JPH08504588A

JPH08504588A - 改変クチナーゼ、ｄｎａ、ベクター及び宿主

Info

Publication number: JPH08504588A
Application number: JP6514770A
Authority: JP
Inventors: エグモンド，マールテン・ロベルト; フアン・デル・ヒーデン，ヘンドリクス・テオドルス・ウエー・エム; ムステルズ，ウオーテル; ペテルス，ハンス; フエリプス，コルネリス・テオドルス; デ・フリーグ，ヤコブ
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1992-12-18
Filing date: 1993-12-09
Publication date: 1996-05-21
Also published as: CZ157895A3; HUT71325A; HU9501771D0; WO1994014963A1; SK79595A3; ZA939415B; CN1090328A; BR9307678A; EP0679188A1; AU5699994A; CA2150837A1; PL309388A1

Abstract

(57)【要約】酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した、改善された脂肪分解活性を示す真核生物クチナーゼ変異体を提供する。特に、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】改変クチナーゼ、ＤＮＡ、ベクター及び宿主技術分野本発明は一般に、脂肪分解酵素の分野に関する。本発明はとりわけ、組換えＤＮＡ技術により改変した脂肪分解酵素、その産生方法、及び特に酵素洗剤組成物でのその使用に関する。背景及び従来技術脂肪分解酵素は、トリグリセリドを遊離脂肪酸やジグリセリド、モノグリセリド、場合によってはグリセロールに加水分解できる酵素である。前記酵素は更に、より複雑なエステル（例えば植物のクチン層又は皮脂）を分解し得る。脂肪分解酵素は、業界ではトリグリセリドのエステル交換やエステル合成のような種々の酵素法で使用されている。前記酵素は更に、洗剤製品の脂肪除去性を改善するために洗剤組成物で使用されている。最も広範に使用されている脂肪分解酵素は、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）である。例えば、ヨーロッパ特許出願公開第２５８０６８号及びヨーロッパ特許出願公開第３０５２１６号（共にＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）は共に、ｒＤＮＡ技術による異種宿主微生物を介した真菌リパーゼの産生、特にＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ／Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａに由来するリパーゼの産生を記載している。ヨーロッパ特許出願公開第３３１３７６号（Ａｍａｎｏ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼのアミノ酸配列を含め、リパーゼ、並びにそのｒＤＮＡ技術による産生及び使用を記載している。ｒＤＮＡ技術により産生されるリパーゼの別の例はＷＯ−Ａ−８９／０９２６３号やヨーロッパ特許出願公開第２１８２７２号（共にＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）に記載されている。リパーゼやその改変に関する刊行物が多数あるにもかかわらず、現在のところ、Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼだけが洗剤製品用添加剤としてＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）の商品名で広く市販されている。リパーゼの特徴は界面で活性を示すことである。これは、完全に溶解した基質よりも、界面又はミセルを形成した基質への酵素活性が遥かに高いことを意味している。界面活性は、基質濃度が基質の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも高くなって、界面が形成されたときに脂肪分解活性の急増となって表れる。実験では、この現象を酵素活性対基質濃度のグラフで非連続性として観察することができる。リパーゼの界面での活性化機構は、リパーゼ分子のタンパク質構造のコンホーメーション変化によって解明されてきた。遊離した未結合の状態では、らせん状リッド（lid）が触媒結合部位を包囲している。脂質基質との結合時には、リッドが移動して、触媒部位が露出する。らせん状リッドは、脂質界面と相互作用して、酵素を界面と結合した状態のままにするとも考えられている。ＷＯ−Ａ−９２／０５２４９号（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）は、脂質接触領域が改変された遺伝子工学的改変リパーゼ、特にＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼを開示している。脂質接触領域は本明細書では、活性形のときにらせん状リッドにより覆われた表面と定義する。改変は、脂質接触領域の１個以上のアミノ酸残基を欠失又は置換して、静電荷を増加させ、及び／又は脂質接触領域の疎水性を減少させ、又は脂質接触領域の表面コンホーメーションを変えることからなる。これは、脂質接触領域の１個以上の陰電荷アミノ酸残基を欠失させ、又はこれらの残基を中性又はより陽性電荷のアミノ酸で置換し及び／又は脂質接触領域の１個以上の中性アミノ酸残基を陽電荷アミノ酸で置換し、及び／又は脂質接触領域の１個以上の親水性アミノ酸残基を欠失させ、又はこれらの残基を疎水性アミノ酸で置換することにより達成される。クチナーゼは、ろうエステル加水分解酵素の一種である（ＥＣ３．１．１．５０）。これらの酵素は、植物で葉や茎の保護膜として生じるエステル化長鎖脂肪酸／脂肪アルコール網状体のクチンを分解し得る。更には、前記酵素はある程度の脂肪分解活性を有し、即ちトリグリセリドを加水分解し得る。従って、前記酵素は、特殊なリパーゼとみなすことができる。しかしながら、クチナーゼは、リパーゼとは異なり実質的な界面での活性を示さない。クチナーゼは、植物（例えば花粉）、細菌及び真菌のような多数の産生源から得ることができる。クチナーゼは、その脂肪分解性のために、酵素洗剤組成物の成分として提案されている。例えば、ＷＯ−Ａ−８８／０９３６７号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）は、界面活性剤と実質的に純粋な細菌クチナーゼ酵素とを組み合わせた効果的な洗浄組成物の製造を提案している。グラム陰性菌ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＡＴＣＣ５３５５２から得たクチナーゼを含む洗剤組成物が開示されている。しかしながら、より最近のヨーロッパ特許出願公開第４７６９１５号（Ｃｌｏｒｏｘ）では、従来の方法を使用した場合、リパーゼと称する前記酵素は織物の油汚れ除去に対して他のリパーゼほどの効果はないと開示されている。最近、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼの三次元構造が解明された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ等（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５６，６１５−６１８）。このクチナーゼが触媒結合部位を覆うらせん状リッドを持たないことが知見された。その代わり、活性部位のセリン残基が溶媒とアクセスし得るように思える。これらの知見は、リパーゼの界面での活性化機構に関する現在の理論を確定するように思える。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼ遺伝子はクローニングされ、配列決定されている（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６，７８８３−７８９２）。ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号（ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓＳｙｓｔｅｍｓ）は、Ｅ．ｃｏｌｉでの前記遺伝子のクローニングや産生を記載している。クチナーゼは、クチナーゼと基質との界面の存在下及び不在下で、水性及び非水性媒質中のエステルの合成や加水分解を効果的に触媒し得る。その一般的な安定性に基づき、このクチナーゼを使用して、洗濯洗剤のような洗浄剤や、化粧品組成物やシャンプーのような他の特定の脂肪溶解製剤を製造することができる。経済的に可能な酵素産生方法も、クチナーゼを含む特定の酵素洗剤組成物も開示されていない。この特徴のため、即ち界面での活性がないために、本明細書中ではクチナーゼを、実質的に界面で活性を示さない脂肪分解酵素と定義する。従って、クチナーゼは、触媒結合部位を覆うらせん状リッドを持たない点が従来のリパーゼと異なる。前述したように、現在のところ、Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼだけが洗剤製品用添加剤としてＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）の商品名で広く市販されている。ＨｅｎｒｉｋＭａｌｍｏｓは、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｙ１９９０，１８３−１８６ページに記載する論文で、洗濯プロセス中のリパーゼ活性は一般に低く、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）も例外でないことは周知であると指摘している。乾燥プロセス中に、織物の含水率が低下すると、酵素は活性を取り戻し、脂肪汚れは加水分解される。次の洗濯サイクル中に、加水分解された物質が除去される。これで、リパーゼ作用が１回目の洗濯サイクルの後は低いのに、以後のサイクルで有意となる理由の説明もつく。従って、洗濯プロセス中に有意な活性を示す脂肪分解酵素が更に必要である。クチナーゼ、特にＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼが明らかな洗濯中（in-the-wash）作用を示すことが知見された。しかしながら、洗濯中脂肪分解活性の改善されたクチナーゼやこのような酵素の産生方法が更に必要である。本発明の目的は、性能、特に洗濯中脂肪分解活性を改善するように改変されたクチナーゼを提供することである。驚くべきことに、真核生物クチナーゼ酵素、特にＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼの脂肪分解活性が、酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変することにより改善され得ることが知見された。発明の定義酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した親クチナーゼのクチナーゼ変異体。好ましくは酵素表面の疎水性を増して、拡大された脂質接触領域を形成した。発明の説明本発明は、クチナーゼ酵素の変異体に関する。前述したように、クチナーゼは、植物（例えば花粉）、細菌及び真菌のような多数の産生源から得ることができる。親クチナーゼとして、即ち組換えＤＮＡ技術による改変のための本発明の出発材料として使用すべきクチナーゼは、真核生物クチナーゼの群の中から選択する。真核生物クチナーゼは、植物（例えば花粉）又は真菌のような種々の産生源から得ることができる。（真核生物）真菌クチナーゼの群は、葉特異性及び茎特異性と特異性の異なる２つのファミリーからなるように思える。葉特異性クチナーゼは、酸性又は中性ｐＨ最適値を有する傾向にあり、茎特異性クチナーゼはアルカリ性ｐＨ最適値を有する傾向にある。アルカリ性ｐＨ最適値を有するクチナーゼは、ヘビィーデューティ織物粉末／液体洗剤のようなアルカリ性ビルダー入り洗剤組成物での使用により適し、酸性又は中性ｐＨ最適値を有するクチナーゼは、ライトデューティ製品又はリンスコンディショナーだけでなく、工業洗浄製品により適している。以下の表Ｉに、４種の異なる茎特異性クチナーゼとそのｐＨ最適値を示す。表Ｉ茎特異性クチナーゼの例 pH最適値 Fusarium solani pisi 9 Fusarium roseum culmorum 10 Rhizoctonia solani 8.5 Alternaria brassicicola（PNBase I） 9 野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉから誘導され得るクチナーゼ（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等，１９８７）が本発明で特に好ましい。このクチナーゼは、特定の洗剤組成物で使用すると明白な“洗濯中”作用を示す。アミノ酸配列がＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼと高度の相同性を示すクチナーゼも、親クチナーゼ、即ち組換えＤＮＡ技術による改変のための本発明の出発材料として適している。Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼがその例である。図１２にこれらのクチナーゼの部分アミノ酸配列を示す。高度の相同性を示すことが知見され得る。遺伝子改変によるＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの改良に代わる方法として、（プロ）クチナーゼをコードするＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａｃＤＮＡに由来する５’及び３’ＤＮＡプローブや、他の脂肪分解酵素の保存配列を認識するプローブを用いて他の真核生物に由来するクチナーゼをコードする遺伝子情報を単離することができ、また必要とあればこれらのプローブを用い、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲ技術を使用してクチナーゼを産生する真核細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）由来のｃＤＮＡを増殖させることができる（例えばＷＯ−Ａ−９２／０５２４９号参照）。このようにして得られたクチナーゼコード化遺伝子を標準的な手順に従ってＥ．ｃｏｌｉにクローニングして発現した後に、クチナーゼの（脂肪）汚れ除去性能を適切な条件下で試験する。このようにして、洗濯中性能の改善された前記クチナーゼの天然変異体を多数得ることができる。更には、これらの天然クチナーゼの配列は、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの別のタンパク質を製造するための優れた基礎となる。 “洗濯中”脂肪分解酵素の活性を決定する因子に関する新たな考えや、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの３Ｄ構造の細心の検査に基づいて、このクチナーゼ、また一般にクチナーゼの性能を組換えＤＮＡ技術で改善するための幾つかの可能性を見出した。クチナーゼは基本的にＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）のようなリパーゼとは異なるので、クチナーゼ／基質（脂質界面）間の相互作用は基質と結合し得る疎水性領域のリッド開放や露出とは異なる原理に基づく（Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５１，４９１−４９４）。本発明は、クチナーゼ分子が凝集し始めるほど大きい疎水性領域を改変クチナーゼの表面上に形成せずに基質との相互作用を改善できるようにクチナーゼを改変できることを示している。疎水面は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンのような疎水性アミノ酸やメチオニン、量は少なくなるがグルタミン酸、グルタミン及びヒスチジンを導入することにより拡大し得る。但し、これらのアミノ酸の疎水性側鎖はクチナーゼの疎水性コアに埋封しないものとする。メチオニンは通常疎水性アミノ酸とみなさないが、特定位置で取り込まれると、クチナーゼ分子表面の疎水性増加に効果的に作用し得る。場合によっては、疎水性アミノ酸の他に帯電アミノ酸を導入して酵素の凝集を回避することが有益であることが知見されている。驚くべきことに、リシンやアルギニンのような陽電荷アミノ酸はクチナーゼ分子の特定位置に取り込まれると、疎水性表面積を拡大し得ることも判明した。これは、リシンやアルギニンに存在するメチレン基がクチナーゼ分子内に埋封されない位置に制限されるからである。リシン又はアルギニンを使用する利点は、メチレン基が露出して、脂質層と相互作用し得る可能性がアミノ基又はイミド基により増大することである。リシンやアルギニンは通常、疎水性アミノ酸とはみなされない。しかしながら、これらの残基の側鎖を形成する原子は、脂質層と相互作用し得る多数の疎水性原子を（メチレン部分中に）含んでいる。実際、リシン残基の疎水性部分の寸法は、バリン残基の寸法に匹敵し得る。クチナーゼの他の固有特性は陽電荷の導入により悪影響を受けるが、これは、脂質層と相互作用するクチナーゼ分子の部分の表面又はこの部分に近い表面に相殺（compensating）陰電荷を導入するか又は前記表面で陽電荷を欠失させることにより相殺され得る。活性部位周辺のＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ表面の疎水性を検査すると、疎水性が最適でないことが分かる。この領域内のこの特定アミノ酸を改良するために、残基をより嵩高い疎水性残基で置換すべきである。脂質分解酵素の構造と機能との関係を更に理解するために、このような幾つかの酵素の三次元（３Ｄ）構造を入念に研究した。これらの構造が文献に記載されていない場合は、構造を分子モデル化技術により誘導した。Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの３Ｄ構造は、Ｘ線結晶法により確定している（Ｂｒａｄｙ等（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４３，７６７−７７０，Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５１，４９１−４９４，Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ等（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１，１５３２−１５４１）。Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐプロテアーゼ様触媒トリアッド部位に属する活性部位Ｓｅｒ１４４を短いらせん状リッド（残基８５−９１）下に埋封する。活性部位Ｓｅｒが埋封されている構造を以下では、酵素の“クローズド”コンホーメーションと称する。油−水界面での吸着がらせん状リッドの移動と関係すると考えられている。この移動によって、活性部位セリンは露出し、活性部位周辺の疎水性領域が増大する。“オープン”コンホーメーションは、油−水界面で吸着される活性化酵素に相当すると考えられる。真菌Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの“クローズド”形態のＣ α−配位は、ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎのＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋに寄託されている。綿密な計算法を使用して、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの全タンパク質配位（主鎖及び側鎖）を生成した。Ｓ．Ｗｏｄａｋ等（１９８９）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２，３３５−３４５に記載されている計算法を適用して、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼのおおよその出発モデルを作成した。この方法は、ＳＹＢＹＬ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＴＲＩＰＯＳａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で実施される。その後、ＢＩＯＳＹＭ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＢＩＯＳＹＭ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実施されるようなエネルギー最小化（ＥＭ）や分子力学（ＭＤ）技術を適用してモデルを修正した。モデルのＥＭ及びＭＤ処理中に、知識をベースとするアプローチを適用した。可能なエネルギー関数の詳細なエネルギー項（terms）や既知の構造基準について、モデルを同時に最適化した。モデル品質を、水素結合の数や品質、二次構造要素での水素結合パターン、ペプチド単位の配向、主鎖二面角の値、芳香族基の相互作用角及びキャビティー寸法のような基準により評価した。更には、不適切に埋封された電荷、極端に露出した疎水性残基、及びジスルフィド架橋のエネルギー的に好ましくない位置についてモデルを検査した。関係する側鎖ロータマー（rotamers）は、Ｐｏｎｄｅｒ＆Ｒｉｃｈａｒｄｓロータマーライブラリーから選択した（Ｐｏｎｄｅｒ等（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３，７７５−７９１）。このライブラリーからの特定側鎖ロータマーの最終的な選択は、前述したような構造基準の評価を基準とした。ＭＤを使用して、側鎖原子を所定位置にアニーリングした。既知の構造特性との一貫性についてモデル構造を入念に検査し、ＥＭ及びＭＤ計算により構造特性を最適化すると、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの確実な全原子モデルを形成することができる。Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの“オープン”コンホーメーションは、Ｃ₁₀−トリグリセリドがリパーゼの活性部位に結合するＭＤコンピューターシミュレーションを適用して得られた。文献に記載のオープン構造のコンホーメーション特性（Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）３１，１５３２−１５４１）と入念に比較すると、このようにして得られた“オープン”コンホーメーションのコンピューターモデルが本質的に同一であることが判明した。真菌Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの既知の３Ｄ構造を出発点とし、ＳＹＢＹＬ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＴＲＩＰＯＳａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＣＯＭＰＯＳＥＲモジュールで実施されるようなルールベースの比較モデル化技術を適用して、Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｇｉｎｏｓａリパーゼの“オープン”及び“クローズド”３Ｄ構造を得た。得られたＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｇｉｎｏｓａリパーゼモデルを、前述したのと同一の計算手順で修正した。真菌Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼ及びＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｇｉｎｏｓａリパーゼの三次元（３Ｄ）構造を比較して、基質の酵素上への吸着に関与するリパーゼ分子の部分を同定した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの既知の３Ｄ構造を出発点とし、ＳＹＢＹＬ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＴＲＩＰＯＳａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＣＯＭＰＯＳＥＲモジュールで実施されるようなルールベースの比較モデル化技術を適用して、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ由来のクチナーゼの３Ｄ構造を得た。得られたＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓクチナーゼモデルを、前述したのと同一の計算手順で修正した。予期に反して、以下の表IIに示す脂肪分解酵素の三次元構造から、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの残基１１６−１２０のＣα−原子を介する最小自乗適合（least-square fit）である特定ベクトル（a particular vector which is the least-square fit through the Cα-atoms）を規定できることが観察された。このベクトルは、基質との相互作用が生じる面と殆ど垂直である。起源の異なる数種の脂肪分解酵素の一次配列を比較すると、例えばＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのアミノ酸残基１１６−１２０が機能相同性の程度が高い領域に位置するように思えることが以下の表IIから分かる。脂肪分解酵素のコンセンサス配列Ｇｌｙ−（Ｈｉｓ／Ｔｙｒ）−Ｓｅｒ−Ｘ− Ｇｌｙを使用して整列し比較することができる。従って、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ分子のアミノ酸残基１１６−１２０を介するベクトルを使用して、洗浄中活性の改善されたクチナーゼを得るためにアミノ酸改変すべきクチナーゼ分子の部分を限定した。以下の表IIIは、表IIに示す脂肪分解酵素について隣接するアミノ酸の構造を示す。本発明の一態様により、酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した、洗浄中脂肪分解活性の改善された改変クチナーゼ酵素を提供する。好ましくは脂質接触領域に隣接する酵素の表面の疎水性を増して、広い脂質接触領域を形成した。１個以上のアミノ酸残基を、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン及びヒスチジンからなる群の中から選択されるアミノ酸残基で置換することにより、クチナーゼの表面疎水性を増すことができる。バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが好ましい。表面疎水性を増すだけでなく、１個以上のリシン又はアルギニン残基を導入して１個以上の陽電荷を導入するようにアミノ酸配列を改変することが有利であることが知見された。改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの残基１１６−１２０のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルと、該ベクトルに垂直で、残基１１７のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を含んでいる面によって規定される分子部分に位置することが好ましい。前述したように、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼの三次元構造は文献に記載されている。この場合、どの改変が本発明の範囲内の改変となるかは明白である。特定クチナーゼの三次元構造が判明していない場合には、脂肪分解酵素のコンセンサス配列Ｇｌｙ−（Ｈｉｓ／Ｔｙｒ）−Ｓｅｒ −Ｘ−Ｇｌｙによって誘導される既知配列のアミノ酸配列（図１２参照）の整列比較によって、本発明の範囲内で適切な改変を行うことが可能である。このプロセスでも分子モデル化技術を使用することが好ましい。本発明に従って産生したクチナーゼ変異体は、洗剤又は洗浄組成物の一部分として使用すると酵素活性で利点を示し得る。特に、前記クチナーゼ変異体は、洗濯プロセスの主サイクル中に改善された洗濯中性能を示すことが判明した。洗濯プロセスの主サイクル中の洗濯中性能とは、酵素を含む洗剤組成物が、濃度、水の硬度、温度に関しては通常の洗濯条件を用い、ヨーロッパタイプの自動洗濯機により、１回の洗濯プロセスで汚れた織物からかなりの量の油汚れを除去できることを意味する。市販されている従来の脂肪分解酵素Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ製）は、同一の条件下で油汚れに対して有意な洗濯中作用を示すとは思えないことに留意すべきである。酵素の油汚れへの洗濯中作用は、以下のアッセイを用いて評価することができる。綿含量が１０％未満の新しいポリエステル試験布を以下に示すような酵素非含有洗剤製品を用いて予洗し、その後十分に濯ぐ。次いで、このような汚れていない布にオリーブ油又は他の適切な加水分解可能な油しみをつける。各試験布（重量約１ｇ）を１００ｍｌのポリスチレンビン内の３０ｍｌの洗液でインキュベートする。洗液は以下に示す洗剤製品を１ｇ／ｌ含んでいる。通常の３０℃主洗濯プログラムを用い、水を一杯に入れたＭｉｅｌｅＴＭＴ洗濯機でビンを３０分間撹拌する。予め３ＬＵ／ｍｌのクチナーゼ変異体を洗液に添加する。対照は酵素を含んでいない。粉末洗剤の組成を以下に示す（重量％）：エトキシル化アルコール非イオン界面活性剤 9.5 硫酸ナトリウム 38.6 炭酸ナトリウム 40.4 ケイ酸ナトリウム（Na₂O：Si₂O=2.4） 7.3 水 4.2 非イオン界面活性剤としては、Ｃ₁₂−Ｃ₁₅エトキシル化アルコール１０．５− １３ＥＯを使用したが、エトキシル化アルコール非イオン界面活性剤の種類は広範囲で変動し得る。洗濯した後に、布を冷水で十分に濯ぎ、冷風式回転乾燥機で乾燥し、残留脂肪量を評価する。これは幾つかの方法で実施することができる。通常の方法は、試験布をＳｏｘｈｌｅｔ抽出装置中、石油エーテルで抽出し、溶媒を留去してから計量し、布の最初の脂肪量の分数としての残留脂肪分パーセンテージを決定することである。更に高感度の第２の方法では、臭素化オリーブ油を用いて、試験布を汚す（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ａ．及びＡｒｋｌａｙ，Ｔ．Ｈ．（１９６８），ＴｅｘｔｉｌｅＲｅｓｅａｒｃｈＪｏｕｒｎａｌ３８，１０５−１０７）。次いで、各試験布を１００ｍｌのポリスチレンビン内の３０ｍｌの洗液でインキュベートする。次いで、通常の３０℃主洗濯プログラムを用い、水を一杯に入れた洗濯機で一連のビンを撹拌する。主洗濯の後、試験布を冷水中で５秒間入念に濯ぐ。濯いだ直後に試験布を冷風式乾燥機で乾燥する。乾燥後、Ｘ線蛍光スペクトル分析で布の臭素含量を測定して脂肪残量を決定することができる。脂肪除去は、以下のように試験布に最初に存在していた量のパーセンテージとして決定することができる。前記式中、臭素_bwは洗濯前の布上の臭素パーセンテージを示し、臭素_awは洗濯後の臭素パーセンテージを示す。酵素活性の別の評価方法は、標準的な技術に従って４６０ｎｍで反射率を測定することからなる。本発明では、改変、突然変異もしくは突然変異体酵素、又は酵素変異体は、突然変異体遺伝子を発現している突然変異微生物によって産生された酵素を意味する。（サイレント突然変異のみを含むもの以外の）突然変異体遺伝子は、直接的又は間接的に誘導され、１カ所以上の場所で対応する親酵素の配列と異なるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子を意味する。親酵素とは、対応する未変化遺伝子の遺伝子産物を意味する。遺伝子のサイレント突然変異とは、遺伝子のポリヌクレオチド配列で生じる変化又は相違のうち、（コドン−アミノ酸関係での縮重（redundancy）のために）前記遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列が変化しない場合を意味する。突然変異体又は突然変異微生物とは、酵素に対する遺伝子が突然変異を起こした親微生物又はその子孫である微生物を意味する。微生物のこのような突然変異は、（ａ）既に親微生物に存在している対応遺伝子（親遺伝子）を突然変異させるか、又は（ｂ）他の起源から直接又は間接的に得た対応遺伝子を突然変異微生物となるべき微生物に移入（導入）する（例えば遺伝子を突然変異させる）ことにより実施され得る。宿主微生物は、その突然変異体遺伝子又は他の起源の移入遺伝子が一部分を構成している微生物である。一般に、宿主微生物は、株又は種源又は血統が親微生物と同一であっても異なってもよい。本発明は特に、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号（ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓＳｙｓｔｅｍｓ）に開示されているＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ、またＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼの突然変異体形態を提供する。これらのクチナーゼ変異体は、ｒＤＮＡ技術で得た又は製造した遺伝子を含むｒＤＮＡ改変微生物により産生され得る。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの残基１１６−１２０のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルと、該ベクトルに垂直で、残基１１７のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を含んでいる面とによって規定される分子部分に位置するアミノ酸残基が同定されると、同定した１つ以上の位置に適切なアミノ酸を導入することにより、例えばＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ又はその相同体の配列に関する突然変異Ｎ７１２Ｋのように、アミノ酸配列を改変することができる。当業者には自明の通り、このような改変はクチナーゼの構造に影響する。明らかに、活性部位周辺の静電荷にそれほど影響しない改変が好ましい。本発明者らは酵素のコンホーメーションの不可避的な歪みと酵素活性増加の利点とのバランスの必要レベルの理解を深めた。これにより、高い成功率で有望なクチナーゼ変異体を予測して、製造することができる。以下の表IVや明細書の他の箇所では、ペプチド配列のアミノ酸やアミノ酸残基を以下に示す１文字及び３文字の略字で示す。表IV Ａ＝Ａｌａ＝アラニンＶ＝Ｖａｌ＝バリンＬ＝Ｌｅｕ＝ロイシンＩ＝Ｉｌｅ＝イソロイシンＰ＝Ｐｒｏ＝プロリンＦ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニンＷ＝Ｔｒｐ＝トリプトファンＭ＝Ｍｅｔ＝メチオニンＧ＝Ｇｌｙ＝グリシンＳ＝Ｓｅｒ＝セリンＴ＝Ｔｈｒ＝トレオニンＣ＝Ｃｙｓ＝システインＹ＝Ｔｙｒ＝チロシンＮ＝Ａｓｎ＝アスパラギンＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミンＤ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシンＲ＝Ａｒｇ＝アルギニンＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン本明細書では、タンパク質のアミノ酸配列に存在する突然変異、従って突然変異体タンパク質自体は、突然変異の位置及び種類により以下の略記法で、即ち突然変異を受けた元のアミノ酸残基のアイデンティティー、突然変異の（配列番号による）部位、及び元のアミノ酸残基にとって代わるアミノ酸残基のアイデンティティーにより記載され得る。余分のアミノ酸が配列に挿入されると、その位置は、正規の配列又は基準配列の挿入直前の残基の番号に１個以上の下付き文字を付けて示す。例えば、１７２位のアスパラギンがリシンで置換されたことを特徴とする突然変異体はＡｓｎ１７２Ｌｙｓ又はＮ１７２Ｋで表す。（仮に）アスパラギンの後にプロリンのような別のアミノ酸残基を挿入すると、Ａｓｎ１７２ＡｓｎＰｒｏ又はＮ１７２ＮＰで表すか、１７２ａ位を示す挿入残基を用いて＊１７２ａＰとして表す。（仮に）同じ位置でアスパラギンが欠失すると、Ａｓｎ１７２＊又はＮ１７２＊で表す。＊は、実際の欠失によって存在しないとみなされる場合は欠失を意味し、この位置に残基を有する他の配列又は基準配列との単なる比較又は相同性によって存在しないとみなされる場合はアミノ酸残基の不在を意味する。複数の突然変異は＋記号で分けて表す。例えばＮ１７２Ｋ＋Ｓ５４Ｉ＋Ａ１２８Ｆは、アミノ酸配列の前記３つの位置の各々で前述したような置換による３つの突然変異を有する突然変異体タンパク質を表す。所望とあれば、以下の表に示す突然変異を組み合わせてもよい。以下の表Ｖは、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼの配列に基づく本発明のクチナーゼ変異体の特定の有用な例を示している。本発明の好ましい変異体は、ＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのＡ８５Ｆ、Ｎ１７２Ｋ及びＥ２０１Ｋ、並びに他のクチナーゼの対応変異体である。このような対応クチナーゼ変異体の一例は、例えばＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓクチナーゼに由来するＡｓｐ１７２Ｌｙｓ、即ちＤ１７２Ｋ変異体である。本発明の別の態様によれば、本発明のクチナーゼ変異体の産生方法を提供する。天然クチナーゼを産生する微生物は通常植物病原体であり、これらの微生物は改変クチナーゼ遺伝子用宿主細胞としての作用にはあまり適さない。従って、ｒＤＮＡ法のために好ましい宿主微生物内に移入することのできるｒＤＮＡベクターに、改変（プロ）クチナーゼをコードする遺伝子を取り込んだ。このため、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号に記載のｒＤＮＡベクターと本質的に同様のｒＤＮＡベクターを使用することができる。天然クチナーゼを産生する微生物は、発酵法にはあまり適さない。発酵法の収率を改善するため、改良されたクチナーゼをコードする遺伝子を、安い培地で急速増殖し得、また多量のクチナーゼの合成や分泌が可能な微生物に移入すべきである。本発明のこのような適したｒＤＮＡ改変（宿主微生物）は、細菌（とりわけＢａｃｉｌｌｉ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又は下等な真核生物（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び関連種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ及び関連種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及び関連種、並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種）である。好ましい宿主微生物は下等な真核生物である。何故ならば、これらの微生物は、発酵法で非常によく酵素を産生分泌し、クチナーゼ分子を解糖し得るからである。グリコシル化は、洗浄系でのクチナーゼの安定性に寄与し得る。本発明は更に、改変真核生物クチナーゼ遺伝子（例えばＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来の遺伝子）をクローニングｒＤＮＡベクターに導入して得られる遺伝子材料、及び新しい宿主細胞の形質転換やクチナーゼ変異体遺伝子の新しい宿主細胞での発現のための前記遺伝子材料の使用を提供する。前記クチナーゼ変異体をコードするｒＤＮＡ技術によって製造又は改変されるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むｒＤＮＡベクター、並びに前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ｒＤＮＡベクターを含むｒＤＮＡ改変微生物も本発明で提供する。本発明は更に、改変真核生物クチナーゼをコードする対応ポリヌクレオチド（例えば成熟クチナーゼ変異体をコードする塩基配列を有し、最終翻訳コドンの次に終結コドンが来るポリヌクレオチドであるが、場合によっては成熟クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナーゼ変異体のプレプロ又はプロ配列をコードするヌクレオチド配列を有する）を提供する。このようなポリヌクレオチドでは、産生源の微生物から誘導される、クチナーゼをコードするヌクレオチド配列を、少なくとも１個のコドン、好ましくはできるだけ多くのコドンが‘サイレント’突然変異の対象に対し、新しい宿主に好まれるコドンである、同等のアミノ酸残基をコードするコドンを形成するように改変することにより、前記宿主の細胞内での使用時に、安定性の改善された導入遺伝子用ｍＲＮＡを提供することができる。プロ又は成熟クチナーゼをコードするヌクレオチド配列の上流には、特定宿主に適したシグナル又は分泌配列をコードするヌクレオチド配列が位置し得る。従って、本発明の一実施態様は、クチナーゼ変異体又はその前駆体をコードするヌクレオチド配列が内部に挿入されたｒＤＮＡベクターに関する。ヌクレオチド配列は例えば、以下の配列から誘導され得る：（ａ）（例えばＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉで産生したプロプレ又はプロクチナーゼの元のアミノ酸配列をコードする）天然ヌクレオチド配列；（ｂ）新しい宿主に好まれるコドンと、新しい宿主で安定なメッセンジャーＲＮＡを生じさせるヌクレオチド配列とからなり、依然として元のアミノ酸配列をコードする化学合成ヌクレオチド配列；（ｃ）アミノ酸配列は異なるが、洗剤系で優れた安定性及び／又は活性を示す、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼをコードする前項ａ又はｂに記載したヌクレオチド配列の一方に由来する遺伝子工学的に作成されたヌクレオチド配列。要するに、好ましい宿主のひとつで前述したようなクチナーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を指令し得るｒＤＮＡベクターは好ましくは、以下の成分を含んでなる：（ａ）成熟クチナーゼ、又はプレクチナーゼ、又は（選択される宿主細胞にとって好ましい）分泌シグナルのすぐ下流でプレ配列の少なくとも一部分が除去された対応プレクチナーゼをコードする二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ。但し、翻訳されるべき遺伝子の部分がコドンＡＴＧで開始していない場合、ＡＴＧコドンを前に置くべきである。また、遺伝子の翻訳部分は常に適切な終結コドンで終了すべきである；（ｂ）クチナーゼをコードするｄｓＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の上流に位置する、（選択される宿主微生物に適した）発現レギュロン；（ｃ）クチナーゼをコードするｄｓＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の下流に位置する、（選択される宿主微生物に適した）ターミネーター配列；（ｄ１）選択される宿主のゲノム内へのｄｓＤＮＡの組み込みを容易にするヌクレオチド配列、又は（ｄ２）選択される宿主で適した複製起点；（ｅ１）場合によっては（栄養要求性）選択マーカー。栄養要求性マーカーは、栄養要求性マーカーのコード領域と欠陥プロモーターとからなり得る；（ｅ２）場合によっては、選択される宿主での一前駆体形態のクチナーゼの成熟及び／又は分泌に関与するタンパク質をコードするｄｓＤＮＡ配列。このようなｒＤＮＡベクターは更に、前述したようなポリヌクレオチドの上流及び／又は下流に、クチナーゼの機能発現を容易にする別の配列を有し得る。栄養要求性マーカーは、栄養要求性マーカーのコード領域と、欠陥プロモーター領域とからなり得る。本発明の他の実施態様は、前述の種々のクチナーゼ変異体の一種の発酵による産生である。このような発酵は、通常のバッチ発酵であっても、フェドバッチ（ fed-batch）発酵であっても、連続発酵であってもよい。使用すべき方法の選択は、宿主株や（公知の）好ましい下流処理（down stream processing）法に依存する。従って、本発明は更に、本明細書に記載するようなクチナーゼ変異体の産生方法を提供し、本方法は、クチナーゼのアミノ酸配列に作用する少なくとも１つの突然変異をもたらすｒＤＮＡ技術により製造した遺伝子を含むｒＤＮＡ改変微生物を発酵培養して、クチナーゼの活性を対応する親酵素と比べて改善し、微生物により産生されたクチナーゼを発酵ブロスと分離するか又は微生物細胞を発酵ブロスと分離することによりクチナーゼ変異体調製物を製造し、分離した細胞を破壊し、物理的又は化学的な濃縮又は精製法により前記ブロスから又は前記細胞からクチナーゼ変異体を濃縮又は部分精製する段階からなる。クチナーゼ変異体が微生物によって発酵ブロス内に分泌され、酵素が濾過又は遠心分離による細胞除去後にブロスから回収されるような条件を選択することが好ましい。場合によっては、次いで、クチナーゼ変異体を所望の程度に濃縮、精製することができる。これらの発酵法自体は微生物の特殊性を除けば、既知の発酵技術や、通常使用されている発酵／下流処理装置を基本とし得る。ｒＤＮＡ技術によりクチナーゼ変異体を産生し得る改変微生物の産生方法を更に本発明で提供する。本方法は、微生物内に導入されるクチナーゼ変異体をコードする遺伝子が５’末端で、宿主微生物のシグナル又は分泌配列として機能的な（改変）プレ配列をコードする遺伝子断片と融合することを特徴とする。本発明の別の態様では、クチナーゼ変異体遺伝子を含み、該遺伝子によってコードされるクチナーゼ変異体を産生し得るｒＤＮＡ改変微生物を提供する。ｒＤＮＡ改変微生物では、天然クチナーゼをコードする遺伝子が元々存在するならば、これを除去（例えば他の構造遺伝子で置換）することが好ましい。本発明の別の態様では、本発明のクチナーゼ変異体を含む酵素洗剤組成物を提供する。このような組成物は、クチナーゼ変異体及び通常洗剤系で使用されている他の成分（例えば洗剤組成物用添加剤、全配合洗剤及び例えばヨーロッパ特許出願公開第２５８０６８号に記載されいている既知の種類の洗浄組成物の成分類）を組み合わせたものである。特に、前記組成物は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜５０重量％の洗浄力ビルダーと、０．１〜５０重量％の活性剤系とを含んでなり得る。活性剤系は、１種以上のアニオン界面活性剤を０〜９５重量％、１種以上の非イオン界面活性剤を５〜１００重量％含んでなる。このような洗剤組成物の他の成分は、例えば英国特許出願公開第１３７２０３４号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、米国特許第３９５０２７７号、米国特許第４０１１１６９号、ヨーロッパ特許出願公開第１７９５３３号（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）、ヨーロッパ特許出願公開第２０５２０８号及びヨーロッパ特許出願公開第２０６３９０号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、特開昭６３− ０７８０００号（１９８８）、１９８８年６月の調査レポート（Research Discl osure）２９０５６号や、本明細書で引用した幾つかの明細書の各々に記載されているような多数の既知の種類のいずれであってもよい。前記特許出願明細書は全て、参考として本明細書に組み入れる。本発明のクチナーゼ変異体は、任意の適切な形態で、即ち酵素の顆粒組成物、溶液もしくはスラリーの形態で、又は担体材料（例えばヨーロッパ特許出願公開第２５８０６８号に記載の材料や、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ製Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）及びＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標））と共に洗剤組成物に有効に添加することができる。クチナーゼ変異体の添加量は、洗剤組成物１ｇ当たり例えば１０〜２０，０００ＬＵ、好ましくは５０〜２，０００ＬＵと広範囲で選択することができる。本明細書でのＬＵ、即ちリパーゼ単位は、ヨーロッパ特許出願公開第２５８０６８号（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）で定義されている通りである。更に存在し得る他の酵素の場合も同様の規定を準用する。ヨーロッパ特許出願公開第４０７２２５号も参照されたい。ｐＩが１０未満のプロテアーゼを選択し、このプロテアーゼをクチナーゼと共に前記洗剤組成物に存在させると有利であり得る。ヨーロッパ特許出願公開第２７１１５４号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、このようなプロテアーゼを多数記載している。クチナーゼ変異体と共に使用されるプロテアーゼは、場合によっては、例えばＢＰＮ’型又は文献に開示されている多数の型のサブチリシンを包含し得る。これらのうち数種は既に、例えばヨーロッパ特許出願公開第１３０７５６号又はヨーロッパ特許出願公開第２５１４４６号（共にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ）；米国特許第４７６００２５号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ヨーロッパ特許出願公開第２１４４３５号（Ｈｅｎｋｅｌ）；ＷＯ−Ａ−８７／０４６６１号（Ａｍｇｅｎ）；ＷＯ−Ａ−８７／０５０５０（Ｇｅｎｅｘ）；Ｔｈｏｍａｓ等（１９８６／５）Ｎａｔｕｒｅ３１６，３７５−３７６及び（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３，８０３−８１３；Ｒｕｓｓｅｌ等（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２８，４９６−５００に記載の突然変異体プロテアーゼのように洗剤用途で提案されている。以下の実施例で本発明を更に詳しく説明する。核酸物質の遺伝子操作や分析で使用した全ての技術は、特に明記しない限り本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）が記載した方法で実施した。添付図面の説明：図１Ａ：合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子のカセット１及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。図１Ｂ：合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子のカセット２及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。図１Ｃ：合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子のカセット３及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。図１Ｄ：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。クチナーゼのプレ配列、プロ配列及び成熟配列を示す。クローニングやオリゴヌクレオチドトランジションに使用する部位も示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。図２：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプロクチナーゼをコードする配列を、Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡプレ配列の誘導体をコードする配列と連結するための合成ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。クローニングで使用する制限酵素部位やリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を示す。コードされたｐｈｏＡシグナル配列やクチナーゼ遺伝子の一部のアミノ酸配列も１文字コードで示す。図３：インベルターゼプレ配列及び成熟Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのコード配列の融合点をコードするカセット８、ＳａｃＩ−ＢｃｌＩ断片のヌクレオチド配列。図４：ｐＵＲ２７４０由来の０．２ｋｂＳａｌＩ−ＮｒｕＩの欠失によって得られたプラスミドｐＵＲ２７４１は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と植物α−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物とを含んでなるＥ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクターである。図５：プラスミドｐＵＲ７２１９は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と成熟Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼをコードする領域との融合物とを含んでなるＥ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクターである。図６：プラスミドｐＵＲ２７４０は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と植物α−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物とを含んでなるＥ．ｃｏｌｉ− Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクターである。図７：ｅｘｌＡプレ配列及び成熟Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのコード配列の結合の型が異なるカセット５、６及び７のヌクレオチド配列。図８：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉゲノムＤＮＡの５．３ｋｂＳａｌＩ断片をｐＵＣ１９のＳａｌＩ部位に挿入して得られたプラスミドｐＡＷ１４Ｂ。図９：ｐＡＷ１４ＢのｅｘｌＡ読み取り枠を含むＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片を、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼコード配列を含むＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片で置換して得られたプラスミドｐＵＲ７２８０。従って、プラスミドｐＵＲ７２８０は、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉプロモータ及びターミネーターの制御下にあるＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼ遺伝子を含んでいる。図１０：Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓａｍｄＳ及びＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉｐｙｒＧの両方の選択マーカーをｐＵＲ７２８０に導入して得られたプラスミドｐＵＲ７２８１。図１１：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ分子の概略図。図１２：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼの部分アミノ酸配列であって、残基の位置を３Ｄ構造で示す。図１３：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋの洗濯中作用。図１４：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナーゼ変異体Ｅ２０１Ｋの洗濯中作用。図１５：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナーゼ変異体Ａ８５Ｆの洗濯中作用。参考文献実施例１Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成遺伝子の構築本質的にヨーロッパ特許出願公開第４０７２２５号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に記載の方法に従って、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ− クチナーゼをコードする合成遺伝子を構築した。発表されているＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて（Ｓｏｌｉｄａｙ等（１９８４）及びＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号，ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ− プロ−クチナーゼポリペプチドをコードする領域を含む完全合成ＤＮＡ断片を設計した。この合成クチナーゼ遺伝子は、元のＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ遺伝子のヌクレオチド配列に比べて幾つかのヌクレオチド変化を含み、これにより制限酵素認識部位が、コードされたアミノ酸配列に影響することなく遺伝子内の好都合な位置に導入されている。全合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図１Ｄに示す。合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドから開始する３個の異なるカセットを集合させて合成クチナーゼ遺伝子を構築した。各合成ＤＮＡカセットは、最初にＥｃｏＲＩ部位を、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えている。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０ＡＤＮＡ合成機を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。各カセットを構築するため、以下に示す手順を用いた。所定のカセットを構成する等モル量（５０ｐｍｏｌ）のオリゴヌクレオチドを標準的な技術に従って混合し、５’末端でリン酸化し、アニールし、結合した。得られた二本鎖ＤＮＡ分子の混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でサイズ分画し、電気溶出でゲルから回収した。得られた合成ＤＮＡカセットをｐＵＣ９の２．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と結合し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに形質転換した。適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて幾つかのクローンのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩインサートを両方向で完全に配列決定し、合成カセットの配列を確定した。この手順を用いて、ｐＵＲ７２０７（カセット１を含む、図１Ａ）、ｐＵＲ７２０８（カセット２を含む、図１Ｂ）及びｐＵＲ７２０９（カセット３を含む、図１Ｃ）を構築した。最後に、ｐＵＲ７２０７の２．９ｋｂＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片をｐＵＲ７２０８の０．２ｋｂＡｐａＩ−ＮｈｅＩ断片及びｐＵＲ７２０９の０．３ｋｂＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と結合させて、合成クチナーゼ遺伝子を作成し、ｐＵＲ７２１０を得た。このプラスミドは、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉの完全プレ−プロ−クチナーゼをコードする読み取り枠を含んでいる（図１Ｄ）。実施例２ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ（プロ）クチナーゼの発現合成クチナーゼ遺伝子を用いて、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号（ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）に記載のものと機能的に同様のＥ．ｃｏｌｉ用発現ベクターを構築した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプロクチナーゼをコードする合成遺伝子の部分の前に、適切なＥ．ｃｏｌｉ発現シグナル、即ち（ｉ）誘導性プロモーター、（ii）リボソーム結合部位、及び（iii ）翻訳開始コドンを提供し、またプロクチナーゼの細胞質膜からの送出に必要な情報を提供するシグナル配列が位置する構築物を設計した。Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡシグナル配列の誘導体（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ等、１９８３）を合成クチナーゼ遺伝子のプロ配列と融合するための合成リンカーを設計した（図２参照）。シグナルペプチドの開裂やプロクチナーゼの分泌を最適化するため、このリンカーのヌクレオチド配列は、ｐｈｏＡシグナル配列の３個のＣ末端アミノ酸残基（Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ）をＡｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａに変換し、クチナーゼプロ配列のＮ末端アミノ酸残基（Ｌｅｕ１、図１Ｄ参照）をＡｌａに変換するようなものであった。この構築により、クチナーゼのペリプラスム間隙内への分泌は確実である（ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号参照、ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）。このような構築物を得るため、クチナーゼプレ配列とプロ配列の一部を含む６９ｂｐＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片をｐＵＲ７２１０から取り出し、Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡプレ配列の誘導体及びクチナーゼプロ配列の改変Ｎ末端アミノ酸残基を提供する合成ＤＮＡリンカー配列（ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片）で置換した（図２）。得られたプラスミドをｐＵＲ７２５０と名付け、これを使用して、リボソーム結合部位及びｐｈｏＡシグナル配列コード領域に融合したプロクチナーゼコード領域を含む０．７ｋｂＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離した。この断片をｐＭＭＢ６７ＥＨの８．９ｋｂＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｆｕｒｓｔｅ等、１９８６）と結合して、ｐＵＲ７２２０を得た。このプラスミドでは、プロクチナーゼをコードする合成遺伝子をｐｈｏＡシグナル配列の変種と融合して、誘導性ｔａｃプロモーターの制御下に置く。ｐＵＲ７２２０を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６を、０．０１７ＭＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０１７ＭＫ₂ＨＰＯ₄ １２ｇ／ｌバクト−トリプトン２４ｇ／ｌバクト−酵母抽出物０．４％グリセロール（ｖ／ｖ）からなる０．５リットルのＩＸＴＢ培地（Ｔａｒｔｏｆ及びＨｏｂｂｓ，１９８８）を含む２リットルの振盪フラスコで増殖させた。培養物を強く振盪しながら（１５０ｒｐｍ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下、２５°Ｃ〜３０℃で一晩増殖させた。６１０ｎｍでのＯＤは１０〜１２であった。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して、最終濃度を１０μＭとし、更に１２〜１６時間インキュベーションを継続した。培養物から取り出した試料の分析判定で、生じた脂肪分解活性の量に更なる顕著な増加が観察できなかったときには、細胞を遠心分離で収集し、最初の培養容量の２０％スクロース含有緩衝液に０℃で再度懸濁させた。細胞を遠心分離で収集し、最初の培養容量の氷冷水に再度懸濁させると、浸透圧ショックで細胞が溶解した。細胞破片を遠心分離で除去し、無細胞抽出物に酢酸を添加してｐＨ４．８に酸性化し、４℃で一晩放置し、得られた沈殿物を除去した。この段階で、無細胞抽出物の超濾過／凍結乾燥により、殆ど内在性リパーゼを含まない純度７５％以上のクチナーゼ調製物が得られた。あるいは、ＳＰ−ｓｅｐｈａｄｅｘ上に酸性化無細胞抽出物を負荷し、酵素をｐＨ８．０の緩衝液で溶出し、濃アルカリ性溶液を適量のＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＷｈａｔｍａｎＤＥ−５２）に通し、ＤＥＡＥ通過液を直接Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに通すことによって、クチナーゼを均質になるまで精製（純度９５％以上）することができる。塩勾配で溶出すると、典型的には７５％以上の総収率で、均一なクチナーゼ調製物が得られた。実施例３Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体をコードする遺伝子の構築実施例１に記載のＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼの合成遺伝子を使用して、コード化したアミノ酸配列に変化を含む変異体遺伝子を構築した。この構築では、完全合成クチナーゼ遺伝子を構成する３個のカセットの構築について実施例１で説明したのと本質的に同じ方法を適用した。例えば、突然変異を起こすべき位置、即ちＡｓｎ１７２のコード化トリプレットをカバーする２個のオリゴを除いて、実施例１に記載したのと同じオリゴヌクレオチドを用いて新種のカセット３を作成して、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋをコードする遺伝子を構築した。代わりには、２個の新しい合成オリゴを使用した。これらのオリゴは、変異体配列を含んでいるが、これ以外は置換前のオリゴと同一である。特に、ＣＵＴＩ３ＤＭＨ及びＣＵＴＩ３ＫＭＨの代わりにそれぞれＣＵＴＩ３ＤＭＨ変異体（ＡＡＴの代わりにＡＡＧを含む）及びＣＵＴＩ３ＫＭＨ変異体（ＡＴＴの代わりにＣＴＴを含む）を取り込んで、変異Ｎ１７２Ｋを含む新しいカセット３を作成した（図１Ｃ参照）。本質的に実施例１に記載した方法で新しいカセット３をクローニングして配列決定し、変異を含む０．３ｋｂＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片をｐＵＲ７２１０の対応断片と置換してｐＵＲ７２５７（Ｎ１７２Ｋ）を得た。このプラスミドに由来する０．６ｋｂＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用して、ｐＵＲ７２２０の対応断片を置換し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＵＲ７２２４（Ｎ１７２Ｋ）を得た。このＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６に形質転換した。形質転換細胞を実施例２に記載した方法で増殖させ、変異体プロクチナーゼ酵素を本質的に実施例２に記載した方法で回収し、精製した。ＣＵＴＩ３ＦＭＨ及びＣＵＴＩ３ＭＭＨ（図１Ｃ参照）の代わりにそれぞれＣＵＴＩ３ＦＭＨ変異体（ＧＡＧの代わりにＡＡＧを含む）及びＣＵＴＩ３ＭＭＨ変異体（ＣＴＣの代わりにＣＴＴを含む）を取り込む新種のカセット３を作成することにより、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ｅ２０１Ｋをコードする遺伝子を同様に構築した。ＣＵＴＩ２ＣＭＨ及びＣＵＴＩ２ＩＭＨ（図１Ｂ参照）の代わりにそれぞれＣＵＴＩ２ＣＭＨ変異体（ＧＣＴの代わりにＴＴＣを含む）及びＣＵＴＩ２ＩＭＨ変異体（ＡＧＣの代わりにＧＡＡを含む）を取り込む新種のカセット２を作成することにより、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ａ８５Ｆをコードする遺伝子を同様に構築した。実施例４ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの発現ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ合成遺伝子の発現のために、成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子の前に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼのプレ配列（Ｔａｕｓｓｉｇ及びＣａｒｌｓｓｏｎ，１９８３）及び強い誘導性ｇａｌ７プロモーター（Ｎｏｇｉ及びＦｕｋａｓａｗａ，１９８３）が存在する発現ベクターを構築した。このような融合のための合成クチナーゼ遺伝子を産生するため、インベルターゼプレ配列のコード配列を、成熟クチナーゼのＮ末端のコード配列と融合するアダプター断片を合成した。この断片を、本質的に実施例１に記載したようなｐＵＣ９のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩカセットとして作成して（カセット８、図３参照）、ｐＵＲ７２１７を得た。プラスミドｐＵＲ７２１０及びｐＵＲ７２１７をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１１０（ｄａｍメチラーゼ活性の欠失した株）に形質転換し、ｐＵＲ７２１７の２．８ｋｂＢｃｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＲ７２１０の０．６ｋｂＢｃｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結することにより、成熟クチナーゼポリペプチドのコード化ヌクレオチド配列がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼプレ配列コード領域の一部と融合したｐＵＲ７２１８を得た。ｐＵＲ２７４０の８．９ｋｂＮｒｕＩ−ＳａｌＩ断片を単離し、ＳａｌＩ突出末端をクレノーポリメラーゼで充填し（fill in）、断片を再度円形にして（r ecircularization）、ｐＵＲ２７４０（Ｖｅｒｂａｋｅｌ，１９９１，図６参照）から発現ベクターｐＵＲ２７４１（図４参照）を誘導した。ｐＵＲ２７４１の７．３ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＲ７２１８の０．７ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、ｐＵＲ７２１９を得た（図５参照）。場合によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｐｏＩＩＩターミネーターをクチナーゼ遺伝子の後ろのＨｉｎｄＩＩＩ部位に置くことができるが、これはクチナーゼ遺伝子の効果的な発現には重要ではないことが判明した。Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルプラスミドｐＵＲ７２１９は、２μプラスミドを保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ｃｉｒ⁺株）の複製起点と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｌｅｕ２^-株での高コピー数形質転換細胞の選択を可能とするプロモーター欠失種のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＬｅｕ２遺伝子と、強い誘導性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｇａｌ７プロモーターの制御下にあってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼプレ配列に操作的に結合したＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの成熟部分をコードする合成遺伝子とを含んでいる。酵母細胞の電気穿孔法の標準的なプロトコルを用いて、株ＹＴ６−２−ｌＬ（Ｅｒｈａｒｔ及びＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，１９８１）と同一のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５０（ａ，ｃｉｒ⁰ ，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａｎ１）を、２μのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプラスミドとｐＵＲ７２１９との等モル混合物で同時形質転換した。ロイシン原栄養性について形質転換細胞を選択し、幾つかの形質転換細胞から全ＤＮＡを単離した。全ての形質転換細胞は、２μプラスミド及びｐＵＲ７２１９の両方を含むように思え、このことは、ｐＵＲ７２１９上に含まれるプロモーター欠失種のｌｅｕ２遺伝子が、２μ酵母プラスミドと共存するために高いコピー数で存在すると、ｌｅｕ２欠失株を単に機能的に補い得ることを示している。完全培地で４０世代以上培養し、次いで固形の選択及び完全培地でレプリカ平板培養して１個の形質転換細胞をｐＵＲ７２１９について処理（cure）し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１（ａ，ｃｉｒ⁺，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａｎ１）を得た。ｐＵＲ７２１９を保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１を、 −アミノ酸を含まない酵母窒素塩基（YNB） 6.7g/l -ヒスチジン 20mg/l -グルコース 20g/l からなる０．２リットルのＭＭ培地を含む１リットルの振盪フラスコ内で増殖させた。培養物を強く振盪（１５０ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩増殖させた。６１０ｎｍでのＯＤは２〜４であった。細胞を遠心分離により収集し、２リットルの振盪フラスコ内で、 −酵母抽出物 10g/1 −バクトペプトン 20g/1 −ガラクトース 50g/1 からなる１リットルのＹＰＧＡＬ培地に再度懸濁させ、更に１２〜１６時間インキュベーションを継続した。一定の間隔で、試料を培養物から取り出し、遠心分離にかけてバイオマスを除去した。オリーブ油を基質として用い、上清のクチナーゼ活性を滴定法で分析した。各試料に対し、５．０ｍｌのリパーゼ基質（Ｓｉｇｍａ、リパーゼの基質としてオリーブ油を含む）と２５．０ｍｌの緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ９．０，４０ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＣａＣｌ₂ ）の撹拌混合物に１００〜２００μｌの濾液を添加した。３０℃でアッセイを実施し、ＭｅｔｔｌｅｒＤＬ２５滴定装置を用い、０．０５ＭＮａＯＨによるｐＨ９．０までの自動滴定により脂肪酸の放出を測定した。滴定液量対時間の曲線が得られた。試料中に含まれるリパーゼ活性の量を、この曲線の最大勾配から計算した。１酵素活性単位は、前述の条件下で、１分間でオリーブ油から１μｍｏｌの脂肪酸を放出させる酵素の量として定義する。このような測定法は、当業者には公知である。クチナーゼ活性の発生量が増加しなくなると、細胞を遠心分離にかけて除去し、無細胞抽出物に酢酸を加えてｐＨ４．８に酸性化して、クチナーゼを実施例１に記載した方法で回収した。実施例５Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体の発現Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体Ｎ１７６Ｋを以下の方法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させた。ｐＵＲ７２５７（Ｎ１７２Ｋ）の０．５ｋｂＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用してｐＵＲ７２１８の類似断片を置換し、変異を含む遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシグナル配列をコードする配列に操作的に融合したｐＵＲ７２２８（Ｎ１７２Ｋ）を得た。ｐＵＲ２７４１の７．０ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＲ７２２８（Ｎ１７２Ｋ）の０．７ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結して、ｐＵＲ７２３４（Ｎ１７２Ｋ）を得た。このプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１に形質転換した。得られた形質転換細胞を実施例４に記載した方法でインキュベートし、産生した変異体酵素を実施例４及び１に記載した方法で培養ブロスから回収した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体Ｅ２０１Ｋを、実施例３に記載したように、クチナーゼ変異体Ｅ２０１ＫをコードするＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の変異体を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで同様に産生した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体Ａ８５Ｆを、実施例３に記載したように、クチナーゼ変異体Ａ８５ＦをコードするＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の変異体を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで同様に産生した。実施例６ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの発現Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉでの合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の発現のために、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成遺伝子をＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉの強い誘導性ｅｘｌＡプロモーター（Ｍａａｔ等，１９９２，ｄｅＧｒａａｆｆ等１９９２）の制御下に置いた発現ベクターを構築した。プラスミドｐＡＷ１４Ｂからプレ−プロ−クチナーゼ発現プラスミド（ｐＵＲ７２８０）を構築した。前記ｐＡＷ１４Ｂは、１９９０年５月３１日にＣＢＳ２３７．９０の番号でＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９で寄託されたものであり、０．７ｋｂのエンドキシラナーゼII （ｅｘｌＡ）遺伝子が２．５ｋｂの５’フランキング配列及び２．０ｋｂの３’ フランキング配列と共に存在する約５．３ｋｂのＳａｌＩ断片を含んでいる（図８）。ｐＡＷ１４Ｂで、ｅｘｌＡコード化領域をプレ−プロ−クチナーゼコード化領域で置換した。ｅｘｌＡ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）を含むＢｓｐＨＩ部位（５’−ＴＣＡＴＧＡ−３’）及びｅｘｌＡ遺伝子の終結コドン（ＴＡＡ）を含むＡｆｌＩＩ部位（５’−ＣＴＴＡＡＧ−３’）は、ｐＵＲ７２８０の構築を容易にした。以下の方法で構築した：ｐＡＷ１４Ｂ（７．９ｋｂ）をＢｓｐＨＩで部分的に切断し、線状化プラスミド（７．９ｋｂ）をアガロースゲルから単離した。その後、単離した７．９ｋｂ断片を、問題のＢｓｐＨＩ部位の数ヌクレオチド下流で切断するＢｓｍＩで切断して、他のＢｓｐＨＩ部位で線状化したプラスミドを除去した。断片をアガロースゲルで分離し、７．９ｋｂＢｓｐＨＩ−ＢｓｍＩ断片を単離した。これをＡｆｌＩＩで部分的に切断し、得られた７．２ｋｂＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片を単離した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコードする全読み取り枠を含むｐＵＲ７２１０の０．７ｋｂＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片を、ｐＡＷ１４Ｂの７．２ｋｂＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片と連結して、ｐＵＲ７２８０を得た。その後、構築したベクター（ｐＵＲ７２８０）を従来の同時形質転換技術によりカビ（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉ等）に移植することができ、次いでプレ−プロ−クチナーゼ遺伝子をエンドキシラナーゼIIプロモーターの誘導により発現させることができる。構築したｒＤＮＡベクターは更に、従来の選択マーカー（例えばａｍｄＳ又はｐｙｒＧ、ヒグロマイシン等）を備えていてもよく、またカビを得られたｒＤＮＡベクターで形質転換して、所望のタンパク質を産生してもよい。一例としては、ａｍｄＳ及びｐｙｒＧ選択マーカーを発現ベクターに導入してｐＵＲ７２８１（図１０）を産生した。このため、合成オリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）を用いて（プレ−プロ−クチナーゼ遺伝子のＡＴＧコドンの１．２ｋｂ上流に存在する）ＥｃｏＲＩ部位をＮｏｔＩ部位に変換してＮｏｔＩ部位を生成して、ｐＵＲ７２８２を産生した。全Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓａｍｄＳ遺伝子及びＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉｐｙｒＧ遺伝子をそれら自体のプロモーターやターミネーターと共に含んでいる適切なＤＮＡ断片は、フランキングＮｏｔＩ部位を備えており、これをｐＵＲ７２８２のＮｏｔＩ部位に導入してｐＵＲ７２８１（図１０）を産生した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉでの合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の代替の発現方法として、成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子の前にそれ自体のプレ−プロ配列ではなく、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉｅｘｌＡのプレ配列が存在する発現ベクターを構築した。このような融合のための合成クチナーゼ遺伝子を産生するために、ｅｘｌＡプレ配列のコード化配列が種々の方法で成熟クチナーゼのＮ末端のコード化配列に結合した数個のアダプター断片を合成した。カセット５では、この結合は、ｅｘｌＡプレ配列をクチナーゼのプロ配列と融合して行う。カセット６では、ｅｘｌＡプレ配列を成熟クチナーゼのＮ末端残基と融合する。カセット７はカセット６と同一であるが、コード化成熟クチナーゼポリペプチドのＮ末端残基を元のグリシンからセリン残基に変えて、シグナルペプチドの開裂要件により適合するようにした。本質的に実施例１に記載したように、カセット５、６及び７を合成オリゴヌクレオチドから作成した（図７参照）。カセット５を使用して、ｐＵＲ７２１０の０．１ｋｂＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片を置換してｐＵＲ７２８７を産生した。カセット６、７を使用して、ｐＵＲ７２１０の０．１ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を置換し、それぞれｐＵＲ７２８８及びｐＵＲ７２８９を産生した。プラスミドｐＵＲ７２８７、ｐＵＲ７２８８及びｐＵＲ７２８９の各々について、０．７ｋｂＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片をｐＡＷ１４Ｂの７．２ｋｂＢｓｐＨＩ −ＡｆｌＩＩ断片と連結して、それぞれｐＵＲ７２９０、ｐＵＲ７２９１及びｐＵＲ７２９２を得た。その後、従来の同時形質転換技術により、構築したｒＤＮＡベクターをカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉ）に移植し、エンドキシラナーゼIIプロモーターの誘導によりプレ−（プロ）−クチナーゼ遺伝子を発現した。本実施例でｐＵＲ７２８０について説明したように（上記参照）、構築したｒＤＮＡベクターは更に、従来の選択マーカー（例えばａｍｄＳ又はｐｙｒＧ、ヒグロマイシン）を備えていてもよく、またカビを得られたｒＤＮＡベクターで形質転換して、所望のタンパク質を産生してもよい。（対応するプロ配列を備えた又は備えていないＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ成熟クチナーゼコード領域と、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉｅｘｌＡプロモーター及びターミネーターの制御下のクチナーゼシグナル配列又はｅｘｌＡシグナル配列とを含む）発現ベクターｐＵＲ７２８０、ｐＵＲ７２８１、ｐＵＲ７２９０、ｐＵＲ７２９１、ｐＵＲ７２９２の各々で形質転換したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ株を、以下の条件下で増殖させた：４００ｍｌの合成培地（ｐＨ６．５）を含む多数の１リットル振盪フラスコに、胞子（最終濃度：１０Ｅ６／ｍｌ）を接種した。培地組成を以下に示す（ＡＷ培地）：スクロース１０ｇ／ｌＮａＮＯ₃ ６．０ｇ／ｌＫＣｌ０．５２ｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄ １．５２ｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．４９ｇ／ｌ酵母抽出物１．０ｇ／ｌＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２２ｍｇ／ｌＨ₃ＢＯ₃ １１ｍｇ／ｌＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ５ｍｇ／ｌＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ５ｍｇ／ｌＣａＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ１．７ｍｇ／ｌＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ１．６ｍｇ／ｌＮａＨ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ１．５ｍｇ／ｌＮａ₂ＥＤＴＡ５０ｍｇ／ｌＭｋＸインキュベーターシェーカーで、２００ｒｐｍ、３０℃で２４時間インキュベートした。増殖後、細胞を濾過（０．４５μｍフィルター）して収集し、スクロース及び酵母抽出物を含まないＡＷ培地（塩溶液）で２度洗浄し、５０ｍｌの塩溶液に再度懸濁させ、キシロースを添加して１０ｇ／ｌの最終濃度にした５０ｍｌの塩溶液（誘導培地）を含む３００ｍｌの振盪フラスコに移した。上記と同一条件下でのインキュベーションを一晩継続した。得られた培養物をミラクロス（miracloth）で濾過してバイオマスを除去し、クチナーゼを本質的に実施例２に記載した方法で回収した。実施例７ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体の発現本質的に実施例６に記載した方法により、但し真菌発現ベクターの構築のためにｐＵＲ７２１０に代わりにプラスミドｐＵＲ７２５７（Ｎ１７２Ｋ）を用いて、変異Ｎ１７２Ｋを含むＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉで産生した。実施例８Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子に関連する遺伝子の同定及び単離Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼとの相同性の程度が異なるクチナーゼのコード化遺伝子を種々の真菌から単離した。Ｈａｎｋｉｎ及びＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ（１９６８）が記載する培地２００ｍｌに０．２５％グルコースを補充したものを含む５００ｍｌの振盪フラスコで真菌培養物を増殖させ、ＭｋＸインキュベーターシェーカー（１００ｒｐｍ）で、２８℃で４日間インキュベートした。この時点で、グルコースが消費され、本質的にＥｔｔｉｎｇｅｒ等（１９８７）が記載したようにクチン水解物を添加してクチナーゼの産生を誘導した。一定の間隔で試料を培養物から取り出し、標準的な技術に従って（実施例４参照）脂肪分解活性の存在を分析した。通常、誘導から約２日後に、脂肪分解活性を実証することができ、この時点で、標準的な技術を用いて細胞を濾過して収集した。標準的な技術に従って、菌糸を洗浄し、液体窒素中で凍結し、凍結乾燥した。グアニジニウムチオシアネート法を用いて全細胞ＲＮＡ調製物を単離し、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）が記載したように、塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製した。ｐｏｌｙＡＴ管（tract）ｍＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｇａ）を用いてｐｏｌｙＡ（＋）ｍＲＮＡ画分を単離した。標準的な技術に従い、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子に由来するｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ｐｏｌｙＡ（＋）ｍＲＮＡ画分をノーザンハイブリダイゼーション分析で使用して、クチナーゼ関連遺伝子の発現を検証した。ＺＡＰｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ）を供給業者の指示に従って用いて、プローブとハイブリダイズし得る物質を含むｍＲＮＡ調製物でｃＤＮＡを合成して、ｐｏｌｙ−Ａ領域に隣接しているＸｈｏＩ付着端と、他端にＥｃｏＲＩアダプターを有するｃＤＮＡ断片を得た。得られたｃＤＮＡ断片を用い、λＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ）でのセンス方向のダイレクショナルクローニングにより発現ライブラリーを構築すると、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（Ｈｕｓｅ等、１９８８）を発現することができた。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼに対する抗血清を用いて、これらのライブラリーをスクリーニングした。あるいは、クチナーゼ特異的プライマー（表２参照）を用いて、合成ｃＤＮＡ画分をＰＣＲスクリーニングにかけた。これらのプライマーは、数種の真菌クチナーゼ遺伝子のアミノ酸配列（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等、１９８７）の比較により得られたものである。ＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのｃＤＮＡを対照として用いてＰＣＲ反応の条件を、各組のプライマーについて最適化した。同一条件下で、長さがＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ由来のｃＤＮＡで産生されるＰＣＲ断片と同様である（又はそれ以上の）特異的ＰＣＲ断片の産生に使用され得るｃＤＮＡ調製物について、ＰＣＲ断片をゲル電気泳動で精製して、ゲルから単離した。代替の方法としては、クチナーゼ特異的プライマーを用いるＰＣＲスクリーニング技術は更に、ＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉのゲノムＤＮＡを陽性対照として用いることにより、幾つかの真菌株のゲノムＤＮＡに直接適用される。同一条件下で、長さがＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ由来のｃＤＮＡで産生されるＰＣＲ断片と同様である（又はそれ以上の）特異的ＰＣＲ断片の産生に使用され得る真菌ゲノムＤＮＡ調製物について、ＰＣＲ断片をゲル電気泳動で精製して、ゲルから単離した。発現ライブラリー法又は（ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを用いる）ＰＣＲスクリーニング法で陽性と評価された株や、他の幾つかの株について、高分子量ゲノムＤＮＡを単離した。株を本質的にＥｔｔｉｎｇｅｒ等（１９８７）の記載した方法で増殖させ、ゲノムＤＮＡをＧｒａａｆｆ等（１９８８）が記載した方法で単離した。ゲノムＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、類似ｃＤＮＡインサート（発現ライブラリー法）又はＰＣＲ断片（ＰＣＲスクリーニング法）又はＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子（他の株）をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションで分析し、クチナーゼ遺伝子の物理マップを構築した。ゲノムＤＮＡの適切な消化物をゲル電気泳動でサイズ分画し、適切サイズの断片をゲルから単離し、ｐＵＣ１９にサブクローニングした。これらのゲノムライブラリーを対応するｃＤＮＡインサート（発現ライブラリー法）又はＰＣＲ断片（ＰＣＲスクリーニング法）でスクリーニングして、クチナーゼ遺伝子のゲノムコピーを含むクローンを産生した。これらの遺伝子を両方向に配列決定した。対応ｃＤＮＡを配列決定するか又は他のクチナーゼ配列（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等、１９８７）と比較してイントロンを同定した。成熟クチナーゼポリペプチドのＮ末端を更にこのような比較から推定した。標準的なＰＣＲ技術を用いて、イントロンを除去し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を読み取り枠のすぐ下流で作成し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子（前にＳａｃＩ部位が存在する、カセット８を比較、図３）のプレ配列のコード化配列を、成熟クチナーゼのＮ末端のコード化配列に融合した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼプレ配列をコードする配列に操作的に連結したクチナーゼ遺伝子を含む産生ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＲ７２４１（図４参照）の７．３ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１に形質転換した。真菌クチナーゼを発現し、本質的に実施例４に記載したように培養ブロスから回収した。実施例９Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋの洗濯中活性クチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋの脂肪除去への作用を、野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの場合と比較した。試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。（前述したように）Ｘ線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ（ＷＴ）及びＮ１７２Ｋ変異体を３ＬＵ／ｍｌ用い、酵素による汚れ除去量を幾つかの実験条件下で測定した：洗剤製品Ａ〜Ｃの組成（重量％）を以下に示す：製品Ａ製品Ｂ製品Ｃ様々な洗濯条件下で、洗濯中性能（油汚れ除去）が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼに比べて改善されることは明白である。図１３は、３０℃、２７゜ＦＨで、３０分間の洗濯で２ｇ／ｌの洗剤製品Ｃを用いた場合の種々の酵素濃度での洗濯中性能を示している。比較として、更に同じ実験をＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）を用いて実施した。全ての条件下で、クチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋの方が優れていた。実施例１２Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ｅ２０１Ｋの洗濯中活性種々の酵素濃度のクチナーゼ変異体Ｅ２０１Ｋが脂肪除去に及ぼす作用を、３０℃、２７゜ＦＨで、３０分間の洗濯で２ｇ／ｌの洗剤製品Ｃ（実施例１１を参照）を用いて野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの場合と比較した。試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。（前述したように）Ｘ線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。結果を図１４に示す。洗濯中性能（油汚れ除去）が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼに比べて改善されることは明白である。比較として、更に同じ実験をＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）を用いて実施した。Ｅ２０１Ｋクチナーゼ変異体の性能の方が明らかに優れていることが知見された。実施例１３Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ａ８５Ｆの洗濯中活性種々の酵素濃度のクチナーゼ変異体Ａ８５Ｆが脂肪除去に及ぼす作用を、３０ ℃、２７゜ＦＨで、３０分間の洗濯で２ｇ／ｌの洗剤製品Ｃ（実施例１１を参照）を用いて野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの場合と比較した。試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。（前述したように）Ｘ線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。結果を図１５に示す。洗濯中性能（油汚れ除去）が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼに比べて改善されることは明白である。比較として、更に同じ実験をＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）を用いて実施した。Ａ８５Ｆクチナーゼ変異体の性能の方が明らかに優れていることが知見された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｓ 11/00 8931−4ＢＤ０６Ｌ 1/00 7199−3Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:77）Ｃ１２Ｒ 1:77） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者フアン・デル・ヒーデン，ヘンドリクス・テオドルス・ウエー・エムオランダ国、エヌ・エル―2907・カー・ベー・カペレ・アー／デー・イユツセル、アイダ・64 (72)発明者ムステルズ，ウオーテルオランダ国、エヌ・エル―3141・エル・デー・マースルイス、ウイツペルスパルク・ 138 (72)発明者ペテルス，ハンスオランダ国、エヌ・エル―3051・イツクス・ベー・ロツテルダム、サフイエルストラート・12 (72)発明者フエリプス，コルネリス・テオドルスオランダ国、エヌ・エル―3142・カー・ベー・マースルイス、ハゲドールン・18 (72)発明者デ・フリーグ，ヤコブオランダ国、エヌ・エル―3142・アー・ペー・マースルイス、カスタニエーダル・32

Claims

【特許請求の範囲】１．酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した親クチナーゼのクチナーゼ変異体。２．脂質接触領域に隣接する酵素表面の疎水性を増加して、拡大された脂質接触領域を形成した請求項１に記載のクチナーゼ変異体。３．１個以上のアミノ酸残基を、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンからなる群の中から選択されるアミノ酸残基で置換して疎水性を増した請求項１又は２に記載のクチナーゼ変異体。４．表面疎水性を増すだけでなく、１個以上の陽電荷を導入するようにアミノ酸配列を改変した請求項１から３のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。５．１個以上のリシン又はアルギニン残基を導入して陽電荷を導入した請求項４に記載のクチナーゼ変異体。６．置換されるアミノ酸残基が小さな側鎖を有し、好ましくはアラニン、セリン又はグリシンからなる群の中から選択される請求項１から５のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。７．親クチナーゼが真核生物クチナーゼである請求項１から６のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。８．親酵素が、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼに対する抗体と免疫学的に交差反応するクチナーゼである請求項１から７のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。９．親酵素がＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼである請求項１から８のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。１０．改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの残基１１６〜１２０のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルと、該ベクトルに垂直で、残基１１７のＣα− 原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を含んでいる面とによって規定される分子部分に位置する請求項１から９のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。１１改変残基が、残基１１７のＣα−原子から１５Ａ離れたＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの残基１１６〜１２０のＣα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルに垂直な第１の面と、該第１の面に平行で、残基１１７のＣα−原子を含んでいる第２の面との間に位置する分子部分中に位置する請求項１から１０のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。１２．改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのアミノ酸配列の以下の位置又は異なるクチナーゼの対応する位置：１７，１８，１９，４０，４２−４６，５０，５３，５４，５８，７４，７５，７６，７８，８０−８８，９１，９２，９３，９５，９６，９７，９９，１００，１１９，１５０−１５６，１５８，１６０，１６８，１６９，１７０，１７２，１７３，１７４，１７６，１７９，１８０−１９０，１９２，１９３，１９４，１９６，１９７，１９８，２０１の１つ以上に位置する請求項１から１１のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。１３．改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのアミノ酸配列の以下の位置又は異なるクチナーゼの対応する位置：１９，４１，４５，４９，５４，５８，７５，７６，８２，８５，９２，９３，９９，１００，１２７，１２８，１７２，１７３，１７９，１８３，１８４，１８５，１８９，１９０，１９４，１９７，２０１の１つ以上に位置する請求項１から１２のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。１４．以下の改変：Ｔ１９Ｖ，Ｇ４１Ａ，Ｔ４５Ｋ，Ｔ４５Ｐ，＊Ｉ４９ａ，Ｓ５４Ｉ，Ｎ５８Ｒ，Ｇ７５Ｒ，Ａ７６Ｐ，Ｇ８２Ａ，Ｄ８３Ｓ，Ａ８５Ｆ，Ａ８５Ｖ，Ｓ９２Ｒ，Ａ９３Ｖ，Ｌ９９Ｋ，Ｇ１００Ｒ，Ａ１２７Ｌ，Ａ１２８Ｆ，Ｎ１７２Ｋ，Ｔ１７３Ｉ，Ｔ１７９Ｆ，Ｉ１８３Ｆ，Ｖ１８４Ｉ，Ａ１８５Ｌ，Ｌ１８９Ｆ，Ａ１９０Ｌ，Ｄ１９４Ｒ，Ｇ１９７Ｖ，Ｅ２０１Ｋの１つ以上が、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのアミノ酸配列で又は異なるクチナーゼの対応する位置で実施された請求項１から１３のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。１５．以下の改変：Ａ８５Ｆ、Ｎ１７２Ｋ、Ｅ２０１Ｋが、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのアミノ酸配列で、又は異なるクチナーゼの対応する位置で実施された請求項１から１４のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。１６．クチナーゼ変異体をコードするｒＤＮＡ技術により製造した遺伝子を含むｒＤＮＡ改変微生物を発酵培養し、微生物で産生されたクチナーゼ変異体を発酵ブロスと分離するか又は微生物細胞を発酵ブロスと分離することによりクチナーゼ変異体調製物を製造し、分離した細胞を破壊し、物理的又は化学的な濃縮又は精製法により前記ブロスから又は前記細胞からクチナーゼを濃縮又は部分精製する段階を包含する請求項１から１５のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体の産生方法。１７．請求項１から１５のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする遺伝子を保有するｒＤＮＡベクターによって形質転換されて、前記クチナーゼ変異体を発現し得るｒＤＮＡ改変微生物。１８．５’末端で、宿主微生物のシグナル又は分泌配列として機能的な（改変）プレ配列をコードする遺伝子断片と融合することによって微生物内に導入されるクチナーゼ変異体をコードする遺伝子を保有する請求項１７に記載のｒＤＮＡ改変微生物。１９．宿主微生物が真核生物、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属もしくはＨａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母菌、又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌である請求項１７又は１８に記載のｒＤＮＡ改変微生物。２０．請求項１から１５のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする組換えＤＮＡベクターを保有し、かつ先祖細胞のひとつで栄養要求性マーカーをコードする遺伝子を置換して栄養要求性突然変異体となったことを特徴とする、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のｒＤＮＡ改変微生物。２１．最終翻訳コドンの次に終結コドンが存在し、場合によっては、成熟酵素をコードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナーゼのプレ配列をコードするヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の成熟クチナーゼ変異体又はその機能等価物又はその突然変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。２２．最終翻訳コドンの次に終結コドンが存在し、場合によっては、成熟酵素をコードするヌクレオチド配列のすぐ上流に対応プレ配列の少なくとも一部分、及び／又は選択される宿主微生物に適したシグナル配列もしくは分泌配列をコードするヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。２３．請求項１から１５のいずれか一項に記載の成熟クチナーゼ変異体又はその機能等価物又はその突然変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、産生源の微生物から誘導される、クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を、少なくとも１個のコドン、好ましくはできるだけ多くのコドンが‘サイレント’突然変異の対象に対し、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の新しい宿主に好まれるコドンである、同等のアミノ酸残基をコードするコドンを形成するように改変することにより、前記宿主の細胞内での使用時に、安定性の改善された導入遺伝子用ｍＲＮＡを提供する前記ポリヌクレオチド。２４．プロ又は成熟クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列の上流に、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の宿主に適したシグナル配列又は分泌配列をコードするヌクレオチド配列が位置する請求項２１から２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。２５．（ａ）成熟クチナーゼ変異体、又はプレクチナーゼ、又は（選択された宿主細胞にとって好ましい）分泌シグナルのすぐ下流でプレ配列の少なくとも一部分が除去された対応プレクチナーゼをコードする二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡであるが、但し、翻訳されるべき遺伝子の部分がコドンＡＴＧで開始していない場合はＡＴＧコドンを前に置くべきとし、更に翻訳されるべき遺伝子部分は適切な終結コドンで終了する即ち前記コドンを付加するものとする、前記ＤＮＡ；（ｂ）クチナーゼ変異体をコードするｄｓＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の上流に位置する、（選択される宿主微生物に適した）発現レギュロン；（ｃ）クチナーゼ変異体をコードするｄｓＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の下流に位置する、（選択される宿主微生物に適した）ターミネーター配列；（ｄ１）選択される宿主のゲノム内へのｄｓＤＮＡの取り込みを容易にするヌクレオチド配列、又は（ｄ２）選択される宿主に適した複製起点；（ｅ１）場合によっては（栄養要求性）選択マーカー；（ｅ２）場合によっては、選択される宿主でのクチナーゼ変異体の一前駆体形態の成熟及び／又は分泌に関与するタンパク質をコードするｄｓＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、クチナーゼ変異体遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を指令し得る組換えＤＮＡベクター。２６．前記定義のポリヌクレオチドの上流及び／又は下流に、クチナーゼの機能発現を容易にする別の配列を更に保有する請求項２５に記載の組換えＤＮＡベクター。２７．栄養要求性マーカーのコード領域と、欠陥プロモーター領域とからなる栄養要求性マーカーを保有する請求項２５又は２６に記載の組換えＤＮＡベクター。２８．請求項１から１５のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体を含む酵素洗剤組成物。