JPH04500608A - 酵素及び酵素洗剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素及沙酵素洗剤組成物 本発明は、酵！、その修飾、（改変）及び産生などに使用し得るｒＤＮ＾ＤＮＡ 並びに、酵素洗剤及び洗浄組成物などにおけるその使用に係る。 本発明は特に、修飾酵素、特に修飾リパーゼの製造及び使用に係る。従って以下 に記載のごとく本発明は特に、リパーゼ、の産生方法、Ｐｓｅｕｄｏ曽ｏａｍｓ 属に由来のリパーゼ、Ｐ。 ｇｌｕｍａｅ（別称Ｐ、　ｇｌａｄｉｏｌｉ）に由来のリパーゼなどの産生方法 を提供し、さらに、かかるリパーゼの遺伝的改質と洗剤及び洗浄組成物における かかる酵素の使用を提案する。 従来技術： リパーゼ及びプロテアーゼはいずれも洗剤及び洗浄組成物の成分として知られて いる。プロテアーゼの使用は普及している。 公知のリパーゼ含有洗剤組成物の例は、ＥＰＡ　Ｏ２０５２０８及びＥＰＡ　Ｏ ２０６３９０（υａｉｌｅｖｅｒ）によって提案された。これらの公開特許出願 は、免疫学的関係に基づいて定義された１つのリパーゼ顕に関するものであり、 洗剤組成物及び繊維製品洗濯におけるその使用を記載している。好ましいリパー ゼはＰｓ、　ｆｌｏｏｒｅｃｅｎｓ、　Ｐｓ、　ｇｌａｄｉｏｌｉ及びＣｈｒｏ ｍｏｂａｅｔａｒ種である。 ＥＰ　Ｏ２１４７６１（Ｎｏｖｏ）及びＥＰ　Ｏ２５８０６８（Ｎｏｖｏ）は夫 々、ある種の微生物に由来のリパーゼを詳細に記載しており、また記載の酵素を 洗剤添加剤及び洗剤組成物として使用するいくつかの例を示している。　ＥＰ　 Ｏ２１４７６１は、Ｐｓ、　ｃｅｐａｃｉａ種の微生物に由来のリパーゼ及びそ のいくつかの使用を詳細に記載している。　ＥＰ　Ｏ２５８０６８はＴｈｅｒｍ ｏｍｙｅｅｓ（旧称Ｈｕｍｉｃｏ１ｍ）属の生物に由来のリパーゼ及びそのいく つかの使用を詳細に記載している。 ＥＰ　Ｏ２５８０６８及びＥＰ　Ｏ３０５２１６（Ｎｏｖｏ）はいずれも、　ｒ ＤＮ＾ＤＮＡよって異種宿主微生物を介して真菌リパーゼを産生ずる方法、特に Ｔｈｅｒｓｏｍｙｅｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ／Ｈｕｍｉｃｏｌａ　Ｉａｎ ｕ−ｇｉｎｏｓａに対応するリパーゼを産生ずる方法を記載している。 ＥＰ　Ｏ３３１３７６（八−ａｎｏ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃ ｉａに由来のリパーゼのアミノ酸配列を含むリパーゼ、ｒＤＮ＾ＤＮＡ手法その 産生及びその使用を記載している。 ｒＤＮＤＮＡ手法って産生されるその他のリパーゼ酵素は、例えばＮｏ　８９− ０９２６３（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）及びＥＰ　Ｏ２１８２７２（Ｇｉｓ ｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）に記載されている。 その他の酵素に使用された組換えＤＮＡ手法は−０８８７０２７７５（Ｎｏｖｏ ）、ＥＰ　Ｏ２４３３３８（Ｌａｂｏｆｉｎａ）、ＥＰ　Ｏ２６８４５２（Ｃｅ ｎｅｎｃｏｒ）。 ＥＰ　Ｏ３０５２１６（ｏｏｖｏ）及び−０８９１０９２６３（Ｇｉｓｔ−Ｂｒ ｏｃａｄｅｓ）などで言及されその技術も記載されている。特に、ＥＰ　Ｏ１３ ０７５６（Ｃｅｎｅｎｔｅｅｈ）　（ＵＳＰ４．７６０．０２５（にｅｎｅｎｃ ｏｒ）に対応）、　ＥＰ　０２１４　４３５（Ｂｅｎｋｅｌ）、１１Ｉ０８７１ ０４４６１（八−ｇｅｎ）、１１０８７１０５０５０（Ｇｅｎｅｘ）。 ＥＰ＾８フ３０３７６１　（（：ｅｎｅｎｔｅｅｈ）及び１０８９１０６２７９ （Ｎｏｖｏ）は、ｒＤＮ＾手法によって産生された変性ズブチリシンプロテアー ゼを記載している。またＥＰ　Ｏ１５７４４１（Ｋｏｋ　Ｊ他）は、Ｂａｃｉｌ ｌｕｓｓｕｂｔ　ｉ　ｌ　ｉｓに由来の酵素の産生に使用できるｒＤＮ＾手法を 開示している。 リパーゼとプロテアーゼとの双方を洗剤組成物に同時に混入するのが難しい理由 は、プロテアーゼがリパーゼを攻撃する傾向８有するからである。 この欠点を是正する処置はいくつか提案されている。 ＥＰ　Ｏ２７１１５４（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）によって提出された１つの試案は、 等電点１０未満のいくつかの選択したプロテアーゼがリパーゼと有利に併用でき ることを示している。 ＮＯ８９１０４３６１（Ｎｏｖｏ）に記載された別の試案は、Ｐｓｅｕｄｏａ＋ ｏ−０１３種に由来のリパーゼと、　Ｆｕｓａｒｉｕ−に由来のプロテアーゼま たはアミノ酸配列の１６６位、１６９位または２２２位にいくつかの方法によっ た突然変異を含むズブチリシン型プロテアーゼとを含存する洗剤組成物を提案し ている。記載された特定のプロテアーゼを用いるときプロテアーゼによるリパー ゼ攻撃の程度が幾らか減少しなと報告されている。 本発明： 本発明の１つの目的は、ｒＤＮ＾手法によって微生物から産生され、プロテアー ゼ及び／または酸化剤による攻撃に対して改良された安定性及び／または対応す る親酵素に比較して増加した活性などの、改良された使用性能を与える、少なく とも１つの突然変異をそのアミノ酸配列に含むリパーゼを提供することである。 本発明によって産生されるリパーゼは、洗剤または洗浄組成物の成分として使用 されると活性及び安定性の双方に有利な効果を与える。 リパーゼのアミノ酸配列を変えることによって極めて有利な結果が得られること を示唆した公開文献はこれまで存在しなかったと考えられる。 ｒＤＮＡ手法によって導入された突然変異は、かがる突然変異リパーゼと共にプ ロテアーゼと漂白系とを含有する洗剤組成物中のリパーゼの安定性を改良するこ とがここに知見された。 本発明の開示において、突然変異酵素または突然変異体酵素なる用語は、突然変 異遺伝子を発現させる突然変異生物によって産生された酵素を意味する。（サイ レント突然変異だけを含む突然変異遺伝子以外の）突然変異遺伝子なる用語は、 対応する親酵素の配列から直接または間接に誘導され１つまたは複数の部位のア ミノ酸が変化したアミノ酸配列を有する酵素なコードする遺伝子を意味する。親 酵素なる用語は、対応する非変性（非変異）遺伝子の遺伝子産生物を意味する。 遺伝子のサイレント突然変異、なる用語は、（コドンとアミノ酸との関係に重複 （ｒｅｄｕｎｄａｎｅｙ）があるので）、遺伝子によってコードされる酵素のア ミノ酸配列の変化を生じさせないような、遺伝子のポリヌクレオチド配列の変化 または変異を意味する。 突然変異微生物または突然変異体微生物なる用語は、酵素をコードする遺伝子の 突然変異を含む親微生物またはその子孫微生物を意味する。生物のかかる突然変 異は、（ａ）親微生物中に既に存在する対応遺伝子（親遺伝子〉の突然変異、ま たは、（ｂ）別のソースから直接または間接に得られた対応遺伝子を突然変異微 生物になるべき微生物に（転移遺伝子を突然変異させるかまたはさせずに）導入 する転移（導入）によって生じる。宿主微生物は、突然変異遺伝子または別の起 原の転移遺伝子がその一部を構成する微生物である。宿主微生物は一般に、親微 生物と同じ起原または異なる起原の菌株または種でもよく、あるいはその子孫で もよい。 例えば、本発明は＋Ｃｂｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｍ　ｖａｒ、　 Ｉｉｐｏ−Ｉｙｔｉｃｕｍ　ＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３に由来のリパーゼ、＾ｌｅ ａｌｉｇｅｎｅｓ　ＰＬ−６７９、＾ＴＣＣ３１３７１もしくはＦＥＲＮ−Ｐ　 ３７８３に由来のリパーゼ、またはｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃ ｅｎｓ　ＩＡＭ　１０５７に由来のリパーゼに対して怒作された抗血清と交差免 疫反応性を示す突然変異形リパーゼを提供する。該リパーゼは、ｒＤＮ＾手法に よって作製された遺伝子を含む人工的に改変された微生物によって産生される。 この遺伝子は、プロテアーゼの攻撃に対するリパーゼの安定性を改良するように リパーゼのアミノ酸配列を変化させる少なくとも１つの突然変異を含んでいる。 より一般的には、突然変異の有用なベースとして使用されるリパーゼは広い範囲 のリパーゼから選択され得る。特に、特許明細書ＥＰ　Ｏ２１４７６１（Ｎｏｖ ｏ）及びＥＰ　Ｏ２５８０６８（Ｎｏｖｏ）に記載されたリパーゼ、特に、Ｔｂ ｅｒｗｂｏｍｙｘｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ＾ＴＣＣ２２０７０に由来のリ パーゼに対して感作された抗血清と交差免疫反応性を示すリパーゼ、　ＥＰ　Ｏ ２０５２０８及び０２０６９３０（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に記載のリパーゼ；　Ｃ ｈｒｏ簡ｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｍｖｉｒ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｅｕｍ　 ＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３に由来のリパーゼまたは＾Ｉｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ＰＬ −６７９，＾ＴＣＣ３１３７１及びＦＥＲＮ−Ｐ３７８３に由来のリパーゼに対 して感作された抗血清と交差免疫反応性を有するリパーゼ；特許（出願公開）明 細書１１０８７１００８５９（に１ｓｔＢｒｏｃａｄｅｓ）及びＥＰ＾０２０４ ２８４（Ｓａｐｐｏｒｏ　Ｂｒｅｗｅｒｉｅｓ）に記載のリパーゼがある。特に 適当なリパーゼの例は市販のリパーゼ調製￥＠：　Ｎ０ＶＯＬｉｐｏｌａｓｅ、 ＾ｎａｎｏリパーゼＣＥ、Ｐ、ＡＰ、Ｍ−ＡＰ、＾札及びＣＥＳ、Ｍｅｉｔｏリ パーゼＮＹ−３０、ＯＦ及びＰＬ、エステラーゼ８Ｍ、Ｌｉｐｏｚｙ−２ＳＰ　 ２２５．　ＳＰ　２８５、Ｅｎｚｅｃｏリパーゼ、Ｔｏｙｏ　Ｊｏｚｏリパーゼ 及びＤｉｏｓｙｎｔｈリパーゼ（商標）である。 出発リパーゼと免疫的に関連した別のリバーザをコードするヌクレオチド配列の 実質的に対応する部分によってヌクレオチド配列の一部が置換された修飾リパー ゼを産生させることもできる。 従って、人工的に改変された本発明の微生物は、特に以下の親機生物、例えば、 Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏ ｓａ−Ｐｓ、　ｐｕｔｉｄａに基づいて産生されてもよく、リパーゼの出発遺伝 子が欠失したＰｓ、　ｇｌｕｉ＋ａｅの変性様、Ｂａ−ｅｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ ｉｌｉｓ　Ｓａｃｅｂｉｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｅ及び関連種、Ｈ ａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及び関連種、及び種々の＾ｓｐｅｒｇ ｉ　ｌ−１ｕｓ属から産生されてもよい、かがる人工的に改変された微生物を産 生ずる親生物を宿主細胞または宿主生物と呼ぶ。 これらの宿主細胞は、種々の微生物の広い範囲を反映しく表し）、実施例で詳細 に記載していないその他の微生物も宿主細胞として使用し得る。 特に、突然変異している場合もある細菌リパーゼを異種宿主微生物中で産生させ るために本発明を使用すると、量産用の出発宿主に関する問題、例えばかかる生 物が潜在的な植物病原体であると考えられる場合の取扱い及び汚染に関する問題 が回避できる。 本発明の突然変異リパーゼにおける突然変異は以下から選択される： （ａ＞そのままではプロテアーゼの攻撃に弱いアミノ酸鎖のロケーションに１つ または複数のプロリン残基が（挿入または置換によって）導入された突然変異； （ｂ）（正電荷をもつアミノ酸残基の挿入または中性もしくは負電荷をもつアミ ノ酸残基の置換などによって）リパーゼ分子の実効正電荷を増加させる突然変異 ；この突然変異は、負電荷をもつ残基（例えばアスパラギン酸またはグルタミン 酸の残基）を欠失させる、中性残基（例えば、セリン、グリシン、プロリン）に よって置換する、中性または負電荷をもつ残基を正電荷をもつアミノ酸残基（例 えばアルギニンまたはりシン）によって置換する、または、正電荷をもつ残基を 挿入するなどの方法を用いて生起され、その例は、実効正電荷及びｐｉを増加さ せるためのＰｓ。 ｇｌｕｍａｅリパーゼの配列またはその相同体の突然変異Ｄ１５７Ｒ１Ｄ５５＾ 及びｌｌｌ０Ｋである； くｃ）１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基の組み合わせが、（例えば挿入ま たは置換によって）リパーゼに導入されて得られた突然変異、該残基は選択宿主 細胞中でリパーゼが合成されるときにグリコジル化され、グリコジル化リパーゼ はプロテアーゼの攻撃に対して改良された安定性をもつ； グリコジル化部位になり得るアミノ酸を導入する（または所望の場合除去する） ために選択される（１つまたは複数の）アミノ酸配列の修飾も可能であり、例え ばＰｓ、　ｇｌｕｍａｅリパーゼまたはその相同体の配列に対する突然変異Ｄ１ ５７Ｔ及び／または寧１５５ａＧがある； （ｄ　）Ｍ止剤に対する酵素の安定性を改良するためにメチオニンを欠失または 置換させた突然変異。 （１つまたは複数の）アミノ酸配列の修飾は、ズブチリシン開裂部位で配列を修 飾することによってズブチリシンプロテアーゼによる攻撃に対するリパーゼの安 定性を改良するように選択される０例えば、かかる部位を形成する１つまたは２ つ好ましくは３つのアミノ酸残基を欠失させるか、または、突然変異以前に存在 していた該リパーゼのアミノ酸配列の開裂部位でもしくはその近傍で少なくとも １つの塩基性（正電荷をもつ）アミノ酸残基または少なくとも１つのプロリン残 基を挿入または置換によって導入する。 本発明によるこのような突然変異リパーゼの例としては、突然変異Ｈ１５４Ｐも しくは本１５５ａＣ等をもつ、Ｐｓ、　ｇｌｕｓ＋ａｅに由来のリパーゼまたは その相同体の配列に基づくリパーゼ、あるいは、突然変異５１５３Ｐをもつ、（ 例えばＥＰ　Ｏ３３１３７６（＾−ａｎｏ）、特に成熟酵素の配列の１位が図中 の４５位に存在する図２に示された）Ｐｓ、　ｅｅｐｉｃｉａに由来のリパーゼ またはその相同体の配列に基づくリパーゼがある。 より一般的に、本発明はまた、１０テアーゼ、例えばズブチリシンプロテアーゼ による攻撃に対するタンパク質の安定性を改良するように選択された１つ以上の アミノ酸配列の（１つまたは複数の）修飾を含むリパーゼまたは別の酵素活性を 有する突然変異タンパク質を提供する。かかる突然変異体を得るためには、（ｉ ）ズブチリシン開裂部位、即ち親タンパク質中のズブチリシン開裂を受け易い結 合のどちらかの側の５ＴＡ基以内の配列を、例えば特定の欠失法（つまり、突然 変異以前に存在していたかかる部位の部分を形成する１つまたは２つ好ましくは ３つのアミノ酸残基を欠失させること）によって修飾するか、あるいは、（ｉｉ ）少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基、または少なくとも１つのプロリン残基 分かかる部位に挿入または置換によって導入するか、あるいは、（ｉｉ′Ｉ）か かる部位に正電荷をもつアミノミｔ導入または負；荷３もつアミノ酸分除去する ことによって該部位の静電ポテンシャルと変更する。得られる突然変異は、（ａ ）親酵素中のズブチリシン開裂を受け易い結合が開裂する際に新しいＮ−末端に なるアミノ酸残基がプロリンによって１損された突然変異、及び／または、（ｂ ）かかる易開裂結合から２つまたは４つの位置のアミノ酸残基が荷電アミノ酸残 基またはより極性のアミノ酸残基によって置換された突然変異である。 従って、突然変異リパーゼまたは別のタンパク質は、易開裂結合、即ち親リパー ゼ中のズブチリシンプロテアーゼによって切断され易い結合から（リパーゼのＮ −末端に向かって）２残基及び４残基と隔てる１つ以上の位置に突然変異を含み 得る。ズブチリシンによるタンパク質分解に対する耐性を改良するために、ａｓ ｐ、ｇｌｕ、１ｙｓ−ｉｒｇ、　ｈｉｓ、ｇｌｎまたはａｓｎなどの１つ以上の 極性または荷電アミノ酸残基が例えば置換によって導入され得る。 かかる開８部位分その修飾の前に同定する方法は後出の実施例１４において説明 する。 失活に対するリパーゼの安定性を改良するアミノ酸配列の修飾の変法では、その 配列からメチオニン残基を除去すべく欠失または置換によってその配列のメチオ ニン桟器を修飾する。 ｒＤＮ八手へによって産生される細菌リパーゼ、特にＣｈｒｏｍ。 ｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｅｏｓｕｓ　ｖｍｒ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＮＲＲＬ 　Ｂ−３６７３に由来のリパーゼ、または、＾ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ＰＬ−６ ７９、＾ＴＣＣ３１３７１らしくはＦＥＲＮ−Ｐ　３７８３に由来のリパーゼ、 または、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＩＡＭ　１０５７に 由来のリパーゼに対して恣作された抗血清と交差免疫反応性を示すリパーゼの別 の安定形態は、（突然変異によって修飾されたアミノ酸配列を有することが可能 ではあるが必須ではない）リパーゼが、人工的に改変された異種真核細胞宿主微 生物中で発現され、遺伝子または配列の超厚である親機生物によって産生される リパーゼとは異なるようにグリコジル化されたリパーゼが真核細胞宿主中で発現 されたものである。 宿主生物は原核生物、例えばダラム（＝）陰性菌１例えばＥ、　ｃｏｌｉ；Ｐｓ 、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；Ｐｓ、　ｐｕｔｉｄａもしくはＰｓ、　ｇｌｕ＋５ ａｅ（Ｉ日称Ｐｓ、　ｇｌａｄｉｏｌｉ）から選択されたグラム陰性菌でもよく 、またはＢａｃｉｌｌｕｓ＋Ｃｏｒｙｎｅｂａｅｔｅｒｉｕｍもしくは５ｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｅｃｕｓ属から選択された原核生物でもよく、特に、例えばＰｓｅ ｕｄ。 ｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ種に所属しＰｓ、　ｇ！ｕｍａｅ（Ｐｓ、　ｇｌａｄ ｉｏ！ｉと同＃ｌ）に由来のリパーゼ遺伝子を発現する原核生物でもよい。 または宿主生物は、真核生物、例えば、５ａｅｃｂａｒｏｓｙｅｅｓ属もしくは Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母でもよく、または＾ｓｐｅｒｇ　ｉ　ｌ　−１ｕｓ 属の真菌類でもよい。 リパーゼ産生に有用な異種宿主細胞の例は、Ｅｓｅｈｅｒｉｅｂｉａｃｏｌｉ、 　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓ、　ｐｕｔｉｄａであ る０本来のリパーゼ遺伝子が欠失したＰｓ、　ｇｌｕｍａｅはより好適な宿主で ある。量産に好ましい宿主系は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｌｉｔｉｓ、Ｓａｅ ｃｈａｒｏｍｙｅｅｓ　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅとその関連種、Ｈａｎｓｅｎｕｌ ａ　ｐｏｌｙａｏｒｐｈａとその関連種、及び＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の微生 物である。 （突然変異体）リパーゼを効率よく分泌するように特別に選択され及び／または 修飾されたダラム（−）陰性菌も量産に適した宿主である。宿主細胞が広範囲の 多様な微生物から選択できることを反映して、実施例で詳細に説明しない他の微 生物も宿主細胞として使用し得る。 好ましい微生物顕のうちでも、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅ（従来の 通称Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ　ｇｌａｄｉｏｌｉ）が本発明の方法及び産物のベー スとして好ましい、好ましいリパーゼをコードする遺伝子のアミノ酸配列及びヌ クレオチド配列はいずれもこれまで知られていなかった。後述するように本発明 によってこの細菌の好ましいリパーゼをコードする遺伝子が単離された。 本発明はまた、以下のような方法でリパーゼの安定性を改良し得る： ＜ａ）洗剤系中の酵素の電荷が洗剤系のｐＨにより近付くように酵素の表面電荷 が変化するような突然変異を生じさせる方法、このためには、酵素のコンホーメ ーションを破壊することなくまた活性部位の周囲の電荷に過度の影響を与えるこ となく酸性アミノ酸残基を中性または塩基性アミノ酸に代える。 （ｂ）リパーゼタンパク質産物のループ構造が物理的もしくは化学的変性または 酵素開裂に対して安定するようにリパーゼアミノ酸配列をｒＤＮ八手へによって 修飾する方法。 リパーゼのいくつかのループは、同じく洗剤系に存在する１０テアーゼによる開 裂に対して極めて敏感である。開裂に対するこれらのループの耐性を改良する有 力な方法は、これらのループの所望のフレキシビリティを破壊しないようにして 開裂部位のアミノ酸をプロリンによって１換する方法である。これらのループの 安定性を改良する別の方法は、ｒＤＮ八手へによって該ループの酸性アミノ酸残 基を塩基性アミノ酸残基によって置換するか、またはその他の手段によって実効 正電荷を増加させ、これによってリパーゼとプロテアーゼとの間に折力を生じさ せる方法である。ある種のループは、アミノ酸残基の欠失及び対応するヌクレオ チドトリプレットの欠失によってリパーゼの精造に本質的な影響を与えることな く短縮され得る。（攻撃されるリパーゼのＮ−末端に向かって）切れ易い結合か ら２残基及び４残基の位置ではズブチリシンが非極性アミノ酸を好むので、これ らの位置の１つ以上のアミノ酸にａｓｐ、　ｇｌｕ、Ｉｙｓ、ａｒｇ、ｂｉｇ、 　ｇｌｎまたはａｓｎなどの１つ以上の極性または荷電アミノ酸残基を置換また は導入することによって、ズブチリシンによるタンパク質分解に対する耐性が改 良され得る。 これらの変化は例えば、（ｉ）ズブチリシン開裂部位の配列、即ち親酵素中のズ ブチリシン開裂を受け易い結合のどちらかの側の５残基以内の配列を、突然変異 以前に存在していたかかる部位の部分を構成する１つまたは２つ好ましくは３つ のアミノ酸残基の欠失によって修飾するか、または、（ｉｉ）かかる開裂部位に 少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基もしくは少なくとも１つのプロリン残基を 挿入もしくは置換によって導入するか、または、（ｉｉ）かかる部位に正電荷ア ミノ酸を導入するかもしくは負電荷アミノ酸を除去することによって該部位の静 電ポテンシャルを変更することによって得られる。 例えば、（ｉ）突然変異が、Ｐｓ、　ｇｌｕｍａｅに由来のリパーゼもしくはそ の相同体の配列の突然変異（例えば旧５４Ｐ）、またはＰｓ、　ｃｅｐａｃｉａ に由来のリパーゼもしくはその相同体の配列の突然変異（例えば５１５３Ｐ）で ある場合等、親酵素中のズブチリシン開裂を受け易い結合の開裂によって新しい Ｎ−末端になるアミノ酸残基をプロリンによって１換し得る。及び／または、（ ｉｉ）突然変異が、Ｐｓ、　ｇｌｕ輸ａｅに由来のリパーゼもしくはその相同体 の配列の突然変異Ｖ１５０Ｄである場合等には、切れ易い結合から２つまたは４ つの位置のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基またはより極性のアミノ酸残基によ って１換し得る。 （ｃ　）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅリパーゼをコードする遺伝子は 、この遺伝子が真核細胞宿主に転移されたときにグリコジル化され得る２つの部 位を含む、特に酵素の活性中心及び脂質結合領域の外部でグリコジル化が生じる ときは、グリコジル化によって酵素を安定させる効果が得られる。グリコジル化 はまた、リパーゼに対する脂質の結合を妨害し得る。 （ｄ）リパーゼ酵素中のメチオニン残基は洗剤系中では酸化によって極めて容易 に失活する。多くの好ましいリパーゼにはメチオニンが１つしか存在しないので 、このメチオニンを欠失させるかまたは別の残基で置換する有用な修飾がｒＤＮ ＾手法によって比較的容易に行なわれる。 （ｅ）ｒＤＮ八手へは、安定性を改良するためだけでなく、リパーゼの比活性及 び汚染質（ｓｏｉｌ　５ａｔｅｒｉｅｅｓ）中の脂質に対する親和性を改良する ために、リパーゼの活性結合部位を決定し、これらの部位またはその近傍のアミ ノ酸を修飾するためにも使用された。 現存する突然変異リパーゼの好ましい例は、Ｈｉｓ　１５４Ｐｒｏ（Ｈ１５４Ｐ ）突然変異をもつＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｓａｅ由来のリパーゼに基づ いたものであり、これはリパーゼの三次構造のループの１つのプロテアーゼ分解 に弱い部位をより強い部位によって置換したものであると考えられている。 本発明によれば、好ましいリパーゼ類のＰｓｅｕｄｏｍｏｎｍｓもしくは別の起 源に由来の修飾（突然変異体）リパーゼ、または、プロテアーゼ消化に対する酵 素の安定性を増加させるように例えばアミノ酸配列が（１つまたは複数の）修飾 を含むかまたはグリコジル化（の様相）が変化した産生用異種生物中で発現され た修飾または非修飾配列をもつリパーゼは特に、プロテアーゼ、例えばズブチリ シン型プロテアーゼと併用されたときに洗剤及び洗浄組成物中で有効であること が知見された。 従って本発明は、細菌リパーゼ例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕ−ｓａｅ のアミノ酸配列と実質的に相同のアミノ酸配列を有し、対応する細菌リパーゼま たはその突然変異体をコードする遺伝子を宿主微生物に導入するために、ｒＤＮ 八手へに基づいて異種真核細胞宿主微生物によって産生されるリパーゼを提供す る。前記リパーゼは前記遺伝子の超厚となる親機生物によって産生されるリパー ゼとは異なる形態にグリコジル化されている。 本発明の別の特徴によれば、リパーゼの実効正電荷及びそのｐｌを増加させるよ うに選択されたアミノ酸配列（１つまた複数の）修飾Ｐ有する、Ｐｓｅｕｄｏａ ＋ｏｎｍｓに由来する修飾（突然変異〉リパーゼまたは好ましい別のリパーゼ類 も、特にプロテアーゼ、Ｍ　７ばてブチリシン型プロテアーゼと併用されると１ 削及び１刑組成物中で有効であることが判明した。 適当な突黙″Ｓ胃の例は、負電荷をもつ残基（例えばアスパラギン酸もしくはグ ルタミン酸の残基）の欠失または中性残基（例えばセリン、グリシン及びプロリ ン）による置換、あるいは正電荷ともつアミノ酸残基（例えばアルギニンまたは りシン）による中性もしくは陰性残基のＩＰＡ、あるいは正電荷をＧつ残基の挿 入である。 実効正電荷及び０１分増加させるこのような突然変異の好適例は、Ｄ１５７Ｒ， Ｄ５５＾及びｌｌｌ０Ｋである。 選択宿主中でグリコジル化されることができ、これによってプロテアーゼ攻撃に 対する安定性が改良される組み合わせアミノ酸残基の導入（挿入または置換）の 好適例は、突然変異Ｄ１５７Ｔ及びＮ１５５とＴ１５６との間のＧの挿入によっ て与えられる。過度のグリコジル化を制限するかまたは不要な位！のグリコジル 化を避けたい場合には、本来のリパーゼの潜在的グリコジル化部位を除去し得る 。 以下の表は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍｉｅに由来のリパーゼの配列に 基づく本発明の突然変異リパーゼの有用ないくつかの例に内包された突然変異を 示す。 以下の突然変異体の表、請求の範囲及び明細嘗の別の箇所において、ペプチド配 列中のアミノ酸及びアミノ酸残基は以下の１文字表二己または３文字表記の略号 で示される：Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン １＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｗ＝−Ｔｒｐ＝トリプトファン ＲＬ＝Ｎｅｔ＝メチオニン Ｇ＝ｃ＋ｙ＝グリシン Ｓ−５ｅｒ＝セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝）レオニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システィン Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン Ｎ＝＾ｓｎ＝アスパラギン Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン Ｄ＝＾ｓｐ−アスパラギン酸 Ｅ＝ＧＩｕ＝グルタミン酸 に＝Ｌｙｓ＝リジン Ｒ＝＾ｒｇ＝アルギニン Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン 本明細書、請求の範囲において、タンパク質のアミノ酸配列中に存在する突然変 異、従って突然変異タンパク質自体は以下のごとく突然変異の位置及び種類を、 突然変異によって影響を受けた元のアミノ酸残基の名称；突然変異の部位（配列 順位）；元のアミノ酸残基にＭ換導入されたアミノ酸残基の名称を示す略式表記 によって示す、配列に追加のアミノ酸が挿入された場合には、その位１は、正常 配列または基準配列の直前の最終アミノ酸の番号に１つまたは複数の下付き文字 を添えて示す。 例えば、１５０位のバリンがプロリンで置換された突然変異体はＶａ１１５０Ｐ ｒｏまたはＶ１５０Ｐと表記する。（仮に）バリンの後にプロリンのような追加 アミノ酸残基が挿入された場合にはＶａｌ１５０ＶａｌＰｒｏまたはＶ１５０Ｖ Ｐと表記するかまたは１１５０ａＰと表記し、挿入された残基の位置が番号１５ ０ａで示される。 （仮に）同じ位１のバリンが欠失した場合には、Ｖａｌ１５０車またはＶ１５０ ＊と表記する。＊（アステリスク）印は、これによる指定位置のアミノ酸残基の 欠失または欠如を示す、現実に生じた欠失でもよく、または該位置に残基を有す る別の配列もしくは基準配列との相同性の比較だけで判断された欠如であっても よい。 多重突然変異はプラス符号で示す０例えば、Ｖ１５０Ｐ＋　５１５２Ｐ＋　Ｂ１ ５４Ｐは、アミノ酸配列中の指定された３つの位置の各々で、指定された置換に よる３つの突然変異が生じた突然変異タンパク質を示す、所望の場合には以下の 表に示す突然変異を組み合わせることも可能である。 表： Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅリパーゼ配列に基づく突然変異リパーゼ 国株　突然変異 （ラベル）： ＰＣｌ３　Ｖ１５０Ａ ＰＣ：Ｌ　５　Ｖ１５０Ｓ ＰＣｌ３　Ｖ１５０Ｄ ＰＣ：Ｌ７　Ｖ１５０Ｋ ＰにＬ８　Ｄ１５９Ｅ ＰＣｌ２４　１１１５４Ｐ ＰＣｌ３１　５１５３Ｐ ＰＣｌ２７　５１５３Ｒ ＰＣ：Ｌ３３　）１１５４Ｒ ＰＣ：Ｌ３９　Ｄ１５７Ｒ ＰＣｌ３２　５１５３Ｇ ＰＣ：Ｌ３４　［］１５４Ｇ ＰＧＬ３７　５１５３Ｐ＋　Ｈ１５４ＰＰにＬ５５　５１５２Ｐ＋　Ｈ１５４Ｐ ＰＣＬ５６　Ｖ１５０Ｐ＋１１１５４ＰＰ［；Ｌ５８　Ｖ１５０Ｐ＋　５１５２ Ｐ＋　Ｈ＋５４ＰＰＧＬ３６　５１５３Ｒ＋　Ｂ１５４ＲＰｌ：Ｌ３８　５１５ ３に　＋）！１５４にＰＧＬ５７　５１５１Ｒ＋Ｈ１５４Ｐ ＰにＬ３５　５１５３に＋　Ｉ（１５４ＰＰ（：Ｌ５９　５１５２本十５１Ｓ３ 本＋Ｉ（１５４ＰＰＣＬ４０　５１５２＾＋寧１５２ａＬ＋　車１５３ａＣ＋本 １５４ａＰ（１５２Ｎ１５４位の配列ＳＳＨが正味３つの挿入を含む＾ＬＳＧＩ ＩＰになる）ＰＣｌ４１　５１５２＾＋率１５２ａＬ＋　富１５３ａＧ＋　車１ ５４ａＰ＋　Ｎ１５５Ｒ＋　Ｔ１５６Ｌ＋　Ｄ１５７Ｐ＋　Ｄ１５９Ｎ（１５２ 〜１５９位の配列５ＳＨＮＴＤＱＤが正味３つの挿入を含む＾ＬＳｆ；ＨＰＲＬ ＰＱＮになる）ＰＣｌ４２　Ｎ４８Ｓ ＰＣ：Ｌ４３　Ｎ２３８Ｓ ＰＣｌ４４　ｍ１５５ａＧ ＰにＬ４５　Ｄ１５７Ｔ ＰにＬ４６　Ｎ４８Ｓ士Ｎ２３８Ｓ ＰにＬ１２　８１５＾ ＰにＬ１３　Ｔ１０９Ｄ ＰＣ：Ｌ１４　Ｔｌｌ０Ｋ ＰＣｌ１６　Ｒ２Ｏ ＰＣｌ１７　Ｒ２Ｏ ＰＣｌ１８　Ｒ６１Ｆ ＰＣｌ１９　Ｒ７０Ｑ ＰＣｌ２０　＾７４Ｓ ＰＣｌ２１　Ｓ８７＾ ＰＣｌ２２　Ｒ９４Ｄ ＰＣＬ２３　Ｒ４９Ｑ ＰにＬ２８　Ｄ５５＾ ＰＣ：Ｌ２９　Ｄ５６＾ ＰＧＬ３０　Ｄ２６３Ｅ Ｐ［：Ｌ６０　Ｄ１２１Ｅ ＰＧＬ６１　Ｄ２８７Ｅ ＰＧＬ６２　Ｈ２８５＾ Ｐ（：Ｌ６３　Ｍ２５４１ 本発明はまた、細菌リパーゼ遺伝子、例えばＰｓ　ｇｌｕ＊ａｅ由来の遺伝子を クローニングベクターに導入することによって得られる遺伝材料を提供し、加え て、新しい宿主細胞を形質転換し新しい宿主細胞中でリパーゼ遺伝子を発現させ るためのこれらの材料の使用を提案する。 本発明はまた、ｒＤＮ八手へによって作製または修飾されかかるリパーゼをコー ドするポリヌクレオチド、ががるポリヌクレオチドを含むベクター、及び、かか るポリヌクレオチド及び／またはかかるベクターを含む人工的、に改変された微 生物を提供する。 本発明はまた、リパーゼ酵素をコードする対応するポリヌクレオチド、特に、例 えば実質的に図２に示す配列の成熟リパーゼまたはその機能性等個物またはその 突然変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。このポ リヌクレオチドにおいては、最終翻訳コドンの後に停止コドンが存在し、また場 合により、成熟リパーゼをコードするヌクレオチド配列の直ぐ上流にこのリパー ゼのプレ配列をコードするヌクレオチド配列が含まれている。 かかるポリヌクレオチドにおいては、超厚生物に由来のリパーゼをコードするヌ クレオチド配列が１次のように修飾され得る。即ち、請求項１６から２３のいず れか一項に特定した新しい宿主によって好まれ且つ等価のアミノ酸残基をコード する少なくとも１つのコドン、好ましくはできるだけ多くのコドンを形成するた めの「サイレント」突然変異の主体となり、従って使用中に宿主細胞中に、改良 された安定性をもつ導入遺伝子のメツセンジャーＲＮ＾を、与えるように、修飾 され得る。 １０−または成熟リパーゼをコードするヌクレオチド配列の上流に、選択宿主に 適したシグナルまたは分泌配列をコードするヌクレオチド配列を配！してもよい 。 従って、本発明の１つの実施態様は、好ましい類に属する（修飾）リパーゼまた はその前駆物質をコードするヌクレオチド配列が挿入されたｒＤＮ＾ＤＮＡ−に 係る。 ヌクレオチド配列は例えば以下の配列から得られる：（ａ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ｇｌｕｍａｅ（図２）によって産生されるプレリパーゼの出発アミノ酸配 列をコードする天然産ヌクレオチド配列（例えば図２のヌクレオチド配列）；（ ｂ）新しい宿主細胞によって好まれるコドン（−例３図５に示す）と新しい宿主 中の安定なメツセンジャーＲＮ＾になるヌクレオチド配列とから成り出発アミノ 酸配列をコードしている化学的に合成されたヌクレオチド配列。 （ｃ　）ＥＰ　０２０５２０８及びＥＰ　Ｏ２０６３９０に記載のごときＰｓｅ ｕｄｏ−ｓｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＩＡＭ　１０５７のリパーゼに 対して怒作された抗体に対して陽性の交差免疫反応性を示すリパーゼをコードす るヌクレオチド配列； （ｄ）前項（ａ）、（ｂ）または（Ｃ）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の １つに由来し異なるアミノ酸配列を有するが洗剤系中で優れた安定性及び／また は活性を有するリパーゼをコードする遺伝子工学的なヌクレオチド配列。 １つの好ましい宿主細胞中で上記のごときリパーゼ遺伝子をコードするヌクレオ チド配列の発現を導くベクターは好ましくは以下の諸成分を含む： （ａ＞成熟リパーゼまたはプレリパーゼ（例えば区２のリパーゼまたはこれに基 づく突然変異配列）、または（選択宿主細胞に好まれる）分泌シグナルの直ぐ下 流のプレ配列の一８部が除去された対応プレリパーゼをコードする二重ｉｔ　（ ｄｓ）ＤＮＡ〔翻訳されるべき遺伝子部分がＡＴＧコドンで始まっていない場合 には、初端にへＴＣコドンを配置しなければならない、遺伝子の翻訳された部分 は常に適当な停止コドンで終了しなければならない〕； （ｂ）リパーゼをコードするｄｓＤＮ＾（成分（ａ））のプラス鎖の上流に位置 する（選択宿主生物に適した）発現レギユロン；（Ｃ）リパーゼをコードするｄ ｓＤＮ＾（成分（ａ））のプラス鎖の下流に位１する（選択宿主細胞に適した） ターミネータ配列；（ｄ）選択宿主のゲノムまたは選択宿主の適当な複製超厚に ｄｓＤＮ＾及び任意に（栄養要求性）選択マーカーを取込ませ易くするヌクレオ チド配列： （ｅ）任意成分として、選択された宿主に存在する１形態のリパーゼ前駆物質（ 例えば選択された宿主の適当な複製超厚）の成熟及び／または分泌に関与するタ ンパク質をコードするｄｓＤＮ＾配列。 かかるベクターは、上記に定義したポリヌクレオチドの上流及び／または下流に 、リパーゼの機能性発現を容易にするための別の配列を含み得る。栄養要求性マ ーカーは栄養要求性マーカーのコード領域と欠失プロモーター領域とから成り得 る。 本発明はまた、突然変異リパーゼの産生方法を提供する。 該方法は、異種超厚の遺伝子、またはリパーゼのアミノ酸配列に影響を与える少 なくとも１つの突然変異を含む遺伝子であって、プロテアーゼ及び／または酸化 剤による攻撃に対して改良された安定性及び／または対応する親酵素に比べて増 加した活性をリパーゼに与えるｒＤＮＤＮＡによって作製される遺伝子を有する 人工的に改変された微生物を発酵培養する段階と、該微生物によって産生された リパーゼを発酵ブイヨンから分離するかまたは該微生物の細胞を発酵ブイヨンか ら分離することによってリパーゼ調製物を調製する段階と、分離した細胞を破壊 し、物理的または化学的濃ｍまたは精製処理によって前記ブイヨンまたは前記細 胞からリパーゼを濃縮または部分精製する段階を含む。 従っていくつかの態様で、本発明は、リパーゼ遺伝子を含み、ｒＤＮＤＮＡによ るリパーゼ産生及び発酵プロセスによって当該微生物の１つに由来するリパーゼ またはかかるリパーゼの修飾形を産生し得る人工的に改変された微生物を提供す る。 人工的に改変された微生物中で、天然形（ｎａｔｉｖｅ）リパーゼをコードする 遺伝子（が最初から存在している場合）は、好ましくは除去される０例えば別の 構造遺伝子によって置換される。 本発明の別の実施態様では、前記リパーゼの種々の形態または関連宿主の１つを 発酵によって産生する。かかる発酵は普通のバッチ発酵でもよく、補給型バッチ （ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵でもよく、または連続発酵でもよい、使用すべき方 法の選択は、宿主菌株及び下流の好ましいプロセッシング方法（公知）に依存す る。 好ましくは、リパーゼが微生物によって発酵ブイヨン中に分泌されるような条件 を使用する。リパーゼは、ｒ過または遠心によって細胞を除去した後でブイヨン から回収される０次いで場合により、リパーゼを濃縮しエタノール抽出によっで ある程度まで精製する。 特殊な性質の微生物以外では発酵プロセスは、公知の発酵技術並びに常用の発酵 及び下流プロセッシング装置に基づく。 本発明はｔな、製造中にリパーゼによって生じ得るアレルギー反応を抑制するた めに種々のリパーゼをカプセル化する方法を含む、リパーゼのカプセル化はまた 、洗剤系中のリパーゼの安定性及び効力を強化する。 本発明はまた、ｒＤＮＤＮＡによって細菌リパーゼを産生じ得る改変微生物の産 生方法を提供する。該方法の特徴は、微生物に導入される細菌をコードする遺伝 子の５°−末端が宿主生物のシグナル−または分泌配列としてＩ！能する（修飾 ）プレ配列をコードする遺伝子フラグメントに融合することである。 宿主生物は、図２に示すようなアレ１０リパーゼに実質的に対応する修飾遺伝子 またはその機能性等個物を与えるかまたは含むものでよい。 本発明の特定実施５様においては、細菌起源の遺伝子が人工的プロ配列によって 真核生物１例えば＃ｆ！または真菌類に導入される。 本発明に関して好ましいリパーゼ想は、グラム（−）＃性菌由来のリパーゼであ り、その例としては、Ｐｓ、　ｆｌｕｏｒｅｓ−ｃｅｎｓ、Ｐｓ、　ｇｌａｄｉ ｏｌｉ及びＣｈｒｏｍｏｂａｅｔｅｒの菌株に由来のリパーゼに免疫的に関連す るリパーゼのようなＥＰ　Ｏ２０５２０８及び０２０６３９０（Ｕｎｉｌｅｖｅ ｒ）で定義されたグループのリパーゼ酵素がある。 多くの文献は、グラム（−）陰性菌が細胞外酵素の良好な産生体でないと記載し ている。従って現状では、洗剤系用酵素のごときバルク酵素を産生ずるための発 酵プロセスでグラム（−）陰性菌は全く使用されていない０本発明では、かかる Ｅ薗がリパーゼ産生用宿主細胞に有用であるという意外な知見が得られた。 本発明はまた、好ましい分層に属する（修飾）リパーゼまたはその前駆Ｔｈ１ｌ ｉ登コードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡベクターと提供する。 本発明は更に、酵素（リパーゼ）の超厚となる生物とは異なる宿主に酵素に対応 する遺伝子をＯＮ八へ法によって導入し、この宿主中で前記の種々の形態のリパ ーゼを発酵によって産生ずる方法を提供する。 かかる発酵プロセスは普通のバッチ発酵でもよく、補給型バッチ発酵でもよく、 または連続発酵でもよい、使用すべきプロセスの選択は宿主菌株及び好ましい下 流プロセッシング方法に依存する。 宿主微生物は、リパーゼが微生物によって発酵ブイヨン中に分泌され、ｒ過また は遠心によって細胞を除去した後にリパーゼをブイヨンから回収できるように選 択されるのが好ましい。 次いで場合によりリパーゼを濃縮しエタノール抽出によっである程度まで精製す る。 いくつかの実施態様によれば本発明はまた、前述のごとく産生されたリパーゼを 含有するカプセル化組成物を提供する。それ自体公知の方法でカプセル化するこ とによって製造中または使用中にリパーゼによって生じ得るアレルギー反応を抑 制し得る。 別の実施態様によれば本発明はまた、ＥＰ　Ｏ２５８０６８に記載のごとき公知 種類の洗剤組成物用及び配合済み（ｆｕｌｌｙ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）洗剤及 び洗浄組成物用の添加剤のごとき、洗剤系で使用される別の成分をリパーゼと共 に含有する配合物を提供する。 本発明はまた、繊維製品の汚れの脂肪質の除去及び脂肪質に吸着された物質の除 去を有利に行なうために、洗剤系で使用される別の成分をリパーゼと共に含有す る配合物を提供する。 洗剤組成物の上記の別の成分は、例えばにＢ　１３７２０３４（Ｕｎｉｌｅｖｅ ｒ）、ＵＳＰ　３９５０２７７、ＵＳＰ　４０１１１６９／ＮＬ　７４０８６７ ３、ＥＰ　Ｏ１７９５３３（Ｐｒｏｅｔｅｒ　＆　（：ａｍｂｌｅ）、ＥＰ　Ｏ ２０５２０８及び０２０６３９０（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、Ｊ＾６３−０７８００ ０（１９８８）（Ｌｉｏｎ　Ｃｏｒｐ／Ｋ　Ｍｕｋｏ−ｙａｍａ他）、及び、１ ９８８年６月のＲｅ５ｅａｒｃｂ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ　２９０５６に記載さ れたような公知の多くの洗剤組成物のいずれでもよい０本文中で引用されたいく つかの特許の記載内容及びこれらの文献の記載内容はすべて本発明に含まれるも のとする。 いくつかの有用な実施態様によれば、洗剤組成物は以下のごとく配合される： （ａ）ホスフェートビルグー、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、 アクリルまたは等価のポリマー、過ホウ酸漂白剤前駆物質、アミノ含有漂白剤活 性化物質、シリケートまたはその他の構造化剤、使用中に所望ｐＨに調整するた めのアルカリ及び中性無機塩を含有する粉末洗剤として配合された洗剤組成物。 （ｂ）ゼオライトビルグー、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ア クリルまたは等価のポリマー、過ホウ酸漂白剤前駆物質、アミン含有漂白剤活性 化物質、シリケートまたはその他の構造化剤、使用中に所望ｐｏに調整するため のアルカリ及び中性無機塩を含有する粉末洗剤として配合された洗剤組成物。 （ｃ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、保湿剤、有機酸、苛性ア ルカリを含み、ｐｉｆが９〜１０の値に調整された水性液体洗剤として配合され た洗剤組成物。 （ｄ）直鎖状アルコキシル化第１アルコールから本質的に成る非イオン性液体界 面活性剤、トリアセチン、三リン酸ナトリウム、苛性アルカリ、１水和過ホウ酸 漂白剤前駆物質、第三アミン漂白剤活性化物質を含み、ｐＨ約９〜１０に調整さ れた非水性液体洗剤として配合された洗剤組成物。 （ｅ）アニオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤、例えば夫々アルコキシル 化度約７及び約３のアニオン性界面活性剤と非イオン性界面活性荊混合物２実質 的に零に近い少量の中性無機塩、ホスフェートビルダー、過ホウ酸漂白剤前駆物 質、第三アミン漂白剤活性化物質、ケイ酸ナトリウム、微量成分及び水分を含有 する嵩密度５５０ｆＩ７１以上、好ましくは６００ｇ／１以上の顆粒状の粉末洗 剤として配合された洗剤組成物。 （ｆ）アルコキシル化度約７及び約３のアニオン性界面活性剤と非イオン性界面 活性剤混合物、実質的に零に近い少量の中性無機塩、ゼオライトビルグー、過ホ ウ酸漂白剤前駆物質、第三アミン漂白剤活性化物質、ケイ酸ナトリウム、微量成 分及び水分を含有する嵩密度６０ｈ＃以上の顆粒状の粉末洗剤として配合された 洗剤組成物。 （ｇ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリルポリマー、脂肪 酸石鹸、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、アミン添加または非添加のクレー粒 子、過ホウ酸漂白剤前駆物質、第三アミン漂白剤活性化物質、ケイ酸ナトリウム 、微量成分及び水分を含有する粉末洗ＩＦＩとして配合された洗剤組成物。 （ｈ）獣脂及びヤシ油の完全鹸化混合物を主成分とし、オルトリン酸で中和し、 プロテアーゼと混合し、更にギ酸ナトリウム、ホウ砂、プロピレングリコール及 びＫＭナトリウムと混合し、石鹸製造ラインで圧出された石鹸含有固形洗’ｉｉ Ｑ＜石鹸）として配合された洗剤組成物。 （ｊ）界面活性剤１１あたり０．４〜０．８ｇに対応する割合で使用されるとき ｐＨ９以下の洗液を与えるように配合された酵素洗剤組成物。 （ｋ＞界面活性剤１１あたり０．４〜ｏ、ａｙに対応する割合で使用されるとき ｐＨ８，５以上の洗液を与えるように配合された酵素洗剤組成物。 （１）界面活性剤１１あたり０，４〜Ｏ，Ｓ、、に対応する割合で使用されると きイオン強度０．０３以下、例えば０．０２以下の洗液を与えるように配合され た酵素洗剤組成物。 （ｍ）界面活性剤１１あたり０．４〜０．８２に対応する割合で使用されるとき イオン強度０．０１以上、例えば０．０２以上の洗液を与えるように配合された 酵素洗剤組成物。 リパーゼは、脂肪分解酵素と担体材料（例えばＥＰ　Ｏ２５８０６８に記載のも の及びＮｏｖｏの製品５ａｖｉｎａｓｅ及びＬｉｐｏｌａｓｅ）との顆粒状組成 物（または溶液もしくはスラリー）の形態で有効に添加され得る。 リパーゼの添加量は、広い範囲、例えば界面活性剤系または洗剤組成物１ｇあた り５０〜３０，０ＯＯＬＵの範囲から選択でき、しばしば１００ＬＵ／ｙ以上、 特に５００ＬＬＩ／ｙ以上、ときには１０００ＬＵ／ｙ以上が好ましく、更に２ ０００ＬＵ／ｙ以上または４０００ＬＵ／ｇ以上でもよい、従って、一般には５ ０〜４０００Ｌｕ／ｇの範囲であり、できる限り２００〜１００ＯＬＵ／ｇの範 囲である０本明細書ではＥＰ　Ｏ２５８０６８（Ｎｏｖｏ）で定義されたリパー ゼ単位を用いた。 存在し得るその他の酵素に関しても必要な変更を加えて同様のことが通用する。 その他の酵素について非限定的に考察する：アミラーゼが存在する場合、アミラ ーゼは洗剤組成物１ｇあたり約１〜約１００ＭＵ（マルトース単位）の範囲の量 （または０．０１４〜１．４、例えば０．０７〜０．７ＫＮＯ／ｇ（Ｎｏｖｏ単 位））で使用され得る；セルラーゼが存在する場合、セルラーゼは例えば洗剤組 成物１ｇあたり約０．３〜約３５ＣＥＶＵ単位の範囲で使用され得る。 組成物のプロテアーゼは例えば洗剤組成物１ｇあたり約０．０００２〜約０．０ ５＾ｎ５ｏｎ単位の範囲で使用され得る。別の単位で示すと、プロテアーゼは洗 剤組成物１ａｇあたり約１〜１００ＧＵ＃ｙの量で組成物に含有され得る。好ま しい使用量の範囲は、２〜５０ＧＩＪ／ｚｇ、特に好ましい範囲は５〜２０ｆｌ ：Ｕ／Ｂである。 ＧＵは、標準条件下にＮ−アセチルカゼインを基質として４０℃で１５分間のイ ンキュベーション中にグリシン１μ箇０！と当量のＮＨ２基を産生するタンパク 質分解酵素活性として定義されたグリシン単位である。 洗剤組成物は更に、以下の常用の洗剤成分を常用の１で含有し得る。これらは混 配合したもの、そうでないものいずれでもよく、無リン型（即ちリン酸含有ビル ダーを全く含まない）でもよい、従って組成物は全体として、例えば１〜５０重 量％、少なくとも約５重量％、しばしば約３５〜４０重量％の１種以上の有機及 び／または無機ビルグーを含有し得る。かかるビルダーの代表例は、前述のビル ダー、及び、より広範にアルカリ金属のオルト、ピロ及びトリーポリホスフェー ト、単独またはカルサイトと混合したアルカリ金属カーボネート、アルカリ金属 シトレート、アルカリ金属ニトリロ−トリアセテート、カルボキシ−メチルオキ シスクシネート、ゼオライト、ポリアセタールカルボキシレートなどである。 洗剤組成物は更に、漂白剤、または漂白剤前駆物質：または漂白剤及び／′また は前駆物質をその活性化剤と共に含む系を、１〜３５？５含有し得る。別の任意 成分として、発泡増進剤、発泡抑制剤、防腐剤、汚れ悲濁止剤、金属イオン封頒 剤、汚染再付着防止剤、香料、染料、酵素安定化剤などを含有し得る。 組成物は、繊維製品の洗濯、特に木綿及びポリエステル主体の布及び混紡製品の 洗濯に使用され得る０例えば、約６０〜６５℃以下、例えば約３０〜３５℃以下 の洗濯温度での使用に特に適している。洗液中で界面活性剤１１あたり例えば約 ０．４〜０．８．の濃度を与えるに十分な割合で組成物を使用するのが適当であ るが、必要に応じて使用量を上記範囲以上または以下の値に増減することも勿論 可能である。限定の意図なく１説明すると、洗剤組成物が後述する実施例Ｄ１〜 ０１４に記載の配合組成を有する場合には、配合洗剤組成物１１あたり約３ｇ〜 約６ｇの使用量が適当である。 かかる洗剤組成物において、１０テアーゼとリパーゼとが共存する場合には、１ ０より小さいｐｔを有するプロテアーゼを選択するのが有利である。　ＥＰ　Ｏ ２７１１５４（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、かかるプロテアーゼを多数開示している 。リパーゼと共に使用されるプロテアーゼはいくつかの場合には、例えばＢＰＮ ’型のズブチリシンまたはまたは文献に記載された他の多様な型のズブチリシン を含む、これらのズブチリシンのいくつかは洗剤で使用することが既に提案され ている。この例は、ＥＰ　Ｏ１３０７５６または欧州特許出願８７３０３７６１ 　（Ｇｅｎｅｎｔｅｅｈ）；ＬＩＳＰ　４７６００２５（Ｃｅｎｅｃｏｒ）　； 　ＥＰ　０２１４４３５（Ｆｌｅｎｋｅｌ）　；１１Ｉｏ　８７１０４６６１（ ＾−ｇｅｎ）；　Ｎｏ　８７１０５０５０（（：ｅｎｅｘ）；　Ｔｈｏｍａｓ他 。 Ｎａｔｕｒｅ（１９８６１５）、　ｐ３１６．　ｐｐ３７５〜３７６及びＪ　Ｍ ｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８７）１９３、　ｐｐ８０３〜８１３；Ｒｕ５ｓｅｌ他 、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）　３２８．　ｐｐ４９６〜５００などに記載さ れている突然変異体である。 添付の図、チャート図及びダイヤグラムを参照しながら本発明を実施例に基づい て以下に詳細に説明する。実施例１〜１３は本発明の実施の種々の段階を示して おり、ｒＤＮ＾手法とリパーゼ酵素の産生例とを詳細に説明する。その後の実施 例Ｄ１〜０１４はリパーゼが使用された適当な配合組成の洗剤組成物の非限定例 を示す。 実施例１　：Ｐ、＠Ｉｕｓａｅの（プレ）−リパーゼをコードする遺伝子の単離 及びキャラクタリゼーション実施例２：リバーゼ遺伝子が欠失したｐ、　ｇｌｕ ＠ａｅ菌株の構築 実施例３　：Ｐ、　ｇｌｕ鵬ａｅ（野性型）リパーゼをコードする合成遺伝子の 産生 実施例４：リパーゼ陰性ｐ、　ｇｌｕｍａｅ菌への野性型リパーゼをコードする 合成遺伝子の導入 実施例５：突然変異遺伝子の産生及びリパーゼ陰性Ｐ。 ｇｌｕｍａｅ菌への導入 実施例６　：Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中での合成リパーゼの発現実施例７　：Ｓ 、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での合成リパーゼの発現実施例８　：Ｈ，ｐｏｌｙ ｍｏｒｐｈａ中での合成リパーゼの発現実施例９二＾ｓｐｅｒｇ　ｉ　Ｉ　Ｉ　 ｕｓ中での合成リパーゼの発現実施例１０：Ｐ、ｇｌｕｍａｅ以外のグラム陰性 菌中でのリパーゼの発現 実施例１１：修飾リパーゼの改良されたプロテアーゼ耐性の測定 実施例１２：単一メチオニンの置換によって得られた酸化変性に対するＰ、　ｇ ｌｕｍａｅリパーゼの耐性の改良実施例１３：ズブチリシンによるリパーゼの開 裂部位の決定 本発明をいくつかの部分に分けて説明する実施例の記載において、参考文献は括 弧内の数字で示される。 以下の実施例で使用された菌株は、Ｂｉａｒｎ、　ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＣ ｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに 以下の受託番号で寄託された： Ｐｓｅｕｄｏｍｏｏａｓ　ｇｌｕｍａｅ＠ＰＧＩ株　ＣＢＳ　３２２．８９Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅｉｉ　Ｐに３株　ＣＢＳ　３２３．８９Ｐｓ ｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅ’！ＩＰＣＴ８９株　ＣＢＳ　２６２．９０ 実施例と参照することによって本発明を容易に理解せしめる添付図面の内容を以 下に簡単に説明する：ロ１：実施例１のプラスミドの構築 図２＝ヌクレオチド１１８以後によってコードされたアミノ末端を有するＰｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅに由来のリパーゼ遺伝子の完全ヌクレオチド配 列（１０４７ｂｐ）及びアミノ酸配列図３　ａ−ｂ　：実施例２のプラスミド構 築（及びその変形）図４：実施例２のプラスミド構築 １］５ａ−ｂ：実施ｆＩＡ３に由来の合成リパーゼ遺伝子図６．＾−Ｃ：実施例 ３に由来の遺伝子カセット図７　ａ−ｂ　：実施例４のプラスミド楕築図８：実 施例４に由来の突然変異遺伝子用オリゴマー図９：実施例６のプラスミド構築 図１０：実施例６のプラスミド橋築 図１１＝実施例６のプラスミド横築 図１２ａ−ｂ　：実施例６のヌクレオチド配列１１１３：実施例６のプラスミド 構築 図１４．１４ｍ、実施例６のプラスミド構築及び結果図１５８：実施例７のウェ スタンプロット図１５ｂ−ｅ　：実施例７のプラスミド構築図１６．１６ａ−ｂ 　：実施例８のプラスミド構築図１７．１７ａ（：実施例９のプラスミド構築図 １８−２０　：実施例１０のプラスミド構築図２１：実施例１０の結果のウェス タンプロット図２２：突然変異微生物培養物の説明図図２３〜２６：実施例１１ の結果のグラフ実施例１　：　Ｐ、　ｇｌｕｍａｅの（プレ）−リパーゼをコー ドする遺伝子の単離及びキャラクタリゼーション Ｐ、　ｇｌｕｓａｅ染色体ＤＮへの単離ＬＢ培地中の１５１１の一夜培養物の細 胞を遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＨＢ４０−タ、１０ｋｒｐ−で１０分間）によって 収気した。細胞ペレットを一２０℃に一夜維持した。解凍した細胞をＺＨ／ｘｉ のリゾチームを含む１０１１の５ＳＣ（０，１５ＭのＮ＆ｃ１．０．０１５Ｍの クエン酸ナトリウム）に再懸濁させた。３７℃で３０分間インキュベーション後 、０．５ｚ１の１０％ＳＯＳを添加し、次いで７０℃で１０分間のインキュベー ションを行なった。４５℃に冷却後、１ｘ１のプロテイナーゼＫ（２Ｈ／ｘ１の Ｔｉ５−ＨＣｊ！　ｐＨ７，０，４５℃で３０分間プレインキュベー１〜）を添 加し、混合物を４５℃で更に約３０分間インキュベートした０次に、３．２ｘｌ の５ＭのＮａＣ１０，を添加し、次いで１５ｍ１のＣＨＣｌ、／イソーＣ，Ｈ， ，０１１（２４：１）で２回抽出しな、毎回の抽出後に遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ　 Ｈ５４，５ｋｒｐｍ／１０分間）を行なった。　１０ｉ＋ｆのエタノールを添加 して上清から［ｌＮ＾を沈降させた。７５％のエタノールで洗浄し、ＯＮ＾ペレ ットを２１１のＨ２Ｏに再懸濁させた。 遺伝子バンクの調製 Ｍａｎｉａｔｉｓ（１）によって記載された手順でＰ、　ｇｌｕｍｉｅのＤＮ＾ 調製物を制限酵素５ａｕ３八で部分消化した。コスミドベクターｃ２ＲＢ（，２ ）をＳ＋ｓａ　ｌ及びＢａ＋ｓＨＩで完全消化した０両方の酵素はロスミド中に １つの認識部位を有する。　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（５０１１ＮのＴｒｉｓ−Ｂ Ｃ１ｐＨ７，５，１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭのＭｇＣ １’２及び０．５ｍＭのｒＡＴＰ中）を用い、過剰のベクターフラグメントをＰ 、　ｇｌｕｌａｅ由来のＤＮＡフラグメントと結合した。このように得られた組 換えＤＮＡを、Ｈｏｈｎ（３）によって記載された手順でファージ粒子にパッケ ージした。このように得られた完全ファージ粒子を使用し、トランスフェクショ ンによって大腸菌１０４１０４６（、Ｆｉｍｌ、ｌａｅ、　ｂｓｄＲ，ｐｈｘ、 　５ｕｐＥ、ｂｓｄＭ、ｒｅｅ＾）を形質転換した。０．４％のマルトースを含 む５ｘｌの新しいＬＢ培地に大腸菌１０４６の０．５ｘｌの一夜培養物を接種し 、連続震盪下に３７℃で６時間インキュベートした。ファージ粒子を感染させる 前にＭｙＣ１２及びＣａＣ１ｚを最終濃度１０ｍＭに添加した。典型的な実験で は、５０１ｇのファージ粒子を５０１１の細胞と混合し、混合物と３７℃で１５ 分間インキュベートし、Ｌｏｏｔ／のＬＢ培地を添加し、３７℃でインキュベー ションを３０分間継続しな、　７５Ｈ／ｘｉのアンピシリン（Ｂｒｏｃａｅｅｆ ）を含むＬＢ−寒天プレートで細胞を直接平板化した。３７℃で一夜増殖させる と約３００のコロニーを計数できた。 オリゴヌクレオチド合成 リパーゼをコードするＤＮＡフラグメントのプローブとして、＾ｐｐｌｉｅ（Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅ曽ｓ　Ｇａｓ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ｒを使用し、エドマン分解によって決定された２４のＮ−末端アミノ酸の配列（ 後記参照）に基づくオリゴヌクレオチドを使用した。 確定されたアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸配列をコードする可能なヌクレオ チド配列全部を推定した。Ｐｂｏｓｐｈ。 −ａｍｄｉｔ手法（４）を用いた［ｌＮ＾シンセサイザー（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ　３８０＾）で、可能なヌクレオチド配列（所謂混合１０ −ブ）の全部または一部を含むデオキシ−オリゴヌクレオチドを合成した。１６ ％または２０％ポリアクリルアミドゲル（１）でオリゴヌクレオチドを精製した 。 放射性標識オリゴヌクレオチド１０−ブ常法通りに、０．１〜０．３ｍｇの精製 オリゴヌクレオチドを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｆ　ｐＨ７，５，１０ｍＭの ＨｇＣ１２，０，１ｍｇのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、７０＋ａＣｉのγ−コ ２Ｐ−＾ＴＰ　（３０００Ｃｉ　／　ｍｍｏｌ　、＾ｍｅｒｓｈａｍ）及び１０ 単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（＾−ｅｒｓｈ＋ｕｓ）中で最終容量１５ Ｍ１にして３７℃で３０分間インキュベーションすることによって標ヱした。　 Ｌｏａｌの０．５ＭのＥＤＴＡ　ｐＨ８，ｏで反応を終了させ、ＴＥバッファ＜ １０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＺ　ｐ）１８．０及びＩＪのＥＤＴＡ）で平衡させた ２、５ｚｌの５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ２５カラム（使い捨てシリンジ）に通した。 ２５０ｚｌの分画と収集し、そこから最初の２つの放射性分画、通常は分画４及 び５をプールし、ハイブリダイゼーションに使用した。 遺伝子バンクのスクリーニング 上記のごとく行なったいくつかのパッケージング及びトランスフェクション実験 から１合計約１０００個の個別コロニーが得られた。これらのコロニーを、１ウ エルあたり１５０μｌのＬＢ培地（１ｚｌあたり１００ｍｙのアンピシリン）な 含むＥＬＩＳ＾プレート（Ｃｒｅｉｎｅｒ、Ｆ形）に移した。３７℃で一夜増殖 させ、マイクロタイターウェルに合うように配列された６８個のビンをもった自 家製のテンペレートを用いて複製し、複製物も用意した。マスタープレートのウ ェルに５０μｌの５０％グリセロールを添加し、テンペレートによって慎重に混 合した後で、これらのプレートを一８０℃で保存した。複製物を使用して遺伝子 バンクをニトロセルロースフィルター側１１１ｉ−ｐｏｒｅ、）ＩＡＴＦ型０． ４５ｍｍ、口径１４ｃｍ）に移した。このために、１００Ｂ／ｍ１のアンピシリ ンを含むＬＢ−寒天プレートにセルロースフィルターを載せて予め湿らせた。テ ンペレートによる細菌の転移後に、コロニーを３７℃で一夜増殖させた。 ０．５Ｍの）ｂＯＨ及び１，５ＭのＮａＣＮで１５分間飽和させたーｂｉｔｔｍ ａ＋＞３ＭＭベーパーのスタック（堆積物）にフィルターを載せてフィルター上 のコロニーを溶菌した。乾燥紙にフィルターを載せて余剰の液体を除去した後、 ＩＮのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐ［＋７．０及び１．５ＪのＨｇＣ１で２〜３分間飽和 させた３８Ｍのペーパーのスタックに載せて中和した。最後に、フィルターを１ ０　ｘ　ＳＳＣ（１，５ＨのＮａＣ１’、０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム）に ３０秒間浸漬させ、風乾し、真空下に８０℃で２時間焼成した。（プレ）ハイブ リダイゼーションの前にフィルター全体を６５℃の３ｘＳＳＣ１０，１％のＳＤ Ｓ中でバッファを数回交換しながら１６〜２４時間洗浄した。コロニーが観察で きなくなると洗浄を終了した。 ５ＸＳＳＣ１５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ（１０Ｘ　ｄｅｎｈａｒｄｔｓ＝　０． ２％のｆｉｅｏｌｌ、０．２％のポリビニルピロリドン、０．２％のウシ血清ア ルブミン）、０．１％のＳＤＳ、５０請Ｈのリン酸ナトリウムｐＨ７，５，１％ のグリシン、１１０Ｏｘ／ｘ１の子ウシ胸腺ＤＮ＾（剪断して熱変性する）、５ ００μｇ／ｘｉのｔＲＮ＾と５０％の脱イオンホルムアミド中でフィルターのプ レハイブリダイゼーションを３７℃で２時間行なった。 放射性標識したく上記参照）混合プローブ（ｖｉｓ０２．３２ヌクレオチド）の ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ１ＩＸＤｅｎ−ｈａｒｄｔｓ、０．１％ のＳＯＳ、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐ［＋７．５．１１０Ｏｘ／ｘｌの子ウ シ胸腺ＤＮＡ、５００ｚｙ／＋＋１のｔＲＮ＾及び５０％の脱イオンホルムアミ ド中で３９℃で１６時間行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルターを室 温の６ｘＳＳＣで３×１５分間、２ｘ　ｓｓｃで１×１５分間、０．１％のＳＤ Ｓで順次洗浄し、オリゴヌクレオチドプローブの特性次第では室温にした。　ｖ ｉｓ０２の場合は、予め温めた０、１　ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ中で３７℃ で洗浄を１５分間延長した。上記の手順で遺伝子バンクをスクリーニングし、い くつかのコスミドクローンを単離した。更に詳細に研究するためにクローン５Ｃ ３（以後ｐＵＲ６０００と呼ぶ）を選択した。 リパーゼ遺伝子の配列決定 ｐＵＲ６０００をＢａｍＨＩで消化して得られたＤＮ＾フラグメントを、やはり ＢａｍＨｌで開裂したプラスミドｐＥＭＢＬ９（５）中で結合し、得られた組換 えＤＮＡを使用して大腸菌ＪＭＩＯＩ株（６）をＣａＣｌ２手順で形質転換し、 Ｘ−ｇａｌ（＝５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピ ラノシド）及びＩＰＴ（：（イソプロピル−チオガラクトシド）（１）を補充し たＬＢ−寒天プレートで平板化した。 ６８個の白色コロニーをマイクロタイタープレートに移し、コスミドバンクの記 載と同様のスクリーニング手順で処理した。いくつかの陽性クローンを単離でき た。これらのコロニーの１つから単離した代表的プラスミドを図１に示し、ｐＵ Ｒ６００２と命名する。このプラスミドをＥｃｏＲ■で消化すると、ゲルの上に 夫々長さ−４，１ｋｂ及び−２，１ｋｂの２つのフラグメントが観察された。別 のプラスミドｐＵＲ６００１は逆配向のＢａｍＨＩフラグメントを含んでいた。 ＥｅｏＲｌで消化後、このプラスミドは−６，１ｋｂ及び−７０ｂｐのフラグメ ントを生じた。 実質的に同じ手順でｐｔｌＲ６００６を構築した。この場合、ｐＵＲ６０００を ＥｅｏＲＩで消化し、その後にフラグメントを１ラスミドｐＬＡＦＲＩ（６ａ） のＥｃｏＲ１部位に結合した。形質転換体のスクリーニング後、−６ｋｂのＥｅ ｏＲＩフラグメントを含む陽性クローンを選択し、ｐＵＲ６００６と命名したく 図１）。 ｐＵＲ６００１及びｐＵＲ６００２の精製ＤＮ＾を使用し、α−３５Ｓ−ｄＡＴ Ｐ（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｉ）及びＫｌｅｎｏ−酵素（＾＋＊ｅｒｓｂａ＋ｓ） 、ｄｄＮＴＰ（Ｐｂａｒａ＋ａ−ｃｉａ−ＰＬ　Ｂｉｏｅｂｅｍｉｅａｌｓ）及 びｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い、Ｂｉｇ−ｇｉｎ他（８）によって 工己載されたように修正されたＳａｎｇｅｒジデオキシチェーンターミネーショ ン手Ｎ（７）によってヌクレオチド配列を確定した。また、ｄｌ：ＰＴを７−ジ アザ−ｄＣ：ＴＰに置換した５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ｋｉｔ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔ ａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ）を使用した。 配列決定反応産物を変性ポリアクリルアミドゲル上でＢｉＢｉｎ他（８）のバッ ファ勾配で分離した。 Ｐ、　ｇｌｕｍｉｅリパーゼ（以後εｌｕｍａｅリパーゼとも呼ぶ）遺伝子の完 全ヌクレオチド配列（１０７４ｂｐ）を図２に示す。 ヌクレオチド配列は３５８個のアミノ酸残基をコードする読取枠と停止コドンと を順次に含む。 推定アミノ酸配列は図２のヌクレオチド配列の下方のＩＵＰＡＣの１文字表記で 示される。 Ｐ、　ｇＩｕｍａｅ培養ブイヨンから精製されたリパーゼ酵素のＮＨ２−末端ア ミノ酸配列はＡＤＴＹ＾＾ＴＲＹＰＶ　ｒＬＶＩ（ＣＬＡＧＴＤＫ　トして同定 された。このアミノ酸配列はヌクレオチド１１８〜１８３（図２）によってコー ドされる。これらの知見から、第一に、成熟リパーゼ酵素が３１９個のアミノ酸 から構成され、計算分子量が３３，０９２ダルトンであるという結論が得られる 。 第二に、その酵素が３９個のアミノ酸残基、Ｎ−末端延長部（図２の−３９〜− １）をもつ前駆物質として合成される。 科学文献からは、多くの分泌タンパク質が前駆物質酵素として細胞内で産生され ることが周知である（９）、極く普通にはこれらの酵素は、Ｎ−末端延長部、所 謂リーダーペプチドまたはシグナル配列を含む、このペプチドは細菌膜との初期 相互作用に関与する。 グラム陰性菌中に観察されるシグナル配列は一般に以下の特徴を有する。 １、アミン末端領域は正電荷をもつアミノ酸残基を（平均で）２つ含む： ２、疎水性配列は１２〜１５残基から成る；３、開裂部位の領域がセリン、アラ ニンまたはグリシンで終わる； ４、全長は約２３個のアミノ酸から成る。 意外にも、かなり長いリパーゼシグナル配列は３９個のアミノ酸を含む、更に、 Ｎ−末端に正電荷をもつ４つのアミン酸を含む、グラム陰性菌の場合、これらは 例外型のシグナル配列であると考えられる。 その他の生物からの関連リパーゼをコードする遺伝子の単離 前記のごと（、Ｐ、　Ｈｌｕｍａｅリパーゼは免疫関連リパーゼのグループに属 する。ここから、これらの酵素は、種々の生物によって産生されるが、高度に保 存力のあるアミノ酸配列のストレッチを含むことが予測される。従って、ＤＮ＾ 配列中にある程度の相同性があるはずである。Ｐ、　ｇｌｕｍａｅリパーゼ遺伝 子が自由に得られるようになったので、他の生物からの関連リパーゼ遺伝子の単 離も容易である。 この手順は上記とほぼ同様でよい、該当する生物から（例えばコスミドまたはフ ァージλ中で）遺伝子バンクを作製する。このゲノムバンクは、−２，２ｋｂの ＢａｍＨＩフラグメント（前述）（の一部）をプローブとして用いてスクリーニ ングできる。陽性シグナルを与えるコロニーを単離しより詳細にキャラクタライ ズする。 参考文献： １、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、他、　Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ； Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２．　ｌ ５ＢＮ　８−８７９６９−１３６−０２゜　Ｂｉｔｅｓ、Ｐ、Ｆ、＆　５ｗ１ｆ ｔ、Ｒ，＾、（１９８３）　Ｇｅｎｅ、２６．　１３７〜１４６ ３、Ｈｏｈｎ、Ｂ、、（１９７９）Ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｖｏｌｏｇ ｙ、Ｖｏｌ　６８゜＾ｃａｄｅｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ２ ９！ＩＪ−３０９４、Ｂａｒｏｎｅ、＾、Ｄ、他、　（１９８４）　Ｎｕｅｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 Ｖｏｌ　１２．ｐｐ４０５１〜４０６１５、　Ｄｅｎｔｅ、　Ｌ、他、　（１９ ８３）　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ　１１゜ｐｐ １６４５〜１６５５ ６、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ、Ｖｏｌ　１０１゜＾ｅａｃｌｅｍｉｅ　ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ６ａ、　Ｆｒｉｅｄｍａｎ他、　Ｇｅｎｅ　１Ｂ　（１９８２）　２８’３− ２９６７、Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、、＆　Ｃｏｕｉｌｓｏｎ 、＾、Ｒ，（１９７７）。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、７４．５４６３〜５４６７ ８、　Ｂｉｇｇｉａ、　Ｍ、　Ｄ、他、　（１９８３）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅｉ。 ＵＳＡ、８０．３９６３〜３９６５ ９、　ｖｏｎ　Ｂｅ１ｊｎｅ、　Ｇ、　＆＾ｂｒａｈｍｓｅｎ、Ｌ、（１９８９ ）、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。 ２４４．４３９〜４４６ 実施例２：リパーゼ陰性Ｐ、　ｇｌｕｍａｅｌｉＰＧ２及びＰＣ３株の構築リパ ーゼ遺伝子が欠失したＰＧ２、及び、リパーゼ遺伝子がテトラサイクリン耐性（ Ｔｃ−ｒｅｓ）遺伝子で置換されたＰＣ３の構築は３つの主要ステップを含む。 Ａ　−ｐＵＲ６００１ヲ出発物ｉｊ　）−ス６　ｐＵＲ６１０６及Ｕ　ｐＬＩＲ ６１０７（大Ｒ菌中）の構築（実施ＰＡｌ参照）： ｐＵＲ６００１は−２，２ｋｂのＰ、　＆ｌｕｍａｅ染色体に由来のＢａｍＨｌ フラグメントを含む、このフラグメントに存在するリパーゼ遺伝子（１０７４塩 基対）は夫々−４８０及ヒ−６６０塩基対の５°−及び３゛−フランキング配列 を有する。 以後の構築段階は； ａ　、　ｐＵＲ６００１（大脳ｚＫ＾８１６株（＝　［：Ｍ４８、ｒｅｒ　Ｉｌ ｍ）（ｄ＋ｕ＋−３、ｄｃｍ−６、ｔｈｒ、ｌｅｕ、ｔｈｉ、　ＬｉｃＹ、ｇａ ｌＫ２、ｇａｌＴ２２、ａｒａ−１４、ｔｏｎ＾３１、ｔｓｘ−７８，５ｕｐＥ ４４）をＣ１ａ　ｌで部分消化して直線状プラスミドを得る。 ｂ、ＤＮＡｐフェノール抽出しエタノール沈殿ｍＬ、次いでＰｓｔ　ｌで消化す る。 ｃ、（Ｃ１ａｌ及びＰｓｔ　Ｉ付着端を有する）４．５１ｔｂのプラスミドＤＮ Ａフラグメントを単離し、ゲル電気泳動後のアガロースゲルから得られた一６７ ０ｂｐのＰｓｔｌフェノールシ透析バッグ内で電気溶出させる（１）。 ｄ、ｃＩｉｌ及びＰｓｔ　ｌ付ｆ端を有する得られたアラスミドＤＮ＾フラグメ ントを、Ｃ１ａｌ及びＰｓｔ付着端を有する合成リンカーフラ２“メント（下ｉ こ）と鮎、イトレｔ；。 Ｃｌａ　Ｉ　ＣＣＡＴＣＡ（：ＡＴＣＴＴ（：ＡＴＣＡＣＴ（：ＣＡ　Ｐｓｔ　 ＩＴＡＣＴＣＴＡ（：＾＾ＣＴＡＣＴに の合成フラグメントは制限酵素Ｂｅ１ｌ及びＢｇｌｌｌ制限酵素の認識部位を含 む。 大腸菌Ｓ＾１０１（ｈｓｄＲ，ｒｅｃ＾をもつＪＭＩＯＩ）を上記結合混合物で 形質転換後、ＬＢ−＾ｐ（１００μｇ／ｌ！のアンピシリンを含む）寒天プレー ト上で選択し、得られた形質転換体から制限酵素分析によってプラスミドをスク リーニングし１次の構築ステップのために正しい構造の１ラスミド（Ｎｏ、７） を選択しな。 この正しいプラスミドをＢＡＩＩＨｌ及び［１ｉｎｄｌで消化すると、−４ｋｂ のベクターフラグメントと一５００ｂｐのインサートフラグメントとが観察され た。 ｅ、ｄ、で記載のごとく得られたプラスミド構築物（Ｎｏ、７）をＰｓｔ　ｌで 消化し、Ｃ１で記載のごとく単離された一６７０ｂｐのＰｓｔ　ｌフラグメント に結合した。 ｆ、大腸菌５Ａ１０１を結合混合物で形質転換し、ＬＢ−＾ｐ（１００μ９／ｘ ｌのアンピシリンを含む）寒天プレート上で選択し、得られた形質転換体からプ ラスミドをスクリーニングした。　ＰｓＢフラグメントが異なる２つの配向を有 し得るので、これを制限酵素分析によって分析する必要があった。所望の構築物 は、ＢａｍＨｌで消化したときに一４ｋｂのベクターフラグメントと−１，２ｋ ｂのインサートフラグメントとが得られるような配向を有していなければならな い。 上記手ノ曜はど好誹しくはないが同じ結果を得るために別の次の手順も使用でき る。 ａ’、＠線状プラスミドを得るためにｐｔｌＲ６００２（大腸菌に＾８１６から ）をＣ！ａ　ｌによって部分消化する。 ｂ′、１％ゲル電気泳動後のアガロースゲルがら直線状プラスミドＤＮＡを単離 し透析バッグ（１）で電気溶出する。 ｃ’、Ｃ！ａｌで直線化したｐＵＲ６００２をＰｓｔ　（で部分消化する。 ｄｏ、得られたフラグメントをゲル電気泳動によって分層した後、−５ｋｂの所 望長さのベクターフラグメントを上記のごとく単離する。 ｅｏ、このように得られたＣ１ａ　ｌ及びＰｓｔ　１付着端を有するＤＮＡフラ グメントを、Ｃ１ａｌ及びＰｓｔ７付着端を有する合成りＮＡフラグメント（下 記）と結合した。 Ｃ１ａ　ｌ　ＣにＡＴにＡにＡＴＣＴＴにＡＴＣＡＣＴにＣＡ　Ｐｓｔ　ＩＴＡ ＣＴＣＴＡＧ＾八ＣＴＡＧＴ（： 更へ、その合成フラグメントはｔｅｈ制限酵素Ｂｅ１ｌ及びＢ。 ＩＨの認識部位を含む。 ｆｏ、上記結合混合物で大腸菌Ｓ＾１０１を形質転換し、このように得られた形 質転換体からプラスミドをスクリーニングする。 かかる正しいプラスミドの代表を図３に示し、ｐＵＲ６１０２と命名しな。 ｇ　、　ｐＵＲ６１０２をＢｇｌｌｌで完全に消化した。 ｈ　、　ｐＢＲ３２２（ｌｌｂ）を八ｖａｌ及びＥｏＲＩで完全に消化後、ＤＮ Ａフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離した。 テトラサイクリン耐性遺伝子を含む一１４３５塩基対のフラグメントを電気溶出 によってゲルから単離した。 ｉ、、（７１６Ｍのｔｒｉｓ−［ＩＣ１ｐ［１７，５，０，１ｍＨのＥＤＴ＾、 ５ｍＮのβ−メルカプトエタノール、７ＩＩＩＮのＭＩＦＣ１２，０，０５＋Ｍ のｄＮＴＰ及び０，１単位／ｘｉのＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを含むバッファ中 で）Ｔｃ−ｒｅｓ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの付着端を埋め戻し、直線化 したｐｔ！Ｒ６４０２を結合した。 ｊ、大腸菌Ｓ＾１０１を結合混合物で形質転換し、ＬＢ−Ｔｃ（２５ｚｇ／ｘ１ のテトラサイクリン）寒天プレートで選択し、得られた形質転換体から制限酵素 分析によってプラスミドをスクリーニングした。ｐＵＲ６１０２及びｐＵＲ６１ ０３のこの構築手順を図３に示す。 ｋ　、　ｐＨＲ６１０６をＢａｍＨ７で消化し、ｐＨＲ６１０６をＢａｍＨＩで 部分消化した。得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し 、所望のフラグメント（夫々−１１４５ｂ、及び−２５５０ｂｐ）を電気溶出に よってゲルから単離した。 １　、　ｐＲＺ１０２（１０）をＢａｗｌ　Ｉで完全に消化し、ｋ、で得られた ＢｉｍＨＩフラグメントに結合した。 ｍ、この結合混合物で大腸菌５１７−１（１１）を形質転換し、ＬＢ−に＋＊　 、　Ｔｃ　（夫々２５μ５ｏａｌ）で選択し、得られた形質転換体から制限酵素 分析によってプラスミドをスクリーニングした。 ＢａｍＨＩフラグメントを含む得られたプラスミドを夫々、ｐＵＲ６１０６及び ｐＵＲ６１０７（図４）と命名した。 Ｂ−Ｐ、　ｇｌｕｍａｅ染色体のリパーゼ遺伝子の欠失ａ、大腸菌５１７−１（ ｐＵＲ６１０６）（プラスミドｐｔｌＲ６１０６を含む大腸菌５１７−１の表記 法）との両親性結合（ｂｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｃｏｎｊｕｇａ−ｔｉｏｎ）を介 してｐ、　ｇｌｕｍａｅにｐＵＲ６１０６を導入する。 Ｐ、　ｇｌｕ＊ａｅコロニーをＭＭＥプレート（０，ｈ＃のＭＭｇＳｏｌ−７Ｈ ｚＯ１２／ｌのクエン酸−１１，０，１ｈ＃のに２）ＨＰＯ４，３，５ｇ／ｉの ＮａＮＨ，ＨＰＯ。 −４［１，Ｏｌｏ、５％のグルコース及び１．５％の寒天）から２０ｉ＋ｌのＬ ｕｒｉａブイヨン（ＬＢ）培地に移し、３０”Ｃで一夜増殖させた。 大腸菌５１７−１　（ｐＵＲ６１０６）を３１１のＬＢ培地、２５ｉｇ／ｗｌ　 Ｋｍで３７℃で一夜増殖させた。 翌日、Ｐ、　ｇｌｕｍａｅ培簑物を１：１希釈し、０Ｄ６６０が２．０〜２．５ になるまで３０℃で４〜５時間増殖させた。大腸菌５１７−１（ｐＵＲ６１０６ ）を１：５０に希釈し０Ｄ６６０が１．５〜２．０になるまで３７℃で４〜５時 間増殖させた。 結合のために、５００Ｄ単位（ＯＤ＝１で１単位＝　１ｚ１）　（２０〜２５ｚ １）のＰ、　ｇｌｕｍａｅ細胞と２．５００単位（１，：’−１．６ｉ１）の大 腸菌５１７−１（ｐＨＲ６１０６）とを混合し、５ｋｒｐｓ＋（ＨＳ２４−ロー タ）で１０分間、回転させた。その細胞ベレットを３つのＬＢプレートに分割し ３０℃で一夜インキユベートした。 次いで、その細胞材料をプレートから除去し、３ｚｆの０．９％のＮａＣｆ溶液 に再懸濁させ、遠心（１０分、ＲＴ、ＨＢ４−ロータ、４ｋｒｐｍ）によってベ レット化した。細胞ベレットを１．８ｚｆの０．９％のＮａＣＮ溶液に再！！濁 させ、３つのプレート（ＭＭＥ、０．５％グルコース、１．５％寒天、５０ｇｇ ／ｘｉのカナマイシン（Ｋｍ））に分割し、３０℃で増殖させた。　ｐＨＲ６１ ０６がＰ、ｇｌｕｍａｅ中で複製しないので、組込みによってＫｍ耐性トランス コンシュガントだけが得られた。これらの菌株中ではプラスミドρ０Ｒ６１０６ が５°−または３°−フランキング領域での単一組換え現象によって細菌染色体 に取込まれた。これらの菌株は機能性リパーゼ遺伝子をまだ含んでいるので、表 現型はリパーゼ陽性である。 ｂ、更に実験するために、このような２つの菌株（Ｐに−ＲＺ２１及びＰＣ−Ｒ Ｚ２５）を選択した。染色体［ＩＮ八からプラスミド及び機能性リパーゼ遺伝子 を欠失させるために、第２の組換え現象を生起する必要がある。このために、Ｋ ｍを含まない（選択圧力のない）ＬＢ培地で上記菌株を数日間増殖させ、ＢＹＰ Ｏ−プレー）　（１０ｇ、＃のトリブチカーゼペプトン、３ｇ／ｌの酵母抽出物 、５１７ｆのウシ抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣ４’、７９／１のＫＦｌ、ＰＯ４， ５０ｍ１ｌｌのオリーブ油懸濁液及び１５％の寒天）で個別コロニーを確保する 密度で細胞を平板化し、リパーゼ陰性コロニーをスクリーニングした。平板化す る際にこれらのリパーゼ陰性コロニーは選択プレート（ＭＭＥ−ＫＭ、　５０μ ｙ／ｘｉ’）で増殖しなかった。このようにして得られた菌株をＰに−２と命名 した。 Ｃ−Ｔｅ−ｒｅｓ遺伝子によるＰ、　ｇｌｕｍａｅ染色体のリパーゼ遺伝子の置 換 ａ、Ｂに記載のごとく大腸菌５１７−１　（ｐＵＲ６１０７）との結合を介して Ｐ、　ｇｌｕｍａｅにｐＨＲ６１０７を導入する。トランスコンシュガントの選 択処理を５ｏｚｇ／ｘｉのＴｃを含有するＭＭＥ培地で３０℃で実施した。 ｂ、このようにして得られたトランスコンシュガントを５０ｚｙ／ｘｉのＴｃを 含むＢＹＰＯ−プレート及び１００μｇ／ｘ１のＫｍを含むＭＭＥプレートに複 製した。いくつかのトランスコンシュガントかに１１惑受性（ＭＭＥ　Ｋｍ−１ ００プレート上で増殖せず）及びリパーゼ陰性（ＢＹＰＯ−プレート上で透明ゾ ーンなし）表現型を示した。（５′−フランキング及び３”−フランキング領域 における）ダブルクロスオーバーによって、リパーゼ遺伝子がＴｅ耐性遺伝子に よって置換された。更に研究を続けるために代表的な菌株を１つ選択しＰに−３ と命名した。 参考文献： １０、　Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｒ，＾、、　Ｒｏｔｈｓｔｅｒｉｏ、　Ｓ、　 Ｊ、、　ａｎｄ　Ｒｅｚｎｉ−ｋｏｆｆ　Ｈ，Ｓ、、　Ｍｏ１ｅｃ、　ｇｅｎ、 　Ｇｅｎｅｔ、　１１７．６５〜７２．　（１９７９）；１１、　Ｓｉｍｏｎ、 　Ｒ，、Ｐｒ１ｅｆｅｒ、　Ｕ、、　ａｎｄ　Ｐｕｅｈｌｅｒ、＾、、　Ｂｉｏ ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ、　７８４〜７９１．　（１９８３）；１１ｉ、　Ｍａ ｒｉｎｕｓ　Ｍ　Ｇ、　Ｍｏ１ｅｅ、　ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２７　 （１９７３）　４７〜５５； １１ｂ、　Ｂｏｌｉｖａｒ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ、　［：ｅｎｅ　２　（１９７７） 　９５゜実施例３　：Ｐ、　ｇｌｕｍａｅ（ｐｒｅ）−リパーゼをコードする合 成遺伝子の構築 Ｐ、　ｇｌｕｓａｅ（ｐｒｅ）−リパーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて 、複数のサイレント突然変異を含む新しい遺伝子を設計した。これらの突然変異 によって当該酵素のアミノ酸配列は変化しなかった。しかしながら、酵素の工学 的操作を容易にするためにＧ＋Ｃ％を低下させ、種々の異種宿主系（実施例６〜 １０参照）中でこの合成遺伝子を使用することが可能になった。 また、酵素の工学的操作が容易になるので、遺伝子中の適当な位置に制限酵素認 識部位を導入することも可能になった。 新しい遺伝子の配列をＩ２１５（＾）に示す。 新しい遺伝子と約２００ヌクレオチドの制限フラグメント、所謂カセットに分割 した。かかるカセットの一例を図６に示す。 各カセットの５°及び３゛末端を延長して夫々ＥｅｏＲ１部位及びＢｉｎｄｍ部 位を生じさせた。 これらのカセットのコーディングｇ３平均長さ３３塩基のオリゴヌクレオチド（ ｏｌｉｇｏｓ）に分割した。非コーディング鎖も、そのｏｌｉｇｏｓがコープイ ン′グ頒のｏｌｉｇｏｓと一５０％オーパーラ・ノブするように同様に分割した 。 ｏｌｉｇｏｓを実施例１に記載のごとく合成した。 フラグメントを組立てる前に、結合を容易にするために合成ｏ１ｉｇｏｓの５“ 末端をホスホリル化する必要がある。以下の手順でホスホリル化な行なった：等 モル量（５０ｐｍｏｌ）のｏｌｉｇｏｓをプールし、４０μｌの反応バッファ中 で８単位のポリヌクレオチドキナーゼと共に３７℃で３０〜４５分間キナーゼ処 理した。７０℃で５分間加熱して反応を停止させ、エタノール沈殿させた。 ７ｗ＊ｍｏ１／１のＴｒｉｓ−１１ｃｌｐＨ７，５，１０ＩＩＩＩＯ１／１の２ −メルカプト−エタノール、５＋ｍｍｏｌ＃の＾ＴＰを含む３０１１のバッファ にベレットを溶解してアニーリングを行なった０次いで、この混合物３６５℃の 水浴に５分間配置し、１時間にわたって３０℃に冷却した。ＨｇＣｌ２なＭＮＪ 度１０＋ｍｏＮ／Ｎに添加した。　Ｔ４　ＤＮＡ−リガーゼ〈２５単位）分添加 し、得られた混合物を３７℃で３０分間または１６℃でｏ／ｎに配！した。その 後で反応混合物を７０℃で１０分間加熱した。エタノール沈殿後にベレットを消 化バッファで溶解しＥｅｏＲｌ及びＨｉｎｄｌｎで切断した。 この混合物を２％アガロースゲルで分離し、正しく組立てられたカセットに対応 する長さのフラグメントと電気溶出によって単離した。 フラグメントを実施例１に示すように、（ＥｅｏＲＩ　／Ｈｉｎｄｌ［Ｉで消化 した）ｐＥＭＢＬ９に結合し、配列解析によって正しいか否かをチェックした０ 次のクローニングＩＩＮで、種々のカセットを適当な順序に配置し、ｐＨＲ６０ ３８を得た。これは完全な合成リパーゼ遺伝子を含むｐＥＭＢＬ９銹導体であ心 導体施例４に記載のごとき構築ができるように、この合成遺伝子の第２のバージ ョンをフラグメント５の１換によって形成した。このようにして、１０９１位の 代わりに１０６９位に３’　Ｐｓｔ部位を有する構築物ｐＵＲ６６００を作製し た（図５Ｂ参照）。 実施例４：リパーゼ陰性Ｐ、　ｇｌｕｍａｅ　Ｐ（：３への（野性型）合成リパ ーゼ遺伝子の導入 上記合成リパーゼ遺伝子がＰ４Ｉｕｍａｅ中で機能性であるか否かを試験するた めに、菌株ＰＧ３にその遺伝子を導入した。 発酵手瀬を簡単にするために、この遺伝子をプラスミドに導入するかわりにＰＧ ３染色体中に安定に取込ませることにした。このような理由から、合成リパーゼ 遺伝子に出発Ｐ、　ｇｌｕｍａｅリパーゼ遺伝子の５°及び３゛ボ一ダー配列を 与える必要がある。 これを以下の手順で行なった（図７）：ａ　、　ｐＵＲ６１１０（大腸菌に＾８ １６から）をＣ１ａ　Ｉで部分消化することによって直線状プラスミドを形成す る；ｂ、ＤＮＡのフェノール抽出及びエタノール沈殿（１）後に、Ｐｓｔ　Ｉで 消化する； ｃ、（Ｃｌａｌ及びＰｓｔ　ｌ粘着端を有する）−４，５ｋｂプラスミドＤＮＡ フラグメント、及び−６７０ｂｐのＰｓｔ　ｌフラグメントを単離する： ｄ、ＰｓｔｌによるｐＵＲ６６００（大腸菌に＾８１６から）の部分消化後にフ ェノール抽出、エタノール沈殿及びＣ１ａ　■による消化を順次行なう； ｅ、はぼ完全な合成リパーゼ遺伝子を含む一１０５０ｂｐのＤＮＡフラグメント を単離し、このフラグメントをＣ１で得られた−４．５ｋｂベクターに結合した 。その結合混合物で大腸菌Ｓ＾１０１を形質転換し、ＬＢ−＾ｐ（１００μｇ／ ｘｉのアンピシリン）プレートで選択し、制限酵素分析によって得られた形質転 換体からプラスミドをスクリーニングし、次の構築ステップのために正しいプラ スミド（Ｎｏ、２）を得た：ｆ、ｅ、で得られたプラスミド構築物（Ｎｏ、２） をＰｓｔ　ｌで消化し、Ｃ０に記載のごとく単離した一６７０ｂｐのＰｓｔ　ｌ フラグメントと結合した； ｇ、この結合混合物で大腸菌Ｓ＾１０１を形質転換し、ＬＢ−＾ｐ培地（１００ μｇｏｍｌのアンピシリン）プレートで選択し、得られた形質転換体からプラス ミドをスクリーニングした；　Ｐｓｉ　１フラグメントが異なる２つの配向を有 し得るので、これを制限酵素分析によって分析する必要があった；構築物中に、 ＢａｍＢ　Ｔによる消化によって一４ｋｂのベクターフラグメントと−２，２ｋ ｂのインサートフラグメントとを生じるような配向を探した；正しいプラスミド の代表をｐＵＲ６６０３と命名した；ｈ　、　ｐＵＲ６６０３をＢａｍＨＩで完 全に消化した：アガロースゲル電気泳動でフラグメントを分Ｍｒ＆、−２，２ｋ ｂのフラグメントを単離した；このフラグメントは５°及び３°フランキング領 域をもつ合成リパーゼ遺伝子を含んでいた；ｉ、更にｐＲＺ１０２をＢａ−）１ １で完全に消化した；ｊ、実施例２に記載のごとく、ｄ、で得られた２、２ｋｂ フラグメントをｐＲＺ１０２と結合した： に、得られた構築￥ｊｙＪｐＨＲ６１３１’ｒ大腸菌５１７−１に移入した。 少し不利にはなるが別の手順も可能である（図７１４照）：有するベクターを実 施例２と同様の方法で調製した。 ｂ’、　ｐＵＲ６６００（大腸菌に＾８１６から）をＣｌａ　ｌで完全消化しＰ ｓｔＩで部分消化した。アガロースゲル電気泳動によるフラグメントの分Ｍｆ＆ 、−１０５０ｂｐのフラグメントを単離した。 ｃ゛、このように得られたフラグメントをｐＵＲ６００２由来のベクターに結合 し、大腸菌Ｓ＾１０１を形質転換した。このようにして構築物ｐＵＲ６６０３が 得られた。 ｄ、ｐ’　ｔｌＲ６６０３をＢａ鵬ＩＩで完全消化した。アガロースゲル電気泳 動によるフラグメントの分離後、−２，２ｋｂのフラグメントを単離した。この フラグメントは野性型Ｐ、　ｇｌｉｄｉｏｌｉリパーゼ遺伝子の５′及び３°フ ランキング領域をもつ合成リパーゼ遺伝子を含んでいた。 ｅ　’　、　ｐＲＺ１０２をＢａｗｌ　ｌで完全に消化した。 ｆ’、ｄ”、で得られた２、２ｋｂのフラグメントを実施例２に記載したように ｐＲ２１０２と結合した。 ｇ、得られた構築Ｑ　ｐＵＲ６１３１を大腸菌５１７−１に移入した。実施例２ のＢ−ａ項のｐＬＲ６１０６に関する記載と同様にしてこの構築−２ＰＧ３の染 色体に組込んだ。 得られたＫｍ耐性トランスコンシュガントのいくつかをＢＹＰＯプレートに移し た。コロニーの周囲に透明ゾーンが出現したのでこれらはすべてリパーゼ陽性表 現型を有すると考えられた。典型的な代表例をＰＣ１２Ｂと命名した。 同じ手順でリパーゼ陰性ｐ、　ｇｌｕｍａｅ　Ｐに２（実施例２Ｂ−ｂ参照）株 中に構築Ｔｈ（ｐＬｉＲ６１３１）を組み込むことができることも明らかである 。 実施例２及び４から、Ｐｓ、　ｇｌｕｍａｅ株Ｐに１（及びその誘導体、例えば ＰＯ２及びＰに３　、または改良リパーゼ産生能を有する従来の突然変異誘発を 介して得られたＰＧｌの誘導体）が細菌染色体中のく相同または異種の）ＤＮＡ フラグメントの欠失または導入によって容易に操作され得ることが明らかであろ う。 これらの手法の使用によって、最適なリパーゼ産生株を構築することが次のよう にして可能である０例えば、本来のリパーゼプロモーターをより強力な（調製自 在な）プロモーターによって置換し、（任意に種々のリパーゼ突然変異体をコー ドする）リパーゼ遺伝子の１つ以上のコピーを導入し、本来のプロモーターを置 換するか、またはリパーゼ酵素（例えばリパーゼ酵素の輸送（ｅｘｐｏｒｔ）に 関与するシャベロンタンパク質、「ヘルパータンパク質」）の産生及び分泌に関 与する機能をコードする遺伝子のより多数のコピーを導入し、（透明ゾーンまた はスキンミルクプレートを産生じないＰＣＩ（Ｐ（：Ｔａ２）のＴｏ５突然変異 体が付着した）細胞外プロテアーゼをコードする遺伝子を欠失させ、ラムノリピ ド産生を操作する。 実施例５二突然変異体リパーゼ遺伝子の産生及びそのＰＣ３内導入 リパーゼを改良するためには、そのタンパク質のアミノ酸配列に確定された変化 を導入できることが必要である。 これを行なうための好ましい方法では、野性型リパーゼをコードする合成遺伝子 または野性型ｐ、　Ｂｌｕｍａｅリパーゼ遺伝子の遺伝子フラグメントを、所望 の突然変異を含む化学的に合成された対応するフラグメントで置換する０合成野 性型リパーゼ遺伝子の場合、カセット（またはそのフラグメント）を所望の突然 変異を含む対応するカセット（またはそのフラグメント）によって置換し得る。 該当する（１つまたは複数の）アミノ酸の（１つまたは複数の）コドンを含むカ セットを（実施例３に記載のごとく）もう一度組立てた。しかしながら今度は、 該当する（１つまたは複数の）コドンを含むコーディングまたは非コーディング ＤＮＡｇのｏｌｉｇｏｓを、所望の突然変異を含むオリゴマーによって置換した 。新しいｏｌｉｇｏｓを実施例１に記載のごとく合成した。このようにして得ら れた突然変異体カセットまたはそのフラグメントを、構築物ｐＵＲ６０３８また はｐＵＲ６６０３のごとき合成野性型リパーゼ遺伝子中の対応する位置に導入し た。 ＰＯ２またはＰＯ２の合成突然変異リパーゼ遺伝子を導入するために、実施例４ に記載の手順をステップ４がら開始する必要がある。 突然変異遺伝子の代表的な産生例を図８に示す（図６と比較）、この場合、野性 型リパーゼ遺伝子の１５４位のＨｉｓはＰｒｏによって１換されている。これを 得るために、新しい２つのオリゴマーを合成した。そのヌクレオチド配列を図８ に示す、成熟リパーゼのアミノ酸１５４をコードするコドンはＣＣＴに変わる。 これらのオリゴマーを使用して実施例３に記載のごとくフラグメント３（１１１ ５４Ｐ）を組立てた。そのフラグメント３ｐＥ−εＬ９中でクローニング後、実 施例１と同様にしてＤＮＡ配列を決定した。 このように得られた横築−３ｐＵＲ６０７１と命名した。プラスミドｐＵＦＩ６ ０７１　’：　Ｆｓｐ　ｌ及び５ｉｌｌによって完全消化した。 得られたＤＮ＾フラグメントを（実施例２に記載のごとく）ゲル電気泳動によっ て分離すると、アガロースゲルがら９゜ｂｐのフラグメントが単離された。 ｐＵＲ６００２をＦｓｐ　ｌて゛部分消化し、５ａｌｌで部分消化した。 ゲル電気泳動後に一６０００ヌクレオチドのベクタ−３実施例２に記載のごとく アガロースゲルから単離した。単離した一９０ｂｐのフラグメントをｐＵＲ６０ ０２ベクターに結合してｐｔｌＲ６０７７＾を得た。　ｐＵＲ６０７７＾のＢ＋ ｕ＋Ｉ’ｌ　Ｉフラグメント（−２２００ｂｐ）を実施例３及び４に記載のごと ＜　Ｉ）ＲＺ１０２に結合した。このようにしてｐＵＲ６１２７が得られた。 この構築物を実施例４に記載の手順でＰＯ２の染色体に導入した。得られたＰ、 　ｇｌｕ■ａｅトランスコンシュガント産生リパーゼをＰＧＬ２４と命名した。 この菌株によって産生された修飾リパーゼは実際の洗剤系において親リパーゼよ りもかなり安定していた（実施例１１参照）。 本質的に同様の方法でその他のいくつかの突然変異リパーゼを作製した。いくつ かの場合にはこの結果として、コードされたタンパク質の実効電荷が変化したく 例えばＤ１５７Ｒ（＋　２）、　Ｄ５５＾（＋　１）、　ｌｌｌ０Ｋ（＋　１） 、　Ｒ６１Ｐ（−１）、　Ｔ１０９Ｄ（−１）、Ｒ２Ｏ（−２＞）、その他の場 合にはアミノ酸が導入または欠失していた（例えばＰＣＬ４０においては１５２ Ｓ−１５４１が＾ＬＳＧ）ＩＰによって１換されていた）、更に潜在的グリコジ ル化部位が除去（例えばＮ４８Ｓ及び／またはＮ２３８Ｓ）及び／または導入（ 例えばＤ１５７Ｔ及びＮ１５５とＴ１５６との闇のＧの挿入）されていた、これ らの及びその他の突然変異体を表１に示す。 実施例６　：　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓにおける合成リパーゼ遺伝子の発グラム 陰性菌特にＢａｃｉｌｌｕｓはヒドロラーゼ産生の極めて優秀な宿主であると考 えられ発酵プロセスに関してもよく知られているので、グラム陰性菌Ｐ、　ｇｌ ｕｍａｅに由来のリパーゼ遺伝子をいくつかの異なる発現ベクターにのせてＢ。 ｓｕｔ　ｉ　ｌ　ｉｓに導入した。 ５ＰＯ２７Ｄ−１＝−９−を含ｔｒ発現フラスミドｐＭＳ４８（１２）を、下記 １．２．３をコードする組換えリパーゼ遺伝子を含む構築物のベースとして使用 した。 １、プレーリパーゼ、 ２、メチオニンに続く成熟リパーゼ、 ３ｇアミラーゼのシグナル配列に続く成熟リパーゼ。 Ｈｐａ　１１部位（ＨＰ＾−プロモーター）の近くにプロモーターを含むプラス ミドｐＵＢ１１０（１３）を、下記４．５をコードする組換えリパーゼ遺伝子を 含む構築物のベースとして使用した。 ４、ズブチリシンＢＰＮ’プロテアーゼプレプロ配列による成熟リパーゼ、 ５、成熟リパーゼに先行しズブチリシンＢＰＮ’プレ配列に続くリパーゼのプレ 配列の種々のＣ末端フラグメント。 上記構築物を得るために、以下の手順を使用した：追加１．（区９参照） ａ、　ｐｕｃ９（１４）をＥｅｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌで消化し１次いで実施例 ２に記載のごとくアガロースゲル電気泳動及び電気溶出によって直線状ベクター フラグメントを精製した。 ｂ、ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌ付着端を有する合成リンカ−（２つのオリゴヌク レオチドから成る）を上記ベクターに結合した。ＥｃｏＲＩ付着端の場合、Ｅｅ ｏＲ１部位は修復されなかった。 ＢｓｔＥ　ＩｆとＥｃｏＲ１部位及びリポソーム結合部位とを含むこのフラグメ ントの配列を図９に示す、このようにしてｐＭｓ５１が得られた。 ｃ　、　ｐＭｓ５１をＥｃＲｌ及びＨｉｎｄＩ［［によって消化した。 ｄ　、　ｐＵＲ６０３８をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌによって消化し、次いで 一１２３０ｂｐ（合成リパーゼ遺伝子を含む）のフラグメントをアガロースゲル 電気泳動及び電気溶出によって精製した。 ｅ、リパーゼ遺伝子フラグメントを（Ｃ″ｃｃ調製）ｐＭｓ５１ベクター中で結 合しｐＵＲ６７７１を得た。 ｆ　、　ｐＭｓ４８をＢｓｔＥ　Ｉ［及びＢｉｎｄｌ［［で完全消化し、次いで 上記の手順でベクターフラグメントを精製した。 ｇ　、　ｐＵＲ６７７１もＢｓｔＥ　］ｌ及びＨｉｎｄｌｌで消化し、リパーゼ 遺伝子フラグメント（−１２５０ｂｐ）を精製した。 ｈ、得られたフラグメント及びベクターを結合し、Ｊ、　Ｋｏｋ（１２）に記載 の手順でＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＢ１０４（１５）に移入した。 この手順でｐＵＲ６７７３が得られた。 追加２．（図１０参照） ａ　、　ｐＵＲ６７７１をＥｃｏＲｌ及びＥｃｏＲＶで完全消化し、上記手順で ベクターフラグメントを精製した。 ｂ、前記ベクター中でＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ末端を有する合成リンカ−を結 合した。翻訳開始シグナルであるＡＴＧコドンに続く成熟リンカ−の最初の８つ のアミノ酸をコードする配列を図１０に示す、この手順でｐ、ｔｌＲ６７７０が 得られた。 ｃ　、　ｐＵＲ６７７０をＢｓｔＥ■及びＨｉｎｄｌ［ｌで消化後、−１１３０ ｂｐのフラグメントを前記のごとく精製した。 ｄ、成熟リパーゼシコードする遺伝子を含むこのフラグメントを追加１．ｆ、で 調製されたベクターに結合した。 ｅ　、　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＢ１０４を形質転換して（追加１．ｈ、９ 照）、ｐＵＲ６７７２が得られた。 追加３．（図１１参照） ａ　、　ｐＵＲ６０３８をＥｅｏＲｌ及びＥｃｏＲＶによって完全消化し、ベク ターフラグメントを精製した。 ｂ、ＥｃｏＲｌ及びＥｃｏＲＶ端を有する合成リンカ−と前記ベクターに結合し た。使用したリンカ−のヌクレオチド配列を図１１に示す、このようにしてｐＵ Ｒ６７５２が得られた。 ｃ　、　ｐＵＲ６７５２をＢｉｎｄｌｌｌで消化しＳａｃ　ｌで部分消化して− １１１゜ｂｐのフラグメントを精製した。 ｄ　、　ｐＭＳ４８をＳａｃ　Ｉ［及びＨｉｎｄＩ［Ｉで完全に消化後、ベクタ ーフラグメントを精製した。 ｅ、成熟リパーゼをコードする遺伝子フラグメントを含む一１１００ｂｐ７ラグ メント（Ｃ１）をｐＭｓ４８ベクターに結合しＢ。 ５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＢ１０４に移入してｐＵＲ６７４３を得た。 ｆ、いくつかの形質転換体からプラスミド（１）を単離後、その制限パターンを 分析するために種々の制限酵素によって消化した。予想した制限パターン３有す るプラスミドは全く観察されなかった。更に得られた形質転換体でリパーゼ産生 を示したものはない。 その他のＢａｃｉｌｌｕｓ株（例えばＢ、　ｌｉｃｂｅｏｉｆｏｒｗｉｓまたは Ｂ。 ａｓｙｌｏｌｉｑｕｅｒａｃｉｅｎｓ）の形質転換によっても同様の結果が得ら れた。これらの結果がらは、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ、及び（Ｂ。 １ｉｅｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＢ、　ロｙｌｏｌｉｑｕｅｒａｃｉｅｎｓな どの）その他のＢａｃｉｌｌｕｓ株中ではｔｉ築物ｐＵＲ６７４３が安定に維持 されないという結論しか得られない。 ４及び５で記載した構築物の調製のために、５゛非コーデイング領域に続くズブ チリシンＢＰＮ’プロテアーゼプレプロ配列？コードする合成遺伝子フラグメン トの作製を決定した。 必要なヌクレオチド配列をＷｅｌｌ他（１６）から入手した。このフラグメント を３つのカセットに分割し、実施例３と同様にして調製した０個別のカセットを 組立てて、最終（ＥｅｏＲｌ　／Ｈｉｎｄｌｌｉ　）フラグメント（−５７０ｂ ｐ）をＭ１３ｍｐ１９中でクローニングした。フラグメントのヌクレオチド配列 を図１２ａに示す、　Ｍ１３ｍｐ１９誘導体をＥｃｏＲｌ及び旧ｎｄｌＩ［で消 化後、−５７０ｂｐフラグメントを上記のごとく精製した０次のステップでこの フラグメントに２つのリンカ−を付け、ＥｅｏＲ■及びｆｌｉｎｄ■部位をｓｐ ｈ　ｌ及び１３ａｍＨＩ付着端にそれぞれ変化させた。 使用したリンカ−及び最終配列を図１２ｂに示す、　ｐＵＢｌｌｏをｓｐｈ　ｌ 及びＢａｗｌ　Ｉによって完全に消化し、ベクターフラグメントを精製した。得 られたベクター及びＳｐｈ　Ｉ　／ｌａ＋ｍ）ｌ　Ｉフラグメントを結合し、Ｂ 、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＢ１０４に移入した。このようにしてｐＵＲ４０２０ ＾が得られた。 追加４．（図１３参照） ａ　、　ｐＬＩＲ６０３８をＥｅｏＲ１及びＥｃｏＲＶによって完全消化し、ベ クターフラグメントを精製した。 ｂ、同じ末端と有する合成リンカ−を前記ベクターに結合した。使用したリンカ −のヌクレオチド配列を図１３に示す。 このようにしてρυＲ６７５３が得られた。 ｃ　、　ｐＵＲ８７５３をＢａａａＨｌで消化しｋｐｎ　ｌで部分消化して−１ １１゜ｂｐのフラグメントをＦ＃製した。 ｄ　、　ｐｔｌＲ４０２０＾をＫｐｎ　ｌ及びＢａｄＩで完全に消化後、ベクタ ーフラグメントを精製した。 ｅ、成熟リパーゼをコードする遺伝子フラグメントを含むこのフラグメントをｐ ［ｌＲ４０２０＾ベクターに結合し、Ｂ、　５ｕｂｔｉ１ｉｓ　ＤＢ１０４に移 入してｐＵＲ６７４４を得た。 ｆ、いくつかの形質転換体からプラスミド（１）を単離し、その制限パターンを 分析するために種々のＭ限酵素によって消化した。予想した制限パターンを有す るプラスミドは全く観察されなかった。更に得られた形質転換体でリパーゼ産生 を示したものはない。 その他のＢａｃｉｌｌｕｓ株（例えばＢ、　ｌ１ｅｈｅｎｉｆｏｒ＋＊ｉｓまた はＢ。 ａｅ＋ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｅｉｅｎｓ）の形質転換によっても同様の結果が得 られた。これらの結果から、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ、及び（Ｂ、　Ｉｉ−ｅｈ ｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＢ、　ａＩＩｙＩｏｌｉｑｕｅｆａｅｉｅｎｓなどの ）その他のＢａｃｉｌｌｕｓ株中では構築物ＤｔｌＲ６７４４が安定に維持され ないという結論しか得られない。 追加３及び４に記載の構築物は生物活性リパーゼを産生及び分泌しなかった。こ れは、このリパーゼが普通の文献から公知の手順だけでは異種宿主中で発現され ないことを示す。 また、ズブチリシンプレ配列が、種々の長さのリパーゼプレフラグメントに続く 成熟リパーゼをコードするリパーゼ遺伝子に適正に接続されたいくつかの発現プ ラスミドを横築した。 追加５１１２１１４参照） ａ　、　ｐｉ；Ｒ６０３８をＥｅｏＲｌ及びＥｃｏＲＶによって完全に消化後、 ベクターフラグメントを１１２した。 ｂ、同じ付着端３有する合成リンカ−分前記ベクターに結合した。前記リンカ− 及び得られた横築物のいくつかの代表例（ｐｔｌＲ６７６３，６７６４及び６７ ６５など）と図１４に示す、これらの種々のリンカ−を使用して種りの（プレ） −リパーゼをコードする遺伝子フラグメントをＢＰＮ’プロテアーゼプレ配列遺 伝子フラグメントに接合することが可能であった。これは、リパーゼ酵素の発現 、プロセッシング及び輸送に関して最適な横築物を確定するために行なわれた。 ｃ　、　ｐＵＲ４０２０八を５ｉｌｌ及びＢａｗｌ　Ｉで完全に消化し、ベクタ ーバンドを精製した。 ｄ、ｂ、で得られた構築物をＴｏｗｅｌ　Ｉで消化し５ａｌｌで部分消化し、次 いで一１１５０ｂｐのフラグメントを精製した。 ｅ、これらのフラグメントをｐＵＲ４０２０＾ベクターに結合し、１３、５ｕｂ ｔｉｌｉｓ　ＤＢ１０４に移入した。このようにしてｐＵＲ６７６６，６７６７ 及び６７６８（など）が得られた。 ｐｌＪＲ６７７３（追加１）、　ｐＬｉＲ６７２（追加２）、ｐｔｌＲ６７６６ 、ｐＵＲ６７６７及びｐＵＲ６７６８を含むＢ、　３ｇｔｉｌｉｓ菌ＤＢ１０４ 株並びにプラスミドｐＵＢ１１０（陰性対照）を含む株をエーレンマイヤーフラ スコ中のオリーブ油含有及び非含有のＬＢ培地で増殖させた。　Ｂ、５ｕｂ−ｔ ｉｌｉｓ　ＢＤ１０４（ｐＵＲ６７７２）及びＤＢ１０４（ｐＵＢｌｌｏ）の場 合を除くすべての場合に油滴が消滅することがはっきりと観察できた。 これは機能性リパーゼの産生及び分泌を示す、細胞及び培地のウェスタン分析に よってリパーゼの産生が証明された。 いくつかのリパーゼを図１４ｂに示す。 参考文献： １２、　Ｋｏｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８５）　ＥＰ−Ａ−０１５７ ４４１１３、Ｌ、ａｃｅｙ、Ｒ，Ｍ、ａｎｄ　Ｃｈｏｐｒａ、Ｊ、、（１９７４ ）　Ｊ、ＭｅｄｉｃａｌＭｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、　７．　ｐｐ２８ ５〜２８７１４、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、（１９８ ２）　Ｇｅｎｅ　ｖｏｌ、１９゜ｐｐ２５９〜２６８ １５、Ｋａｗａｍｕｒａ、Ｆ、ａｎｄ　Ｄｏｉ　Ｒ，Ｆｌ、、（１９８４）　Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏ−１ｏｇｙ　ｖｏｌ、１６０．ｐｐ、４４２〜４４４１６、 Ｈｅ１ｌｓ、Ｊ、＾、ｅｔ　ＪＬｌ、、（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ　ｖｏｌ、１１．ｐｐ７９１１〜７９２５実施例７　 ：　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の合成リパーゼ遺伝 子の発現 真核微生物によるｐ、　Ｈ１ｕｍａｅ１μ−ゼの産生を示すために、ＣＡＬ７プ ロモーター（１７）を使用して酵母Ｓ、　”ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でＰ、　ｇ ｌｕｍａｅリパーゼを発現させる適当なベクターを構築した。２つの異なる発現 系を使用して酵母Ｓ、　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅによってＰ、　Ｈ１ｕｍａｅ１μ −ゼを産生させた。１つの発現系はリパーゼ発現カセットによる自律複製プラス ミドに基づき、１つの発現系はリパーゼ発現カセットのマルチコピー組込みに基 づく。 Ａ、自律複製プラスミドによるｐ、　ｇｌｕｍａｅリパーゼの産生リパーゼ発現 プラスミドのベースとしてプラスミドｐυＲ２７３０（１７）を使用した。プラ スミドｐＵＲ２７３０はＧＡＬプロモーターとＳ、　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の ２μ−の複製配列と、Ｓ、　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での選択のためのＬＥＬ１ ２ｃｌ遺伝子と、大腸菌中での複製及び選択のためのρＢＲ３２２配列とから精 成されていた。 プラスミドｐＵＲ６０３８をリパーゼ遺伝子のソースとして使用した。 以下のリパーゼをコードするＳ、　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現プラスミドを構築 した： １、インベルターゼシグナル配列に続く成熟リパーゼ（ｐ［ｌＲ６８０１）　； ２、ＫＥＸ２開裂部位、グリコジル化部位及びインベルターゼシグナル配列（ｐ ＵＲ６８０２）に続く成熟リパーゼ。 上記構築物を得るために、以下の手順を使用したく図１５；使用した制限酵素認 識部位を本で示す）：追加１及び２ ａ、プラスミドｐＵＲ２７３０をＳｕｅ　Ｉ及びＨｉｎｄｌｌで消化し、ベクタ ーフラグメントを単離した。 ｂ、プラスミドｐＵＲ６０３８をＥｃｏＲ■及びＨｉｎｄｌｌ［で消化し、リパ ーゼ遺伝子をもつフラグメントを単離した。 Ｃ９以下の配列から成る合成Ｓｕｅ　Ｉ　−ＥｅｏＲＶ　ＤＮ＾フラグメントを 合成し実施例３に記載のごとく横築した：ｐＵＲ６８０１の場合： ＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＡＣ入入λＣ入入入入Ｃ入入ＡλＴＧ入ＴＧＣＴＴＴＴＣ Ｃ入入ＧＣＣＴ’ＴＣＣＴｒＴＴＣＣｐｔｌＲ６８０２の場合： ＴＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴ”Ｉ？ＧＴｌ”ｒＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＣｒＡＣ ＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＧＧＡＡＧＧ　入入入入ＧＧｄ　、　Ｓａｃ　Ｉ−ＨＩｎ ｄＩ［［ベクターフラグメント、　Ｓａｃ　ｌ　−ＥｅｏＲＶ合成フラグメント の１つ（１）及びり）＜−ゼ遺伝子をも一つＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩ［Ｉ　ＤＮ Ａフラグメントとを結合した。　ｐＨＲ６８０１を構築するためにこれを区１５ で示す、　＜ｐＵＲ６８０２は合成フラグメント■を使用して同様に合成される ）。 ｅ、上記結合混合物で大腸菌を形質転換した。単個コロニーを培養後、プラスミ ドＤＮＡを単離し、制限酵素分析によって判断された正しいプラスミドを選択し 大量に単離した。 ｆ　、　ＬＥＵ２ｄ遺伝子産物の存在下の選択を用いるスフェロプラスト手順ヲ 用イ、７　ラスミドｐＵＲ６８０１及びｐＵＲ６８０２でＳ。 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌５ＵＩＯ株（１７）を形質転換した。 ｇ、その形質転換体を所定の培地（０，６８％の酵母窒素塩基ｗ１０アミノ酸、 ２％グルコース、ヒスチジン及びウラシル）中で一夜増殖させ、１：１０の誘導 培地（１％酵母抽出物、２％バクトーペプトン、５％ガラクトース）に希釈し、 ４０時間増殖させた。 ｈ、遠心によって細胞を単離し、細胞抽出物を調製した（１９）。 ｉ、ａｌｌ油抽出物５ＤＳ−ゲル電気泳動（１）によって分析し、ニトロセルロ ースにプロットした。 ｊ、ニトロセルロースプロットをリパーゼ抗体と共にインキュベートし、次いで ヨウ素−１２５標識したプロティン−Ａと共にインキュベートし、次いでフルオ ログラフィー処理した（図１５ｍ）。 図１５ｍに示すように４５ＵＩＯはプラスミドｐＵＲ６８０１と共に、ｐ、　Ｈ ｌｕｍａｅに由来のリパーゼに比較して正しい分子量のリパーゼ酵素を産生ずる ことがはっきりと観察される。正しいタンパク質以外に、加工されないグリコジ ル化リパーゼタンパク質も検出される。　Ｓ、　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅによって 産生されたＰ、　ｇｌｕｍａｅリパーゼは酵素活性である。 Ｂ、マルチコピー組込みによるＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるＰ。 ｇｌｕｍａｅリパーゼの産生 ３３５ｂｐの酵母ＲＮ＾ポリメラーゼＩプロモーターエレメントをＳ、　Ｃ６ｒ ６ｙｉｓｉａｅ　ｒＤＮ＾の４．５Ｂ［ｌＩ　ＩＩ　Ｂフラグメント（１９ｂ） で置換することによってプラスミドｐＡＲＥＳ６　（１９ｍ）からマルチコピー 組込みベクターを誘導した。また、２μ−の自律複製配列を除去し、Ｓ、　ｏｒ ｉｇｏｒｈｉｚａに由来のクロロプラスト（ｅｈｒｏｌｏｐｌａｓｔ）をもつＢ ｇｌ　Ｉｆ　−［１ｉｎｄＩ［ｌ　ＤＮＡフラグメントをポリリンカーＤＮ配列 によって置換した。この結果、プラスミドｐＵＲ２７９０が得られた。この詳細 図を図１５ｂに示す。 酵母ゲノムにｐＵＲ２７９０のマルチコピー組込みを行なうための必須配列は： １、酵母ゲノム中のマルチコピー組込み用ｒＤＮ＾配列；２　、　Ｓ、　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ　ＬＥＵ２ｄ遺伝子＜１９ｅ）である、これは欠損プロモーター を有するＬＥ０２遺伝子である。 特に、以下のリパーゼをコードするマルチコピー組込み発現プラスミドを構築し た： １、インベルターゼシグナル配列に続く成熟リパーゼ（ｐ［１Ｒ６８０３）　； ２、ＫＥＸ２開裂部位、グリコジル化部位及びインベルターゼシグナル配列部位 に続く成熟リパーゼ（ｐＨＲ６８０１）。 上記構築物を得るために、以下の手順を使用した（図１５；使用した制限酵素認 識部位を車で示す）：追加１及び２ ａ、プラスミドｐｌＪＲ２７９０をＨｉｎｄｌｌｌで部分消化した。直線状プラ スミドを単離し、Ｂ、ｌｌｌ及びｔｌｉｎｄ［ｌで完全に消化し、アガロースゲ ル電気泳動及び電気溶出によって旧ｎｄｌＩ［−Ｂｇｌ■フラグメントを単離し た。 ｂ、プラスミドｐｔｌＲ６８０１をＢｇｌ［で部分消化し、［ｌ１ｎｄｌＩ［で 完全消化し、リパーゼ遺伝子をもつＢｇｌＩ［−旧ｎｄｌ［［ＤＮＡフラグメン トを単離した（プラスミドｐＵＲ６８０１の代わりにプラスミドＰＵＲ６８０２ を用いて同様の方法でｐＨＲ６８０１を構築した）。 ｃ　、　ｐＬＩＲ２７９０のＢｇｌ　ｌｌ−Ｈｌｎｄｌ［ベクターフラグメント をリパーゼ遺伝子をもつＢｇｌ　ｌｌ−Ｈｌｎｄｎ［フラグメントと結合しく図 １５０）、プラスミドｐＵＲ６８０３を作製した。 ｄ、その結合混合物で大腸菌を形質転換した。単個コロニーから培養後にプラス ミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析によって判断された正しいプラスミドｐＵＲ ６８０３及びｐＵ８６８０４を選択し大量に単離した。 ｅ　、　ＬＥＵ２ｄ遺伝子産物の存在下の選択を用い、スフェロプラスト手順（ １８）で、プラスミドｐＵＲ６８０３及びｐＵＲ６８０４によってＳ、　ｅｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ菌ＹＴ６−２−Ｉ　Ｌ株（１９ｅ）を形質転換した。酵母ゲノム にプラスミドのマルチコピー組込みを行なうためにはＬＥＵ２遺伝子の欠損プロ モーターが必須である。マルチコピー組込みは、プラスミドのｒＤＮ＾配列と酵 母ゲノムのｒＤＮ＾配列との相同組換えにより酵母ゲノムのｒＤＮ八遺へ子座で 生じる。 このようにして、活性Ｐ、　ｇｉｕｍａｅリパーゼを産生ずるためのプラスミド ｐＵＲ６８０３及びｐＵＲ６８０４（リパーゼ発現カセットを含む）のマルチコ ピー組込み（１００コピーまで）によって酵母菌が得られた。 参考文献５ １７、０ｖｅｒｂｅｅｋｅ、　Ｎ、　ｅＬ　ｉｆ、、　Ｗｏ、　８７１０７６４ １１８、　ＢｅｇＢｓｊ、　Ｄ、　Ｎａｔｕｒｅ、　（＋９７８）　ｖｏｌ、　 ２７５．　ｐ１０４〜１０９１９、　Ｖｅｒｂａｋｅｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅ ｎｅ、　（＋９８７）　ｖｏ１６１．　ｐ２０７〜２１５１９ａ、Ｋｅｅｐｅｒ ｓ−Ｖｅｅｎｓｔｒｉ、＾、Ｅ、ｅｔ　ｉｆ、、ＥＭＢＯＪ、（１９８４）ｖｏ ｌ、　３．１３７７〜１４８２ １９ｂ、　５ｚｏｓｔａｋ、Ｊ、　’Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｌａｓｍｉｄ、　 （１９７９）　ｖｏｌ　２゜５３６〜５５４ １９ｅ、Ｅｒｈａｒｔ、Ｅ、ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、ＢａｅｔｅｒｉｏｌｏＢｙ、（ １９８３）　ｖｏ１１５６．６２５〜６３３゜ 実施例８　：　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ中の合成リパーゼ遺 伝子の発現 以下の手順を用い、この合成リパーゼ遺伝子をＨ，ｐｏｌｙ−ｍｏｒｐｈａゲノ ムに組込こんだ（図１６：この実施例の各図では使用した制限認識部位を京で示 す；括弧内の制限認識部位はクローニング手順によって除去される）。 ａ、プラスミドｐｔｌＲ６０３８（図１６＾）を制限酵素ＥｃｏＲｌ及びＥｃｏ Ｒ■によって完全に消化した。アガロースゲル電気泳動によってフラグメントを 分離後、実施例２に記載のごとくベクターフラグメントを単離した。 ｂ、いくつかの異なる合成カセットを実施例３に記載のごとく組立てた。これら のカセットは種々の長さの未成熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）リパーゼ遺伝子とイン ベルターゼシグナル配列との正しい接合に必要な多数のアミノ酸をコードしてい た。これはリパーゼ酵素の発現、プロセッシング及び輸送に関して最適な構築物 を形成するために行なわれた。更にこれらのカセットはＥｅｏＲＩ及びＲｃｏＲ Ｖ末端を有していた。 代表例を７１６に示す。 Ｃ１組立てたカセットをａ項で調製したベクターに結合した。 ｄ、このように得られたプラスミド（ｐＵＲ６８５０，６８５１及び６８５２、 図１６Ｂ）を酵素Ｘｈｏ　ｌで部分消化し、直線状プラスミドを単離した。 ｅ、プラスミドｐｔｌＲ３５０１（１７、図１６０）をＸｈｏ　ｌで部分消化し た。アガロースゲル電気泳動後、ＭＯＸプロモーターとインベルターゼシグナル 配列の最初のアミノ酸とを順次に含む約１５００ｂｐのＤＮ＾フラグメントを単 離した（ｐＵＲ３５０１の０〜１５００位に由来のＸｈｏｌ　ＤＮ＾フラグメン ト）。 ｆ、ｅ、の１．５ｋｂのフラグメントを、ｄ、で調製したベクターフラグメント に結合しプラスミドｐＵＲ６８６０，６８６１，６８６２、図１６０を得た。 ｇ、結合混合物で大腸菌を形質転換した。単個コロニーから培養後にプラスミド ＤＮＡ　ｅ単離し、制限酵素分析によって判断された正しいプラスミドを選択し 大量に単離した。 ｈ、ステップｇ、で得られた正しいプラスミド（例えばｐＵＲ６８６０，６８６ １，６８６２、図１６Ｄ）をＢａ＋ｔｌ　Ｔで完全に消化し、次いで付着端をＫ ｌｅｏｏｗポリメラーゼ（２から）で埋め戻した０次のステップで直線状プラス ミドをＥｃｏＲＩで消化し、ＭＯＸプロモーター、インベルターゼシグナル配列 及び約２．５ｋｂの合成リパーゼをもつＢａｗＨｌ　−ＥｅｏＲＩ　ＤＮ＾フラ グメントをアガロースゲルから単離した。 ｉ、プラスミドｐＵＲ３５１１（ｐＥＭＢＬ９のＢａ＋Ｈｆ及びＨｉｎｃＩＩ制 限部位クローニングされたＭＯＸターミネータ、図１６Ｅ）を５ＩＩａ　ｌ及び ＥｃｏＲｌで消化し、次いでベクターをアガロースゲルから単離した。 ｊ　、　ｐＵＲ３５１１ベクター及び２．５ｋｂのフラグメントを結合して大腸 菌中でクローニングした。得られた構築物中ではリパーゼ遺伝子にＭＯＸ転写タ ーミネータが続いていた。これらの構築物の代表例はｐＵＲ６８７０，６８７１ 及び６８７２　（図１６Ｆ）である。 ｋ、これらのプラスミドをＥｅｏＲｌ及びＨｉｎｄｌ［Ｉで消化後、約３ｋｂの フラグメントをアガロースゲルから単離した。付着端をＫｌｅｎｏｗポリメラー ゼで埋め戻した。 １、プラスミドｐＵＲ３５１３；これは５ａｉｌ消化によって２μ−の配列が欠 失したプラスミドｙＥＰ１３　（２０）　（図１６Ｇ）であり、これをＰｖｕ　 ■で消化しな。 ｍ、直線状プラスミドｐＵＲ３５１３とに、で得られたフラグメントとを結合し て最終構築物、例えばｐｌＪＲ６８８０，６８８１及び６８８２（図１６ｂ）が 得られた。 Ｈ，ｐｏＩｙｍｏｒｐｈａゲノムへの発現カセットの導入プラスミドＤＮＡによ るＢ１ｎ５ｅｎｕｌａ細胞の形質転換は（１７゜２０ｍ及び２０ｂ）に記載のご と〈実施し得る。 組込み体の分析はサザンプロット手順（１）で実施し得る。 参考文献： ２０、　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ　（１９７９）　ｖ ｏｌ　８．１２１〜１３３２０ａ、　Ｃ＋Ｉｅｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｎｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８８）、 　ｖｏｌ　１３２．３４５９〜３４６５２０ｂ、　ＲｏＨｇｅｎｋｉｍｐ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８６）、　ｖｏ１２０ ２、３０２〜３０８ 実施例９　Δｓｐｅｒｇｉ　ｌ　Ｉｕｓ中での合成リパーゼ遺伝子の発現１　、 ８ｐｄ＾プロモーターと含む発現プラスミドの横築＾５ｐｅｒｌｉｌｌｕｓ　ｎ １ｄｕｌａｎｓの構成的ｇｐｄ＾プロモーター（２２）及びｔｒｐＣ転写ターミ ネータ（２３ン３含むプラスミドｐＡＮ５２１（２１、図１７＆）を＾ｓｐｅｒ ｇｉｌｌｓ発現プラスミド楕築用出発材料とし構築用したく図１７：全図で、使 用した制限認識部位な寡で示す７制限認識部位が除去されたときには括弧にいれ て示す）。 ａ、　ｐＡＮ５２−１（図１７ａ）をχｂａｌ及びＨｉｎｄｌｎで消化した。付 着端をＫｌｅｎｏ−ポリメラーゼ（１）で埋め戻し、ベクターな再結合した。こ の中では一６０ｂｐのＸｂａ　Ｉ　／ＲｉｎｄＩＩｌフラグメントが欠失し７　 イタ、Ｒｉｎｄｆ［Ｉ　Ｍ　位ヲＷｂ　去しテｐＬＩＲ８９００＜図１７ｂ）を 得た。 ５１次のステップとして、プロモーターとターミネータとの間のＢｉｍＨ１部位 を除去し、ＨｉｎｄＩ［１部位を導入した。これはＫｕｎｋｅｌ（２４）に記載 のごとく特定部位の突然変異誘発（ＳＤＭ）を介して行ない、プラスミドｐｔｌ Ｒ６９０１を得た。ヌクレオチド配列では以下の変化だけが生じた： ｐＬＩＲ６９００Ｂａｍ）ｌ　ｌ ＾ＣＣＡＴＣ；ＧＡＴＣＣ” Ｎｅｏ　１ ｐｕＲ６９０１Ｈｉｎｄｍ ＾ＣＣＡＴＧＣ，＾＾（：ＣＴＴＧＡＣ＾ＴＣＣｅｏ　１ ｃ　、　Ｂｏｅｌ＜２５）によって記載の配列に基づいて、グルコアミラーゼシ グナル配列の最初の２４個のアミノ酸なコードする合成フラグメントを設計し実 施例３に記載のごとく組立てた。クローニングの便宜上、アミノ酸セリンをコー ドする第２コドン（ＴＣに）を、グリシンをコードするＧＧＣに変化させること によってＮｅｏ　１部位を導入した。構築手順の後の段階で特定部位の突然変異 誘発分介して正しい配列を回復することが可能である。Ｎｃｏｌ及び旧ｎｄｎ［ 付着端を有する使用フラグメントの配列を図１７に示す。 ｄ　、　ｐＵＲ８９０１（図１７０）をＮｃｏｌ及びＨｉｎｄＩ［ｌで消化した 。アガロースゲル；気泳動後、ベクターをゲルがら単離した。上記の合成フラグ メントをベクター中で結合し、このようにしてプラスミドｐＩＪＲ６９０２（図 １７ｄ）を得た。 合成リパーゼ遺伝子を＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓゲノムに組込むために以下の構築 物を作製した： ａ、構成的ｇｐｄ＾プロモーターーＨ１ａΔ２４シグナル配列及びｔｒｐターミ ネータを含む発現プラスミドｐＵＲ６９０２（図１７ｄ）をＢｓ５Ｈ■及びＨｉ ｎｄｍで完全に消化しな、電気泳動後、ベクターをアガロースゲルから単離した 。 ｂ　、　ｐＵＲ６６００（図１７ｅ、図５ｂも参照）をＥｃｏＲｌ及びＢｉｎｄ ｌ［で消化後、アガロースゲル；気泳動によってフラグメントを分離した。リパ ーゼ遺伝子を含む一１０９０ｂｐのフラグメントをゲルから単離した。 ｃ、２つのオリゴマー（配列は図１７参照ンをこのフラグメントのＥｃｏＲｌ付 着端に結合してＢｓｓ［Ｉ　Ｉｆ付着端を得た。 ｄ、このように得られたＢｓ５ＨＩ［−Ｈ１ｎｄＩｆｆフラグメントをｐＵＲ６ ９０２（図１７ｄ）ベクターに結合してｐＵＲ８９０３を得た（図１７）。 Ｃ特定部位の突然変異誘発（２４）を介して合成オリゴマーによってリパーゼ遺 伝子をｇｌａ＾シグナル配列（の一部）を種々の方法でコードする遺伝子フラグ メントに接合した。これはリパーゼ酵素の発現、プロセッシング及び輸送に関し て最も適当な構築物を確定するために行なわれた。これらの構築物の幾つかをよ り詳細に説明する（図１４）。 ｌ　、　Ｂｌａ＾シグナル配列の最初の１８個のアミノ酸をコードする遺伝子フ ラグメントと−１３〜３１９のアミノ酸をコードするプレリパーゼ遺伝子フラグ メントとを順次に含むｐＵＲ８９０５。 ２、ｇｌａ＾シグナル配列の最初の２４個のアミノ酸をコードする遺伝子フラグ メントとプレーリパーゼ遺伝子フラグメント（１，参照）とを順次に含むｐＵＲ ６９０６。 ３、成熟リパーゼ遺伝子を含むｐＵＲ６９０５同様のｐＵＲ６９０７゜４、成熟 リパーゼ遺伝子を含むｐＵＲ６９０６同様のｐＵＲ６９０８゜構築物ｐＬＩＲ６ ９０６及びＵＲ６９０８中で、Ｂｓ５ＲＩ［部位は、ｇｌａ＾シグナル配列とプ レリパーゼとの結合後にも維持されていた。 ４つの構築物の全部で、リパーゼ遺伝子とｇｌｉ＾シグナル配列との間のＥｅｏ Ｒ１部位は欠失していた。 上記の手順で、細胞内産生ｇｌｕｍａｅリパーゼの輸送シグナルとしてグルコア ミラーゼシグナル配列（の一部）の使用を選択した。その他のシグナル配列が同 じ結果を導くことは明らかである。 別の選択では、輸送された（相同）タンパク質のシグナル配列だけでなく、成熟 タンパク質のく一部）（例えばグルコアミラーゼまたはＬｉｐｏｌａｓｅ（ＮＯ ＶＯの商標））も使用し、これをｇｌｕｍａｅリパーゼと融合させる。この手順 を用いるときは輸送されたタンパク質と成熟リパーゼとの間に（単一）開裂部位 （例えば成熟リパーゼの２６３位のメチオニンの突然変異と組み合わせた）ＫＥ Ｘ２、Ｘ因子またはメチオニン）を導入する必要がある。このようにすれば、産 生後の成熟リパーゼを、輸送されたキメラタンパク質がら遊離させることが可能 であろう。 最後に、Ｌｉｐｏｌｉｓｅ　Ｎ末端から始マつ種々のＬｉｐｏｌａｓｅ及びｇ　 ｌ　ｕｍａｅリパーゼフラグメントを順次に含むキメラリパーゼをコードし最適 リパーゼを産生及び分泌させる遺伝子の産生も可能であろう。 ２、ｇＩｉ＾−プロモーターを含む横築ａ　、　Ｂｏｅｌ（２５）及びＮｕｎｂ ｅｒｇ（２５）によって発表された制限地図及びヌクレオチド配列に基づいて、 実施例１の手順で合成りＮ＾プローブ（２３ｂｐ）を調製した。この合成プロー ブの配列は５’　ＴＧＣＴＧＡＧＧＴＧＴ＾＾ＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧ３’であっ た。このプローブを（１）に記載の標準クローニング手順で使用し、＾、ｎｉｇ ｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｉａ＾）を単離した。 ｂ、このプローブを用いてファージλ中に作製した＾。 ｎ　ｉｇｅｒ遺伝子バンクから、グルコアミラーゼプロモーター及びコーディン グ領域（の一部）を含むクローンをスクリーニングした。 Ｃ１これらのクローンから、ｇｌａ＾遺伝子のプロモーター領域とアミノ酸２４ までのコーディング領域の５′部とを含む４．１ｋｂのＨｉｎｄＩ［ｌ　／Ｂｓ ５ＨＩｌフラグメントを、前記酵素による消化及びゲル電気泳動後のアガロース ゲルがら単離した。 ｄ、２つのオリゴマー（下記参照）をＨｉｎｄｎ［付着端に結合することによっ てＥｃｏＲｌ付着端と導入した。 ＥｅｏＲｌ　＾＾ＴＴＣＴＣＴＡ（：Ａ　１ｌｉｎｄｌｌＧ；ＡＧＴＣＴＴＧＣ ＾ このようにしてＥｅｏＲＩ　／Ｂｓ５Ｈｎフラグメントが得られた。 ｅ　、　ｐＵＲ６９０６及びｐＵＲ６９０８をＥｃｏＲＩ及びＢｓ５ＨＵで完全 消化し、ゲル電気泳動にかけた後、直線状プラスミドを単離した。 ｆ、これらのベクターを前記（ｄ）のＤＮ＾フラグメントと結合し、このように してｐＵＲ６９１０及びｐＵＲ６９１２を得た。 ｇ、再び、特定部位の突然変異誘発を介してリパーゼ遺伝子を種々の方法でグル コアミラーゼシグナル配列に結合した。これは、同じオリゴマーを用いて実質的 に上記と同様の手順で行ない、夫々ｐＵＲ６９０９及びｐＵＲ６９１１を得た。 プラスミドｐｐＵＲ６９０５〜ｐＵＲ６９０８に比較したプラスミドｐＵＲ６９ ０９〜ｐＵＲ６９１２の違いはｇｐｄ＾プロモーターがｇｌａ＾プロモーターに よって置換されていることである。 ３、＾ｓｐｅｒｇ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ｕｓゲノムへの発現カセットの導入具なる２つ の方法で＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓゲノムに発現カセットを導入した。 １、同時形質転換を用いる方法： この方法では２７に記載のプロトコルを使用した。 ２、陽性選択マーカーを導入した発現カセットによる形質転換を用いる方法： 使用した選択マーカーは−ａａｄｓ（例えば＾、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ、２６）ま たは−ｐｕｒｃ（例えば＾、　ｏｒｙｚａｅ、２７）である。 これらは夫々、ｐＧＨ３Ｚ５からのＥｃｏＲｌフラグメント（Ｎｅｒ−ｎａｒｓ 、　ｐＨＤ　ｔｈｅｓｉｓ（１９８６）＾ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ　ｉ’ｌａｇｅ−ｎｉｎｇｅｎ、　ＭＬ）及びｐ＾０４−２からのＢ ａｍ［Ｉ　ｆＪｌフラグメント２７）として得られた。 ａｍｄｓマーカーを導入するために、上記プラスミドをＥｃｏＲｌまたはＨｉｎ ｄｌｌで消化し、ＥｃｏＲｌまたは（ＥｅｏＲｌ−ＨｌｎｄＩ［Ｉリンカ−で適 応させて）Ｈｉｎｃｌｌ［［選択マーカーフラグメントの存在下に結合させた。 　ｐｙｒＧの場合、上記プラスミドをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄｌで部分消化し 、ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩアダプターが生じさせたＥｃｏＲＩ　選択マーカー フラグメント存在下に結合させるかまたはＨｉｎｄｍ　−Ｂａａ＋ＨＩアダプタ ーが生じさせたＨｉｎｄＩ［Ｉ選択マーカーの存在下に結合させた０例えばプラ スミドｐＵＲ６９１５ｏａ、の）２００位のＥｅｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部 位にマーカー遺伝子が結合した正しいプラスミドを大量に単離し形質転換実験に 使用した。 プラスミドＤＮＡによる＾、　ｎｉｇｅｒ、＾、　ａｗａｍｏｒｉ及び＾、ｏｒ ｙｚｅ（など）の形質転換は、Ｎｅｒｎｅｒｓ他（２８）及びＫｅｌｌｙ（２９ ＞の方法で行なった。 組み込み体の分析は、サザンプロット手順（１）で行なった。 参考文献： ２１、　Ｐｕｎｔ　Ｐ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　５６　（１９８７）　ｐ ｐ　１１７〜１２４２２、　Ｐｕｎｔ　Ｐ　Ｊ　ｅｔ　ｍｌ、　Ｇｅｎｅ　８９ 　（１９８８）　９ｐ４９〜５７２３、Ｍｕｌｌａｎｅｙ　Ｅ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ 、Ｎｏ！　［：ｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　１９９　（１９８５）ｐｐ３７〜４５ ２４、Ｋｕｎｋｅｌ　Ｔ　＾、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｅａｄ　Ｓｅｉ　ＵＳ＾　 ８２　（１９８５）　４８８〜４９２ ２５、Ｂｏｅｌ　Ｅ　ｅｔ　ｉｆ、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３　（１９８４） 　ｐｐ１５８１〜１５８３２５ａ、　Ｎｕｎｂｅｒｇ　Ｊ　Ｈ，Ｍｏｌ　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ　４　（１９８４）　２３０６〜２３１５２６、Ｄｙｎｅｓ、Ｎｏ ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　３　（１９８３）　１４３０−１４３９２７、Ｄｅ　 Ｒｕ１ｔｅｒ−Ｊａｃｏｂｓ　ｅｔ　ｉｆ、Ｃｕｒｒ　Ｃｅｎｅｔ　１６　（１ ９８９）　１５９〜１６３ ２８、Ｗｅｒｎａｒｓ　ｅｔ　ｉｆ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃ＋ｅｎｅｔｉｅｓ　９ 　（１９８５）　３６１〜２９、Ｋｅｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ、ＥＭＢＯＪ　４　（ １９８５）　４７５〜４７９実施例１０：その他のグラム陰性菌中でのＰｓε１ ｕｓａｅリパーゼ遺伝子の発現 ｐ、　ｇＩｕ＋ｓａｅリパーゼの産生に別のグラム陰性菌が使用できるようにす るために、大腸菌からの誘導性ｔａｃプロモーターとＩａｅリプレッサーとを広 い宿主範囲の発現プラスミドｐＭＭＢ６７ＥＨ（３０）に配置した別のプラスミ ドを横築した。当該種においてＩ！能する調節プロモーターを含む広い宿主範囲 の任意の別のプラスミドも同様に適当であることは明らかであろう。 Ａ、　ｐＵＲ６５００の横築 カナマイシン耐性を与える長さ−１，５ｋｂのＢａ＋ｍＨｌフラグメントをｐｃ Ｐ１３（３１）から採取し、Ｋｌｅｏｏｗポリメラーゼで処理して平滑端を発生 させ、ｐＭＭＢ６７ＥＩＩの平滑端をもつＰｖｕ　１部位に結合させてｐＵＲ６ ５００（図１８）を得た。 Ｂ　、　ｐｔｌＲ６５０２の構築 ｐ１１Ｒ６００２（大腸菌に３８１７株から）をＣ１ａ　ｌ及びＥｏＲＩで完全 消化し、次いで一１７５０ｂｐのフラグメント（はぼ完全なリパーゼ遺伝子と３ ′フランキング領域とを含む）を単離した。このフラグメントを以下の配列の合 成りＮＡリンカ−分子に結合した。 ＥｃｏＲｌ　＾＾Ｔ　ＴＣＣＡＣに　Ｔ＾＾　ＣＣ［；　ＡＴ八　ＡＣ［；　Ｔ ＡＣ−Ｃ［；　Ｔ（：ＣＡＴＴ　ににＣＴＡＴ　Ｔ（：ＣＡＴＣ−−（：ＡにＡ Ｔ＾　＾＾ＣＡＴＧ　にＴＣＡにＡ　Ｔ　Ｃ１ａ　Ｉ−ＣＴＣＴＡＴ　ＴＴＧ　 ＴＡＣＣＡ［；　ＴＣＴ　ＡＣＣ結合後に、フラグメントをＥｅｏＲｌで再度消 化した。 ｐｔｌＲ６５００をＥｃｏＲＩで完全に消化し、次いでＥｅｏＲｌフラグメント （−１７８０ｂρ、上記）に結合した。結合混合物で大腸菌ＨＢＩＯＩ　（１） を形質転換後、所望のプラスミドを得るために得られたコロニーをスクリーニン グした。フラグメントを異なる２つの配向で挿入できるので、（プロモーターに 対して）正しい配向を選択する必要があった。このために、ＥｅｏＲｌフラグメ ントを含むプラスミドをＢａｍＨｌで消化した。 ｔａｃプロモーターの後にＥｃｏＲｌフラグメントを所望の配向で含む構築物を ｐＵＲ６５０２（図１９）と命名した。 Ｃ、ｐＵＲ６５２２の横築 １、プラスミドｐＵＲ６００６（実施例１に記載）を制限酵素ＥｅｏＲＩ及び５ ａｌｌで完全に消化し、次いで、−５ｋｂのＤＮ＾フラグメント含単離した。 ２、プラスミドｐＵＲ６５０２を制限酵素ＥｅｏＲＩ及び５ｉｌｌで完全に消化 し、次いで一５７０ｂｐのＤＮ＾フラグメントを単離した。 ３、ステップ１及び２で得られたフラグメントを結合し、ＥｃｏＲＩで再度消化 し、−５，６ｋｂのフラグメントを単離した。 ４、−５．６ｋｂのフラグメントを、ＥｅｏＲＩで消化したベクターＤＵＲ６５ ００に結合した。大腸菌ＨＢＩＯＩを結合混合物で形質転換後、得られたコロニ ーから所望の１ラスミドをスクリーニングした。ここでもＥｅｏＲｌフラグメン トは異なる２つの配向をもつことができ、Ｂｉｓ＋ＨＩで消化するとｔａｃプロ モーターに対して適正配向のＥｅｏＲｌフラグメントをもつ横築物を選択できた 。 このようにしてｐＵＲ６５２２（図２０）が得られた。 Ｄ、大腸菌５１７−１及びＰｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの形質転換大腸菌に関す るＭａｎｉａｔｉｓ他のＣａＣＬ法（１）を用いたコンピテント細胞の形質転換 を介してプラスミドｐＵＲ６５０２、ｐＵＲ６５２２及びｐＵＲ６５００（陰性 対照）を別々に大腸菌５１７−１及びＰｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｐ＾０２５（ 参考３２）に導入した。 Ｅ　、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｉｓ　ｐｕｔｉｄａの形質転換プラスミドｐｕＲ６ ５０２、ｐＵＲ６５２２及びｐＵＲ６５００（陰性対照）を、これらのプラスミ ドの１つを含む大腸菌５１７−１との両親性結合によってＰｓ　ｐｕｔｉｄａ　 １１ｃ３５８（参考３３）に導入した。 Ｆ、誘導実験 Ｋｍを補充したＬＢ培地（夫々２５μｇ／ｘｉ及び１００μｇｈｌ）中で０．２ ＪのＩＰＴＧ　（ｔａｃプロモーターのインデューサー）の存在下に大腸菌ＨＢ ＩＯＩ　（ｐｉ］Ｒ６５０２）及びＰｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　Ｐ＾０２５（ ｐＵＲ６５０２）を増殖させると、培養ブイヨン中にリパーゼ活性は全く検出さ れなかった。　Ｆｒｅｎｃｈプレスで細胞を破壊し、細胞破片を４℃で１６時間 保存すると、リパーゼ活性が証明された。 完全（ｉｎｔａｃｔ）なりパーゼの存在を細胞破片のウェスタンブロット分析に よって確認したく図２１）。 ＩＰＴに添加または非添加のＢＹＰＯプレートでＰｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＷＣＳ３ ５８（ｐｔｌＲ６５０２）及び（ｐｔｌＲ６５２２）を増殖させると、意外な結 果が得られた。ｐ［］Ｒ６５２２を含むＰｓ　ｐｕｔｉｄｉ　ＮＣ５３５８は有 意な量のリパーゼ（広いハロ形成によって証明される）を産生じたが、ｐＵＲ６ ５０２と含むものはリパーゼをほとんど産生じなかった（図２２）、この知見は 、Ｂａｗｌ　１部位の後方に延びるリパーゼ遺伝子の３′領域によってコードさ れるリパーゼ特異性のｒヘルパー機能」の存在を強力に証明する。この「ヘルパ ー機能」は細胞外活性リパーゼの適正及び／または最適な産生に関与すると考え られる。 参考文献・ ３０、　Ｆｒｕｓｔｅ　Ｐ　ｅＬ　ａｔ、　Ｇｅｎｅ　４８　（１９８６）　１ １！１１−１３１３１、　Ｄａｒｚｉｎｓ　ｅＬ　ａｔ、　Ｊ　Ｂａｃｔ　１５ ９　（１９８４）　’ＩＪ−１８３２、［１ａａｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏｌ　Ｃ ｅｎ　（：ｅｎｅｔ　１４４　（１９７６）　２４３〜２５１３３、　（：ｅｅ ｌｓ　ｅｔ　ａｌ、ＰｈｙｔｏｐａＬｈ　Ｚ　１０８　（１９８３）　１９３〜 ２０６　＆２０７〜２１４ 実施例１１：修飾リパーゼの改良プロテアーゼ耐性の測定ｐ、　ｇｌｕｍａｅリ パーゼ遺伝子（実施例５に記載）にいくつかの突然変異と導入し、洗剤プロテア ーゼの存在下のリパーゼの安定性を改良するためにプロテアーゼ開裂部位（実施 例１０に記載）の周囲のアミノ酸を変化させた。突然変異の利点を以下のごとく 確認した。 一補給型バッチ発酵によって修飾リパーゼを産生じ、細胞除去、濃縮、エタノー ル抽出及びＤＥＡＥ−セルロースアニオン交換によって単離しな。 −トリリン酸ナトリウムと３ｍＭの塩化カルシウムとを含むベース粉末洗剤５ｇ ／ｌの溶液にリパーゼ変異体を５ｘｇ／ｌの濃度で添加し、Ｓａｖ：ｎａｓｅ（ 丁Ｍ）を濃度２０ＣＩＪ／ｘｌに添加し、温度を３０℃に維持して残留リパーゼ 活性を経時的に追跡した。 −図２３は、トランスコンシュガントＰＧＬ６及びＰにＬ２４によって産生され 、Ｖａｌ１５０が八ｓｐに変化し！ｆｉｓ１５４がＰｒｏに変化したリパーゼに よって得られた結果を示す、これらの結果は、プロテアーゼ攻撃に対する３受性 （ｓｕｓｅｅｐｔｉｂｉｌｉＬｙ）がかなり減少していることを示す。 一図２４は、５ｅｒ１５３及び／または）Ｉｉｓ１５４が＾ｒｇに変化したリパ ーゼ変異体ＰＣ：Ｌ２７．３３及び３６における結果を示している。 これらの１換によってｐＨ９〜１０で正電荷をもつアミノ酸の安定性が有意に改 良されることが明らがである。 −図２５は、２つの突然変異の組み合わせによってプロテアーゼとの共存適性が 更に改良されることを示す、　ＰＧＬ２４（８１５４Ｐ）中で残基１４９と１５ ０との間に新しい一次開裂部位が決定された。　ＰＧＬ５６はｌ！１５４ＰとＶ １５０Ｐとを組み合わせて含み、ＰにＬ２４に比較して改良されていることが判 明した。　Ｐ（：Ｌ５７はプロリン導入を（局部的）正電荷の増加（）１１５４ Ｐ　＋　５１５１Ｒ）と組み合わせて含み、同等に改良されていることが判明し た。 実施例１２：単一メチオニンの置換による酸化性分解に対するＰ、　ｇｌｕ＋ａ ａｅリパーゼの耐性の改良過酸化水素の存在下のインキュベーシゴン中のリパー ゼ活性の減少を経時的に追跡したく３％のＨ，Ｏ□、６０リパ一ゼ単Ｑ／ｍｌ、 ０．２５％のドデシルベンゼンスルホネート、５０ＩＩＭのホウ酸塩ｐｉ（９） 。 過酸化水素の非存在下の活性減量の値を基準とし、結果を図２６にプロットした 。 これらの条件下では、修飾酵素ＰＧ：Ｌ６３（突然変異Ｍｅｔ　２５４１ｉｅ） が出発酵素に比較して有意に改良された安定性を有することが容易に判明した。 この修飾は、実際の洗濯条件下に洗剤系及び液体洗剤中のリパーゼの安定性を増 加させるためにも重要であり、また、成熟リパーゼ（例えば実施例９）の最初の アミノ酸残基に先行する最終アミノ酸残基としてメチオニン残基が導入されたキ メラタンパク質を作製するためにも重要である。 実施例１３：ズブチリシンによるリパーゼの開裂部位の決定リパーゼ酵素のアミ ノ酸配列に導入すべき有用な突然変異を同定するために、ズブチリシンの作用下 のリパーゼポリペプチドの一次開裂部位を以下のごとく決定し得る。主としてＰ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅのリパーゼに関する手順を詳細に説明する が、この手順は多少の変更を加えて別のリパーゼにも使用できる。 Ｐｈｅｎｙｌｓｅｐｂａｒｏｓｅ（ＴＭ−Ｐｈａｒｍａｅｉａ）疎水性相互作用 クロマトグラフィー、アセトン抽出及びゲル透過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈ ａｅｒｙｌ−２００，Ｐｈａｒｖａｃｉａ）を順次用いてＰｓ　ｇｌｕｍａｅを 濃縮発酵ブイヨンから単離した。得られた酵素調製物は、比活性、υＶ吸収及び ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で約３４ｋＤに１つのバンドが存在する ことがら判断するとほぼ純粋であった。 Ｓａｖｉｎａｓｅ（ＴＭ−Ｎｏｖｏズブチリシン）、ドデシルベンゼンスルホネ ート１　ｇ／ｌ、トリリンｔｌナト’Ｊ　’）ムｏ、７ｇ／１．　Ｋｒ１ｉｆト リウム０．７ｇ／ｌ、ゲイ酸ナトリウム０．２ｔ／ｌ及び過ホウ酸すトリウム０ ．７ｙ＃（ｐＨ９，５）の溶液中でリパーゼ（５Ｈ／ｍｌ）を３０℃で消化した 。　（ＩＩ；Ｕは、最ＭｐＨで４０℃で１５分間インキュベーション中に基質で あるＮ−アセチルカゼインからグリシン１μｍｏｌに均等の量の一次アミノ酸を 産生ずるプロテアーゼ活性の標準単位である）、３０分後にリン酸でｐＨ２，５ にするｐＨショックによってタンパク質分解を停止させた。 タンパク質分解産物の５ＤＳ−ＰＡＧＥは、合計するとリパーゼの初期分子量を 与える見掛は分子量１４及び１９ｋＤの２つのポリペプチドだけを実質的に示し た。開裂部位を同定すべく産物分分析するために、Ｅｘｔｒｔｃｔｉｇｅｌ　Ｄ （Ｐｉｅｒｅｅ）によって調製物からアニオン性洗剤を除去し、Ｂａｋｅｒｂｏ ｎｄ　ｗｉｄｅ　ｐｏｒｅ４．６ｘ　２５０ｍｍ　Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラムで ０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル勾配で溶出することによってポ リペブトに対応することが判明した。 分離産生物の気相配列決定（八Ｂ＋　４７０７１２０）によって以下のＮ末端配 列が判明した；ｌ：Ｈｉｓ−＾５ｎ−Ｔｈｒ−＾ｓｐ−；２：＾１ａ−＾３ｐ− Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−：　３　、＾１ａ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−，リパーゼがリ パーゼの出発アミノ酸配列の５ｅｒ１５３とｔｌｉｓ１５４との間で５ａｖｉｎ ａｓｅによって分割され、１〜１５３を含むフラグメントはビーク２に出現して 分子量−１４ｋＤを有し且つ初期Ｎ末端を含み、１５４〜３１９を含むフラグメ ントはビーク１に出現して分子量−１９ｋＤを有し初期Ｃ末端を含むと推定され る。 ＰＳｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｅｅｐａｅｉａ（その配列はＥＰ　Ｏ３３１３７６（ ＾−ｔｎｏ）に開示されている）を同様に処理すると、ズブチリシンの一次開裂 部位が成熟リパーゼの５ｅｒ１５２と５ｅｒ１５３との間に存在していた。 、ズブチリシンによる分解に対して改良された耐性を与えるために上記の手順で 組立てたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅのリパーゼの突然変異の例は、 突然変異）１１５４Ｐを含む変異体ＰにＬ２４及び突然変異ＶＩ５０Ｄを含む突 然変異体ＰＣＬ６である。これらの双方の突然変異リパーゼ酵素を試験してプロ テアーゼ攻撃に対する怒受性の有意な減少を確認した。　Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎ ａｓｅｅｐａｅｉａのリパーゼの対応する有用な突然変異の例は、５１５３Ｐを 含む突然変異である。 本発明の洗剤組成物の配合組成を以下の非限定実施例Ｄ１〜Ｄ１４によって更に 詳細に説明する。これらの各実施例では特に注釈がない限り、本発明のリパーゼ が０．５重量％存在している。 実施例Ｄ１： 本発明の実施例の１つとして、ホスフェートビルダーを含有する粉末洗剤を、活 性洗剤合計的１６％、アニオン性洗剤約９％、非イオン性洗剤約６％、ホスフニ ート含有ビルダー約２０％、アクリルまたは等価のポリマー約３．５％、（また は約２％以上）、過ホウ酸塩漂白剤前駆物質約６〜１８％、または約１５〜２０ ％、アミノ含有漂白剤活性化物質的２％、シリケートまたは別の構造化剤約３． ５％、または約８％以下、約８グリシン単位／ｌｙの活性の酵素、使用中に所望 ｐＨに調製するアルカリ、中性無機塩及び酵素（夫々的０．５％のプロテアーゼ 及びリパーゼ）から成る配合組成で調製した。 アニオン性洗剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、または直鎖状アル キルベンゼンスルホン酸ナトリウム６％と第一アルキル硫酸塩３％との混合物で ある。非イオン性洗剤は、１モル当たり７つのエトキシレート残基をもつ約Ｃ１ ３〜Ｃ１５の第一アルコールのエトキシレートである。 ホスフェートビルダーは、トリポリリン酸ナトリウムである。ポリマーはポリア クリル酸、またはアクリル／マレインコポリマーである。過ホウ酸塩漂白剤活性 化物質は４水和または１水和テトラホウ酸ナトリウムである。活性化物質は、テ トラ−アセチル−エチレン−ジアミンである。構造化剤はケイ酸ナトリウムであ る。中性無機塩は硫酸ナトリウムである。 実施例Ｄｌａ　： 本発明の実施例の１つとして、ホスフェートビルダーを含有する粉末洗剤を、活 性洗剤合計的１５％、アニオン性洗剤約７％、非イオン性洗剤約６％、ホスフェ ート含有ビルグー的２５％、アクリルまたは等価のポリマー約０．５％、過ホウ 酸塩漂白剤前駆物質約１０％、アミン含有漂白剤活性化物質的２％、シリケート または別の構造化剤約６％、約８グリシン単位／ｘｇのグレードのプロテアーゼ 酵素、使用中に所望ｐＦｌに調製するアルカリ、中性無機塩及び酵素（夫々的０ ．５％のプロテアーゼ及びリパーゼ）から成る配合組成で調製した。 アニオン性洗剤は、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。非イ オン性洗剤は、１モル当たり７つのエトキシレート残基をもつ約Ｃ１３〜Ｃ１５ の第一アルコールのエトキシレート、または、該エトキシレートと１モルあたり ３残基の程度までエトキシル化した対応するアルコールとの混合物である。ホス フェートビルダーは、トリポリリン酸ナトリウムである。過ホウ酸塩または過酸 漂白剤活性化物質は４水和テトラホウ酸ナトリウムである。活性化物質は、テト ラ−アセチル−エチレン−ジアミンである。 精造化剤はケイ酸ナトリウムである。中性無機塩は硫酸ナトリウムである。 実施例Ｄ２： 本発明の実施例の１つとして、ゼオライトビルダーを含有する粉末洗剤を、活性 洗剤合計的１６％、アニオン性洗剤約９％、非イオン性洗剤約６％、ゼ万うイト 含有ビルダー約２０％、アクリルまたは等価のポリマー約３５％、過ホウ酸塩漂 白剤前駆物質約６〜１８％、アミノ含有漂白剤活性化物質的２％、シリゲートま たは別の構造化剤約３．５％、または約２．５％以上、約８（または約１５）グ ツシン羊位／Ｈのグレードの酵素、使用中に所望ｐＨに［’するアルカリ、中性 無機塩及び酵素（夫々的０５％のプロテアーゼ及びリパーゼ）から成る配合組成 で調製した。 アニオン性洗剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたは［鎚状アルキ ルベンゼンスルホン酸ナトリウム６％と第一アルキルｖｉ酸塩３％との混合物で ある。非イオン性洗剤は、１モル当たり７つのエトキシレート残基をもつ約Ｃ１ ３〜Ｃ１５の第一アルコールのエトキシレートである。ゼオライトビルダーはＡ 型ゼオライトである。ポリマーはポリアクリル酸である。過ホウ酸塩漂白剤活性 化物質は４水和または１水和テトラホウ酸ナトリウムである。活性化物質は、テ トラアセチル−エチレンジアミンである。構造化剤はケイ酸ナトリウムである。 中性無機塩は硫酸ナトリウムである。 実施例Ｄ２ａ： 本発明の実施例の１つとして、ゼオライトビルダーを含有する粉末洗剤を、活性 洗剤合計的１４％、アニオン性洗剤約７％、非イオン性洗剤約７？６．ゼオライ ト含有ビルダー約２５％、アクリルまたは等価のポリマー約３％、過ホウ酸塩ま たは過酸漂白剤前駆物質的１０％、アミノ含有漂白剤活性化物質的２％、シリゲ ートまたは別の構造化剤約０．５％、約６グリシン単位／ａｙのグレードの酵素 、使用中に所望ｐｎに調製するアルカリ、中性無機塩及び酵素（夫々的０．５％ のプロテアーゼ及びリパーゼ）から成る配合組成で調製した。 アニオン性洗剤は、直望状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、非イオン性 洗剤は、１モル当たり夫々７つ及び３つのエトキシレート残基を６つ約Ｃ１３〜 Ｃ１５の第一アルコールである。ゼオライトビルダーはＡ型ゼオライトである。 ポリマーはアクリル／マレインコポリマーである。過ホウ酸塩漂白剤活性化物賀 は１水和テトラホウ酸ナトリウムである。活性化物質は、テトラ−アセチル−エ チレン−ジアミンである。構造化剤はケイ酸ナトリウムである。中性無機塩は硫 酸ナトリウムである。 実施例Ｄ３： 本発明の実施例の１つとして、水性液体洗剤を、ドデシルベンゼンスルホン酸１ ６％、７ｍｏｌ／鴎ｏ１のエチレンオキシドと縮合しなＣ１２〜Ｃ１５直鎖状ア ルコール７％、モソエタノールアミン２％、クエン酸６．５％、キシレンスルホ ン酸ナトリウム６％、水酸化ナトリウム約４．１％、プロテアーゼ０．５％、微 量成分及び１００％になるまでの水分から成る配合組成で調製した。　ｐＨを９ 〜１０の値に調整した。リパーゼ及びプロテアーゼの双方が夫々的０．５％存在 する。 実施例Ｄ４： 本発明の実施例の１つとして、非水性液体洗剤を、４．９ｍｏｌ／ｍｏｌのエチ レンオキシド及び２．７ｍｏｉ’／ｍｏ１のプロピレンオキシドでアルコキシル 化したＣ１３〜Ｃ１５の直鎖状第一アルコール３８．５％、トリアセチン５％、 三リン酸ナトリウム３０％、ソーダ灰４％、微量のオキソボラートを含む１水和 化ホウ酸ナトリウム１５．５％、ＴＡＥＤ　４％、その０，１％がリン酸である ＥＤＴ＾０．２５％、＾ｅｒｏｓｉｌ　Ｏ，６％、ＳＣＭＣ１％及びプロテアー ゼ０．６％から成る配合組成で調製した。ｐＨを９〜１０の値、例えば約９．８ に調整した。リパーゼ及びプロテアーゼの双方が夫々的０．５％存在した。 実施例Ｄ５： 本発明の実施例の１つとして、嵩密度６００，７１以上を有する顆粒状の本発明 の粉末洗剤を、界面活性剤約２０重量％でその約１０％がドデシルベンゼンスル ホン酸ナトリウムで残りが５ｙｏｐｅｒｏｎｉｅ＾７及び５ｙｎｐｅｒｏｎｉｅ ＾３（約５．５％〜４．５％）の混合物、中性無機塩（例えば硫酸ナトリウム） 非含有、ホスフェートビルグー約３３％、４水和過ホウ酸ナトリウム約１６％、 ＴＡＥＤ活性化物質約４．５％、ケイ酸ナトリウム約６％、及び約２％の炭酸ナ トリウムを含む微量成分、水分的１０％か一ゼ及びリパーゼ）を含む。 実施例Ｄ６： 本発明の１つの実施例として嵩密度８００ｙ＃以上、または約５５０ｇ／ｌを有 する顆粒状の粉末洗剤を、その約９％または約７％がドデシルベンゼンスルホン 酸ナトリウムまたは直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムで残りが５ｙ ｎ−ｐｅｒｏｎｉｅ＾７及び５ｙｎｐｅｒｏｎｉｅ＾３（または同様のエトキシ レート）（夫々的５％及び６％または約４％及び７％）の混合物から成る界面活 性剤約２０重量％、または約１６重量％以上、中性無機塩（例えば［酸ナトリウ ム）非含有、ゼオライトビルグー約３０％または約２５％、４水和または１水和 過ホウ酸ナトリウム約１４％または約１５％、ＴＡＥＤ活性化物質約３．６％、 約９％または１５％以下の炭酸ナトリウムを含む微量成分、Ｄｅ−ｑｕｅｓｔ　 ２０２Ｏ４７（Ｔ約０．７％、水分約１０％から成る配合組成で調製した。酵素 （夫々的ｏ　、　５　？、；のプロテアーゼ及びリパーゼまたは約０．２％のリ パーゼ及び約０７％のプロテアーゼ）が含まれている。 実施系Ｄ６ａ　： 本発明の１つの実施例として嵩密度６００ｇ／１以上を有する顆粒状の粉末洗剤 を、その約７？コが直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、２％が第一 アルコールＫＭ塩で残りが５ｙｎｐｅｒｏｎ　ｉ　ｅ＾７及び同様のエトキシレ ートから成る界面活性剤約１５重量％、中性無機塩（例えばＰＩ酸ナトリウム） 非含有、ゼオライトビルグー約２２％、４水和過ホウ酸ナトリウム約１５％、Ｔ ＡＥＤ活性化物質約７％、約１５％の炭酸ナトリウムを含む微量成分、Ｄｅｑｕ ｅｓｔ　２０２Ｏ４７（Ｔ約０．７％、水分約１０％から成る配合組成で調製し た。酵素（全体で約１．２％のプロテアーゼ及びリパーゼ）が存在する。 実施例Ｄ７： 本発明の１つの実施例として粉末洗剤を、ドデシルベンゼンスルホンｖｉ６％、 ７■ｏ１／ｓｏ１のエチレンオキシドと縮合したＣ１２〜Ｃ１５の直鎖状アルコ ール５％、脂肪酸石鹸３％、５ｏｋｏｌａｎ　ＣＰ５ポリマー（ＴＭ）３％、ゼ オライトＡ　２２％、炭酸ナトリウム１０％、硫酸ナトリウム１７％、クレー粒 子８％、４水和過ホウ酸ナトリウム１３％、テトラアセチルエチレンジアミン２ ％、プロテアーゼ０．５％、微量成分及び１００％までの水から成る配合組成で 調製した。　ｐｌｌを９〜１０の値に調整した。リパーゼ及びプロテアーゼが夫 々的０．５％存在する。 実方１例Ｄ８・ 本発明の１つの実施例として棒状洗剤（石鹸）を、完全鹸化した８２％獣脂と１ ８％ヤシ油とを主成分とし、０．１５％のオルトリン酸で中和し、プロテアーゼ （棒状組成物１ａｇあたり約８にＵ）と混合し、ギ酸ナトリウム２％、ホウ砂２ ％、プロピレングリコール２％及び硫酸ナトリウム１％と混合し、次いで石鹸生 産ラインで固形製品として圧出する。製品はリパーゼ及び１０テアーゼを夫々的 ０．５％含む。 実施例Ｄ９： 構造化した液体洗剤は、プロテアーゼ（約０．５％）及び本文に記載のリパーゼ （約０．５％）に加えて、非イオン性界面活性剤２〜１５％、非イオン性及び任 意に加えてもよいアニオン性の界面活性剤合計５〜４０％、ホスフェート含有ま たは非含有ビルグー５〜３５％、高分子増粘剤例えば分子量１０’以上の架橋ア クリルポリマー０．２〜０．８％、例えば中性水ガラスの形態のケイ酸ナトリウ ム１０％以上を含有し、所望のｐｌｌ好ましくはｐＦ１９〜１０またはそれ以上 例えばｐＨ１１以上に調整するためのアルカリ（例えばカリウム含有アルカリ） を含有し、ナトリウムカチオン：シリケートカチオン（遊離シリカ）の重量比０ ．７：１未満で、粘度０．３〜３０Ｐｉｓ　（２０℃及び２０ｓ−１）である。 この実施例の適当な変形例は、約５％の非イオン性界面活性剤、１モルあたり約 ５ＥＯの基及び約２．７のＰＯ基でアルコキシル化されたＣ１３〜Ｃ１５アルコ ール、シリカ対酸化ナトリウムの重量比３，５の中性水ガラス１５〜２３％、Ｋ ＯＢ　１３〜１９％、５ＴＰＰ　８〜２３％、炭酸ナトリウム０〜１１％、Ｃａ ｒｂｏｐｏｌ　９４１（ＴＭ）０．５％を含む。 実施例Ｄ１０＝ 洗濯に適した構造化粘性水性液体洗剤を以下の配合組成で調製する（重量％）： クエン酸　２．５ ホウ砂（１０ａｑ）　４ ＮａＯＨ２ グリセロール　５ Ｃ１４〜Ｃ１５直鎖状アルキルベンゼンスルホネートまたはＣ１４〜Ｃ１５第一 アルコール硫酸塩　６．５Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｅ＾３ 非イオン性Ｃ１２〜Ｃ１５３ＥＯ１，２Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｅ　＾７ 非イオン性Ｃ１２〜Ｃ１５７ＥＯ３，６ゼオライト　２０ プロテアーゼ　０．５ アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ　３００ＬＤＸ）　０．２微量成分及び水　１０ ０％まで ｐｎを９〜１０の値に調整し得る。酵素はリパーゼ（約０．５％）を含む。 実施例吋１： 洗濯に適した等方性水性液体洗剤を以下の配合組成で調製する（重量％）： クエン酸　２ ホウ酸　ｌ ＮａＯＨ３ ＫＯ［ｌ　４．５ グリセロール　１０ エタノール　６．５ 非イオン性界面話性嗣 （Ｃ１２アルコール　６５ＥＯ工トキシレート基／ｍｏ１）または第一アルコー ル硫酸＋トリウム　１０ オレイン酸　１６ ヤシ油（Ｃ１２）石鹸　１１ １０テアーゼ　０．５ 微量成分及び水　１００％まで ｐＨを９〜１０の値に調整し得る。酵素はリパーゼ（約０．５％）を含む。 実施例Ｄ１２゜ 水性液体洗剤組成物を以下の配合組成で調製する：アルキルベンゼンスルホン酸 ナトリウム　１４．５ＣｔＳナトリウム石鹸　２ 非イオン性洗剤（０１２〜Ｃ１５６ＥＯ）　９脂肪酸くオレイン酸）４．５ アルケニルコハク酸ナトリウム　１１ プロパンジオール　１．５ エタノール　３．６ クエン酸ナトリウム　３．２ 錯化剤、例えばＤｅｑｕｅｓｔ　２０６０　０．７塩化ナトリウム　０．５ 微量成分及び水　１００％まで ｐｉ（を９〜１０の値に調整し得る。酵素はリパーゼ（約０．５％）を含む。 実施例Ｄ１３　： 水性液体洗剤組成物を以下の配合組成で調製する・アルキルベンゼンスルホン酸 ナトリウム　８非イオン性洗剤６．５Ｅ０　１０ オレインジエチルアミド　１０ 脂肪酸（Ｃ１２／Ｃ１８７５：２５）　１８クエン酸ナトリウム　１ トリエタノールアミン　５ Ｄｅｑｕｅｓｔ　２０６０　０．５ 微量成分及び水　１００％まで ｐｎを９〜１０の値に調整し得る。酵素はリパーゼ（約０．５％）を含む。 実施例Ｄ１４： 非水性液体洗剤組成物を以下の配合組成で調製する：液体非イオン性洗浄剤（Ｃ １０〜１２．６．２ＥＯ）　４Ｌ＄トリアセチン　５ 直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸　６酸化マグネシウム安定剤　１ 炭酸ナトリウムビルダー／塩基　１８ 炭酸カルシウムビルダー　８ 漂白剤活性化物質ＴＡＥＤ　３．５ 漂白剤前駆物質１水和過ホウ酸塩　１０．５部分疎水性シリカ　２ プロテアーゼ　０．４ リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ）　０．３微量成分又は追加した液体非イオン性 界面活性剤（非水性）１００％ この組成物を調製するときは、液体非イオン性界面活性剤とトリアセチンとをま ず添加し、次いで酸化マグネシウムを添加し、次に酵素以外のその他の諸成分を 添加する。 混合物をコロイドミルで混練して冷却し、最後に（１種または複数の）酵素及び その他の熱感受性微量成分を添加する−。 プロテアーゼ（０，５％）及びリパーゼ（約０．５％）をこの段階で添加する。 ＥＰ　Ｏ３４２１７７の実施例に記載の洗剤調製物にリパーゼ（約０．５％）を 添加して使用してもよい。 本文の記載、図面、請求の範囲及び参考文献に基づいて本発明の多数の変更及び 変形が可能であること、本発明の開示がかかる変更及び変形のすべてを包含する こと、また、本文の記載、参考文献、請求の範囲及び図面に記載及び図示した諸 特徴の任意の組み合わせが可能であることは当業者に明らかであろう。 、：１９ＭＶＲ５ＭＲ５ＲｉノＡＡＲＡＶＡＩＪＡＬＡＶ−ＤＴＹＡＡＴＲＹＰ ＶＩＬＶＨ，（：ＬＡＧＴＤ　−ＫＦＡＮＶＶＤＹＷＹにＩＱＳＤＬＱ５ＨＧ　 −ＣＣＧＡＡＧＧ？ＧＴＡＣｃＴＣＣ；ＣＧＡＡＴＣＴＣＴＣＧＧＧＡＴＴＣＣ ＡにＡＧＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＣＣＧＡＡＣＣにＣＣＧＣ２４１−−−−−−− −−＋−−−−−−−−−十−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−− −−−−−・峰−−−−−−−−−＋@３ＱＯ ＡＫＶＹＶＡＮＬＳＧＦＱＳＤＤＧＰＮＧＲ−３０１−−−−−−−−−＊−− −−−−−−−＊−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−− −＋−−−−−−−−−＋R６０ ＣＣにＣＴＣにＴＣにＡＣＣＡＧＣＧＧＡＴにＣＡＣＴＴＣ（：ＴＣＣＡｃｃＡ ｃｃｃｃｃＣ；ＣＴＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣ；ＧＴＴＣＣＡＣＣＥＱＬＬＡＹＶＫ ＱＶＬＡＡＴＣＡＴＫＶ　＋ＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧにＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧに ＣＣＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣにＴＣＣＣにＣＣＣ（：ＴＣＣ；ＣＣ ：ＣＣに３６１　−−−−−−−−一◆−−−−−−−−−÷−−−−−−−一 −◆−−−−−−−−−＋−−−−−−−−一今−−−−−−−−−■S２０ τＴＣＧＡＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＴＣＧにＴＣＣＣＣＣＣにＧＡＣＴＣＣＡＧＣ Ｃ，ＣＣ；ｋＴｃ、ｃＡにＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣ；b ＮＬＩＧ）ＩｓＱＧＧＬＴｓＲＹＶＡＡＶＡＰ　−ＣＡＡＣＴＣ（Ｔ　ＣＣＣＣ ＴＣＧｃＴＧＡＣにＡｃＧＡＴｃｃＧＣＡＣにＣＣＣＣＡＴＣにＣＧＧＣＴＣＣ ＧＡＣ口：（ＡＣＣＧＡＣ４２１−−−−−−−−−十−−−−−−−−−＋− −−・−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−一今−−−−−−− −−＊@４８０ （ＴＴにＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＴにＣＴＡＣＣＣＣ；ＴＬ；ＣＣ Ｃ；ＣＣＴＡにＣＣ；ＣＣＣ；ＡＣＣ；ＣＴＣＡＡにＣＣＣbＴＧ ＱＬＶＡ５Ｖ丁丁ＩＣＴＰＨＲにＳＥＦＡＤ−＾ＡＬＲＴＬτ丁ＡＱＴ＾丁ＹＮ ＲＮＦＰＳ−＾ＧＬＧＡＰＧＳＣＱＴＣＡＡＴＥＴＶＣ（ニー５ＱＨＬＬＹＳＩ ＪＧＧＴ　＾　１ＱＰＴＳ　τ　ＶＬ−ＮＤＧＬＶＳＲＣ５５ＬＦＧＱＶＩＳＴ ＳＹ　・）！１ＪＮＨＬＤＥ　Ｉ　ＮＱＬＬＧＶＲＧＡＮＡＥ　・ＤＰＶＡＶＩ ＲＴＨＶＮＲＬＸＬＱＧＶ會−Ａ、　今へ゛ル（イシ゛−／１ｒＯＮＡｈ乙Ｇ　 （ｅｕＲｂｏ３Ｂ　＋）ＡＶＭＰＬＡＧＡＡＣＬＴＭＡＡＳＰＡＡＶ　−Ｖ　。 ＡＡＤＴＹＡＡＴＲＹＦＶＸＬＶＨにＬＡＣ−ＴＤＫＦＡＮＶＶＤＹＩＪＹ（： ＩＱＳＤＬＱＳ　−ＨにＡ）ＣＶＹＶＡＮＬＳＧＦＱＳＤＤ（：Ｉ’Ｎ　−ＧＲ ＣＥＱＬＬＡＹＶＫＱＶＬＡＡＴＧＡＴ　−ｘｖｓ　Ｌ　Ｉ　ｃ　Ｈ５ｑｃｃｔ ｒｓ　Ｒｙｖ　Ａ　Ａ　ｖ　−ＡＰＱＬＶＡＳＶ　τ　ＴＩＧＴＰＨＲＧＳＥＦ 　−＾　ＤＦＶＱＤＶＬＸＴＤＰＴＧＬＳ５ＴＶ！　・ＡＡＦＶＮＶｒ（：ＴＬ ＶＳＳＳ　ＨＮ　丁　ＤＱＤ　−＾　ＬＡＡＬＲτ　Ｌ　丁　丁　Ａ　ＱＴＡＴ ＹＮＲＮＦ　−ＰＳＡＧＬＧＡＰに５ＣＱＴＣＡＡＴＥＴＶ　−ＧＧＳＱＨＬ’ ＬＹＳ　υ　（：にＴＡＺＱＰＴＳＴ’−ＶＬＧＶＴＣＡＴＤＴＳＴＧ　τ　Ｌ ＤＶＡＮＶ　−τにＣＣＴＣ；ＧＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＣ；ＡＣＡＡＡＡＣ ｃｃＡＴＣＣＣＣＴＣにＣＣＡＡＴＡＣＴＡＧＴＴＧＧ　ＣＡＣＧＡＡＧＡτ　 ＤＰ５ＴＬＡＬＬＡＴＣＡＶＭＩ、ＮＲＡＳ　−にＱＮＤにＬＶＳＲＣ５ＳＬＦ にＱＶＩＳ　τ　・５ＹＨＩＪＮＨＬＤ！ＩＮＱＬＬＣＶＲ（：　Ａ　Ｎ　−Ｃ ＣＴ　ｃＡｃｃ、ｔｔｃ　ＣＣＴＣＴＴＣＣＣにＴＣＡＴＴＣにＴＡ　Ｃに　Ｃ ＡＣにＴ　ＣＡＡＣＡＧ；　ＡＴｒにＡＡＡ　ＣＴｒ　ｃ`ｃｃ　ＧＡ（７Ｔ １０２１　・−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−，、−−−−−−＋− −−−−−−＝＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−P０８０ ＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴにＣＣＴＣＣＡＣ 丁ＴＣ丁ＣＴＡ＾Ｃτ丁ＴＧＡ＾ＣＴＣＣＣτＣ人Ａ＾ＥＤＰＶＡＶＩＲＴＨＶ ＮＲＬＫＬＱＣ”ノーＡＴＴＡＴＣＧＡＣＣ丁ＣＡＡＴＧＡＴＣＣＴＡにＧＡＧ τＡＡ丁ＣττＣＧ八＾Ｂ、ノ壬へメジブＩぐ−てｚ”、’、”−７つ３′−工 ／ＶＤＮＡシ紀−ｐＪ（ｐＵＲ６６ＱＯ’Ｐ）。 ＡＥＤＰＶＡＶＩＲＴＨＶＮＲＬＫＬＱにＶ　−ＣｐＵｌ！Ｌ　６０２Ｂ　（２ ６４ｂｐ）ｐＬＩＲ６７７１ ｐＵ只６７７０ 隼組へ゛７１−７ラク゛メ／ト ○ ―−−―−畷■陶−・　−−一一閤一−−−−旨　−一一一一一一一一―−一■ −−，，，。 ｐＵＲ６９０１（ｆｉ９．　１７Ｃ） Ｏ ｐＵＲ６５２２ｐＵＲ６５０２ ｐＵＲ６５００ｐＬＩＲ６５２２ 時−１１（／か） 時間（す） 晴ｒ、Ｉｌｌ　Ｉ分） 国際調査報告 −１１中−ｈｏｅ−ｔ−ｍｍ　ＰＣＴ／ＧＢ　９０１０１０５２−一一市−＾綽 −，，−−ＰＣＴ／ＧＢ　９０１０１０５２国際調査報告

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．ｒＤＮＡ手法によって微生物から産生され、プロテアーゼ及び／または酸化 剤による攻撃に対して改良された安定性及び／または対応する親酵素に比較して 増加した活性を与える少なくとも１つの突然変異をそのアミノ酸配列に含むリパ ーゼ酵素。
2. ２．Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｍ　ｖａｒ　ｌｉｐｏｌｙｔｉ ｃｕｍ　ＮＲＲＬＢ−３６７３に由来のリパーゼ、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＰＬ −６７９，ＡＴＣＣ３１３７１もしくはＦＥＲＨ−Ｐ３７８３に由来のリパーゼ 、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｎｓＩＡＨ１０５７に由来の リパーゼに対して感作された抗血清と交差免疫反応性を示す請求項１に記載のリ パーゼ。
3. ３．リパーゼタンパク質産生物のループ構造が物理的もしくは化学的変性または 酵素開裂に対して安定しているようにｒＤＮＡ手法によって修飾されたアミノ酸 配列を有する請求項１または２の記載のリパーゼ。
4. ４．（ｉ）ズブチリシン開裂部位、即ち親酵素中のズブチリシン開裂を受け易い 結合のいずれかの側の５残基以内の配列を、例えば突然変異以前に存在していた 該部位の構成部分であった１つまたは２つ好ましくは３つのアミノ酸残基を欠失 させることによって修飾するか、あるいは、（ｉｉ）少なくとも１つの塩基性ア ミノ酸残基、または少なくとも１つのプロリン残基をこのような開裂部位に挿入 または置換によって導入するか、あるいは、（ｉｉｉ）かかる部位に正電荷をも つアミノ酸を導入または負電荷をもつアミノ酸を除去することによって該部位の 静電ポテンシャルを変更することによって、ズブチリシンプロテアーゼなどのプ ロテアーゼによる攻撃に対するリパーゼの安定性を改良するように選択された（ １つ以上の）アミノ酸配列修飾を有する請求項１から３のいずれか一項に記載の リパーゼ。
5. ５．（ｉ）突然変異がＰｓ．ｇｌｕｍａｅまたはその相同体に由来のリパーゼの 配列に基づく突然変異、例えば突然変異Ｈ１５４Ｐであるか、またはＰｓ．ｃｅ ｐａｃｉａもしくはその相同体に由来のリパーゼの配列に基づく突然変異、例え ばＳ１５３Ｐのとき等に、親酵素中のズブチリシン開裂を受け易い結合が開裂す る際に新しいＮ−末端になるアミノ酸残基がプロリンによって置換されているこ と、及び／または、（ｉｉ）突然変異がＰｓ．ｇｌｕｍａｅまたはその相同体に 由来のリパーゼの配列に基づく突然変異、例えば突然変異Ｖ１５０Ｄであるとき 等に、かかる易開裂結合から２つまたは４つの位置のアミノ酸残基が荷電アミノ 酸残基またはより極性のアミノ酸残基によって置換されることを特徴とする請求 項４に記載のリパーゼ。
6. ６．配列からメチオニン残基を除去すべく欠失または置換によって配列のメチオ ニン残基を修飾することによって、酸化性失活に対するリパーゼの安定性を改良 するように選択されたアミノ酸配列の（１つ以上の）修飾を有することを特徴と する請求項１から５のいずれか一項に記載のリパーゼ。
7. ７．細菌リパーゼ、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌｕｍａｅのアミノ酸配 列と実質的に相同のアミノ酸配列を有し、対応する細菌リパーゼをコードする遺 伝子またはその突然変異体を宿主微生物に導入するｒＤＮＡ手法に基づいて異種 真核宿主微生物によって産生され、かくして、前記遺伝子の起原である親微生物 によって産生されるリパーゼとは異なるようにグリコシル化したことを特徴とす るリパーゼ。
8. ８．負電荷残基（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸の残基）を欠失させ るかまたはこれらを中性残基（例えば、セリン、グリシン、プロリン）によって 置換する、中性もしくは負電荷残基を正電荷アミノ酸残基（例えばアルギニンま たはリシン）によって置換する、または、正電荷残基を挿入するなどによってリ パーゼの実効正電荷及びｐＩを増加させるように選択されたアミノ酸配列の（１ つ以上の）修飾を含むこと、例えば、Ｐ３．ｇｌｕｍａｅリパーゼまたはその相 同体の配列に比べて実効正電荷及びｐＩの増加した突然変異Ｄ１５７Ｒ、Ｄ５５ Ａ及びＩ１１０Ｋを含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載 のリパーゼ。
9. ９．グリコシル化部位になり得るアミノ酸を導入または除去するように選択され たアミノ酸配列の（１つ以上の）修飾；例えばＰ３．ｇｌｕｍａｅリパーゼまた はその相同体の配列に突然変異Ｄ１５７Ｔ及び／または＊１５５ａＧを含むこと を特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のリパーゼ。
10. １０．ヌクレオチド配列の一部が、請求項２に記載し且つ第１のリパーゼに免疫 的に関連した別のリパーゼをコードするヌクレオチド配列の実質的に対応する部 分によって置換されていることを特徴とする請求項２及び３から９のいずれか一 項に記載のリパーゼ。
11. １１．Ｐｓ．ｇｌｕｍａｅリパーゼまたはその相同体の配列に対してアミノ酸配 列の１つ以上の次の修飾： Ｖ１５０Ａ；Ｖ１５０Ｓ；Ｖ１５０Ｄ；Ｖ１５０Ｋ；Ｄ１５９Ｅ；Ｈ１５４Ｐ； Ｓ１５３Ｐ；Ｓ１５３Ｒ；Ｈ１５４Ｒ；Ｄ１５７Ｒ；Ｓ１５３Ｃ；Ｈ１５４Ｇ； Ｓ１５３Ｐ＋Ｈ１５４Ｐ；Ｓ１５２Ｐ＋Ｈ１５４Ｐ；Ｖ１５０Ｐ＋Ｈ１５４Ｐ； Ｖ１５０Ｐ＋Ｓ１５２Ｐ＋Ｈ１５４Ｐ；Ｓ１５３Ｒ＋Ｈ１５４Ｒ；Ｓ１５３Ｇ＋ Ｈ１５４Ｇ；Ｓ１５１Ｒ＋Ｈ１５４Ｐ；Ｓ１５３Ｃ＋Ｂ１５４Ｐ；Ｓ１５２＊＋ Ｓ１５３＊＋Ｅ１５４Ｐ；Ｓ１５２Ａ＋＊１５２ａＬ＋＊１５３ａＧ＋＊１５４ ａＰ（１５２〜１５４位の配列ＳＳＨが３つの正味の挿入を含むＡＬＳＧＨＰに なる）；Ｓ１５２Ａ＋＊１５２ａＬ＋＊１５３ａＧ＋＊１５４ａＰ＋Ｎ１５５Ｒ ＋Ｔ１５６Ｌ＋Ｄ１５７Ｐ＋Ｄ１５９Ｎ（１５２〜１５９位の配列ＳＳＨＮＴＤ ＱＤが３つの正味の挿入を含むＡＬＳＧＨＰＲＬＰＱＮになる）； Ｎ４８Ｓ；Ｎ２３８Ｓ；＊１５５ａＧ；Ｄ１５７Ｔ；Ｎ４８Ｓ＋Ｎ２３８Ｓ；Ｈ １５Ａ；Ｔ１０９Ｄ；Ｔ１１０Ｋ；Ｒ８Ｄ；Ｒ８Ｑ；Ｒ６１Ｐ；Ｋ７０Ｑ；Ａ７ ４Ｓ；Ｓ８７Ａ；Ｒ９４Ｄ；Ｒ４９Ｑ；Ｄ５５Ａ；Ｄ５６Ａ；Ｄ２６３Ｅ；Ｄ１ ２１Ｅ；Ｄ２８７Ｅ；Ｈ２８５Ａ；及び／またはＨ２５４Ｉ を有することを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載のリパーゼ。
12. １２．実質的に図２に示すアミノ酸配列またはその機能性等価物を有し、同じく 図２に示すプレプローリパーゼまたはその機能性等価物に実質的に対応する改造 遺伝子を含む人工的に改造された微生物に由来する請求項１から１１のいずれか 一項に記載のリパーゼ。
13. １３．タンパク質が、ズブチリシンプロテアーゼによる開裂に対して改良された 耐性を与える１つ以上の突然変異を含み、該突然変異は、（１）ズブチリシン開 裂部位の配列、即ち親酵素中のズブチリシン開裂を受け易い結合のいずれかの側 の５残基以内の配列を、突然変異以前に存在していたかかる部位の部分を構成す る１つまたは２つ好ましくは３つのアミノ酸残基の欠失によって修飾するか、ま たは、（ｉｉ）かかる開裂部位に少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基もしくは 少なくとも１つのプロリン残基を挿入もしくは置換によって導入するか、または 、（ｉｉｉ）かかる部位に正電荷アミノ酸を導入するかもしくは負電荷アミノ酸 を除去することによって該部位の静電ポテンシャルを変更することによって、ズ ブチリシンプロテアーゼなどのプロテアーゼによる攻撃に対する該タンパク質の 安定性を改良するように選択されたアミノ酸配列の（１つ以上の）修飾を含んで おり、該突然変異が例えば、（ａ）親酵素中のズブチリシン開裂を受け易い結合 が開裂する際に新しいＮ−末端になるアミノ酸残基がプロリンによって置換され た突然変異、及び／または、（ｂ）かかる易開裂結合から２つまたは４つの位置 のアミノ酸残基が荷電アミノ酸残基またはより極性のアミノ酸残基によって置換 された突然変異であることを特徴とする突然変異タンパク質。
14. １４．異種起原の遺伝子またはリパーゼのアミノ酸配列に影響を与える少なくと も１つの突然変異を含む遺伝子であってプロテアーゼ及び／または酸化剤による 攻撃に対して改良された安定性及び／または対応する親酵素に比べて増加した活 性をリパーゼに与えるｒＤＮＡ手法によって作製された遺伝子を有する人工的に 改造された微生物を発酵培養する段階と、微生物によって産生されたリパーゼを 発酵ブイヨンから分離するかまたは微生物の細胞を発酵ブイヨンから分離するこ とによってリパーゼ調製物を調製する段階と、分離した細胞を破壊し、物理的ま たは化学的濃縮または精製処理によって前記ブイヨンまたは前記細胞からリパー ゼを濃縮または部分精製する段階を含む請求項１から１３のいずれか一項に記載 の突然変異リパーゼの産生方法。
15. １５．更に、リパーゼ調製物をカプセル化する段階を含む請求項１４に記載の方 法。
16. １６．請求項１から１２のいずれか一項に記載のリパーゼをコードする遺伝子を 含むベクターによって形質転換され、該リパーゼを発現し得る人工的に改造され た微生物。
17. １７．細菌リパーゼをコードする遺伝子または種々の微生物に由来の原核生物リ パーゼもしくは真核生物リパーゼの突然変異体形をコードする遺伝子を含み、前 記リパーゼは、その例が、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｍ　ｖａ ｒ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＮＲＲＬＢ−３６７３に由来のリパーゼ、Ａｌｃ ａｌｉｇｅｎｅｓ　ＰＬ−６７９，ＡＴＣＣ　３１３７１もしくはＦＥＲＨ−Ｐ ３７８３に由来のリパーゼ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏ−ｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓ ｃｅｎｓ　ＩＡＨ　１０５７に由来のリパーゼに対して感作された抗血清と交差 免疫反応性を示すリパーゼであり、従ってこれらのリパーゼを発現させ得る異種 宿主となり得ることを特徴とする人工的に改造された微生物。
18. １８．宿主生物のシグナル配列または分泌配列として機能する（修飾）プレ−配 列をコードする遺伝子フラグメントの５′末端に融合することによって微生物に 導入されるリパーゼコード遺伝子を含む人工的に改造された微生物。
19. １９．Ｅ．ｃｏｌｉ；Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａもしく はＰｓ．ｇｌｕｍａｅ（旧称Ｐｓ．ｇｌａｄｉｏｌｉ）から選ばれたグラム陰性 菌などのグラム（−）陰性菌に代表される原核生物、またはＢａｃｉｌ−ｌｕｓ 、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍもしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属か ら選択された原核生物であることを特徴とする請求項１６から１８のいずれか一 項に記載の人工的に改造された微生物。
20. ２０．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ種に所属し、Ｐｓ．ｇｌｕｍａｅ （Ｐｓ．ｇｌａｄｉｏｌｉと同義）に由来のリパーゼ遺伝子を発現する請求項１ ９に記載の人工的に改造された微生物。
21. ２１．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属もしくはＨａｎｓｅｎｌａ属の酵母、また はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の真菌類のごとき真核生物から成る請求項１６から １８のいずれか一項に記載の人工的に改造された微生物。
22. ２２．請求項１から１２のいずれか一項に記載のリパーゼをコードする組換えＤ ＮＡベクターを含み、祖先細胞の１つの栄養要求性マーカーをコードする遺伝子 の遺伝子置換によって栄養要求性突然変異体として作製された請求項１６から２ １のいずれか一項に記載の人工的に改造された微生物。
23. ２３．天然形リパーゼをコードする遺伝子が別の構造遺伝子によって置換されて いることを特徴とする請求項１６から２２のいずれか一項に記載の人工的に改造 された微生物。
24. ２４．実費質に図２に示す配列の成熟リパーゼまたはその機能性等価物またはそ の突然変異体をコードする塩基配列を有し、その最終翻訳コドンの直後に停止コ ドンが存在すること、また、成熟リパーゼをコードするヌクレオチド配列の直ぐ 上流に、該リパーゼのプレ配列をコードするヌクレオチド配列が存在し得ること を特徴とするポリヌクレオチド。
25. ２５．請求項１から１２のいずれか一項に記載のリパーゼをコードする塩基配列 を有すること、最終翻訳コドンの直後に停止コドンを有すること、また、成熟リ パーゼをコードするヌクレオチド配列の直ぐ上流に、対応するプレ配列の少なく とも一部及び／または選択宿主生物に適したシグナルまたは分泌配列をコードす るヌクレオチド配列を有し得ることを特徴とするするポリヌクレオチド。
26. ２６．実質的に図２に示した配列の成熟リパーゼまたはその機能性等価物または その突然変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、少な くとも１つ好ましくはできるだけ多数のコドンが請求項１６から２３のいずれか 一項に記載の新しい宿主によって好まれ且つ等価のアミノ酸残基をコードするコ ドンを形成するための「サイレント」突然変異の主体となり、従って改良された 安定性をもつ導入遺伝子のメッセンジャ−ＲＮＡが使用された宿主中に与えられ るように、起原生物に由来のリパーゼをコードするヌクレオチド配列が修飾され ているポリヌクレオチド。
27. ２７．プロ−または成熟リパーゼをコードするヌクレオチド配列の上流に、請求 項１６から２３のいずれか一項に記載の宿主に適したシグナルまたは分泌配列を コードするヌクレオチド配列が配置された請求項２５または２６に記載のポリヌ クレオチド。
28. ２８．当該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部が、請求項２に記載の誘 導体であり且つ第１のリパーゼと免疫的に関連する別のリパーゼをコードするヌ クレオチド配列の実質的に対応する部分によって置換されていることを特徴とす る請求項２に記載のリパーゼをコードする請求項２５から２７のいずれか一項に 記載のポリヌクレオチド。
29. ２９．リパーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を導くために以下の 成分： （ａ）成熟リパーゼもしくはプレリパーゼ（例えば図２のリパーゼまたはこれに 基づく突然変異配列）または（選択宿主細胞に好まれる）分泌シグナルの直ぐ下 流のプレ配列の一部が除去された対応プレリパーゼをコードするＤＮＡであって 、翻訳されるべき遺伝子部分がＡＴＣコドンで開始しないときには、前端にＡＴ Ｃコドンが配置され、翻訳されるべき遺伝子部分が適当な停止コドンで終了する かまたは停止コドンが付加された二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ；（ｂ）リパーゼをコー ドするｄｓＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の上流に位置する（選択宿主生物に 適した）発現レギュロン；（ｃ）リパーゼをコードするｄｓＤＮＡ（成分（ａ） ）のプラス鎖の下流に位置する（選択宿主細胞に適した）ターミネータ配列を含 んでおり；また （ｄ）選択宿主のゲノムまたは選択宿主の適当な複製起原に、更に場合により栄 養要求性選択マーカーに、ｄｓＤＮＡを組込み易くするヌクレオチド配列； （ｅ）（請求項１６から２３のいずれかに記載の宿主に適した）複製起原として 、リパーゼの前駆物質体の１つの成熟及び／または分泌に関与するタンパク質を コードするＤＮＡ配列；を含み得る組換えＤＮＡベクター。
30. ３０．Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｍｖａｒ　ｌｉｐｏｌｙｔｉ ｃｕｍ　ＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３に由来のリパーゼ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　 ＰＬ−６７９，ＡＴＣＣ　３１３７１もしくはＦＥＲＨ−Ｐ　３７８３に由来の リパーゼ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＩＡＨ　１ ０５７に由来のリパーゼに対して感作された抗血清と交差免疫反応性を示すリパ ーゼをコードする遺伝子を含む請求項２９に記載の組換えＤＮＡベクター。
31. ３１．更に、上記に定義したポリヌクレオチドの上流及び／または下流に、リパ ーゼの機能性発現を容易にするための配列を含む請求項２９または３０に記載の 組換えＤＮＡベクター。
32. ３２．栄養要求性マーカーのコーディング領域と欠損プロモーター領域とから成 る栄養要求性マーカーを含む請求項２９から３１のいずれか一項に記載の組換え ＤＮＡベクター。
33. ３３．請求項１から１３のいずれかに記載のリパーゼ酵素またはタンパク質を含 み、場合によりズブチリシンプロテアーゼを含み、残りの洗剤成分が： （ａ）ホスフェートビルダー、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、 アクリルもしくは等価のポリマー、過ホウ酸もしくは過酸漂白剤前駆物質、アミ ノ含有漂白剤活性化物質、シリケートまたはその他の構造化剤、使用中に所望ｐ Ｈに調整するためのアルカリ及び中性無機塩を含有する粉末洗剤として配合され るか； （ｂ）ゼオライトビルダー、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ア クリルもしくは等価のポリマー、過ホウ酸漂白剤もしくは過酸前駆物質、アミノ 含有漂白剤活性化物質、シリケートまたはその他の構造化剤、使用中に所望ｐＨ に調整するためのアルカリ及び中性無機塩を含有する粉末洗剤として配合される か； （ｃ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、保湿剤、有機酸もしくは その他のビルダー、苛性アルカリを含み、ｐＨが９〜１０の値に調整された水性 液体洗剤として配合されるか； （ｄ）直鎖状アルコキシル化第１アルコールから実質的に成る非イオン性液体界 面活性剤、トリアセチン、三リン酸ナトリウム、苛性アルカリ、１水和過ホウ酸 漂白剤前駆物質、第三アミノ漂白剤活性化物質を含み、ｐＨ約９〜１０に調整さ れた非水性液体洗剤として記合されるか；（ｅ）夫々アルコキシル化度約７及び 約３のアニオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤混合物、実質的に零に近い 少量の中性無機塩、ホスフェートビルダー、過ホウ酸もしくは過酸漂白剤前駆物 質、第三アミン漂白剤活性化物質、ケイ酸ナトリウム、微量成分及び水分を含有 する嵩密度６００ｇ／ｌ以上の顆粒状の粉末洗剤として配合されるか；（ｆ）ア ルコキシル化度約７及び約３のアニオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤混 合物、実質的に零に近い少量の中性無機塩、ゼオライトビルダー、過ホウ酸もし くは過酸漂白剤前駆物質、第三アミン漂白剤活性化物質、ケイ酸ナトリウム、微 量成分及び水分を含有する嵩密度６００ｇ／ｌ以上の顆粒状の粉末洗剤として配 合されるか；（ｇ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリルポ リマー、脂肪酸石鹸、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、クレー粒子、過ホウ酸 もしくは過酸漂白剤前駆物質、第三アミン漂白剤活性化物質、ケイ酸ナトリウム 、微量成分及び水分を含有する粉末洗剤として配合されるか；（ｈ）オルトリン 酸で中和された獣脂及びヤシ油の完全鹸化混合物を主成分とする石鹸を含むか、 またはＣ６〜Ｃ１６のアルキルベンゼンスルホネート、トリポリリン酸ナトリウ ム、炭酸カルシウム及びナトリウム並びにカルボキシメチルセルロースを含むも のであって、プロテアーゼと混合され、更にギ酸ナトリウム、ホウ砂、プロピレ ングリコール及び硫酸ナトリウムと混合され、石鹸製造ラインで圧出された固形 石鹸または固形合成洗剤として配合された酸素洗剤組成物。
34. ３４．界面活性剤１ｌあたり０．４〜０．８ｇに対応する割合で使用されるとき ｐＨ９以下の洗液を与えるように配合された請求項３３に記載の酸素洗剤組成物 。
35. ３５．界面活性剤１ｌあたり０．４〜０．８ｇに対応する割合で使用されるとき イオン強度０．０３以下、例えば０．０２以下または０．０１以下の洗液を与え るように配合された請求項３３に記載の酵素洗剤組成物。
36. ３６．界面活性剤１ｌあたり０．４〜０．８ｇに対応する割合で使用されるとき ｐＨ８．５以上の洗液を与えるように配合された請求項３３に記載の酵素洗剤組 成物。
37. ３７．界面活性剤１ｌあたり０．４〜０．８ｇに対応する割合で使用されるとき イオン強度０．０１以上、例えば０．０２以上の洗液を与えるように配合された 請求項３３に記載の酵素洗剤組成物。