JPH08505771A

JPH08505771A - 増殖分化因子−３

Info

Publication number: JPH08505771A
Application number: JP6516374A
Authority: JP
Inventors: リー，セ−ジン; シー．マクフェロン，アレクサンドラ
Original assignee: ジョーンズホプキンスユニバーシティースクールオブメディシン
Priority date: 1993-01-12
Filing date: 1994-01-12
Publication date: 1996-06-25
Also published as: EP1475440A3; EP0679163A4; CA2153652A1; US5808007A; EP1475440A2; WO1994015965A1; EP0679163A1

Abstract

(57)【要約】増殖分化因子−３（ＧＤＦ−３）をそのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列とともに開示する。ＧＤＦ−３ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を使用する診断および治療方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】増殖分化因子−３発明の背景１．発明の分野本発明は、一般的には増殖因子に関するものであり、特定的には形質転換増殖因子−β（transforming growth factor−β：ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの新メンバーである増殖分化因子−３（growth differentiation factor-3：ＧＤＦ−３）に係わるものである。２．関連技術分野の説明形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、胚発生中の広範な分化過程に影響を及ぼす、構造的に関連したタンパク質の一群を包含する。このファミリーには、正常な雄性発達に必要とされるミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）（Behringerら，Nature，345:167，1990）；背−腹軸の形成および成虫原基の形態形成に必要とされるショウジョウバエのデカペンタプレジック（ＤＰＰ）遺伝子産物（Padgettら，Nature，325:81-84,1987）；卵の植物極に局在するツメガエルＶｇ−１遺伝子産物（Weeksら，Cell，51:861-867，1987）；ツメガエル胚における中胚葉および前方構造の形成を誘導し得る（Thomsenら，Cell,63:485 ，1990）アクチビン類（Masonら，Biochem．Biophys.Res．Commun.，135:957-96 4，1986）；および新たな軟骨および骨の形成を誘導し得る（Sampathら，J．Biol．Chem.，265:13198，1990）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、オステオゲニン、ＯＰ−１）が含まれる。ＴＧＦ−βは、脂質生成、筋発生、軟骨形成、造血および上皮細胞分化を含めて、さまざまな分化過程に影響を与えることができる（再検討のため、Massague，Cell，49:437 ,1987を参照のこと）。ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、最初に大きな前駆体タンパク質として合成され、その後前駆体タンパク質はＣ末端側の約１１０〜１４０個のアミノ酸から成る塩基性残基のクラスターで加水分解切断を受ける。これらのタンパク質のＣ末端領域はどれも構造的に関連しており、その相同度に基づいて、それぞれのファミリーメンバーを別個のサブグループに分類することができる。特定のサブグループ内の相同性は７０〜９０％アミノ酸配列同一性の範囲であるが、サブグループ間の相同性は著しく低く、一般的にはせいぜい２０〜５０％の範囲である。いずれの場合も、活性種はＣ末端フラグメントのジスルフィド架橋二量体であると考えられる。これまでに研究された大半のファミリーメンバーでは、ホモ二量体種が生物学的に活性であるとされているが、インヒビン（Lingら，Nature ，321:779，1986）やＴＧＦ−β（Cheifetzら，Cell，48:409，1987）のような他のファミリーメンバーについてはヘテロ二量体も検出されており、これらはそれぞれのホモ二量体とは異なる生物学的性質をもつようである。発現パターンが組織特異的である新規因子の同定は、その組織の発達および機能のより一層の理解をもたらすだろう。発明の概要本発明は、細胞増殖分化因子ＧＤＦ−３、該因子をコードするポリヌクレオチド配列、および該因子と免疫反応性である抗体を提供する。この因子は種々の細胞増殖性疾患（特に、造血および脂肪組織に関係するもの）、ならびに免疫系の機能に関連した疾患に関係があるようである。従って、１つの実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−３と関係がある骨髄、脾臓、胸腺または脂肪起源の細胞増殖性疾患または免疫疾患を検出する方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−３活性を抑制または増強することにより、ＧＤＦ−３の異常な発現レベルと関係がある細胞増殖性疾患または免疫疾患を治療する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、成体組織におけるＧＤＦ−３ｍＲＮＡの発現を示す。図２は、ＧＤＦ−３のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。共通のＮ−グリコシル化シグナルを無地のボックスで示す。推定上の四塩基プロセシング部位を点刻ボックスで示す。推定上の開始ＡＴＧの上流にある同じ読み枠の終止コドンおよび共通のポリアデニレーションシグナルには下線が引いてある。ポリＡ尾部は示してない。数字は５’末端からのヌクレオチド位置を示す。図３は、ＧＤＦ−３のＣ末端配列とＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーとの並列化を示す。保存されたシステイン残基には陰影が付けてある。ダッシュ（− ）は並列化を最大とするために導入されたギャップを表す。図４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの各メンバー間のアミノ酸相同を示す。数字は最初の保存システインからＣ末端までで計算された各対間のアミノ酸同一性のパーセントを表す。ボックスは特定のサブグループ内の密接に関連したメンバー間の相同性を表す。図５は、ヒトＧＤＦ−３の部分ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。図６は、Bam HI（B）、Eco RI（E）、またはHind III（H）で消化し、マウスまたはヒトＧＤＦ−３を用いて釣り上げたマウスおよびヒトゲノムＤＮＡのサザン分析を示す。発明の詳細な説明本発明は、増殖分化因子ＧＤＦ−３ならびにＧＤＦ−３をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ＧＤＦ−３は主に骨髄、脾臓、胸腺および脂肪組織において発現され、動物では多様な調節的役割を果している。１つの実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−３発現と関係がある骨髄、脾臓、胸腺または脂肪組織の細胞増殖性疾患または免疫疾患を検出する方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−３活性を抑制または増強する薬剤を使用することにより、ＧＤＦ−３の異常な発現と関係がある細胞増殖性疾患または免疫疾患を治療する方法を提供する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーは多くの細胞型の増殖、分化、その他の機能を制御する多機能性ポリペプチドから成っている。かかるペプチドの多くは他のペプチド増殖因子に対してポジティブおよびネガティブの両方の調節作用を有する。本発明のＧＤＦ−３タンパク質とＴＧＦ−βファミリーのメンバー間の構造的相同性は、ＧＤＦ−３が増殖および分化因子のファミリーの新メンバーであることを示す。他の多くのメンバーのすでに知られた活性に基づくと、ＧＤＦ−３もまた診断薬や治療薬として有用であるような生物学的活性を有することが期待できる。例えば、ＴＧＦ−βは、ＢおよびＴ細胞の増殖ならびに機能に及ぼす強力な抑制作用を含めて、広範な免疫調節活性を有することが分かっている（再検討のため、Palladinoら，Ann．N．Y.Acad．Sci.，593:181，1990を参照のこと）。ＧＤＦ−３も同様の活性を示すかもしれず、それゆえ、抗炎症剤としてまたはリンパ球の異常な増殖に関係した疾患の治療薬として有用である可能性がある。加えて、ＴＧＦ−βとアクチビンは両方とも、造血においてある役割を担っていると考えられている。特に、ＴＧＦ−βは初期の造血前駆細胞の増殖の阻害因子であることが判明している（再検討のため、Moore，Blood，78:1，1991を参照のこと）。これに関連して、ＧＤＦ−３は化学療法の間に造血幹細胞を保護するのに有用であるかもしれない。さらに、アクチビンは骨髄と脾臓で発現され（Shiozakiら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA,89:1553，1992）、赤血球細胞の分化を誘導し得ることが分かっている（Murataら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:2434，198 8）。ＧＤＦ−３も同様の活性を有して、地中海貧血や鎌状赤血球貧血のような疾患の治療に有用であるかもしれない。また、ＴＧＦ−βはin vitroで脂肪細胞分化の強力な阻害因子であることが分かっている（IgnotzおよびMassague，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA, 82:8530，1985）。これに関連して、ＧＤＦ−３は肥満の治療または脂肪細胞の異常な増殖に関連した疾患の治療に有用であるかもしれない。ＧＤＦ−３はまた増殖促進因子としても機能することができ、それゆえにin v itroでの種々の細胞集団の生存に有用である可能性がある。特に、ＧＤＦ−３が造血幹細胞の増殖を促進させる上で何らかの役割を果たすのであれば、ＧＤＦ− ３は化学療法、骨髄移植またはあるタイプの貧血の治療に応用できるかもしれない。ＧＤＦ−３を用いてin vitroで幹細胞および前駆細胞集団を速やかに増やし、移植に必要とされる組織の量を大幅に減らすことができる。さらに、ＧＤＦ− ３は移植に先立って幹細胞集団を維持するのに有用であるかもしれない。また、ＴＧＦ−βファミリーの他の多くのメンバーは組織修復の重要な媒介物質ともなる。ＴＧＦ−βはコラーゲンの形成に対して著しい影響を及ぼすことが知られており、新生マウスでは顕著な脈管形成応答を生じさせる（Robertsら，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA，83:4167，1986）。ＧＤＦ−３も同様の活性を示して、例えば外傷や火傷による組織傷害の修復に有用であるかもしれない。本明細書中で用いる「実質的に純粋な」という用語は、他のタンパク質、脂質、炭水化物または自然界でＧＤＦ−３と結合している他の物質を実質的に含まないＧＤＦ−３を指す。当業者はタンパク質精製の標準的な技法を用いてＧＤＦ− ３を純化することが可能である。実質的に純粋なポリペプチドは非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドをもたらすだろう。ＧＤＦ−３ポリペプチドの純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列解析によって決定することができる。ＧＤＦ−３ポリペプチドは、ＧＤＦ−３の活性が残っているという条件で、該ポリペプチドのフラグメントを含むものである。ＧＤＦ−３の生物学的活性を有する比較的小さいペプチドも本発明に含まれる。本発明はＧＤＦ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドとして、ＧＤＦ−３をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。ＧＤＦ−３の全部または一部をコードするポリヌクレオチドはすべて、それらがＧＤＦ−３活性を有するポリペプチドをコードするのであれば、本発明に含まれることが理解されよう。こうしたポリヌクレオチドとして、天然に存在するもの、合成されたもの、そして故意に操作されたものが挙げられる。例えば、ＧＤＦ−３ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発にかけることができる。ＧＤＦ−３のポリヌクレオチド配列はアンチセンス配列も含むものである。本発明のポリヌクレオチドは遺伝暗号の結果としての縮重配列を含む。２０種類の天然アミノ酸が存在し、その大部分は１種類より多いコドンによって規定されている。かくして、すべての縮重ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列によってコードされるＧＤＦ−３ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない限り、本発明に含まれるものである。特に、本明細書中では、鎖長が１２８０塩基対で、ヌクレオチド１２２のメチオニンコドンから始まるオープンリーディングフレームを含むＧＤＦ−３のｃＤＮＡ配列が開示される。コードされるポリペプチドは３６６個のアミノ酸から成り、ヌクレオチド配列解析で測定して約４１．５ｋＤの分子量を有する。推定上の開始メチオニンの上流には、ヌクレオチド７７で始まる同じ読み枠の終止コドンがある。ＧＤＦ−３配列は、Ｎ末端の近傍に、分泌のためのシグナル配列を暗示する疎水性アミノ酸のコアを含んでいる。ＧＤＦ−３はアスパラギン残基１１３および３０８に２つの可能なＮ−グリコシル化部位と、アミノ酸２４９−２５２に推定上の四塩基タンパク質分解プロセシング部位（ＲＫＲＲ）を含む。この部位での開裂は、１１４個のアミノ酸から成りかつヌクレオチド配列解析で測定して非グリコシル化分子量が約１３．０ｋＤであると想定されるＧＤＦ−３の成熟フラグメントを生成するだろう。当業者は標準的な技法を使ってグリコシル基を修飾したり、ＧＤＦ−３タンパク質からグリコシル基を部分的にまたは完全に除いたりできるだろう。それゆえ、本発明の機能性タンパク質またはそのフラグメントとして、ＧＤＦ−３のグリコシル化種、部分的グリコシル化種および非グリコシル化種が含まれる。推定上のタンパク質分解プロセシング部位のあとのＧＤＦ−３のＣ末端領域は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知メンバーに対して著しい相同を示す。ＧＤＦ−３配列は他のファミリーメンバーに高度に保存されている残基のほとんどを含んでいる（図３参照）。しかし、ＧＤＦ−３配列はそのＣ末端領域にシステイン残基の異なるパターンを有する。特に、ＧＤＦ−３は他のファミリーメンバーのすべてに保存されている７個のシステイン残基のうちの１個を欠いている。すなわち、アミノ酸位置３３０に、他のすべてのファミリーメンバーはシステイン残基を含んでいるのに、ＧＤＦ−３配列はバリン残基を含んでいる。さらに、ＧＤＦ−３は２６２位に追加のシステイン残基（想定される開裂部位から１０番目のアミノ酸）を含んでいる。既知の哺乳動物ＴＧＦ−βファミリーのメンバーのうち、ＧＤＦ−３はＶｇｒ −１およびＢＭＰ−２に対して最大の相同性を示す（５３％の配列同一性）。ＧＤＦ−３はツメガエルＶｇ−１に対してより高い相同性を示す（５７％の配列同一性）が、Ｖｇ−１のマウス相同体ではなさそうである（例えば、Ｖｇｒ−１とＢＭＰ−２は、ＧＤＦ−３がＶｇ−１に相同であるのと同程度にＶｇ−１に相同である）。しかし、ＧＤＦ−３は推定上の四塩基プロセシング部位の上流のプロ領域においてＧＤＦ−１とＶｇ−１の両方に相同性を示し（それぞれ２８％および２９％）、配列相関度はＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２間でプロ領域に見られるもの（３３％；de Martinら，EMBO J.，6:3673，1987）に匹敵する。ＧＤＦ−３はまた、その配列が種を越えて分岐している程度にＧＤＦ−１に類似している。ＧＤＦ−１の場合と同様に、マウスとヒト間のＧＤＦ−３の配列相同は８０〜８５％の範囲のアミノ酸同一であるにすぎないようだ。組換えＧＤＦ−３の一次アミノ酸配列のマイナーな修飾は、本明細書に記載のＧＤＦ−３ポリペプチドと比べて実質的に同等の活性を有するタンパク質をもたらすかもしれない。かかる修飾は部位特異的突然変異誘発によるもののように故意であっても、自然に起こるものであってもよい。これらの修飾によって得られるポリペプチドのすべては、ＧＤＦ−３の生物学的活性が依然として存在するのであれば、本発明に包含される。さらに、１個以上のアミノ酸を欠失させることも、その生物学的活性を著しく変えることなく分子構造の修飾を可能とする。これはより広い有用性を有するより小さな活性分子の開発へと導く。例えば、ＧＤＦ−３の生物学的活性にとっては必要でないアミノまたはカルボキシ末端のアミノ酸の除去が可能である。本発明のＧＤＦ−３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、開示した配列およびその保存的変更を含むものである。ここで用いる「保存的変更」という用語は、アミノ酸残基を他の生物学的に類似した残基で置き換えることを意味する。保存的変更の例として、ある疎水性アミノ酸（イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなど）を別の疎水性アミノ酸と置き換えること、または、ある極性アミノ酸を別の極性アミノ酸と置き換えることが含まれ、例えば、リシンとアルギニンとの置換、アスパラギン酸とグルタミン酸との置換、アスパラギンとグルタミンとの置換などを挙げることができる。また、「保存的変更」という用語は、置換ポリペプチドに対して誘起された抗体が非置換ポリペプチドと免疫反応性であるという条件で、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも包含する。本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡは当技術分野で公知のハイブリダイゼーション技法を使って単離し得る。これらには、１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション、２）対象のＤＮＡ配列にアニールし得るプライマーを用いるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および３）構造的特徴を共有するクローン化ＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングが含まれるが、これらに限らない。好ましくは、本発明のＧＤＦ−３ポリヌクレオチドは哺乳動物に由来するものであり、マウス、ラットまたはヒト由来のものが最も好ましい。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法は、適当なプローブが利用可能であれば、どの動物からでも任意の遺伝子配列を単離することを可能にする。対象のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成可能である。そのためには、短いオリゴペプチドの範囲のアミノ酸配列が既知でなければならない。タンパク質をコードするＤＮＡ配列はアミノ酸配列から推定することができるが、遺伝暗号の縮重を考慮に入れる必要がある。配列が縮重をもつときは混合付加反応を行うことが可能である。これは変性二本鎖ＤＮＡの不均質混合物を含む。こうしたスクリーニングでは、一本鎖ＤＮＡかまたは変性二本鎖ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、対象のポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列が極めて少ない量で存在する供給源から誘導されたｃＤＮＡクローンの検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的結合を回避するようなストリンジェントハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、標的ＤＮＡとその完全な相補体である混合物中の単一プローブとのハイブリダイゼーションにより、特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフ可視化を可能にすることができる（Wallac eら，Nucl．Acid Res.，9:879，1981）。また、ＧＤＦ−３をコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、２）対象のポリペプチドに必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造、および３）真核供与細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成、により得ることができる。後者の場合は、一般にｃＤＮＡと呼ばれるｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が最終的に形成される。組換え法で用いる特定のＤＮＡ配列を得るための上記の３方法のうち、ゲノムＤＮＡ単離物の単離が最も一般的でない方法である。イントロンの存在ゆえに哺乳動物ポリペプチドの微生物発現を得ることが望ましい場合は特にそうである。目的とするポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知であるときは、ＤＮＡ配列の合成がしばしば好適な方法となる。目的とするポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が不明であるときは、ＤＮＡ配列の直接合成が不可能で、ｃＤＮＡ配列の合成が好適な方法となる。対象のｃＤＮＡ配列を得るための標準的な方法として、高レベルの遺伝子発現を有する供与細胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写により誘導されるプラスミド‐またはファージ‐担持ｃＤＮＡライブラリーの作製がある。ポリメラーゼ連鎖反応の技法とともに用いると、稀な発現産物でさえもクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が知られている場合には、標的ｃＤＮＡ中に存在すると想定される配列を複写した一本鎖または二本鎖の標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを作製し、該プローブを、一本鎖形態に変性させたクローン化コピー数のｃＤＮＡに対して実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法において用いることができる（Ja yら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983）。ラムダｇｔ１１のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ＧＤＦ−３に特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトープを有するＧＤＦ−３ペプチドについて間接的にスクリーニングし得る。こうした抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、ＧＤＦ−３ｃＤＮＡの存在を示す発現産物の検出に用いられる。ＧＤＦ−３をコードするＤＮＡ配列は適当な宿主細胞へのＤＮＡ導入によりin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」とは、ベクターを増幅しかつそのＤＮＡを発現し得る細胞のことである。また、この用語は被験宿主細胞のあらゆる子孫をも含むものである。すべての子孫は、複製中に突然変異を起こすことがあるから、その親細胞と同一でなくてもよいことが理解されよう。しかし、「宿主細胞」という用語を用いるときは、こうした子孫も含むものとする。安定したＤＮＡ導入（外来ＤＮＡが宿主内に連続的に維持されることを意味する）の手法は当技術分野で公知である。本発明では、ＧＤＦ−３ポリヌクレオチド配列が組換え発現ベクターに挿入される。「組換え発現ベクター」という用語は、ＧＤＦ−３遺伝子配列の挿入または組込みによって操作された、当技術分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体を指す。かかる発現ベクターは宿主内に挿入した遺伝子配列の効率のよい転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは複製起点、プロモーター、さらに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特殊な遺伝子を含むのが常である。本発明で使用するのに適したベクターとしては、バクテリア発現用のＴ７をベースとした発現ベクター（Rosenbergら，Gene，56:125，1987）、哺乳動物細胞発現用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（LeeおよびNathans，J.Biol．Chem.，263:3521，1988）、および昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクターを挙げることができるが、これらに限らない。ＤＮＡセグメントはプロモーター（例：Ｔ７、メタロチオネインＩ、ポリヘドリンプロモーター）のような調節要素に機能的に連結された状態でベクター中に存在する。ＧＤＦ−３をコードするポリヌクレオチド配列は原核生物または真核生物のいずれで発現させてもよい。宿主としては、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物が含まれる。原核生物内で真核生物配列またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は当技術分野で公知である。宿主内で発現・複製しうる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で知られている。本発明のＤＮＡ配列を組み込む際には、こうしたベクターが用いられる。組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られているような慣用の技法を使って行われる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合は、指数増殖期の後に回収した細胞からＤＮＡ取込み能を有するコンピテント細胞を調製し、その後当技術分野で公知の手法を用いてＣａＣｌ₂法で処理する。また、ＭｇＣｌ₂やＲｂＣｌを用いてもよい。所望により、宿主細胞のプロトプラストを形成させた後で形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクションのような慣用の機械的方法、エレクトロポレーション、リポソーム内に保持されたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターといったＤＮＡトランスフェクション法が用いられる。真核細胞はまた、本発明のＧＤＦ−３をコードするＤＮＡ配列および選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）を用いて同時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）やウシパピローマウイルスのような真核生物ウイルスベクターを使って真核細胞を一時的に感染させるか形質転換することにより、タンパク質を発現させる方法である（例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Ha rbor Laboratory,Gluzman編集，1982を参照のこと）。本発明により提供される、微生物内で発現させたポリペプチドまたはそのフラグメントの単離・精製は、分離用クロマトグラフィーおよびモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫学的分離を含めて、慣用の手段により行うことができる。本発明は、ＧＤＦ−３ポリペプチドと免疫反応性の抗体またはその機能性フラグメントを含むものである。様々なエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体のプールから本質的に成る抗体、ならびに明確に異なるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は当業者によく知られた方法を用いてタンパク質の抗原含有フラグメントから作られる（Kohlerら，Nature,256:495，19 75）。本発明で用いる「抗体」という用語は、完全な抗体分子のほかに、ＧＤＦ −３上のエピトープ決定基と結合し得るFabおよびＦ（ab'）₂のような抗体フラグメントを包含する。「細胞増殖性疾患」という用語は、しばしば周囲の組織と形態学的にも遺伝子型的にも相違するように見える悪性ならびに非悪性の細胞集団を表す。アンチセンス分子からなるＧＤＦ−３ポリヌクレオチドは、さまざまな器官系の悪性疾患、特に、例えば骨髄、脾臓、胸腺または脂肪組織の細胞の悪性疾患を治療するのに有用である。本質的に、ＧＤＦ−３発現の変化が原因的に関係している疾患はどれも、ＧＤＦ−３抑制剤による治療に感受性であると考えられる。骨髄由来細胞と関連した、こうした疾患の１つが例えば白血病である。「免疫疾患」という用語は、免疫系の細胞、例えばリンパ球を巻き込んだ疾患を意味する。かかる免疫疾患としては例えば炎症過程と関連した疾患が含まれる。免疫疾患は免疫学的細胞増殖性疾患に限らない。本発明は、骨髄、脾臓、胸腺又は脂肪組織の細胞増殖性又は免疫学的障害を検出する方法であって、抗ＧＤＦ−３抗体をＧＤＦ−３関連障害を有する疑いがある細胞と接触させ、その抗体への結合を検出することを含む方法を提供する。ＧＤＦ−３と反応性のこの抗体は、ＧＤＦ−３への結合を検出できるようにする化合物で標識される。本発明の目的のために、ＧＤＦ−３ポリペプチドに特異的な抗体を用いて生物学的流体及び組織中のＧＤＦ−３のレベルを検出することができる。検出可能な量の抗原を含有するあらゆる検体を用いることができる。この発明の好ましいサンプルは、骨髄起源の組織、特に造血幹細胞又は始原細胞を含有する組織である。疑いのある細胞中のＧＤＦ−３のレベルを正常細胞中のレベルと比較して、被験体がＧＤＦ−３関連細胞増殖性又は免疫学的障害を有するかどうかを確認することができる。好ましくは、被験体はヒトである。本発明の抗体は、in vitro又はin vivo免疫診断又は免疫療法を施すのが望ましいあらゆる被験体に用いることができる。本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイに用いるのに適しており、その際それらを液相で用いても固相キャリヤーに結合させてもよい。加えて、これらイムノアッセイにおける抗体を検出できるように種々の方法で標識することができる。本発明の抗体を用いることができるタイプのイムノアッセイの例は、直接又は間接フォーマットのいずれかの競合及び非競合イムノアッセイである。かかるイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びサンドイッチ（免疫測定）アッセイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含む、フォワード、リバース、又は同時モードのいずれで行われるイムノアッセイを用いても行うことができる。当業者は、過度な実験を重ねることなく他のイムノアッセイフォーマットを認知するか、又は容易に認識できるであろう。本発明の抗体は、多くの異なるキャリヤーに結合できるので、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出するのに用いることができる。周知のキャリヤーの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱が含まれる。このキャリヤーの性質は、本発明の目的のためには可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、抗体を結合させるのに適する他のキャリヤーを認知するか、又は日常的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。当業者にとって既知の多くの異なる標識及び標識方法がある。本発明に用いることができるタイプの標識の例には、酵素、放射性同位元素、蛍光性化合物、コロイド状金属、化学発光性化合物、リン光性化合物、及び生物発光化合物が含まれる。当業者は、抗体に結合するのに適する他の標識を認知するか、又は日常的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。より大きな感度をもたらすこともできるもう１つの技術は、これら抗体を低分子量ハプテンにカップリングさせることからなる。次いで、第２反応によってこれらハプテンを特異的に検出することができる。例えば、特異的抗ハプテン抗体と反応するビオチン（アビジンと反応する）、ジニトロフェニル、ピリドキサール、及びフルオレセインのようなハプテンを用いるのが普通である。抗原のin vivo検出に本発明のモノクローナル抗体を用いるに際して、検出できるように標識された抗体を診断に有効な用量投与する。「診断に有効」という用語は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の量が、本発明のポリペプチド（このポリペプチドに対してモノクローナル抗体は特異的である）を含む抗原を有する部位の検出が可能になるのに十分な量で投与されることを意味している。検出できるように標識されたモノクローナル抗体の投与濃度は、該ポリペプチドを有する細胞への結合がバックグラウンドに比較して検出可能になるのに十分な濃度であるべきである。更に、最良の標的対バックグラウンド信号比を得るために、検出できるように標識されたモノクローナル抗体が循環系から急速に浄化されることが望ましい。一般に、検出できるように標識されたモノクローナル抗体のin vivo診断のための用量は、個体の年齢、性別、及び疾患の程度の如き要因に依存して変動するであろう。かかる用量は、例えば、注射が多数回行われるかどうか、抗原負担、及び当業者に知られている他の要因に依存して変動してもよい。 in vivo診断的画像化については、利用可能な検出装置のタイプが、所定の放射性同位元素を選択するにあたっての主因となる。選ばれる放射性同位元素は、所与のタイプの装置で検出可能なタイプの崩壊を起こさければならない。in viv o診断用の放射性同位元素を選択するに際して重要なもう１つ要因は、宿主に対して有害な放射線を最小限に抑えることである。理想的には、in vivo画像化に用いられる放射性同位元素は粒子放射を欠くが、慣用的なガンマカメラにより簡単に検出できる１４０〜２５０ｋｅＶの範囲の多数の光量子を生成するであろう。 in vivo診断については、介在官能基を用いることにより放射性同位元素を直接又は間接にイムノグロブリンに結合させてもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素をイムノグロブリンに結合させるのにしばしば用いられる介在官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び類似の分子の如き二官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体に結合できる金属イオンの典型的な例は、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、及び²⁰¹Ｔｌである。本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）又は電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように、in vivo診断の目的のために常磁性同位元素で標識することもできる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる慣用方法を用いることができる。通常、ガンマ及び陽電子放射性ラジオアイソトープが、ＭＲＩ用のカメラ画像化及び常磁性同位元素として用いられる。かかる技術に特に有用である元素には、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒ、及び⁵⁵Ｆｅが含まれる。本発明のモノクローナル抗体は、in vitro及びin vivoで用いて被験体のＧＤＦ−３関連疾患の改善の経過を追跡することができる。かくして、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加若しくは減少、又は種々の体液中に存在するかかる抗原の濃度の変化を測定することにより、ＧＤＦ−３関連疾患の改善を狙った特定の療法が効果的であるかどうかを確認することが可能になろう。「改善」という用語は、治療を受けている被験体のＧＤＦ−３関連疾患の好ましくない作用が少なくなることを表す。本発明は、正常細胞における発現に比較して変異した方法で発現され得るヌクレオチド配列を同定するものであり、従ってこの配列に向けられる適切な治療又は診断法を設計するのが可能となる。かくして、細胞増殖性又は免疫学的障害がＧＤＦ−３の発現と関連している場合には、翻訳レベルでＧＤＦ−３発現を妨害する核酸配列を用いることができる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸及びリボザイムを用いて特定のＧＤＦ−３ｍＲＮＡの翻訳を遮断するものであって、それはアンチセンス核酸でそのｍＲＮＡをマスクするか又はリボザイムでそれを開裂させるかのいずれかによりなされる。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であるＤＮＡ又はＲＮＡ分子である（Weintraub,Scientific American，262:40，1990）。細胞内でアンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないであろうから、アンチセンス核酸はこのｍＲＮＡの翻訳を妨害することになる。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。というのは、それらは、より大きな分子よりも簡単に合成できかつ標的ＧＤＦ−３産生細胞内に導入したときにあまり問題を起こしそうにないからである。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためにアンチセンス法を用いることは、当該技術分野で周知である（Marcus-Sakura，Anal．B iochem.，172:289，1988）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似のやり方で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に開裂する能力を有するＲＮＡ分子である。これらＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識してそれを開裂する分子を工学的に作ることが可能である（Chen，J．Amer. Med．Assn.，260:3030，1988）。このアプローチの主要な利点は、それらが配列特異性であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけを不活性にする点である。２つの基本的なタイプのリボザイム、即ち、テトラヒメナ型（Hasselhoff，Na ture，334:585，1988）及び“ハンマーヘッド”型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長さが４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボザイムは長さが１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種内に独占的に存在する可能性が大きくなる。従って、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、しかも１８塩基の認識配列がそれより短い認識配列よりも好ましい。本発明は、ＧＤＦ−３タンパク質により媒介される細胞増殖性又は免疫学的障害を治療するための遺伝子治療も提供する。かかる療法は、ＧＤＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドをこの増殖性障害を有する細胞内に導入することによりその治療効果を奏することになる。アンチセンスＧＤＦ−３ポリヌクレオチドの運搬（デリバリー）は、キメラウイルスの如き組換え発現ベクター又はコロイド分散系を用いて行うことができる。アンチセンス配列の治療的デリバリーに特に好ましいのは、標的設定（ターゲティング）されたリポソームを用いることである。ここに教示した遺伝子治療に用いることができる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア又は、好ましくは、レトロウイルスの如きＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウス又は鳥類のレトロウイルスの誘導体である。単一の異種遺伝子を挿入することができるレトロウイルスの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイ（Harvey）マウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれるが、これらに限定されない。多くの更なるレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を組み込むことができる。導入細胞が同定されて世代形成できるように、これら全てのベクターは、選択マーカー用の遺伝子を移入するか又は取り込むことができる。興味の対象であるＧＤＦ−３配列を、例えば、特定の標的細胞上のレセプターのリガンドをコードする別の遺伝子と一緒にウイルスベクターに挿入することにより、そのベクターはその時点で標的特異性となる。レトロウイルスベクターを、例えば、糖、糖脂質又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異性にしてもよい。好ましい標的設定（ターゲティング）は、抗体を用いることにより行われる。当業者は、過度な実験を重ねることなく、ＧＤＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異性デリバリーを可能にするためにレトロウイルスゲノム内に挿入できる特定のポリヌクレオチド配列を認知するか、又は容易に探知できるであろう。組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるので、感染性ベクター粒子を生成させるためにはそれらは助けを必要とする。この助けは、例えば、レトロウイルスの全ての構造遺伝子をそのＬＴＲ内の調節配列の制御下でコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用いることにより提供することができる。これらプラスミドには、そのパッケージング機構がキャプシデーション（包膜）のためにＲＮＡ転写産物を認識するのを可能にするヌクレオチド配列が存在しない。このパッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞系には、例えば、Ψ２、ＰＡ３１７及びＰＡ１２が含まれるが、これらに限定されない。これら細胞系は、ゲノムがパッケージされていないので、空のビリオンを産生する。パッケージングシグナルは完全であるが構造遺伝子が興味の対象である他の遺伝子により置換されている細胞内にレトロウイルスベクターを導入した場合には、そのベクターはパッケージされてベクタービリオンを産生することができる。また、ＮＩＨ３Ｔ３又は他の組織培養細胞は、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖをコードするプラスミドで慣用的なリン酸カルシウムトランスフェクションにより直接トランスフェクトすることができる。次いで、これら細胞を対象の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトする。得られる細胞は、培地中にそのレトロウイルスベクターを放出する。ＧＤＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドのもう１つの標的デリバリーシステムは、コロイド分散系である。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、及び、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。この発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、 in vitro及びin vivoでの運搬体として有用である人工膜小胞である。サイズが０．２〜４．０μｍの大きな単ラメラ小胞（large unilamellar vesicle，ＬＵＶ）が巨大分子を含有する相当なパーセンテージの水性緩衝液を封入できることが分かった。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷ビリオンをその水性内部に封入して、生物活性形態で細胞へ運搬することができる（Fraleyら，Trends Biochem．Sci.，6: 77，1981）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母、及び細菌細胞へのポリヌクレオチドの運搬に用いられてきた。リポソームが効率のよい遺伝子導入運搬体であるためには、次の特徴が示されるべきである：（1）対象となる遺伝子を高い効率で封入するがそれらの生物活性を弱めないこと；（2）非標的細胞に比較して標的細胞に優先的かつ強固に結合すること；（3）標的細胞の細胞質へ該小胞の水性内容物を高い効率で運搬すること；及び（4）遺伝子情報を正確かつ効率的に発現すること（Manninoら，Biotechniques，6:682，1988）。リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質とステロイド、特にコレステロールとを組み合わせたものである。他のリン脂質又は他の脂質を用いることもできる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。リポソーム生成に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドの如きホスファチジル化合物が含まれる。特に有用なのは、脂質部分が１４〜１８個炭素原子、特に１６〜１８個炭素原子を含有し飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールである。実例となるリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的設定（ターゲティング）は、解剖学的及び機械学的要因に基づいて分類される。解剖学的分類は、選択性、例えば、器官特異性、細胞特異性及びオルガネラ特異性のレベルに基づく。機械学的標的設定は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的標的設定は、洞様毛細血管を含む器官内の細網内皮系（reticulo-endothelialsystem，ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの自然的傾向を利用するものである。一方、能動的標的設定は、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質の如き特異的リガンドにカップリングさせることにより又はリポソームの組成若しくはサイズを変えることによりリポソームを改変して、天然に存在する局在部位以外の器官及び細胞型に標的設定することを包含する。標的デリバリーシステムの表面をいろいろな方法で修飾することができる。リポソーム標的デリバリーシステムの場合には、脂質基をリポソームの脂質二重層内に取り込ませて、標的指向性リガンドをリポソーム二重層との安定な結合状態で維持するようにできる。脂質鎖を標的指向性リガンドに結合するために種々の連結基を用いることができる。骨髄、脾臓、胸腺及び脂肪組織内でのＧＤＦ−３の発現のために、これら組織に関連する本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び抗体を用いる種々の応用がある。ＧＤＦ−３は造血の調節にある役割を果たすであろうから、種々の移植操作に有用であろう。組織移植についての応用に加えて、細胞増殖性及び免疫学的障害の治療への応用が含まれる。以下の実施例は、本発明を説明するものであって限定を意図するものではない。それらは用いられるかも知れない実例を代表しているが、当業者にとって既知の他の手法を代わりに用いてもよい。実施例１新規なTGF-βファミリーメンバーの同定と単離 TGF-βスーパーファミリーの新しいメンバーを同定するため、公知のファミリーメンバーにおける２つの保存領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドを設計した。１つの領域は２つのトリプトファン残基の間にわたる、MISを除いて全てのファミリーメンバーに保存されているものであり、もう１つの領域はC-末端に近い不変システイン残基の間にわたるものである。これらのプライマーをマウスゲノムDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応に使用し、その後プライマーの５’末端に置かれた制限部位を利用してPCR生成物をサブクローン化し、これらのサブクローン化された挿入物を含む大腸菌の個々のコロニーを採集し、そしてランダムな配列決定とハイブリダイゼーション分析を組み合わせて使用して、前記スーパーファミリーの公知のメンバーを除外した。 GDF-3は、プライマーであるにより得られたPCR生成物の混合物から同定された。これらのプライマーを使用したPCRは、２μｇのマウスゲノムDNAを使用して、 94℃で１分間、42℃で２分間、72℃で3.5分間、40サイクル行った。約280 bpのPCR生成物をゲル精製し、EcoRIにより消化し、再度ゲル精製し、Bluescriptベクター（Stratagene，San Diego，CA）中にサブクローン化した。個々のサブクローンを含む細菌コロニーを96ウェルマイクロタイタープレートに採集し、ニトロセルロース上に細胞をプレーティングすることにより複数のレプリカを調製した。複写したフィルターを、ファミリーの公知のメンバーを示すプローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしないコロニーから配列分析のためのDNAを調製した。 SJL120及びSJL121のプライマーは、それぞれアミノ酸配列EVGWH(R/S)WV(I/M)A P及びYEDMVVDECGCをコードしており、その組合せは、分析した80のサブクローン中、１種の先に同定されていた配列GDF-1及び２つの新規な配列を与え、この２つの新規な配列のうちの１つをGDF-3と指称することとした。ハイブリダイゼーションを５×SSPE、10%硫酸デキストラン、50%ホルムアミド、１%SDS、200μg/mlサケDNA並びにウシ血清アルブミン、フィコール及びポリビニルピロリドンのそれぞれ0.1%中で行った以外は、RNA単離及びノーザン分析は以前に記載されたようにして行った（Lee，S.J.，Mol．Endocrinol.，4:1034,19 90）。Stratageneにより与えられた指示書に従い、骨髄からポリＡ選択したRNA 2.5μｇから、オリゴdTプライマーを用いてcDNAライブラリーをλZAPIIベクター中に調製した。スクリーニングの前にライブラリーを１回増幅した。フィルターを前に記載されたようにハイブリダイズさせた（Lee，S.J.，Proc．Natl．Acad. Sci．USA.，88:4250-4254，1991）。ジデオキシチェーンターミネーション法（S angerら，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，74:5463-5467，1977）及びS1ヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼIIIの組合せによる方法（Henikoff，S.，Gene，28:351-359，1984）及び合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、両鎖のDNA配列決定を行った。実施例２ GDF-３の発現パターン及び配列 GDF-3の発現パターンを調べるため、種々の成体組織から調製したRNA試料をノーザン分析によりスクリーニングした。各組織から調製した、２回ポリＡ選択したRNAの５μｇをホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にかけ、ブロットし、GDF-3 で釣り上げた。図１に示すように、GDF-3プローブは、胸腺、脾臓、骨髄及び脂肪組織中に発現された1.3kb mRNAを検出した。 1.8×10⁶組換えファージからなる骨髄cDNAライブラリーをλZAP II中に構築し、GDF-3 PCR生成物から得たプローブを使用してスクリーニングした。ハイブリダイズする最も長いクローンの全ヌクレオチド配列を図２に示す。共通のN-グリコシレーションシグナルを無地のボックスにより示す。推定の４塩基プロセシング部位を点で描いたボックスにより示す。推定の開始ATGの上流の読み枠内終結コドン及び共通のポリアデニレーションシグナルに下線を付した。ポリＡ尾部は示していない。数字は5’末端からみたヌクレオチドの位置を示す。この1280 bp 配列は、ヌクレオチド122のメチオニンコドンから始まり、41.5kDの分子量を有する366アミノ酸長のタンパク質をコードし得る長いオープンリーディングフレームを含んでいる。推定上の開始メチオニンの上流はヌクレオチド77から始まる読み枠内終結コドンである。予測されるGDF-3アミノ酸配列は疎水性N-末端領域を含み、これは分泌のためのシグナル配列を示唆するものであり、またアスパラギン残基113及び308における２つの可能性のあるN-結合グリコシル化部位並びにアミノ酸249-252における推定の４塩基タンパク質分解プロセシング部位（RKRR）を含む。この部位におけるGDF- 3前駆体の開裂により、非グリコシル化分子量が13.0kDと予測される114アミノ酸長の成熟GDF-3タンパク質が生成されるであろう。推定のタンパク質分解プロセシング部位に続くGDF-3のC-末端領域は、TGF-β スーパーファミリーの公知のメンバーに対して有意な相同性を示す（図３）。図３は、GDF-3のC-末端配列と、ヒトGDF-1（Lee，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，8 8:4250-4254，1991）、ツメガエルVg-1（Weeksら，Cell，51:861-867，1987）、ヒトVgr-1（Celesteら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:9843-9847，1990）、ヒトOP-1（Ozkaynakら，EMBO J.，2:2085-2093,1990）、ヒトBMP-5（Celesteら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA,87:9843-9847，1990）、ショウジョウバエ60A（ Whartonら，Proc.Natl．Acad．Sci．USA，88:9214-9218，1991）、ヒトBMP-2及び4（Wozneyら，Science，242:1528-1534，1988）、ショウジョウバエDPP（Padg ettら，Nature，325:81-84，1987）、ヒトBMP-3（Wozneyら，Science，242:1528 -1534，1988）、ヒトMIS（Cateら，Cell，45:685-698，1986）,ヒトインヒビン α、βＡ、及びβB（Masonら，Biochem，Biophys．Res．Commun.，135:957-964 ，1986）、ヒトTGF-β１（Derynckら，Nature，316:701-705，1985）、ヒトTGF- β２（deMartinら，EMBOJ.，6:3673-3677，1987）、ヒトTGF-β3（ten Dijke ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:4715-4719，1988 ）、ニワトリTGF-β4（Jakowlewら，Mol．Endocrinol.，2:1186-1195，1988）、並びにツメガエルTGF-β5（Kondaiahら，J．Biol．Chem.，265:1089-1093，1990 ）の対応する領域との並列化を示すものである。保存システイン残基には影を付した。ダッシュは並列化を最大とするために入れたギャップである。図４は、TGF-βスーパーファミリー中の異なるメンバーの間のアミノ酸相同性を示す。数字は、第１の保存システインからC-末端まで計算した各対のアミノ酸の同一性のパーセントを表す。ボックスは、特定のサブグループ内の高度に関連したメンバーにおける相同性を示す。 GDF-3は、その他のファミリー全メンバーに保存されている７つのシステインの４番目のシステイン残基を欠いている。このシステイン残基は、TGF-β2の場合、成熟二量体において分子間ジスルフィド結合の形成に関与する唯一のシステインとして知られている（Daopinら，Science，257:369，1992；Schlunegger an dGrutter，Nature，358:430，1992）。従って、GDF-3は二量体を形成しないかもしれず、あるいは共有結合されていない二量体を形成し、ここではサブユニット間の相互作用が強力であり制御の主役となっているかもしれない。GDF-3配列は、第１の保存システインの４アミノ酸上流に別のシステイン残基を含んでいる。別のシステイン残基を含むファミリーのメンバーとしてはTGF-β類及びインヒビンβ類しか知られておらず、これらはそれぞれ２つの別のシステイン残基を含んでいる。TGF-β2の場合、これらの別のシステイン残基は分子間ジスルフィド結合を形成するものとして知られている（Daopin、上出）。GDF-3は単一の別のシステイン残基を含んでいるので、GDF-3は対を形成しないシステインを含む唯一のファミリーのメンバーであるようである。あるいは、GDF-3はホモ二量体あるいは他のファミリーのメンバーとのヘテロ二量体としてジスルフィド結合二量体を形成し、この別のシステインが分子間のジスルフィド結合の形成に関与するとも考えられる。実際、GDF-3の全体の構造がTGF-β2のものと同様であるとすると、この余分なシステインの「手」の「親指」における位置（Daopin、前掲）はそのような役割に合致する。実施例３ヒト-GDF-3の単離実施例１に記載したのと同じプライマー対（プライマーSJL 120及び121）を使用して、ヒトゲノムDNAによりPCR生成物を得たが、これはGDF-3に対して有意な相同性を示した（約82%のアミノ酸同一性、図５）。マウス及びヒトゲノムDNAのサザン分析は、0.9M 塩化ナトリウム、50 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0）、10m M EDTA、10%硫酸デキストラン、50%ホルムアミド、1%SDS、200μg/mlサケ精巣DN A並びにウシ血清アルブミン、フィコール及びポリビニルピロリドンのそれぞれ0 .1%中で、37℃で行った。図６に示したように、プローブがマウスGDF-3配列に由来する場合も、あるいは高度に関連するヒト配列に由来する場合も、ハイブリダイゼーションバンドの同じパターンが得られた。従って、データは図５に示したヒト配列がヒトGDF-3であることを示している。本発明を現時点で好ましい態様を引用して説明したが、本発明の概念を逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されるべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。配列の要約配列番号１は、GDF-3のためのPCRプライマー、SJL 120のヌクレオチド配列である。配列番号２は、GDF-3のためのPCRプライマー、SJL 121のヌクレオチド配列である。配列番号３は、プライマーSJL 120によりコードされたアミノ酸配列である。配列番号４は、プライマーSJL 121によりコードされたアミノ酸配列である。配列番号５は、マウスGDF-3についてのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。配列番号６は、マウスGDF-3についての推定アミノ酸配列である。配列番号７は、GDF-3のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号８は、GDF-9のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号９は、GDF-1のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号10は、Vg-1のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号11は、Vgr-1のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号12は、OP-1のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号13は、BMP-5のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号14は、60AのC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号15は、BMP-2のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号16は、BMP-4のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号17は、DPPのC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号18は、BMP-3のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号19は、MISのC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号20は、インヒビン−αのC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号21は、インヒビン−βAのC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号22は、インヒビン−βＢのC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号23は、TGF-β1のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号24は、TGF-β2のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号25は、TGF-β3のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号26は、TGF-β4のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号27は、TGF-β5のC-末端領域のアミノ酸配列である。配列番号28は、ヒトGDF-3のヌクレオチド配列である。配列番号29は、ヒトGDF-3の推定アミノ酸配列である。配列表配列番号：１配列の長さ：41塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA（genomic）直接の起源クローン：SJL120 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..41 他の情報：Ｒが存在する場合、Ｒ＝アデニンまたはグアニン；Ｎ＝イノシン；Ｙ＝チミンまたはシトシン；Ｍ＝アデニンまたはシトシン配列配列番号：２配列の長さ：42塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA（genomic）直接の起源クローン：SJL121 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..42 他の情報：Ｒが存在する場合、Ｒ＝グアニンまたはアデニン；Ｎが存在する場合、Ｎ＝イノシン；Ｙが存在する場合、Ｙ＝チミンまたはシトシン配列配列番号：３配列の長さ：11アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド直接の起源クローン：SJL120 配列の特徴特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..12 他の情報：Argが存在する場合、Arg＝ArgまたはSer； Ileが存在する場合、Ile＝IleまたはMet 配列配列番号：４配列の長さ：11アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド直接の起源クローン：SJL121 配列の特徴特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..11 配列配列番号：５配列の長さ：1280塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA（genomic）直接の起源クローン：GDF-3 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：122..1219 配列配列番号：６配列の長さ：366アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７配列の長さ：117アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：GDF-3 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..117 配列配列番号：８配列の長さ：118アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：GDF-9 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..118 配列配列番号：９配列の長さ：122アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：GDF-1 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..122 配列配列番号：10 配列の長さ：118アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：Vg-1 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..118 配列配列番号：11 配列の長さ：118アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：Vgr-1 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..118 配列配列番号：12 配列の長さ：118アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：OP-1 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..118 配列配列番号：13 配列の長さ：118アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：BMP-5 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..118 配列配列番号：14 配列の長さ：118アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：60A 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..118 配列配列番号：15 配列の長さ：117アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：BMP-2 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..117 配列配列番号：16 配列の長さ：117アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：BMP-4 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..117 配列配列番号：17 配列の長さ：118アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：DPP 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..118 配列配列番号：18 配列の長さ：119アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：BMP-3 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..119 配列配列番号：19 配列の長さ：115アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：MIS 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..115 配列配列番号：20 配列の長さ：121アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：Inhibin α 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..121 配列配列番号：21 配列の長さ：121アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：Inhibin βA 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..121 配列配列番号：22 配列の長さ：120アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：Inhibin βB 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..120 配列配列番号：23 配列の長さ：114アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：TGF-β1 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..114 配列配列番号：24 配列の長さ：114アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：TGF-β2 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..114 配列配列番号：25 配列の長さ：114アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：TGF-β3 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..114 配列配列番号：26 配列の長さ：116アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：TGF-β4 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..116 配列配列番号：27 配列の長さ：114アミノ酸配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質直接の起源クローン：TGF-β5 配列の特徴特徴を表す記号：protein 存在位置：1..114 配列配列番号：28 配列の長さ：201塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：DNA（genomic）直接の起源クローン：GDF-3 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..201 配列配列番号：29 配列の長さ：67アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｅ 9284−4ＣＴ 9284−4Ｃ 48/00 8314−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｋ 14/52 8318−4Ｈ 16/24 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋な増殖分化因子−３（ＧＤＦ−３）およびその機能性フラグメント。２．請求項１のＧＤＦ−３ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。３．前記のポリヌクレオチドが哺乳動物細胞から単離されるものである、請求項２に記載のポリヌクレオチド配列。４．哺乳動物細胞がマウス、ラットおよびヒト細胞よりなる群から選ばれる、請求項３に記載のポリヌクレオチド配列。５．請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。６．前記のベクターがプラスミドである、請求項５に記載のベクター。７．前記のベクターがウイルスである、請求項５に記載のベクター。８．請求項５のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。９．前記の細胞が原核細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。 10．前記の細胞が真核細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。 11．請求項１のポリペプチドと反応性の抗体またはそのフラグメント。 12．前記の抗体がポリクローナルである、請求項11に記載の抗体。 13．前記の抗体がモノクローナルである、請求項11に記載の抗体。 14．請求項11の抗体を、ＧＤＦ−３関連疾患の疑いがある患者の標本と接触させ、該抗体の結合を検出することからなる、細胞増殖性疾患の検出方法。 15．前記の細胞が造血細胞である、請求項14に記載の方法。 16．細胞増殖性疾患が白血病である、請求項14に記載の方法。 17．検出をin vivoで行う、請求項14に記載の方法。 18．抗体が検出可能なように標識されている、請求項17に記載の方法。 19．検出可能な標識が放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物および化学発光化合物よりなる群から選ばれる、請求項18に記載の方法。 20．検出をin vitroで行う、請求項14に記載の方法。 21．抗体が検出可能なように標識されている、請求項20に記載の方法。 22．標識が放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物および酵素よりなる群から選ばれる、請求項21に記載の方法。 23．ＧＤＦ−３の発現に関連した細胞増殖性疾患の治療方法であって、該細胞とＧＤＦ−３活性を抑制する薬剤とを接触させることからなる方法。 24．前記の薬剤が抗ＧＤＦ−３抗体である、請求項23に記載の方法。 25．前記の薬剤がＧＤＦ−３アンチセンス配列である、請求項23に記載の方法。 26．前記の細胞が造血細胞である、請求項23に記載の方法。 27．細胞増殖性疾患が白血病である、請求項23に記載の方法。 28．ＧＤＦ−３活性を抑制する薬剤が運び屋を使って細胞に導入される、請求項 23に記載の方法。 29．前記の運び屋がコロイド分散系である、請求項28に記載の方法。 30．コロイド分散系がリポソームである、請求項29に記載の方法。 31．リポソームが本質的にターゲット特異的である、請求項30に記載の方法。 32．リポソームが解剖学的にターゲティング（標的設定）される、請求項31に記載の方法。 33．リポソームが機械学的にターゲティングされる、請求項32に記載の方法。 34．機械学的ターゲティングが受動的である、請求項33に記載の方法。 35．機械学的ターゲティングが能動的である、請求項33に記載の方法。 36．リポソームが糖、糖脂質およびタンパク質よりなる群から選ばれる成分と結合することにより能動的にターゲティングされる、請求項35に記載の方法。 37．タンパク質成分が抗体である、請求項36に記載の方法。 38．前記の運び屋がウイルスである、請求項37に記載の方法。 39．前記のウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項38に記載の方法。 40．ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項39に記載の方法。 41．レトロウイルスが本質的にターゲット特異的である、請求項40に記載の方法。 42．ターゲット特異性のための成分がレトロウイルスゲノムに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされる、請求項41に記載の方法。 43．ターゲット特異性のための成分が糖、糖脂質およびタンパク質よりなる群から選ばれる、請求項42に記載の方法。 44．前記のタンパク質が抗体である、請求項43に記載の方法。