JPH08505286A

JPH08505286A - ベタインの異化に関して改変された細胞、それらの調製、および特に、代謝産物または酵素の生産のための使用

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Publication number: JPH08505286A
Application number: JP6513860A
Authority: JP
Inventors: ベアトリーチエカメロン，; ジヨエルクルーゼ，
Original assignee: ローン−プーラン・ビヨシミ
Priority date: 1992-12-09
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 1996-06-11
Anticipated expiration: 2019-01-19
Also published as: WO1994013813A1; DE69333962T2; FR2698879A1; EP0673422B1; CA2151123A1; US5691163A; CA2151123C; JP3488924B2; FR2698879B1; USRE38331E1; DK0673422T3; EP0673422A1; ES2255052T3; ATE315091T1; DE69333962D1

Abstract

(57)【要約】ベタイン異化に関与する遺伝子において少なくとも１つの改変をもつ細胞、それらの調製および特に、代謝産物および／または酵素の生産のためのそれらの使用が、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ベタインの異化に関して改変された細胞、それらの調製、および特に、代謝産物または酵素の生産のための使用本発明は、ベタインの異化に関して改変された細胞、それらの調製および特に、代謝産物および／または酵素の生産改良のための使用に関する。本発明は、また、ベタインの異化に関する遺伝子を担持するＤＮＡ断片に関する。グリシンベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）は、一般に、その浸透防御性について知られており、それは、細菌において浸透ストレスに対する寛容を与える（Csonka，1989）。この性質の由来を説明するために、水の活性に対する、またエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の細胞質の浸透圧に対するグリシンベタインの分子効果が、それが置き換わる溶質の分子効果よりも重要であることが、提案されてきた（Cay1eyet al，1992）。さらに、また、その浸透防御力に加えて、グリシンベタインは、酵素の（ＪＰ8,260,709 ）、または、アミノ酸（ＪＰ202703）；抗生物質（豪州特許第825513号）およびビタミン（White et al，1971）のような代謝産物の、生産を促進できるということも報告された。しかしながら、シアノバクテリアおよびその他のＣＯ₂固定原核生物を除くほとんどの細菌は、植物によって主に合成されるグリシンベタインを合成しない。それ故、それは、発酵槽中の生産培地に添加されねばならず、工業的製法においてコストの付加を生じる。本発明は、この問題に対する解決を提供する。本発明者は、特に遺伝的方法によって、細胞のベタインの異化を改変することにより、工業的発酵条件下で、細胞の増殖速度、その生存率などに影響を与えることなく酵素または代謝産物の生産において、この化合物の効果を発揮させ得ることを、実際に証明した。また、本発明者は、ベタインの異化に関与する遺伝子を担持するＤＮＡ断片を同定し、単離し、そして特徴化したが、その断片を用いて、ベタインの異化に関して特異的に改変され、その改変が、細胞分裂に安定であり非可逆的である細胞を、特に作製することを可能にした。また、これらの断片は、適切な酵素活性の増幅によってベタインの異化を促進することを可能にした。それ故、本発明は、ベタインの効果を高め、それによってこの化合物を、工業的発酵工程において経済的に使用するることを可能ならしめた。したがって、本発明の第１の主題は、ベタインの異化に関与する遺伝子に関して、少なくとも一つの改変を現す改変細胞に関する。第１の態様において、用語、改変細胞は、より特別には、問題の遺伝子において１つまたは複数塩基の置換および／または欠失および／または挿入をもち、ベタインを徐々に分解する、いかなる細胞をも表す。そのような改変は、試験管内（ベタインの異化に関する遺伝子をもつ単離されたＤＮＡ上で）で、またはインサイチュー（ｉｎｓｉｔｕ）で、例えば、遺伝子工学技術の方法によって、さもなくば変異誘発剤による処理に該細胞を曝すことによって得られる。変異誘発剤として、例えば、エネルギー照射（Ｘ−、γ−もしくは紫外線およびそれに類するもの）のような物理的因子、またはＤＮＡ塩基の種々の官能基と反応し得る化学薬剤、および例えば、アルキル化剤［メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−ニトロキノリン１−オキシド（ＮＱＯ）］、ジアルキル化剤、挿入剤およびそれに類するものが挙げられる。欠失は、問題の遺伝子の全部または一部の除去を意味すると理解される。これは、特に、コード領域の、および／または転写のプロモーター領域の全部または一部の、一定部分であってもよい。また、遺伝的改変は、例えばRothstein（1983）により最初に記された方法による遺伝子破壊によっても得ることができる。この場合には、好ましくは、その遺伝子の全部または一部が乱されて、試験管内で作製された非機能的もしくは変異配列によって、野生型ゲノム配列を相同組み換えにより置換させられる。該改変は、遺伝子のコーディング部分か、または該遺伝子の発現および／または転写調節に関与する領域に位置されてもよい。該細胞がベタインを分解できない（全部もしくは一部）ということは、構造的もしくは立体配座的改変に因る不活性な酵素の生産、または生産の欠如、または損なわれた活性をもつ酵素の生産、あるいはまた弱められたレベルにおけるかまたは要求された制御様式による自然の酵素生産、のいずれかによって明らかにすることができる。さらに、点突然変異のようなある種の改変は、例えば、細胞分裂に先立つＤＮＡの複製の間に、細胞機構によって、本来、修正もしくは弱められる。この場合には、そのような遺伝的改変は、それからもたらされる表現型の性質が完全には安定ではないので、工業レベルにおいては有益性が限定される。今、本発明により、ベタインの異化に関する遺伝子を担持するＤＮＡ断片の同定に因って、該改変が細胞分裂上安定であり、および／または非可逆的である改変細胞を作製することが可能である。そのような改変を発現する細胞は、代謝産物および／または酵素の生産のための細胞宿主として特に有用である。その他の特定の実施態様においては、本発明の改変細胞は、ベタインの異化に関与する少なくとも１つの遺伝子が増幅され、その結果として、ベタインをより速く分解する細胞である。その増幅は、ベタインの異化に関する遺伝子を担持するＤＮＡ断片を細胞中に導入することによって得ることができる。この断片は、好ましくは、ベクターの一部であり、自律複製するベクターでも組み込まれたベクターでもよい。さらにＤＮＡ断片は、改変細胞との関係において相同でも非相同でもよく、すなわち、増幅された遺伝子は、該細胞由来の遺伝子でも、また、他の細胞起源から得られ、同種の活性をコードしている遺伝子であってもよい。ベクターおよび増幅される断片の起源の選択は、目的の細胞および考えられる応用に依存する。ＤＮＡ断片は、細胞に外来ＤＮＡを導入させるどんな方法によっても、その細胞中に導入することができる。これは、特に、形質転換、エレクトロポレーション、接合、プロトプラスト融合、または当業者により既知のどんな他の技術でもよい。リゾビウム・メリロチ（Ｒｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）において実際に実施された研究によれば、グリシンベタインの分解は、３段階の連続する脱メチル化（図１参照）によって、低浸透性の培地において行われる。第１段階は、ベタインホモシステイン・メチルトランスフェラーゼＥ．Ｃ．２．１．１．５．によって触媒され、ジメチルグリシンを生じ；第２段階は、ジメチルグリシン・デヒドロゲナーゼＥ．Ｃ．１．５．９９．２によって触媒され、モノメチルグリシンもしくはサルコシンを生じ；最後に、第３段階は、サルコシンデヒドロゲナーゼＥ．Ｃ．１．５．９９．１によって触媒され、その反応生成物は、グリシンである（Smit h et al，1988）。好ましくは、本発明の細胞によって示される改変は、ベタインの異化の最初の２段階の一つ、または場合により、二つの最初の段階に同時に影響を与える。好ましくは、本発明の細胞は、代謝産物および／または酵素を生産する細胞である。この点において、それらは、また、代謝産物および／または酵素を生産する組み換え細胞、すなわち、それらの生産能力を改善するために、組み換えＤＮＡ技術によって改変された細胞であってもよい（特に、WO 91/11518，EP 346000 ，参照）。さらになお、好ましくは、本発明の細胞は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノミセーテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびメタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細胞から選択される。本発明のその他の態様は、工業的発酵条件下で使用できる、ベタインの異化に関与する少なくとも１つの遺伝子の改変を発現する細胞を作製する方法に関する。本発明は、実際には、ベタインの異化に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の同定、単離、そして特徴化を記述する。今や、これらの断片は、ベタインの異化に関して特異的に改変された細胞を作製することを可能にした。事実、上記のＤＮＡを試験管内で改変して、それらを非機能的にし、それらを特定の細胞に再導入することを可能にしたが、その細胞において、断片は、対応する機能的ゲノムのコピーについて二重相同組み換えによって、置換されているであろう。また、このように単離された断片を基に、目的の細胞のゲノム、特に対応する遺伝子中に、組み込まれるであろうプローブを作製することが可能である。より具体的には、本発明の方法は、考慮される染色体遺伝子を、試験管内で改変されたバージョンによって置き換えることにおいてなる。本発明のその他の主題は、ベタインの異化に関する少なくとも１つの遺伝子を担持するＤＮＡ断片に関する。より具体的には、本発明は、ジメチルグリシンへのグリシンベタインの異化を遮断された変異株、およびサルコシンへのジメチルグリシンの異化を遮断された変異株を相補するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のＤＮＡ断片、すなわち、ジメチルグリシンへのグリシンベタインの、およびサルコシンへのジメチルグリシンの分解に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離および特徴化によって例証される。本発明によるＤＮＡ断片は、菌株ＭＢ５８０から取得されるシュードモナス・デニトリフィカンス菌株ＳＣ５１０から単離された（米国特許第3,018,225号）。これらの断片は：（ｉ）ベタインの異化を遮断された変異株の作製。既に上述された種々の技術が、この目的に使用され得る。変異株の選択は、適切な培地上での培養、および当業者には慣用の技術に従い、ベタインもしくはその異化産物のアッセイによって行われる。（ｉｉ）ベタインを異化できる微生物からの核酸を用いるこれらの変異株の相補、（ｉｉｉ）それ故、ベタインの異化に関する遺伝子を担持する相捕的変異株の選択、次いで、この相補を可能とする核酸の単離および特徴化、によって得られた。本発明において同定され、単離されたＤＮＡ断片から、当業者は、特にハイブリダイゼーション実験によって、他の細胞起源由来のベタインの異化に関する遺伝子を単離し、クローン化できることは明らかである。したがって、より好ましくは、問題の遺伝子は、ベタイン−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子であって、それに関する本発明による改変は、細胞中で、ベタイン−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ活性の低下を引き起こす。好ましくはなお、問題の遺伝子は、ジメチルグリシン・デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子であって、それに関する本発明による改変は、細胞中で、ジメチルグリシン・デヒドロゲナーゼ活性の低下を引き起こす。本発明のその他の主題は、ベタインの異化に関して改変された、代謝産物もしくは酵素を生産する細胞を、生産条件下で培養することによって、該代謝産物もしくは酵素を生産し、次いで該代謝産物もしくは酵素を回収するための改良法に関する。第１の実施態様によれば、生産細胞は、ベタインの異化に関与する遺伝子に関して、少なくとも１つの改変を現し、徐々にベタインを分解する。好ましくは、第１の実施態様によれば、その改変は、細胞分裂上安定であり、および／または非可逆的である。本発明の好適な変形においては、その改変は、突然変異的欠失および／または挿入である。第２の実施態様によれば、ベタインの異化に関与する生産細胞の少なくとも１個の遺伝子が、増幅され、該細胞は、より急速にベタインを分解する。本発明の方法は、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、それらの誘導体もしくはそれらの前駆体のような代謝産物の生産のために特に好適である。本発明の方法は、特にコバラミンの、好ましくは、ビタミンＢ１２の生産を改良することができる。本発明は、次の実施例によって補足されるが、これは、例示であり、制約のないものとして考慮されるべきである。一般的分子生物学技術分子生物学において使用される慣例の方法、例えば、プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化セシウム濃度勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースもしくはアクリルアミドゲルにおける電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、タンパク質のフェノールもしくはフェノールークロロホルム抽出、エタノールもしくはイソプロパノールによる塩溶液中でのＤＮＡ沈殿、エシェリヒア・コリ等における形質転換は、当業者にとって周知であり、広く文献に記述されている［Maniatis T．et al.，“Molecular Cloning，a Laboratory Manual”，Cold S pring Habor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982; Ausubel F.M．et al.，（eds.），“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons，New York 1987］。制限酵素は、New England Biolabs（Biolabs）、もしくはPharmaciaによって生産され、供給先の指示に従って使用される。ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミドは、市販のものである（Bethes da Research Laboratories）。連結反応のためには、ＤＮＡ断片が、アガロースもしくはアクリルアミドゲルの電気泳動によってそれらのサイズに従って分別され、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合液を用いて抽出され、エタノールを用いて沈殿され、次いで供給先の指示に従ってＴ４ファージのＤＮＡリガーゼ（Boehringer）の存在でインキュベートされる。突出５’末端のフィリング（ｆｉｌｌｉｎｇ）は、供給先の指示に従ってＥ．コリのＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehringer）のクレノウフラグメントを用いて行われる。突き出た３’の末端の破壊は、製造者の指示に従って使用されるＴ４ファージのＤＮＡポリメラーゼの存在で行われる。突出５’末端の破壊は、Ｓ１ヌクレアーゼによるコントロール処理によって実施される。合成オリゴデオキシヌクレオチドによる試験管内での部位特異的変異誘発は、 Taylor et al．［Nucleic Acids Res．13（1985）8749-8764］により開発された方法に従って実施される。いわゆるＰＣＲ技術［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，Saiki R.K．et al.，Science 230（1985）1350-1354; M ullis K.B．and Faloona F．A.，Meth．Enzym．155（1987）335-350］によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、製造者の説明に従って、“ＤＮＡｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅr”（Perkin Elmer Cetus）を用いて実施される。ヌクレオチド配列の確認は、Sanger et al．［Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74 （1977）5463-5467］により開発された方法によって実施される。略語ベタイン：グリシンベタインまたはＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィーＤＭＧ：ジメチルグリシンｋｂ：キロベース図の説明図１：グリシンへのグリシンベタインの分解経路。３回の連続的脱メチル化が起き、グリシンベタインは、ジメチルグリシンに異化され、それがサルコシンに分解され、それ自体がグリシンに分解される。図２：最少Ｍ培地における増殖曲線。非変異株ＳＢＬ２７Ｒｉｆ^r、および変異株Ｇ３７２８およびＧ３９００は、炭素源としてグリシンベタインの存在下で最少Ｍ培地で培養され、それらの増殖が、ｍｌ当たりの細胞数としてＸ軸に、また時間の関数、日としてＹ軸に表される。図３：変異株Ｇ３７２８、Ｇ３７３６、Ｇ３８９９およびＧ３９００を相補するＰ．デニトリフィカンス由来のＤＮＡ断片のマッピング。制限酵素部位、および対応する変異株Ｇ３７２８、Ｇ３８９９およびＧ３９００のトランスポゾンの挿入位置が、そのＤＮＡ断片上に示される。その変異株を相捕するために使用されたプラスミドｐＸＬ２１００、ｐＸＬ２１０１、ｐＸＬ２１０５およびｐＸＬ２１０７の挿入は、断片の下に表される。＋相捕性、 − 非相補性。図４：変異株Ｇ３７２７およびＧ３７３８を相補するＰ．デニトリフィカンス由来のＤＮＡ断片のマッピング。制限酵素部位、およびトランスポゾンＧ３７３８の挿入位置は、そのＤＮＡ断片上に示される。その変異株を相補するために使用されたプラスミドｐＸＬ１９Ｅ２、ｐｘＬ１７Ａ１０およびｐＸＬ１３Ｃ５の挿入部は、断片の下に示される。＋相補性、 − 非相補性。実施例（実施例１）グリシンベタインの異化を遮断されたシュードモナス・デニトリフィカンス変異株の単離この実施例は、ジメチルグリシンおよびサルコシンへのグリシンベタインの異化を遮断されたシュードモナス・デニトリフィカンス変異株の単離を述べる。これらの変異株は、トランスポゾンＴｎ５Ｓｐ^rが、シュードモナス・デニトリフィカンス菌株ＳＢＬ２７Ｒｉｆ^rのゲノムに挿入される変異株のライブラリーから単離された。このライブラリーは、次の方法で作製された：プラスミド、ｐＲＫ２０１３：：Ｔｎ５Ｓｐ^rは、プラスミドｐＨＰ４５Ω（Prentki et al.，1 984）由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子Ｓｐ^rを、プラスミドｐＲＫ２０１３：：Ｔｎ５（Ditta et al.，1980）中にクローン化されたトランスポゾンＴｎ５（Berg et al.，1983）のＢａｍＨＩ部位中に挿入することによって構築された。次いで、接合が、ＳＢＬ２７Ｒｉｆ^rおよびＥ．コリＭＣ１０６０（ｐＲＫ２０１３：：Ｔｎ５Ｓｐ^r）の指数増殖期の培養を混合することによって実施された。トランスコンジュガント（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）Ｒｉｆ^rＳｐ^r株は、３０℃で５日間培養後、受容細胞当たり１０^-8 クローンの頻度で得られた。導入されたプラスミドが、実際に失われており（そのプラスミドＤＮＡは、作製され、次いで形質転換によってＥ．コリ中に導入された；そのプラスミドの耐性を担持するクローンは、得られなかった）、そしてトランスポゾンＴｎ５Ｓｐ^rが、ＳＢＬ２７Ｒｉｆ^rのゲノム中に実際に組み込まれたことは、１２クローンについてチェックされた（実施例２に記載のサザン法によって）。このライブラリーの約３０００変異株が、炭素源が１０ｇ／ｌのグリシンベタインである固体（Ｄｉｆｃｏ寒天１５ｇ／ｌ）最少Ｍ培地（ＮＨ₄Ｃｌ１ｇ／ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄７ｇ／ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄３ｇ／ｌ，ＮａＣｌ０．５g／ｌ，１ｍＭＭｇＳＯ₄，０．１ｍＭＣａＣｌ₂、サイアミン１０ｇ／ｌ）上で再び単離され、次いで３０℃で３日間培養された。次に、ベタイン、ジメチルグリシンおよびサルコシンが、ＨＰＬＣ（カラム：ＳｈｏｄｅｘＩｏｎｐａｋＳ８０１Ｐ、長さ５０ｃｍ，直径８ｍｍ；温度：７０℃；移動相：０．０１Ｍナトリウムアジド）による分別、示差屈折法による検出で、培養上澄液についてアッセイされた。１８変異株が、炭素源としてベタインをもはや使用しないことが分かったが、それらは、Ｇ３７２７〜Ｇ３７３１，Ｇ３７３３〜Ｇ３７４２、およびＧ３８９７，Ｇ３８９９およびＧ３９００である。さらに、これらの変異株が、既に記した方法（Cameron et al.，1989）に従って、ＰＳ４培地１０ｍｌ中で、３０℃５日間培養された場合に、ベタイン、またはジメチルグリシンもしくはサルコシンが、ＨＰＬＣ分別、示差屈折法検出によって、培養上澄液中に測定され得る。ベタインは、変異株Ｇ３７２８，Ｇ３７３６，Ｇ３８９７，Ｇ３８９９およびＧ３９００のブロス上澄液中に検出される（初発培地中に含有されたベタインの５３〜９８％）が、一方、変異株Ｇ３７２７，Ｇ３７３８およびＧ３７４２については、それはジメチルグリシンであり（初発培地に含有されるベタインの約８８〜９７％）；変異株Ｇ３７２９，Ｇ３７３０、Ｇ３７３１，Ｇ３７３３，Ｇ３７３７およびＧ３７４１については、それはサルコシンであり（培地に導入されたベタインの約６４〜７５％）；他の変異株Ｇ３７３４，Ｇ３７３５，Ｇ３７３９，Ｇ３７４０および非変異株については、３種の生成物のいずれも観察されない、表１参照。さらになお、ＳＢＬ２７Ｒｉｆ^rおよび変異株Ｇ３７２８，Ｇ３７３６、Ｇ３３８９７，Ｇ３８９９およびＧ３９００のみが、炭素源がジメチルグリシン（１０ｇ／ｌ）である固体最少Ｍ培地で増殖する。炭素源がグリシンベタイン１０ｇ／ｌである液体最少Ｍ培地での培養は、次のように行われる：高栄養ＬＢ培地（ Cameron et al.，1989）での再単離により出発して、その菌株は、ＬＢ培地５ｍｌ中で、３０℃１２時間培養され；この前培養の細胞が、最少Ｍ培地中で洗浄され、次いで種菌０．２％が、炭素源がグリシンベタイン（１０ｇ／ｌ）である最少Ｍ培地２５ｍｌを含む８個の２５０ｍｌ容エルレンマイヤーフラスコ中に植菌され、３０℃で２５０ｒｐｍの撹拌で培養される。３，４，５，６，１０，１４，２１日目に、エルレンマイヤーフラスコに含まれる細胞が、炭素源がグリシンベタインである固体最少培地にプラテンされ、増殖された後、計数される。変異株Ｇ３７２８およびＧ３９００は、炭素源がグリシンベタイン１０ｇ／ｌである液体最少培地で培養される場合には、最初の３日間は、増殖が観察されないのに対して、菌株ＳＢＬ２７Ｒｉｆ^r については、既に定常増殖期に達している、図２参照；しかしながら、６日目には、ＳＢＬ２７Ｒｉｆ^rのそれに匹敵する定常増殖期が、観察される。この結果は、ＰＳ４培地に含まれるベタイン（１０ｇ／ｌ）のすべてを必ずしも分解しない変異株、表１参照は、ベタイン１０ｇ／ｌを含む最少培地中の炭素源として、それを資化できないが、３日の誘導期の後は、非変異株に匹敵することを示している。これらの生理学的データは、シュードモナス・デニトリフィカンスＳＢＬ２７Ｒｉｆ^rにおけるジメチルグリシンおよびサルコシンへのグリシンベタインの分解の経路を証明することを可能にしたが、この場合：１）ジメチルグリシンへのグリシンベタインの分解段階は、変異株Ｇ３７２８，Ｇ３７３６，Ｇ３８９７，Ｇ３８９９およびＧ３９００において遮断（または部分的遮断）され；２）サルコシンへのジメチルグリシンの分解段階は、変異株Ｇ３７２７，Ｇ３７３８およびＧ３７４２において遮断され；３）サルコシンの分解段階は、変異株Ｇ３７２９，Ｇ３７３０、Ｇ３７３１，Ｇ３７３３，Ｇ３７３７およびＧ３７４１において遮断される。（実施例２）ベタインの異化を遮断されたシュードモナス・デニトリフィカンス変異株の遺伝的特性この実施例は、変異株を、それらのトランスポゾンを使って分類し、特徴化することを可能とする分子生物学的実験を記述する。各変異株の遺伝子型は、次のようにサザン法（Maniatis et al.，1982）によって解析される：各変異株（Ｇ３７２７〜Ｇ３７３１，Ｇ３７３３〜Ｇ３７４２、およびＧ３８９７，Ｇ３８９９およびＧ３９００）のゲノムＤＮＡが、作製され、次いで、その一部のものが、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化される；このようにして得られた断片は、アガロースゲル上での電気泳動によって分別され、次いで、Ｂｉｏｄｙｎｅ膜上に転移される；次に、この膜が、α³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルされた次に示すプラスミドの１つとハイブリダイズされる。これらのプラスミドは、ｐＴ２７，ｐＴ２８，ｐＴ３０，ｐＴ３１，ｐＴ３４，ｐＴ３５，ｐＴ３６，ｐＴ３７，ｐＴ３８，ｐＴ３９，ｐＴ４０，ｐＴ４２，ｐＴ９７，ｐＴ００である。これらのプラスミドは、それぞれ変異株Ｇ３７２７，Ｇ３７２８，Ｇ３７３０，Ｇ３７３１，Ｇ３７３４，Ｇ３７３５，Ｇ３７３６，Ｇ３７３７，Ｇ３７３８，Ｇ３７３９，Ｇ３７４０，Ｇ３７４２，Ｇ３８９７，Ｇ３９００のトランスポゾンＴｎ５Ｓｐ^rを挿入される非反復（ｕｎｉｑｕｅ）ゲノムＥｃｏＲＩ断片のベクターｐＲＫ２９０のＥｃｏＲＩ部位における挿入によって得られた。目的のＥｃｏＲＩ断片を担持するプラスミドｐＴは、トランスポゾンによって付与されたそれらのスペクチノマイシンに対する耐性によって選択される。例えば、プラスミドｐＴ２７と膜とのハイブリダイゼーションにおいては、変異株Ｇ３７２７およびＧ３７２８のゲノムＤＮＡは、約１６ｋｂの分子量をもつＥｃｏＲＩ断片に対応するただ一つの放射性バンドを示し、そのことは、これらの変異株においては、トランスポゾンが、同じ位置に挿入されることを示めしている。反対に、非変異菌株については、ハイブリダイズする断片は、８ｋｂであり、すべての他の変異株とは、２つの断片がハイブリダイズするが、一方は、非変異菌株のそれと同一移動し、他方は、トランスポゾン（８ｋｂ）（de Bru ijn，1987; Prentki，1984）のサイズよりも大きい一定しないサイズをもつ。プラスミドの各々との継続するハイブリダイゼーションにより、１から１２までのハイブリダイゼーションのクラスによって、変異株をグループ分けすることが可能になった、表１参照。さらに、プラスミドｐＴ２７，ｐＴ２８，ｐＴ３０，ｐＴ３１，ｐＴ３４，ｐＴ３６，ｐＴ３７，ｐＴ３８，ｐＴ９７，ｐＴ００は、既に述べた方法（Camero n et al.，1991）に従って、トランスポゾンの挿入により得られた変異株を、非変異菌株ＳＢＬ２７Ｒｉｆ^r中に、二重相同組み換えによって再導入するために使用された。このようにして遺伝子破壊によって得られた菌株に関して、その遺伝子型が、すぐ前節で述べられたように、サザン法によってチェックされ、表現型は、実施例１に記載のようにＰＳ４培地での培養の上澄液において検出された化合物の分析により決定された。最初に変異された菌株と同じ表現型になるすべての遺伝子破壊により得られた菌株について、検出された化合物の量が比較される、表１参照。これらの菌株は、次のいずれかである：１）ハイブリダイゼーションクラス５に属し、ベタインを蓄積する、２）ハイブリダイゼーションクラス２に属し、ジメチルグリシンを蓄積する、３）ハイブリダイゼーションクラス４に属し、サルコシンを蓄積する。さらにまた、１０ｋｂのＢｇｌＩＩゲノム断片の欠失およびスペクチノマイシン耐性カセットの挿入が、プラスミドｐＴ２８を用いて実施された。表現型がサザン法（本実施例の第１節に記載）によりチェックされた菌株は、ハイブリダイゼーションクラス５に記載の菌株と同じベタイン蓄積表現型をもつ。（実施例３）サルコシンへのグリシンベタインの脱メチル化段階を遮断されたシュードモナス・デニトリフィカンス変異株の相補この実施例は、サルコシンへのベタインの分解に関与する遺伝子を担持するＰ．デニトリフィカンスからのＤＮＡ断片の単離を記す。これらの断片は、プローブとしてプラスミドｐＴ２８またはｐＴ３８の挿入、ならびにｐＸＬ５９中にクローン化されるＰ．デニトリフィカンスＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ断片を含むプラスミドのライブラリーを用いて、ハイブリダイゼーション実験によって検出された（Cameron et al.，1989）。そのプローブとハイブリダイズするプラスミドの挿入が、制限酵素地図に表された。ＲＳＦ１０１０（Cameron et al，1989）由来のベクターにおいて構築された（Maniatis et al，1982）クローンおよびサブクローンが、ジメチルグリシンへのベタインの異化を遮断された変異株、またはサルコシンへのジメチルグリシンの分解を遮断された変異株に、接合によって（Ca meron et al，1989）導入された。そのクローンおよびサブクローンによる変異株の相補は、実施例１記載のように、ＰＳ４培地で培養されたトランスコンジュガント株の培養上澄液における、ベタイン、ジメチルグリシンもしくはサルコシンの蓄積の欠如によって決定された。３−１ジメチルグリシンへのベタインの分解に関与する遺伝子を担持するＰ．デニトリフィカンスからのＤＮＡ断片。ｐＴ２８とハイブリダイズするクローンは、ジメチルグリシンへのベタインの異化を遮断された変異株Ｇ３７２８，Ｇ３７３６，Ｇ３８９７，Ｇ３８９９およびＧ３９００中に導入された。図３に提示されるように、１２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片に含まれた２種のサブクローンｐＸＬ２１０５およびｐＸＬ２１０７は、５種類中４種類の変異株Ｇ３７２８，Ｇ３７３６，Ｇ３８９９およびＧ３９００を相補する。サブクローンの一つｐＸＬ２１０５は、ベクターｐＸＬ４３５（Came ron et al，1989）中にクローン化された３．４ｋｂのＳｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を含み、２つの変異株Ｇ３９００およびＧ３８９９を相補し；他のｐＸＬ２１０７は、ｐＫＴ２３０（Cameron et al，1989）中にクローン化された４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含み、変異株Ｇ３７２８およびＧ３７３６を相補する。さらに、変異株Ｇ３８２７，Ｇ３８９９およびＧ３９００におけるトランスポゾンの挿入は、実際に、この１２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片上にマップされていたが、変異株Ｇ３７３６には観察されない。この変異株の表現型は、逆向き遺伝学により得られた変異株がベタインを蓄積しないことから、トランスポゾンの位置とは相関しないようである、実施例２参照。その結果、少なくとも２個の遺伝子が、ジメチルグリシンへのベタインの分解段階に関与している。３−２サルコシンへのジメチルグリシンの分解に関与する遺伝子を担持するＰ．デニトリフィカンスからのＤＮＡ断片。ｐＴ３８とハイブリダイズするクローンは、サルコシンへのジメチルグリシンの異化を遮断された変異株Ｇ３７２７，Ｇ３７３８中に導入された。図４に提示されるように、ライブラリーから得られ、１４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片上にマップされる２種のクローンは、Ｇ３７２７およびＧ３７３８を相補する。サブクローンの一つｐＸＬ１９Ｅ２は、６．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含み、他のｐＸＬ１３Ｃ５は、１４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を含む。その結果、図４記載の断片にマップされた少なくとも１つの遺伝子が、サルコシへのジメチルグリシンの分解段階に関与している。（実施例４）グリシンベタインの異化において改変されたシュードモナス・デニトリフィカンス株におけるビタミンＢ₁₂生産の改良この実施例は、ジメチルグリシンへのベタインの異化に関与する遺伝子の破壊によって、コバラミンを生産する菌株におけるコバラミン生産の改良を例示する。変異株Ｇ３７２８（またはＧ３９００）の表現型に寄与する突然変異が、ＥｃｏＲＩ断片上にマップされるトランスポゾンによって作出され、ｐＴ２８（またはｐＴ００）中にクローン化され、そして実施例２に記載される。この突然変異は、コバラミンを生産するシュードモナス・デニトリフィカンス菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆ^r（Cameron et al，1991）中に、二重相同組み換えによって導入された。逆向き遺伝学によって、このようにして得られた両菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆ^r：：ｐＴ２８およびＳＣ５１０Ｒｉｆ^r：：ｐＴ００について、表現型が、実施例２記載のサザン法によってチェックされ、そして既に述べられた方法（Cameron et al，1989）に従って、ベタイングリシンが２ｍｇ／ｌであるＰＳ４培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌ容エルレンマイヤーフラスコにおいて、３０℃で７日間増殖された菌株の培養液に含まれるビタミンＢ₁₂のＨＰＬＣ（カラム：ＡｓａｈｉｂａｋＯＤ５０，長さ：１５ｃｍ、直径：６ｍｍ、移動相：アセトニトリル／０．１Ｍシアン化カリウム）による分析および紫外線検出（波長：３６５ｎｍ）によって、コバラミン生産が測定された。これらのアッセイの結果は、表２に示される。それらは、独立して行われた４実験の２培養について得られた平均値を表す。用いられた培養条件下で、コバラミンの生産は、１３ｋｂのＥｃｏＲＩゲノム断片（そのＤＮＡは、ジメチルグリシンへのベタインの異化に関与する遺伝子をコードしている、図３参照）において変異された菌株では、ＳＣ５１０Ｒｉｆ^r 菌株に比較して１０倍増加された。これらの結果は、本発明の菌株のベタインの異化を改変することによって、それらの代謝産物生産能が増大されたことを、明らかに示している。表２ジメチルグリシンへのベタインの異化に関与する遺伝子を担持するＥｃｏＲＩ断片において変異された菌株におけるビタミンＢ₁₂の生産。改変された菌株の生産レベルは、ＳＣ５１０Ｒｉｆ^r菌株の生産を１とした場合に比較して、与えられる。引用文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:38）Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims

【特許請求の範囲】１．生産細胞が、ベタインの異化に関与する遺伝子に関して、少なくとも１つの改変を発現することを特徴とする、生産条件下で、代謝産物および／または酵素を生産する細胞を培養することによって該代謝産物および／または酵素を生産し、次いで、該代謝産物および／または酵素を回収する微生物学的方法。２．改変が、１つまたは複数塩基の置換および／または挿入および／または欠失、および／または破壊であり、そして細胞が、ベタインを徐々に分解することを特徴とする、請求の範囲１記載の方法。３．改変が、細胞分裂上安定であり、および／または非可逆的であることを特徴とする、請求の範囲２記載の方法。４．改変が、遺伝子のコーディング部分、および／または該遺伝子の発現および／または転写調節に関与する領域に作用することを特徴とする、請求の範囲２または３記載の方法。５．ベタインの異化に関与する少なくとも１つの遺伝子が、増幅され、そして結果として細胞が、ベタインをより急速に分解することを特徴とする、請求の範囲１記載の方法。６．細胞が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノミセーテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クロストリシウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）およびメタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細胞から選択されることを特徴とする、請求の範囲１〜５記載の方法。７．代謝産物が、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、それらの誘導体もしくはそれらの前駆体から選ばれることを特徴とする、請求の範囲１〜６記載の方法。８．代謝産物が、コバラミン、好ましくは、ビタミンＢ１２であることを特徴とする、請求の範囲７記載の方法。９．細胞が、代謝産物および／または酵素を生産する組み換え細胞であり、そして細胞が、ベタインの異化に関与する遺伝子に関して、少なくとも１つの改変を発現することを特徴とする細胞。１０．ベタインの異化に関与する遺伝子に関して少なくとも１つの改変を発現し、代謝産物および／または酵素を生産する細胞の、代謝産物および／または酵素の生産のための使用。