを選択しそして精製した。このｃＤＮＡ挿入断片をサブクローン化させ、そしてＤＮＡ配列を標準的な方法を使用して決定した。２つのｃＤＮＡクローンが得られた。この２つのものの各々は異なる形態のヒトＰＨ−２０をコード化していた。一方のヒトクローンをＨ１８（図４）と表示し、そしてもう一方のものをＨ１６（図５）と表示する。Ｈ１８は５１０のアミノ酸からなる読み取り枠、ならびに短い５’および３’ の翻訳されない領域を含む全長クローンである。Ｈ１８の読み取り枠中においてコード化される蛋白質はモルモットのＰＨ−２０に対して５９％相同であり、そして７４％類似している（保存性置換基を含む）。これらの２つのペプチド配列を使用してモルモット睾丸ｃＤＮＡにおける組み込み式（ｎｅｓｔｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための変成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このプライマーの同一性および組み合わせはＢｌｏｂｅｌｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ３５６：２８４（１９９２））においてより具体的に特定されている。組み込み式ＰＣＲ産物である３０８ヌクレオチドのバンドをサブクローン化させ、配列決定を行い、そして既に決定されているペプチド配列をコード化することが示された。その後組み込み式ＰＡＣＥ実験計画を実行して成熟ＰＨ−３０のαの３’配列を完成させ、そして成熟Ｎ−末端のペプチド配列を確認した。増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、ゲネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ．社）を用いて精製し、そして直接的な配列決定を行った。両方の鎖共について約１７５ヌクレオチドの間隔を開けてあるプライマーを用いて配列決定を行ったところ、２つの異なる初期ＲＡＣＥ反応からの第二反応産物は相同であった。このＰＣＲ産物の演鐸アミノ酸配列は、既に決定されているペプチド配列を含むことを見いだした。αサブユニット配列の残りの部分を、ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）実験計画（ＦｒｏｈｍａｎおよびＭａｒｔｉｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１：１６５−１７０（１９８９））の組み込み式高速増幅法により作製した。ＰＨ−３０のαサブユニットの演鐸配列を図６に示した。αサブユニットのヌクレオチド配列は、２８９アミノ酸をコード化する一つの読み取り枠を含む。 βサブユニットの配列を類似する様式において決定した。ペプチド配列は、Ｎ −末端ペプチド配列を作製た以外はαサブユニットについて記載したようにして決定し、βサブユニットをイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）（ＤｕＰｏｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｙｓｔｅｍｓ社，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）膜上に転移させた。内部ペプチド配列を作製するためには、溶出させた蛋白質を臭化シアンもしくはＶ８プロテアーゼで切断し、電気泳動にかけ、そしてイモビロン上に転移させた。別の方法では、溶出させた蛋白質をＣＮＢｒおよびトリプシンで順次消化させ、その後逆相ＨＰＬＣを行った。これらの方法により決定されたペプチド配列は、ＳＮＰＶＧＮＮＲＶＥＱＧＥＤＣＤＣＧＳＱＥＥＣＱＤＴＣ（配列番号２２）、ＡＱＧＰ（配列番号１６）、ＳＴＤＥＣＤＬＰＥＹＣＮＧＳＳＧＡＣＱＥＤＬ（配列番号１６）、ＭＧＳＶＤＦＥＱＬＴＫＮＤＩＴＮ（配列番号２７）、ＡＧＡＳＮＷＫ（配列番号３１）、ＭＩＹＡＩＳＧ（配列番号３１）、ＳＡＬＶＲ（配列番号３４）、ＣＰＳＶＣＲ（配列番号３４）、およびＶＡＴＶ（配列番号３９）であった。ペプチドＳＮＰＶＧＮＮＲＶＥＱＧＥＤＣＤＣＧＳＱＥＥＣＱＤＴＣ（配列番号２２）およびＳＴＤＥＣＤＬＰＥＹＣＮＧＳＳＧＡＣＱＥＤＬ（配列番号１６）を使用して４本の変成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。変成プライマーを組み合わせて使用する組み込み式ＰＣＲにより１８５および２０６塩基対の２本の強いバンドが生じた。この２０６−塩基対断片をポリアクリルアミドゲルから切り出し、水で溶出させ、沈殿化させ、配列決定を行ったところ、ＰＨ−３０のβペプチド配列をコード化することを見いだした。これを³²Ｐでラベル化し、そしてこれを用いて高緊縮性ハイブリッド形成および洗浄条件を用いるモルモット精子形成性細胞ｃＤＮＡの発現ライブラリー（Ｌａｔｈｒｏｐｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：２９３９ −２９４１（１９９０））の探索を行った。成熟ＰＨ−３０ βプラス前駆体ドメインの４アミノ酸のすべてをコード化する一つのクローンを５００，０００のプラークの内から同定し、そして約２００ヌクレオチドの間隔を開けてあるプライマーでＰＣＲ増幅化させたＤＮＡ断片を使用して直接的に配列決定を行った。この配列を、第一鎖のモルモット華丸ｃＤＮＡからのＰＣＲにより増幅させた成熟ＰＨ−３０ βの両方の鎖の配列を決定することにより確認した。ＰＨ−３０ βサブユニットの演鐸ｃＤＮＡ配列を図７に示す。βサブユニットのヌクレオチド配列は、３５３アミノ酸をコード化する一つの読み取り枠を含む。ほとんどのウイルス性融合蛋白質はＮ末端もしくはポリペプチド内のいずれかに「融合ペプチド」を含んでおり、この配列はウイルス一族内では高度に保存されるが、ウイルス一族間では保存されない。融合ペプチドは、（１）常に膜固定化サブユニット内に位置しており、（２）比較的疎水性であり、そして（３）大半のかさばった疎水性残基が一方の面に存在する「偏った」αヘリックスとして形成することができる。少なくともある事例においては、融合ペプチドが膜表面と相互作用を行う際にヘリックス構造が採用される。ヘリックスの疎水性面はウイルス−細胞膜相互作用を成立することができ、そしれこれにより融合が導かれる。ＰＨ−３０ αは内部融合ペプチドのこれらの基準のうちの３つ全てを満たす領域（図８ｂにおける残基９０−１１１）を含む。仮想的内部ウイルス融合ペプチドはその中心部にもしくはその付近にプロリン残基（複数）を有しており、同様にこの領域も予想されるヘリックスの中心内に２つのプロリンを有しており、プロリンは他の膜−相互作用的αヘリックスにおいて行うように折れ曲がり状態を生じるが、恐らくこの場合にもこれらのプロリンがこのような折れ曲がり状態を生じる原因になるものと思われる。ＰＨ−３０ αのこの可能な融合ペプチドは、風疹ウイルスのＥ２糖蛋白質の可能な融合ペプチド（ＧＡＤＴＲＣＧＲＬＩＣＧＬＳＴＴＡＱＹＰＰＴＲ）（配列番号４２）に配列が類似する他のＰＨ−３０領域（図８ｂの残基８２−１０２）と重複している。ほとんどのウイルス性蛋白質は標的膜に対する結合ならびに融合という責務を担っている。成熟ＰＨ−３０ βのＮ−末端の９０のアミノ酸は、精子−卵子融合の前に生じる膜結合段階において機能することができる仮想的インテグリン− 結合性「ディスインテグリン」ドメインを含む。インテグリンｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａに対するフィブリノーゲン結合の競合的阻害により作用するヘビ毒液からの、短く（４９−８３アミノ酸）可溶性であり、そして高度に保存されている血小板凝固阻害剤の一族には、ビスタチン（ｂｉｓｔａｔｉｎ）（Ｓｈｅｂｕｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１５５０−２１５５６（１９８６））、バーバーリン（ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９３５９−９３６２（１９９１））、キストリン（ｋｉｓｔｒｉｎ）（Ｄｅｎｎｉｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：４０２２−４０２６（１９８１）、およびエキスタチン（ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）（Ｇａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１９８３２（１９８８））が含まれる。これらのインテグリンリガンドに対する精子ＰＨ−３０ βの類似性により、これが卵子原型質膜上のレセプター、おそらくはインテグリンに対して結合することが示唆される。ほとんどのインテグリンはインテグリン共通結合配列ＲＧＤを含む。この配列における変化は、親和性（Ｇａｒｓｋｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：４０２２−４０２６（１９８９））、もしくは結合の特異性（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９３５９−９３６２（１９９１）、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６５：３５９−３６２（１９９１））のいずれかを変化させる。しかしながら既知のインテグリンリガンドの内の半分はこのトリペプチドを含まないか、あるいは非ＲＧＤ配列を用いてインテグリンと相互作用を行うことができるかのいづれかである。等価物当業者は、慣例となっている実験と同様のものを使用して本明細書中に具体的に記載されている本発明の具体的態様に対する多くの等価物を突き止めることができることを理解するであろうし、あるいは実際に突き止めることができるであろう。このような等価物は以下に示される特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。８．インビボにおいて精子表面蛋白質に対して結合する抗体の刺激化について有効であり、そしてこのことにより精子−卵子融合を回避させるもしくはその率を実質的に低減させる、噛乳類に対する精子表面蛋白質からのペプチドであることを特徴とする、避妊における利用のためのペプチド。９．ＰＨ−２０の細胞外ドメインのものに対してアミノ酸配列が機能的に相同である、請求の範囲８のペプチド。１０．インテグリン−結合性ドメインのものに対してアミノ酸配列が機能的に相同である、請求の範囲８のペプチド。１１．ＰＨ−３０のインテグリン−結合性ドメインのものに対してアミノ酸配列が機能的に相同である、請求の範囲１０のペプチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．インビボにおける精子表面蛋白質に対して結合する抗体の刺激化について有効な、哺乳類に対する精子表面蛋白質からのペプチドの量を投与し、そしてこのことにより精子−卵子融合を回避させるかもしくはその率を実質的に低減させる、避妊の方法。２．精子表面蛋白質がＰＨ−２０である、請求の範囲１の方法。３．精子表面蛋白質がＰＨ−３０である、請求の範囲１の方法。４．ペプチドがインテグリン結合ドメインに対して相同である、請求の範囲３の方法。５．薬剤学的に許容される担体中の、精子表面蛋白質からの免疫原エピトープに対して相同である配列を有する本質的に純粋なペプチドを含んでなる避妊用組成物。６．精子表面蛋白質がＰＨ−２０もしくはＰＨ−３０である、請求の範囲５の避妊用組成物。７．本質的に純粋なペプチドが、組換えＤＮＡ発現ベクター中の精子表面蛋白質の免疫原エピトープをコード化するＤＮＡを発現することにより産生される、請求の範囲６の避妊用組成物。８．インビボにおいて精子表面蛋白質に対して結合する抗体の刺激化について有効であり、そしてこのことにより精子−卵子融合を回避させるもしくはその率を実質的に低減させる、哺乳類に対する精子表面蛋白質からのペプチドであることを特徴とする、避妊における利用のためのペプチド。