JPH08506018A

JPH08506018A - Ｇ−ｃｓｆ類似体組成物及び方法

Info

Publication number: JPH08506018A
Application number: JP6517294A
Authority: JP
Inventors: オスランド，テイモシー・デイ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1993-01-28
Filing date: 1994-01-25
Publication date: 1996-07-02
Also published as: IL145994A0; ZA94568B; US5581476A; AU697451B2; US5790421A; FI123078B; FI20090384L; ES2422269T3; JP2009057368A; FI953593L; ES2382927T3; EP2345724B1; KR100390338B1; DE69425516D1; JP2006096762A; US8058398B2; NO952974D0; IL108446A0; KR100375274B1; PT1482046E

Abstract

(57)【要約】本発明は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）類似体、該類似体をを含む組成物及び関連組成物を提供する。別の態様では、その類似体をコードする核酸又は関連核酸、関連宿主細胞及びベクターを提供する。更に別の態様では、Ｇ−ＣＳＦ及びその類似体の三次元構造を表現するためのコンピュータープログラム及び装置を提供する。別の態様では、Ｇ−ＣＳＦ類似体及び関連組成物を合理的に設計するための方法を提供する。更に別の態様では、本発明のＧ−ＣＳＦ類似体を使用した治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｇ−ＣＳＦ類似体組成物及び方法発明の属する技術分野本発明は顆粒球コロニー刺激因子（“Ｇ−ＣＳＦ”）類似体、前記類似体を含む組成物、及び関連組成物に関する。別の態様によると、本発明は本発明の類似体をコードする核酸又は関連核酸、関連宿主細胞及びベクターに関する。別の態様によると、本発明はＧ−ＣＳＦ及びその類似体の三次元構造を表現するためのコンピュータープログラム及び装置に関する。別の態様によると、本発明はＧ− ＣＳＦ類似体及び関連組成物を合理的に設計するための方法に関する。更に別の態様によると、本発明は本発明のＧ−ＣＳＦ類似体を使用する治療方法に関する。背景技術造血は、骨髄微小環境内の細胞と成長因子との２つの系により制御される。成長因子はコロニー刺激因子とも呼称され、前駆細胞を刺激して増殖させ、分化性血球のコロニーを形成する。本明細書中でＧ−ＣＳＦと呼称する顆粒球コロニー刺激因子はこれらの因子の１種であり、好中球の成長及び発生を優先的に刺激するので、好中球減少症に使用できると予想される。Ｗｅｌｔｅら，ＰＮＡＳ−ＵＳＡ８２：１５２６− １５３０（１９８５）；Ｓｏｕｚａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：６１−６５（１９８６）及びＧａｂｒｉｌｏｖｅ，Ｊ．ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ２６：（２）１−１４（１９８９）。ヒトでは血漿中に内因性Ｇ−ＣＳＦが検出可能である。Ｊｏｎｅｓら，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓＣｌｉｎｉｃａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ２（１）：８３−１１１（１９８９）。Ｇ−ＣＳＦは繊維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞トロホブラスト、内皮細胞及び上皮細胞により産生され、１７番染色体に位置する４個のエキソンと５個のイントロンから構成される単一コピー遺伝子の発現産物である。この遺伝子座の転写により生成されるｍＲＮＡ種は示差的プロセッシングを受け、１７７アミノ酸のタンパク質をコードする形態と１７４アミノ酸のタンパク質をコードする形態との２形態のＧ−ＣＳＦｍＲＮＡをもたらし（Ｎａｇａｔａら，ＥＭＢＯＪ５：５７５−５８１（１９８６））、１７４アミノ酸からなる形態は最大のｉｎｖｉｖｏ生物比活性を有することが判明した。Ｇ −ＣＳＦは種交差反応性であるため、ヒトＧ−ＣＳＦを例えばマウス、イヌ又はサル等の別の哺乳動物に投与すると、持続的な好中球白血球増加症が誘発される。Ｍｏｏｒｅら，ＰＮＡＳ−ＵＳＡ８４：７１３４−７１３８（１９８７）。ヒトＧ−ＣＳＦは多数の起源から取得及び精製できる。天然ヒトＧ−ＣＳＦ（ｎｈＧ−ＣＳＦ）は培養ヒト腫瘍細胞系の上清から単離することができる。組換えＤＮＡ技術の発達（例えば参考資料として本明細書の一部とする米国特許第４，８１０，６４３号（Ｓｏｕｚａ）参照）により、真核宿主細胞発現産物としてグリコシル化形態のＧ−ＣＳＦ及び原核宿主細胞発現産物として非グリコシル化形態のＧ−ＣＳＦを商業規模の量で生産することが可能になった。Ｇ−ＣＳＦは、好中球の増加が有益であるような症状の治療に有用であることが判明した。例えば癌患者にとってＧ−ＣＳＦは、化学療法又は放射線療法に起因する造血欠損を補償するために好中球産生を選択的に刺激する手段として有益である。この他に、細菌代謝物により主に誘発される種々の感染症及び関連症状（例えば敗血症）の治療にも使用できる。更に例えば骨髄移植の目的で培養細胞を成長又は増殖させるために、Ｇ−ＣＳＦを単独使用又は他の化合物（例えば他のサイトカイン）と併用しても有用である。Ｇ−ＣＳＦの細胞代謝過程であるシグナル変換は現在、十分に解明されていない。個々の前駆細胞内に変化を誘発すると思われる細胞表面レセプターにＧ−ＣＳＦが結合し、細胞分化に至ると考えられる。種々の改変Ｇ−ＣＳＦが報告されている。一般に、薬剤を設計するためには、ある種の構造効果を及ぼすように特定の改変を加えることが知られている。例えば、１個のシステインを欠失させると、未改変状態では通常はジスルフィド結合を介して折り畳まれている分子が解放される。この他に、タンパク質の機能を変えるために、アミノ酸を付加、欠失又は置換させる方法も知られている。組換えヒトＧ−ＣＳＦ突然変異体は製造されているが、その製造方法は全体構造／機能関係情報を考慮していない。例えば、Ｃｙｓ１８の突然変異及び生化学的修飾が報告されている。Ｋｕｇａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ１５９：１０３−１１１（１９８９）；Ｌｕら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６８：８１−９２（１９８９）。（上記）米国特許第４，８１０，６４３号（発明の名称「多能性顆粒球コロニー刺激因子の製造」）には、Ｇ−ＣＳＦのポリペプチド類似体及びペプチドフラグメントが広く開示されている。特定のＧ−ＣＳＦ類似体としては、（１７４アミノ酸種又はこれにＮ末端メチオニンを付加した１７５アミノ酸種の）１７、３６、４２、６４及び７４位のシステインを別のアミノ酸（例えばセリン）で置換した類似体や、最初の（Ｎ末端）位置にアラニンを有するＧ−ＣＳＦが開示されている。ヨーロッパ特許第０３３５４２３号（発明の名称「改変ヒトＧ−ＣＳＦ」）は、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドにおける少なくとも１個のアミノ酸の修飾を開示しているらしい。ヨーロッパ特許第０２７２７０３号（発明の名称「新規ポリペプチド」）は、Ｎ末端又はその「近傍」のアミノ酸を置換又は欠失させたＧ−ＣＳＦ誘導体を開示しているらしい。ヨーロッパ特許第０４５９６３０号（発明の名称「ポリペプチド」）は、天然に存在するＧ−ＣＳＦの生物学的特性の少なくとも１種と５ｍｇ／ｍｌで少なくとも３５％の溶液安定性とを有する天然に存在するＧ−ＣＳＦの誘導体を開示している模様であり、該誘導体は、少なくとも天然配列のＣｙｓ¹⁷がＳｅｒ¹⁷残基で置換され、天然配列のＡｓｐ²⁷がＳｅｒ²⁷残基で置換されている。ヨーロッパ特許第０２５６８４３号（発明の名称「Ｇ−ＣＳＦとそのムテインの発現及びその使用」）は、タンパク質のアミノ酸配列を変えずに組換え宿主におけるタンパク質の発現を強化するようにＮ末端を修飾した、Ｇ−ＣＳＦをコードする改変ＤＮＡ配列を開示しているらしい。ヨーロッパ特許第０２４３１５３号（発明の名称「ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質発現」）は、少なくとも１個の酵母ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を不活性化することによりＧ−ＣＳＦを修飾すると、酵母を使用した組換え生産収率を増加できると開示しているらしい。Ｓｈａｗの米国特許第４，９０４，５８４号（発明の名称「ポリペプチドの部位特異的均質改変」）はリジン改変タンパク質を開示しているらしい。ＷＯ／９０１２８７４号は、タンパク質のシステイン改変変異体を開示しているらしい。オーストラリア特許出願第ＡＵ−Ａ−１０９４８／９２号（発明の名称「組換えタンパク質の活性化の改善」）は、原核発現後の分子の折り畳みの助長を目的としてＧ−ＣＳＦ分子の各末端にアミノ酸を付加することを開示しているらしい。オーストラリア特許出願第ＡＵ−Ａ−７６３８０／９１号（発明の名称「顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のムテイン」）は、１７４アミノ酸を有するＧ−ＣＳＦの５０〜５６位及び１７７アミノ酸を有するＧ−ＣＳＦの５３〜５９位の配列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ、及び／又は１７４アミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの４３、７９、１５６及び１７０位もしくは１７７アミノ酸を有する成熟Ｇ−ＣＳＦの４６、８２、１５９及び１７３位の４個のヒスチジン残基の少なくとも１個における顆粒球刺激因子Ｇ−ＣＳＦのムテインを開示しているらしい。英国特許第２２１３８２１号（発明の名称「合成ヒト顆粒球コロニー刺激因子遺伝子」）は、選択された領域のカセット突然変異誘発を助長するための制限部位と、所望の発現系への遺伝子の組み込みを助長するためのフランキング制限部位とを含む合成Ｇ−ＣＳＦコーディング核酸配列を開示しているらしい。Ｇ−ＣＳＦは、ある程度まで結晶化されたと報告されており（例えばヨーロッパ特許第３４４７９６号）、Ｇ−ＣＳＦの全体構造は推定されているが、粗レベルに止まっている。Ｂａｚａｎ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ１１：３５０−３５４（１９９０）；Ｐａｒｒｙら，Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ８：１０７−１１０（１９８８）。Ｇ−ＣＳＦの全体構造は未だ報告されておらず、また、Ｇ−ＣＳＦ類似体の体系的設計には分子の全体構造と機能の関係の体系的研究が必須であるが、このような研究も報告されていない。従って、Ｇ−ＣＳＦ類似体のこの体系的設計方法及び該方法により得られる組成物が必要とされている。発明の要約本発明により、Ｇ−ＣＳＦの三次元構造は原子レベルまで決定されるに至った。この三次元構造から、Ｇ−ＣＳＦ分子の組成がどのように変化すると構造変化を生じるかをかなり確実に予想することができる。これらの構造特性を生物活性と相関させると、Ｇ−ＣＳＦ類似体を設計及び製造することができる。Ｇ−ＣＳＦの三次元構造については他にも考察されている（Ｂａｚａｎ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ１１：３５０−３５４（１９９０）；Ｐａｒｒｙら，Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ８：１０７− １１０（１９８８））が、推定構造が不正確（Ｐａｒｒｙら，前出）及び／又は推定構造から構成部分と構造の相関の詳細が得られないという理由により、これらの考察はＧ−ＣＳＦ類似体を製造しようと意図する人々には何ら役立たなかった。三次元構造を原子レベルまで決定するという本発明の構造分析は従来の最も完全な分析よりも遥かにすぐれており、Ｇ−ＣＳＦ類似体を設計及び製造しようとする人々に重要な情報を提供する。例えば、本発明の三次元構造分析から、厳密な疎水性及び親水性領域が決定された。相対疎水性は分子の安定性に直接関係するので重要である。一般に、水性環境中に存在する生物分子は外部が親水性であり、内部が疎水性であり、熱力学の第２法則によると、これは最低エネルギー状態であり、安定性を提供する。Ｇ−ＣＳＦの内部コアは疎水性であり且つ外部領域は親水性であると予想することができるが、特定の疎水性又は親水性領域を知る術はなかった。本発明により提供された疎水性／親水性領域の知識に基づき、Ｇ−ＣＳＦ分子のどのような変化が分子の全体構造に影響するかをかなり確実に予想することができる。一般に、Ｇ−ＣＳＦ全体構造を変化させずに生物活性を変化させるような類似体を設計するために、疎水性及び親水性領域の位置の知識を使用することができる（本明細書中では「生物活性」なる用語は機能を表すために最も広義に使用する）。生物活性を構造に相関させることができる。構造が変化せず且つ突然変異が生物活性に影響しないならば、突然変異は生物学的機能をもたない。他方、構造が変化せず且つ突然変異が生物活性に影響するならば、残基（又は原子）は少なくとも１種の生物学的機能に不可欠である。本発明の実施例のいくつかは全体構造を変えずに生物学的機能を変化させるように意図した。構造と生物活性との相関に基づき、本発明の１態様はＧ−ＣＳＦ類似体に関する。これらの類似体は、非常に少数のアミノ酸残基をＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と相異させるか又は改変した分子である。改変は１個以上のアミノ酸残基の付加、置換又は欠失であり得る。改変は、アミノ酸自体の類似体（例えばペプチド類似体）又は改変部分（例えば改変側基）を有するアミノ酸の付加又は置換を含み得る。比較の基準として使用されるＧ−ＣＳＦはヒト、動物又は組換え核酸技術起源であり得る（本明細書中の実施例は付加的Ｎ末端メチオニル残基を有するヒトＧ−ＣＳＦの１７４アミノ酸種の組換え製造に基づく）。類似体は天然ヒトＧ−ＣＳＦ分子と異なる機能を有してもよいし、同一機能を示してもよいし、同一機能を別程度で示してもよい。例えば、類似体は改変前よりも生物活性が高くても低くてもよいし、貯蔵寿命を延ばしてもよいし、安定性を低下させてもよいし、調合し易くしてもよいし、他の成分と結合しにくくしてもよい。類似体は造血活性をもたなくてもよく、従って、（例えばＧ−ＣＳＦの過産生の場合等のように）Ｇ−ＣＳＦ効果に対するアンタゴニストとして有用であり得る。本明細書中では本発明の類似体を便宜上タンパク質又はペプチドと呼称する場合もあるが、本発明はペプチド類似体又は化学的に修飾されたペプチド等の他の型の分子も包含する。別の態様によると、本発明はＧ−ＣＳＦ類似体を活性成分として含有する関連組成物に関する。本明細書中で使用する「関連組成物」なる用語は、Ｇ−ＣＳＦ類似体の存在を確認後に得られる組成物（例えば検出可能なラベルで標識したＧ−ＣＳＦ類似体、関連レセプター又は医薬組成物）を意味する。少なくとも１個のポリエチレングリコール分子を結合した類似体等の化学的に修飾したＧ−ＣＳＦ類似体も関連組成物とみなされる。例えば、検出可能なラベル（例えば蛍光、化学発光又は放射性分子）を結合したＧ−ＣＳＦ類似体を製造することができる。別の例は公知材料を使用して公知技術により調剤することが可能な医薬組成物である。例えば、参考資料として本明細書の一部とするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，第１８版（１９９０，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１８０４２）ｐｐ．１４３５−１７１２参照。一般に、組成は投与法、安定性、製法等の種々の因子及び他の因子に依存する。Ｇ−ＣＳＦ類似体は注射又は吸入による肺投与により投与することができる。本発明のＧ−ＣＳＦ類似体組成物には腸溶性剤形も使用可能であり、従って経口投与が有効であり得る。Ｇ−ＣＳＦ類似体をリポソーム又は他の送達用マイクロキャリヤーに組み込んでもよいし、ジェル又は他の徐放用組成物に配合してもよい。好適組成物は組成物の用途により異なるが、一般に天然Ｇ−ＣＳＦの生物活性の少なくとも１種を有するＧ−ＣＳＦ類似体の好適医薬組成物は皮下注射又は吸入による肺投与用に製造した組成物であり、各投与型毎の特定組成は類似体の特性に依存する。関連組成物の別の例は本発明の類似体のレセプターである。本明細書中で使用する「レセプター」なる用語は、本発明の類似体分子と選択的に結合する部分を意味する。例えば、抗体又はそのフラグメント又は「組換え抗体」（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５（１９８９））をレセプターとして使用することができる。（本発明は結合特異的レセプターを包含するが）選択的結合は特異的結合のみを意味するものではないものの、どちらかといえば結合はランダムではない。レセプターは細胞表面上又は細胞内もしくは細胞外に位置し、本発明の類似体の生物活性を提供、抑制又は局在化するように機能し得る。レセプター結合は類似体自体と間接的に関係する活性カスケードの始動メカニズムでもあり得る。本発明は更に前記レセプターをコードする核酸、該核酸を含むベクター及び該核酸を含む宿主細胞も包含する。関連組成物の別の例は、化学的部分を結合させたＧ−ＣＳＦ類似体である。一般に、化学修飾はタンパク質の生物活性又は抗原性を変えるか、又は他の特性を変えることができ、これらの因子は当業者に考慮されよう。上述のように、このような化学的部分の１例はポリエチレングリコールである。修飾は親水性もしくは疎水性ポリマー分子、脂肪酸分子、又は多糖分子の１種以上の付加を含み得る。化学修飾剤の例としては、ポリエチレングリコール、アルキルポリエチレングリコール、ＤＩ−ポリ（アミノ酸）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ピランコポリマー、酢酸／アシル化、プロピオン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、プルラン又はアガロースが挙げられる。Ｆｒａｎｃｉｓ，ＦｏｃｕｓｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ３：４−１０（Ｍａｙ１９９２）（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，ＭｏｕｎｔｖｉｅｗＣｏｕｒｔ，ＦｒｉｅｒｎＢａｒｎｅｔＬａｎｅ，ＬｏｎｄｏｎＮ２０ＯＬＤ，英国刊）参照。更に、化学修飾は付加的タンパク質もしくはその部分、細胞毒性物質又は抗体の使用を含み得る。化学修飾はレシチンも使用し得る。別の態様によると、本発明は前記類似体をコードする核酸に関する。核酸はＤＮＡ又はＲＮＡ又はその誘導体であり、典型的には適当な調節配列を含むファージ又はプラスミド等のベクターにクローニングされ、このベクターで発現される。核酸は、例えば診断又は予後の目的で（例えば放射性、化学発光又は蛍光ラベルを使用して）標識してもよい。核酸配列は、例えば細菌発現に好適なコドンを含むなどして発現に最適化することができる。核酸とその相補鎖及び、所望の類似体をコードするのを妨げないようなその改変体も本発明に含まれる。別の態様によると、本発明は本発明の類似体をコードする上記核酸を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は真核細胞でも原核細胞でもよく、発現系は糖基の結合（グリコシル化）（又は阻止）、分子の適正な折り畳み、組換え発現に付随するリーダー配列もしくは他の因子の付加又は欠失に関する追加の段階を含み得る。別の態様によると、本発明はこのような核酸配列の発現の型又は量を抑制又は変更するように機能するアンチセンス核酸に関する。これらの核酸は公知方法により製造することができる。本発明の別の態様によると、本発明の類似体をコードする核酸は、例えば類似体をコードする配列を含むベクターを受容体に導入し、類似体組成物を必要とする受容体の体内で核酸自体を発現させることにより、遺伝子療法の目的で使用することができる。まず最初にベクターを細胞等のキャリヤーに導入後、キャリヤーを受容体に導入する。このような発現は局在化してもよいし、全身でもよい。他のキャリヤーとしては、受容体への遺伝子移入を媒介するように機能し得る非天然に存在するキャリヤー（例えばリポソーム又は他のマイクロキャリヤーもしくは粒子）が挙げられる。本発明は更に、Ｇ−ＣＳＦ又は類似体の三次元構造を表現（例えば視覚表示）するためのコンピュータープログラム及び、Ｇ−ＣＳＦ分子の各成分の存在と全体構造内の原子レベルまでの該成分の厳密な位置を表現するコンピュータープログラムを提供する。このようなプログラムの１例を以下に説明する。分子の三次元構造を表現するためのコンピュータープログラムは多数のものが現在市販されている。一般に、これらのプログラムは分子の三次元構造の座標（即ちｘ、ｙ及びｚ軸に沿うＧ−ＣＳＦ分子の各原子の数値帰属）の入力手段、前記座標の表現手段（例えば視覚表示）、前記座標の修正手段、及びこのような修正座標を有する分子の画像の表現手段を提供する。結晶情報即ち、Ｇ−ＣＳＦ分子の結晶分析から得られた三次元空間におけるＧ−ＣＳＦ分子の原子の位置の座標をプログラムすると、Ｇ−ＣＳＦ三次元構造の表現（例えば視覚表示）のためのコンピュータープログラムを作成することができる。従って、Ｇ−ＣＳＦ類似体三次元構造の表現用コンピュータープログラムも提供される。ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに所在のＢｉｏｓｙｍから市販されているコンピュータープログラムＩｎｓｉｇｈｔＩＩ，ｖｅｒｓｉｏｎ４に図５に示すような座標を入力すると好適である。好適表現手段としては、ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓ３２０ＶＧＸコンピューターでＧ−ＣＳＦ分子又はその類似体を立体的に観察することが可能なＣｒｙｓｔａｌＥｙｅｓ眼鏡（ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓの市販品）を着用する。また、本発明のＧ−ＣＳＦ結晶座標及び回折データは、米国、Ｕｐｔｏｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ１１９７２３に所在のＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ，ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙに寄託されている。これらのデータを使用してＧ−ＣＳＦ分子又はその類似体の三次元構造の表現用の別のコンピュータープログラムを作成することもできる。従って、本発明の別の態様は、Ｇ−ＣＳＦ分子の三次元構造の表現用コンピュータープログラムである。Ｇ−ＣＳＦ分子の三次元構造の視覚表示用コンピュータープログラムも提供され、更に、該プログラムはこのような視覚表示を変更するための手段を有する。このようなコンピュータープログラムの表現に有用な装置、特にＧ−ＣＳＦ分子又はその類似体の前記三次元構造のコンピューター画像の視覚表示に有用な装置と、前記コンピュータープログラム及び装置を製造するための手段も提供される。Ｇ−ＣＳＦ分子上の被改変特定部位を選択することができ、この改変がＧ−ＣＳＦ分子の全体構造に及ぼす影響を容易に確認することができるので、コンピュータープログラムはＧ−ＣＳＦ類似体を製造するために有用である。前記被改変部位の選択は、Ｇ−ＣＳＦ類似体の所望の生物特性に依存する。前記Ｇ −ＣＳＦ分子（ｒ−ｍｅｔ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ）をランダムに改変したならば、１７５²⁰通りもの置換が考えられ、複数の置換、付加又は欠失を有する類似体の数は更に多い。分子の組成と相関させながら三次元構造を観察することにより、改変部位をランダムに選択する必要がなくなり、改変部位を合理的に決定することができる。上述のように、各成分の原子レベルまでの位置決定を含めてＧ−ＣＳＦの三次元構造が確認されたので、どの部分がＧ−ＣＳＦ分子の全体構造を維持するために必要であるかに関する情報を得られるようになった。従って、本発明のＧ−ＣＳＦ類似体の製造時にＧ−ＣＳＦ分子の全体構造を維持すべきか、又は本発明のＧ−ＣＳＦ類似体の製造時にＧ−ＣＳＦ分子の全体構造を変更すべきか（及びどのように変更すべきか）を選択することができる。場合により、このような類似体を製造後、このような類似体が所望の特性を有するか否かを試験することができる。例えば、非改変天然又は組換えＧ−ＣＳＦ分子の全体構造を維持しようとすることができる。全体構造を図２、３及び４に示し、以下に詳細に説明する。全体構造の維持により、天然Ｇ−ＣＳＦの造血能を有する類似体に必要な特性であるレセプター結合を確保することができる（レセプター結合が存在しないならば、類似体の存在からシグナル変換は行われない）。あるクラスのＧ−ＣＳＦ類似体は天然又は組換え（非改変）Ｇ−ＣＳＦ分子の三次元コア構造を有しながら、好中球を選択的に刺激する能力の増加等の別の特性も有すると予想される。別のクラスのＧ−ＣＳＦ類似体は別の全体構造を有する類似体であり、Ｇ−ＣＳＦ類似体分子とＧ−ＣＳＦレセプターの結合能が低く、非改変天然又は組換えＧ−ＣＳＦに比較して好中球を選択的に刺激する能力が低い。例えば、こうしてＧ−ＣＳＦ分子の内部領域内のどの部分が疎水性であるかが分かり、これに対応してＧ−ＣＳＦ分子の外部のどの分子が親水性であるかが分かる。好ましくは本発明のように原子レベルまで全体三次元構造を認識できなければ、この疎水性内部領域内のどの改変が分子の全体構造コンフォーメーションの変化をもたらすかを予測することはできない。全体構造が変化すると、例えばレセプター結合の欠損等の機能的変化が生じ、従って、非改変Ｇ−ＣＳＦに認められるような生物活性の低下が生じ得る。従って、別のクラスのＧ−ＣＳＦ類似体は、（非改変）天然又は組換えＧ−ＣＳＦと同一の疎水性を有するＧ−ＣＳＦ類似体である。より特定的には、別のクラスのＧ−ＣＳＦ類似体は、（非改変）天然又は組換えＧ−ＣＳＦの疎水性部分と同一の疎水性部分をその内部コアの４螺旋束の内側に有しており、且つ前記非改変天然又は組換えＧ −ＣＳＦとは異なる組成を有する。別の例は、Ｇ−ＣＳＦ分子の内部コア（螺旋）と結合する構造である外部ループに関する。アミノ酸残基の空間位置に関する情報を含む三次元構造から、特定のループにおける特定の変化は全体的コンフォーメーション変化をもたらさないと予想することができる。従って、本発明の別のクラスのＧ−ＣＳＦ類似体は、改変外部ループを有しており且つ（非改変）天然又は組換えＧ−ＣＳＦと同一の全体構造を有する。より特定的には、本発明の別のクラスのＧ−ＣＳＦ類似体は改変外部ループを有しており、該ループは本明細書中のループ及び螺旋の表記に従い、螺旋Ａ及びＢの間、螺旋Ｂ及びＣの間、螺旋Ｃ及びＤの間、螺旋Ｄ及びＡの間に存在するループから選択される。より特定的には、前記ループ、好ましくはＡＢループ及び／又はＣＤループは該ループを安定化させることにより分子の半減期を増加させるように改変されている。このような安定化は、前記ループの全部又は一部をＧ−ＣＳＦ（又は類似体）分子のコアに存在するα螺旋束の一部と結合することにより得られる。このような結合は、 βシート、塩架橋、ジスルフィド結合、疎水性相互作用又は当業者に使用可能な他の結合手段を介して実施され、このような結合手段は前記外部ループを安定化するように機能する。例えば、ＡＢループを分子の内部領域内の螺旋の１つと結合することによりＡＢ又はＣＤループを安定化させることができる。Ｎ末端は内部螺旋の構造安定性に影響しないので、Ｎ末端を改変してもＧ−ＣＳＦ分子の全体構造は変化せず、外部ループは改変には好適であるが、同一の一般論がＮ末端にも当てはまる。また、（非改変）天然又は組換えＧ−ＣＳＦではこのような外部ループは比較的フレキシブルであり、レセプター結合を妨げない傾向があるので、このような外部ループは化学的修飾部位となり得る。従って、更に化学的部分を直接結合（又は化学的結合手段として機能する別の化学的部分を介して間接結合）する余地がある。化学的部分は、Ｇ−ＣＳＦ分子の１種以上の機能の変更に使用可能な種々の部分から選択することができる。例えば、外部ループはポリエチレングリコール分子等のような血清半減期を増加させるように機能する１種以上のポリマーを添加するための部位を提供し得る。このようなポリエチレングリコール分子を加え、ポリエチレングリコール部分と結合可能な反応性側基を有する付加的リジンを含むように前記ループを改変させることができる。他のクラスの化学的部分も１個以上のループに結合することができ、このような化学的部分の非限定的な例としては、他の生物活性分子（例えばレセプター）、他の治療用タンパク質（例えばハイブリッド分子をもたらす他の造血因子）、又は細胞毒性物質（例えばジフテリア毒素）が挙げられる。当然これらの例に留まることなく、所望の化学的部分を有する当業者は、該所望の部分を所望の外部ループに結合することができる。従って、別のクラスの本発明のＧ−ＣＳＦ類似体は、少なくとも１個のポリエチレングリコール分子等の化学的部分を付加する少なくとも１つの改変を外部ループに有する類似体を含む。欠失（例えば分子の分解のためにタンパク質により認識される部位の欠失）も外部ループに有効であり得る。こうして、一方ではＧ−ＣＳＦレセプター結合及びシグナル変換能（即ち好中球の突然変異を選択的に刺激する能力）を有する分子の半減期を増加することができる。従って、別のクラスの本発明のＧ−ＣＳＦ類似体は、プロテアーゼによる前記類似体の代謝回転を低下させる少なくとも１つの改変を外部ループに有する類似体を含む。この改変に好適なループはＡＢループ及びＣＤループである。（以下に詳細に説明する）外部ループに存在するアミノ酸残基の一部を欠失させることにより短縮Ｇ−ＣＳＦ分子を製造することができ、該短縮Ｇ−ＣＳＦ分子は製造又は生物学的機能に付加的利点を有する。別の例は、相互に近接するアミノ酸残基間の相対電荷に関する。上述のように、Ｇ−ＣＳＦ分子は比較的密に充填された４螺旋束を含む。螺旋上の面のいくつかは他の螺旋に向き合う。螺旋が別の螺旋に向き合う点（例えば残基）において、相互に向き合う２つのアミノ酸分子は同一電荷を有することができ、従って、相互に反発しあい、分子全体を不安定にする。これは、反発が生じないようにアミノ酸部分の一方又は両方の電荷を（逆電荷又は中性電荷に）変えることによりこれを解決することができる。従って、別のクラスのＧ−ＣＳＦ類似体は、電荷位置等の表面相互作用による不安定を修正するように改変されたＧ−ＣＳＦ類似体を含む。別の態様によると、本発明はＧ−ＣＳＦ類似体及び関連組成物の設計方法並びに該方法の産物に関する。前記方法の終産物は上記Ｇ−ＣＳＦ類似体又は関連組成物であり得る。例えば、本明細書中に開示する実施例は、（ａ）Ｇ−ＣＳＦ分子の成分（即ち化学的部分）の改変がＧ−ＣＳＦ構造に及ぼす作用及び（ｂ）構造変化が生物学的機能に及ぼす作用を立証する。従って、本質的に本発明の別の態様は、（ａ）Ｇ−ＣＳＦ分子の各アミノ酸残基又は各アミノ酸残基の各原子等の化学的部分を相関させたＧ−ＣＳＦ分子の三次元構造を含む情報を観察する段階と、（ｂ）前記情報からＧ−ＣＳＦ分子上の被改変部位を選択する段階と、（ｃ）このような改変を有するＧ−ＣＳＦ類似体分子を製造する段階と、（ｄ）任意に、このようなＧ−ＣＳＦ類似体分子が所望の特性を有するか否かを試験する段階とを含むＧ−ＣＳＦ類似体の製造方法である。本発明のコンピュータープログラムは、コンピューターに基づくＧ−ＣＳＦ類似体の製造方法に使用することができる。従って、本発明の別の態様は、（ａ）Ｇ−ＣＳＦ分子の各アミノ酸残基又は各アミノ酸残基の各原子等の化学的部分と相関させたＧ−ＣＳＦ分子の三次元構造のコンピューター表現を提供する段階と、（ｂ）前記情報からＧ−ＣＳＦ分子上の被改変部位を選択する段階と、（ｃ）このような改変を有するＧ−ＣＳＦ分子を製造する段階と、（ｄ）任意に、このようなＧ−ＣＳＦ分子が所望の特性を有するか否かを試験する段階とを含む、コンピューターに基づくＧ−ＣＳＦ類似体の製造方法である。より特定的には本発明は、（ａ）（ｉ）Ｇ−ＣＳＦ分子の座標を三次元空間に表示し且つ（ｉｉ）前記Ｇ− ＣＳＦ表現の変更及びその観察のための情報を入力できるようにプログラムされたコンピューターを介してＧ−ＣＳＦ分子の三次元構造を観察する段階と、（ｂ）前記Ｇ−ＣＳＦ分子の前記視覚画像上の被改変部位を選択する段階と、（ｃ）前記コンピューターに前記改変のための情報を入力する段階と、（ｄ）前記コンピューターを介して前記改変Ｇ−ＣＳＦ分子の三次元構造を観察する段階と、（ｅ）任意に段階（ａ）〜（ｅ）を繰り返す段階と、（ｆ）前記改変を有するＧ−ＣＳＦ類似体を製造する段階と、（ｇ）任意に前記Ｇ−ＣＳＦ類似体が所望の特性を有するか否かを試験する段階とを含む、Ｇ−ＣＳＦ類似体の製造方法を提供する。別の態様によると、本発明は本発明のＧ−ＣＳＦ類似体及び関連組成物の使用方法、並びに造血障害治療において単独又は他の造血因子もしくは薬剤と併用して哺乳動物を治療又は予防する方法に関する。Ｇ−ＣＳＦ類似体を設計する１態様は、非改変Ｇ−ＣＳＦが有するとして知られている特性を増加又は変更することを目的とすると意図される。例えば、本発明の類似体は強化又は変更された活性を有するので、Ｇ−ＣＳＦが（例えば）好中球減少症の治療に有用である場合には本発明の組成物及び方法は同様にこのような治療に使用することができる。別の例は、特に造血障害の治療で他の因子と併用した場合により有効に相互作用することを目的としたＧ−ＣＳＦの改変である。このような併用の１例は、初期作用性造血因子（即ち造血カスケードの初期に比較的未分化の細胞に対して作用する因子）の使用及び後期作用造血因子、例えばＧ−ＣＳＦ又はその類似体（Ｇ−ＣＳＦは好中球の選択刺激においてＣＦＵ−ＧＭ系に作用する）の同時又は順次使用である。本発明の方法及び組成物は、造血因子のこのような組み合わせ又は「カクテル」を使用する療法で有用である。本発明の組成物及び方法は、白血球減少症、骨髄性白血病、重度慢性好中球減少症、再生不能性貧血、糖原病、粘膜炎及び他の骨髄不全症状の治療にも有用である。本発明の組成物及び方法は、化学療法又は放射線療法に起因する造血欠損の治療にも有用であり得る。例えば骨髄移植の成功又は移植における末梢前駆血球の使用は、本発明の組成物（遺伝子療法の場合にはタンパク質又は核酸）及び方法を適用することにより増進することができる。本発明の組成物及び方法は、創傷治癒、火傷治療、菌血症、敗血症、真菌感染、心内膜炎、骨腎盂炎、腹部外傷に関連する感染、抗生物質に反応しない感染、肺炎等の感染症の治療にも有用であり、本発明の組成物及び方法を細菌炎症の治療に利用することもできる。更に、本発明の組成物及び方法は白血病細胞分化能の報告（Ｗｅｌｔｅら，ＰＮＡＳ−ＵＳＡ８２：１５２６−１５３０（１９８５））に基づき白血病の治療にも有用であり得る。。この他に、腫瘍細胞に結合するレセプター（例えば抗体）の任意存在下で本発明の組成物及び方法を使用して腫瘍個体を治療することもできる。治療用途に関する研究論文については、いずれも参考資料として本明細書の一部とするＬｉｅｓｈｈｋｅとＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：２８−３４及び９９−１０６（１９９２）を参照されたい。本発明の組成物及び方法は、他の部分の製造の中間体として使用するのにも有用であり、例えば、Ｇ−ＣＳＦは他の造血因子の生成に影響を及ぼすことが報告されており、（確認されたならば）この機能は本発明の組成物及び／又は方法により増進又は変更することができる。本発明のＧ−ＣＳＦ類似体に関連する組成物（例えばレセプター）は、Ｇ−ＣＳＦ又は類似体の活性を阻止するアンタゴニストとして作用するのにも有用である。非改変Ｇ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦ類似体の活性の一部又は全部を有する組成物を得ることができ、１種以上の化学的部分を付加してこのようなＧ−ＣＳＦ又は類似体の１種以上の特性を改変することができる。三次元コンフォーメーションの知識に基づき、所望の効果に達するためにこのような化学修飾の最良の幾何学的位置を予測することができる。化学修飾の一般目的としては、半減期の改善（例えば腎性クリアランス、免疫クリアランス又は細胞クリアランスの減少）、生物活性の変更（例えば酵素特性の変更、有機溶媒中の生物活性又は活性の分離）、毒性の低下（例えば毒性エピトープの隠蔽、区画化及び選択的生物分布）、免疫反応性の改変（免疫原性の低下、抗原性又はアジュバント作用の低下）、又は物性の低下（例えば溶解度の増加、熱安定性の改善、機械的安定性の改善又はコンフォーメーション安定化）が挙げられる。Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕs ｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ３：４−１０（Ｍａｙ１９９２）（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，ＭｏｕｎｔｖｉｅｗＣｏｕｒｔ，ＦｒｉｅｒｎＢａｒｎｅｔＬａｎｅ，ＬｏｎｄｏｎＮ２０ＯＬＤ，英国刊）参照。以下、実施例により本発明を非限定的に説明する。当業者は種々の変形及び変更が可能であり、請求の範囲は本発明の範囲に該当するこのような全等価態様を包含する。図面の詳細な説明図１は、付加的Ｎ末端メチオニンを有するＧ−ＣＳＦの１７４アミノ酸種のアミノ酸配列図である（配列番号１）（配列番号２）。図２は、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、ｐＧＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦ−Ｂ、ＩＬ−２及びＩＬ−４の結晶構造のトポロジー図である。これらの図は引用文献を参考にした。二次構造元素の長さは残基の数に比例して表した。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ螺旋はＧ−ＣＳＦについて本発明で使用する方式に従って分類した。ＩＮＦ−βについては、螺旋の元の分類を括弧内に示す。図３は、Ｇ−ＣＳＦの三次元構造の「リボン図」である。螺旋Ａはアミノ酸残基１１〜３９（上記図１による番号付け）、螺旋Ｂはアミノ酸残基７２〜９１、螺旋Ｃはアミノ酸残基１００〜１２３、螺旋Ｄはアミノ酸残基１４３〜１７３である。比較的短い３¹⁰螺旋はアミノ酸残基４５〜４８に位置し、α螺旋はアミノ酸残基４８〜５３に位置する。残基９３〜９５は左回り螺旋のほぼ１回転を形成する。図４は、Ｇ−ＣＳＦの三次元構造の「バレル図」である。Ｇ−ＣＳＦの三次元構造の全体円筒体とその向きを種々の濃淡で示す。数字は上記図１によるアミノ酸残基位置を示す。図５は、Ｇ−ＣＳＦの三次元構造のコンピューターによる視覚画像を生成するために使用される座標のリストである。座標は以下の通りである。各列は別個フィールドに対応する。（ｉ）（左側から）フィールド１は原子、（ｉｉ）フィールド２は帰属原子の番号、（ｉｉｉ）フィールド３は原子名（周期表標準命名法により、ＣＢは炭素原子β、ＣＧは炭素原子γ等である）、（ｉｖ）フィールド４は残基型（例えばＳｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｙ．１９８８、裏内表紙に示されるようなアミノ酸の三文字命名法による）、（ｖ）フィールド５〜７は原子のｘ軸、ｙ軸及びｚ軸位置、（ｖｉ）フィールド８（多くの場合には“１．００”）は前記位置における占有度、（ｖｉｉ）フィールド９はＢ因子、（ｖｉｉｉ）フィールド１０は分子表示を示す。Ｇ− ＣＳＦの３分子（ａ、ｂ及びｃ）は１単位として相互に結晶した。ａ、ｂ又はｃの表示はどの座標がどの分子に由来するかを示す。文字の後に記載した数字（１、２又は３）は、帰属アミノ酸残基位置を示し、分子Ａは１０〜１７５位を割り当てられ、分子Ｂは２１０〜３７５位を割り当てられ、分子Ｃは４１０〜５７５位を割り当てられている。これらの位置は、相互に結晶した３分子がオーバーラップしないように指定した。（Ｗ表示は水を表す）。図６は、結晶化に関与するパラメーターに関して結晶化マトリックスの最適化に使用されるストラテジーを示す。結晶化マトリックスは２４穴組織培養プレートのウェル中の結晶化溶液の成分（塩、緩衝液及び沈殿剤）の最終濃度に対応する。これらの濃度は、適量のストック溶液をマイクロタイタープレートのウェルにピペット分注することにより生成される。マトリックスを設計するために、結晶学者は成分の高低濃度を決定する。これらの高低濃度を行（例えばＡ１〜Ａ６、Ｂ１〜Ｂ６、Ｃ１〜Ｃ６又はＤ１〜Ｄ６）又は全トレー（Ａ１〜Ｄ６）に沿ってピペット分注することができる。前者方法は制限された数のウェルに沿って単一成分の結晶成長の再現性を調べるために有用であり、後者方法は初期スクリーニングで有用である。結晶化マトリックスの数段の最適化段階の結果を３つのプレートの図により示す。ウェルの色が濃いほど正の結晶化結果を表し、最終段階ではＸ線品質結晶であり、初期段階では約０．０５ｍｍ未満の寸法の油滴、顆粒状沈殿又は小結晶であり得る。Ａは最初のウェル（Ａ１）と最後のウェル（Ｄ６）の間の濃度範囲が広く且つウェル間の濃度増加が（（濃度Ａ１）−（濃度Ｄ６））／２３）として計算される１パラメーターの初期スクリーンを示す。Ｂは、濃度の結晶化マトリックス最適化の後期段階でＡ１とＤ６の間の差が縮まり、プレート当たりに形成される結晶が増加していることを示す。Ｃはプレートの大部分のウェルに高品質結晶が存在するマトリックス最適化の最終段階を示す。発明の詳細な説明本発明はＧ−ＣＳＦの三次元構造の知見に基づく。この三次元構造は立体的に観察するためのコンピュータープログラムにより表現された。これを立体的に観察することにより、構造−機能関係を認識し、Ｇ−ＣＳＦ類似体を設計及び製造した。Ｇ−ＣＳＦの三次元全体構造構造を確認するために使用したＧ−ＣＳＦは、細菌発現に付随する付加的Ｎ末端メチオニン残基を有する非グリコシル化１７４アミノ酸種であった。このＧ− ＣＳＦのＤＮＡ及びアミノ酸配列を図１に示す。全体として、Ｇ−ＣＳＦの三次元構造は主に螺旋状であり、１７５個の残基のうちの１０３個は４α螺旋束を形成する。他の二次構造は最初の２つの長い螺旋の間のループに存在し、４残基３¹⁰螺旋の直後には６残基α螺旋が存在する。図２に示すように、全体構造を他のタンパク質、即ち成長ホルモン（Ａｂｄｅｌ− Ｍｅｇｕｉｄら，ＰＮＡＳ−ＵＳＡ８４：６４３４（１９８７）及びＶｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３０５−３１２（１９９２））、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１７７９−１７８２（１９９１））、インターフェロン−β（Ｓｅｎｄａら，ＥＭＢＯＪ．１１：（３１９３−３２０１））、インターロイキン−２（ＭｃＫａｙＳｃｉｅｎｃｅ２５７：１６７３−１６７７（１９９２））、及びインターロイキン−４（Ｐｏｗｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１６７３−１６７７（１９９２）、及びＳｍｉｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２））に報告されている構造と比較した。アミノ酸配列は類似していないにも拘わらず、これらの成長因子間には構造類似性が存在する。構造情報はＧ−ＣＳＦ生化学の相関であり、これは以下のように要約することができる（配列位置１はＮ末端とする）。配列位置構造の特徴分析 1〜10 伸長鎖欠失により生物活性は低下しない。 Cys18 部分的に包埋 DTNB及びThimersososlに対しては反応性であるが、酢酸ヨードに対して非反応性。 34 択一的スプライス部位挿入により生物活性は低下しない。 20〜47 螺旋A、第1の中和抗体データに基づく推定レセプター（両端含む）ジスルフィド及び結合領域。 AB螺旋の部分 20,23,24 螺旋Λ 残基の単一アラニン突然変異により生物活性低下。推定レセプター結合（部位B）。 165〜175 カルボキシ末端欠失により生物活性低下。（両端含む）抗体結合試験から収集したこの生化学情報（Ｌａｙｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６６：２３８１５−２３８２３（１９９１）参照）を三次元構造に重ね合わせてＧ−ＣＳＦ類似体を設計した。これらのＧ−ＣＳＦ類似体の設計、製造及び試験を下記実施例１に説明する。実施例１本実施例は結晶質Ｇ−ＣＳＦの製造、コンピューター生成画像による組換えヒトＧ−ＣＳＦの三次元構造の可視化、特定部位突然変異誘発又は核酸増幅法を使用した類似体の製造、Ｇ−ＣＳＦ類似体を分析するために使用した生物アッセイ及びＨＰＬＣ分析、並びに全体構造／機能関係の決定について説明する。全引用文献は参考資料として本明細書の一部とする。Ａ．自動結晶化の使用組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ）の三次元構造が必要であることと、大量の精製タンパク質が入手可能であることから、不完全階乗サンプリング及び接種による結晶成長法を実施した。ＪａｎｃａｒｉｋとＫｉｍ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：４０９（１９９１）に記載されている不完全階乗結晶化の実施から出発して、油滴及び複屈折凝集体を生成する溶液条件を確認した。また、自動ピペッティングシステムのソフトウェア及びハードウェアを改造して毎日約４００の異なる結晶化条件を設定した。Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０：３６６−３７３（１９８７）。この手順により、ｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ結晶を生成する結晶化溶液を調製した。結晶の寸法、再現性及び品質は、「核生成開始単位」の数を接種溶液の連続希釈により推定する接種法により改善された。これらの方法により、２．０ｍｍのｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ結晶を再現可能に成長させることができた。これらの結晶の空間群はＰ２₁２₁２₁であり、セル寸法はａ＝９０Å、ｂ＝１１０Å及びｃ＝４９Åであり、２．０Åの分解能まで回折する。１．全体的手法新規タンパク質の結晶化条件を探索するために、ＣａｒｔｅｒとＣａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１２２２１９−１２２２３（１９７９）は不完全階乗法を提案した。同氏らによると、一般に有望であるとみなされるランダムに選択された多数の結晶化条件のサンプリングにより、タンパク質結晶化をもたらす好適な試薬組み合わせが得られる。このアイデアは、ＪａｎｃａｒｉｋとＫｉｍ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：４０９（１９９１）により実現され、同氏らはｐＨ範囲、塩及び沈殿剤を考慮した初期結晶化試験のための３２種の溶液を記載した。本発明では同氏らの作業を拡張し、７０種までの溶液を記載する。溶液調製の人的労力及び誤差を最小限にするために、自動ピペッティング機にあわせて手法をプログラムした。Ｗｅｂｅｒの連続自動格子探索法（ＳＡＧＳ），Ｊ．Ｃｒｙｓｔ，Ｇｒｏｗｔｈ９０：３１８−３２４（１９８８）に従い、ロボットシステムを使用して温度、ｐＨ、塩及び沈殿剤の結晶化条件を連続的に最適化する一連の溶液を調製した。結晶を再現可能に成長させることが可能な溶液が決定されると、結晶の品質を著しく改善する接種技術が開発された。これらの方法を組み合わせると、数百種の回折品質結晶（少なくとも約２．５Åに回折し、好ましくは少なくとも部分的に２Å未満、より好ましくは約１Åに回折する部分を有する結晶）が数日で生成された。一般に、結晶化を所望する任意のタンパク質と共に使用され得る結晶化方法は、（ａ）（ｉ）異なる塩濃度を各々有する塩溶液のアリコート又は（ｉｉ）異なる沈殿剤濃度を各々有する沈殿剤溶液のアリコートと所望のタンパク質の水性アリコートとを一定範囲のｐＨの任意存在下で結合する段階と、（ｂ）こうして結合したアリコートの予備結晶形成を観察し、予備結晶形態の生成に有効な前記塩もしくは沈殿剤組み合わせ及び前記ｐＨを選択するか、又は予備結晶形態が生成されない場合には、タンパク質の前記水性アリコートのタンパク質出発濃度を増加させる段階と、（ｃ）前記塩又は前記沈殿剤濃度を選択後、前記選択された濃度の存在下で前に選択しなかった前記溶液を用いて段階（ａ）を繰り返す段階と、（ｄ）所望の品質の結晶が得られるまで段階（ｂ）及び段階（ａ）を繰り返す段階とを含む。上記方法は任意に自動化することができ、時間と労力を著しく節約することができる。好適タンパク質出発濃度は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌであるが、この出発濃度はタンパク質により異なる（下記Ｇ−ＣＳＦは３３ｍｇ／ｍｌを使用して分析した）。分析を開始するために好適な塩溶液範囲は０〜２．５Ｍ（ＮａＣｌ）である。好適沈殿剤はポリエチレングリコール８０００であるが、他の沈殿剤としては、有機溶媒（例えばエタノール）、分子量５００〜２０，０００のポリエチレングリコール分子、及び当業者に公知の他の沈殿剤を挙げることができる。好適ｐＨ範囲はｐＨ４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５及び９．０である。予備結晶化形態は、油状物、複屈折沈殿、小結晶（＜約０．０５ｍｍ）、中結晶（約０．５〜．５ｍｍ）及び大結晶（＞約０．５ｍｍ）を含む。結晶構造を検出するまでの好適待機時間は４８時間であるが、週に一度の観察でも好適であり、一般には約１カ月後に別のタンパク質濃度を使用する（一般にタンパク質濃度を増加させる）。自動化はＡｃｃｕｆｌｅｘシステムを改造すると好適である。好適自動化パラメーターを以下に説明する。一般に、濃度１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を０〜２．５ＭのＮａＣｌ溶液と組み合わせ、上記濃度範囲の存在下で（別々に）このような各組み合わせを実施した。予備結晶化構造が観察されたら、所望の結晶品質に達するまで前記塩濃度及びｐＨ範囲を別実験で最適化させる。次いで、ｐＨレベルを変えながら沈殿剤濃度も最適化させる。両者が最適化されたら、最適条件を同時に実施し、所望の結果を得る（これを図６に示す）。ａ．自動ピペッティングシステムの実施標準シリアルインターフェースを介してＡＳＣＩＩコードを送信するパーソナルコンピューターにより制御されるＡｃｃｕｆｌｅｘピペッティングシステム（ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡ）により、液滴及び液溜溶液を調製した。ピペッターは回転バルブにより６種の異なる溶液をサンプリングし、ｘｙ座標系内の並進を制御可能なプレートにこれらの溶液をピペット分注する。座標系の鉛直成分は液体を分配及び回収することが可能な注射器を操作する。Ａｃｃｕｆｌｅｘのソフトウェアは、ＣｏｘとＷｅｂｅｒ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０：３６６−３７３（１９８７）により提案されているようなＳＡＧＳ法を利用した。この方法は、他の２つのパラメーターを変化させながら、ｐＨ及び沈殿剤濃度という２つの主要な結晶化パラメーターを体系的に変化させるものである。これらのコンセプトに基づきながら、本発明で使用するソフトウェアは自動格子探索ストラテジーで使用される結晶化溶液の設計及び実現により高いフレキシビリティーを提供する。このフレキシビリティーの結果として、本発明のソフトウェアはより多数の異なる溶液を生成することができた。これは、下記不完全階乗法の実施に不可欠である。自動格子探索ストラテジーの速度及び設計を改善するために、Ａｃｃｕｆｌｅｘピペッティングシステムはソフトウェア及びハードウェアの改造が必要であった。ハードウェアの改造により、懸垂液滴（ｈａｎｇｉｎｇｄｒｏｐ）実験用トレーと、放置液滴（ｓｉｔｔｉｎｇｄｒｏｐ）実験用トレーとの２種の異なるマイクロタイタートレーと、２４種の付加的緩衝液、塩及び沈殿剤溶液を保持するＰ１ｅｘｇｌａｓトレーを使用できるようになった。これらの付加溶液により、調査可能な結晶化条件の格子を拡大した。ハードウェア改造を利用するために、ピペッティングソフトウェアを２つのサブルーチンに書き込んだ。結晶学者は一方のサブルーチンにより成分の濃度に基づいて結晶化溶液のマトリックスを設計することができ、第２のサブルーチンにより適正容量の溶液を結晶化トレーにピペット分注するコンピューターコードにこれらの濃度を翻訳することができる。濃度マトリックスは２種のプログラムのどちらかを使用して作成することができる。第１のプログラム（ＴｈｏｕｓａｎｄＯａｋｓ，ＣＡに所在のＡｍｇｅｎＩｎｃ．の市販品ＭＲＦ）は結晶学者により供給されるストック溶液濃度のリストに関するものであり、指定濃度に達するために必要なピペット分注容量を計算する。より好適な第２の方法は、沈殿剤の勾配又はｐＨを改善するために使用可能なスプレッドシートプログラム（Ｌｏｔｕｓ）を組み込む。これらのプログラムにより生成される濃度マトリックスは制御プログラム（Ａｃｃｕｆｌｅｘピペッターに元々内蔵されているプログラムの改造であり、ＴｈｏｕｓａｎｄＯａｋｓ，ＣＡに所在のＡｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．の市販品ＳＵＸ）により翻訳され、ウェルはこれに従って充填される。ｂ．不完全階乗法の実施改造ピペッティングシステムは種々の溶液を調製するのに便利であるため、拡張不完全階乗法の実施を改善することができた。３つの変数から１つの因子の９６のランダムな組み合わせを含むリストを作成するプログラムＩＮＦＡＣ（Ｃａｒｔｅｒら，Ｊ．Ｃｒｙｓｔ．Ｇｒｏｗｔｈ９０：６０−７３（１９８８））を使用して「ランダム」な成分を有する結晶化溶液の新しい組合わせを展開した。即座に沈殿したカルシウムとリン酸の組み合わせを除くと、沈殿剤、塩及び緩衝液の７０種の異なる組み合わせが残った。自動ピペッターを使用してこれらの組み合わせを調製し、１週間インキュベートした。混合物を検査し、沈殿を形成した溶液をより低い成分濃度で再び調製した。全ウェルから沈殿が除去されるまでこれを繰り返した。ｃ．ｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦの結晶化Ｘ線品質結晶を生成する溶液を見いだすために数種の異なる結晶化ストラテジーを使用した。これらのストラテジーは、不完全階乗法の使用、連続自動格子探索（ＳＡＧＳ）を使用した結晶化条件の最適化、接種技術の実施、及び数百の品質結晶を一晩で生成する結晶生成手順の開発を含むものであった。特に指定しない限り、スクリーニング及びｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ結晶の生成は懸垂液滴蒸気拡散法を使用した。Ａｆｉｎｓｅｎら，Ｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．：Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（編），ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４１：１−３３（１９９１）。ｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦの結晶化条件の初期スクリーニングはＪａｎｃａｒｉｋとＫｉｍ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：４０９（１９９１）の不完全階乗法を使用し、「予備結晶化」結果をもたらす数種の溶液を調製した。これらの結果は複屈折沈殿、油状物及び非常に小さい結晶（＜０．０５ｍｍ）を含むものであった。これらの予備結晶化溶液をその後、体系的スクリーニングの出発点として使用した。スクリーニングプロセスには結晶化マトリックスの開発が必要であった。これらのマトリックスは結晶化溶液中の成分の濃度に対応し、ＩＢＭ−ＰＣに基づくスプレッドシートＬｏｔｕｓ（商標）を使用して生成し、改造Ａｃｃｕｆｌｅｘピペッティングシステムを用いて実施した。マトリックスの設計におけるストラテジーは、他の条件（例えばｐＨ及び沈殿剤濃度）を一定に維持しながら１つの結晶化条件（例えば塩濃度）を変化させることであった。スクリーニングの開始時に変更条件の濃度範囲は広かったが、マイクロタイタートレー中の全ウェルが同一結晶化結果を生じるまで濃度を連続的に最適化した。これらの結果を結晶、複屈折沈殿、顆粒状沈殿、油滴及び非晶質塊の分類により評点した。ある結晶化パラメーターの濃度が少なくとも沈殿を生成しなかった場合には、沈殿が形成されるまでこのパラメーターの濃度を増加させた。各トレーを調製後、少なくとも２日間撹乱せずに静置した後、結晶成長を検査した。この初期スクリーニング後、トレーを週に一度の割合で検査した。このスクリーニングプロセスから、ｐＨ及び沈殿剤が同一でありながら塩（ＭｇＣｌ，ＬｉＳＯ₄）が異なり、小（０．１×０．０５×０．０５ｍｍ）結晶を生成した２種の別々の溶液を確認した。これらの結果に基づき、他の結晶化パラメーターを一定に維持しながらＬｉＳＯ₄に対してＭｇＣｌの濃度を変化させた濃度マトリックスの新しい組合わせを作成した。この実験系の結果、約３週間で回折品質結晶（＞約０．５ｍｍ）を生成する溶液が確認されたこの結晶化成長溶液（１００ｍＭＭｅｓｐＨ５．８，３８０ｍＭＭｇＣｌ₂，２２０ｍＭＬｉＳＯ₄及び８％ＰＥＧ８ｋ）を見いだすために、約３００ｍｇのタンパク質を消費した約８，０００の条件をスクリーニングした。結晶の寸法は液滴当たりの結晶形成数に依存した。典型的には平均寸法（１．０×０．７×０．７ｍｍ）を有する３〜５個の結晶が形成された。接種（下記参照）を実施したか否かに依存して、等しい空間群（Ｐ２₁２₁２₁）及び単位セル寸法ａ＝９０．２，ｂ＝１１０．２，ｃ＝４９．５を有する２種の形態が得られた。接種を実施しない場合には、ｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ結晶は１つの長い平坦な表面と丸みを帯びた縁部を有していた。接種を使用した場合には、４〜６時間以内に鋭角面を有する結晶（０．０５× ０．０５×０．０５ｍｍ）が液滴内に観察された。２４時間以内に結晶は（０．７×０．７×０．７ｍｍまで）成長し、液滴中の結晶形成数に依存して２ｍｍを越えるまで成長し続けた。ｄ．接種及び核生成開始部位の決定本発明の結晶接種方法は、（ここでは最適結晶成長条件を決定後に）使用した各個ウェル中の核生成開始単位数を確定する。この方法は、「種晶」の数が結晶の品質に影響し、分解能に影響するという点で有利である。本発明の接種は更に、接種を実施しない場合には成長に約３週間を要するが、接種を実施すると、Ｇ −ＣＳＦ結晶は約３日で成長するという利点がある。ある生成成長系列（手法の項参照のこと）では、確定された小結晶（＜０．０１×０．０１×０．０１ｍｍ）のシャワーが一晩で生成された。前に使用したピペット先端を再使用した以外は上記と同様の結晶化条件に従った。恐らく、使用済み先端に形成されており、結晶の核生成部位を提供する小核生成単位により結晶シャワー効果が生じたと予想される。標準生成成長条件下で結晶シャワーを含む少量（０．５μｌ）の液滴を新しい液滴に加えると、一晩で結晶のシャワーが生成された。この方法を使用して結晶シャワーを含む液滴のトレー数個を作成し、これを「種晶ストック」と名付けた。「種晶ストック」液滴内に含まれる核生成開始単位（ＮＩＵ）の数を推定し、ｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ結晶の再現性及び品質を改善するように試みた。「種晶ストック」中のＮＩＵの数を決定するために、９６穴マイクロタイタープレートに沿って液滴のアリコートを連続希釈した。マイクロタイタープレートは、等容量のｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ（３３ｍｇ／ｍｌ）と（上記）結晶成長溶液を含有する溶液５０μｌを各ウェルに加えることにより調製した。「種晶ストック」のアリコート（３μｌ）をマイクロタイタープレートの第１のウェルに移した。ウェル内の溶液を混合した後、３μｌをマイクロタイタープレートの行に沿って次のウェルに移した。マイクロタイタープレートの各行を同様に調製し、トレーをプラスチックテープで密閉した。一晩でマイクロタイタープレートのウェルの底に小結晶が形成されたので、ウェル中の結晶の数を元の「種晶ストック」の希釈液に相関させた。大きい単結晶を生成するために、「種晶ストック」液滴を新鮮なＣＧＳ中に適宜希釈した後、ＮＩＵを含有するこの溶液のアリコートを液滴に移した。結晶化条件が一旦最適化されたら、ＣＧＳ及びｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ（３３ｍｇ／ｍｌ）各３ｍｌを混合して５個のトレー（各２４穴）を作成する生成法で結晶を成長させた。この方法は、リットル量の最適化結晶化溶液を調製し、この溶液をタンパク質と混合し、懸垂液滴又は放置液滴トレーにタンパク質／結晶化溶液を加えるものであった。この方法では典型的には約５日間で１００〜３００の品質結晶（＞０．５ｍｍ）が得られた。ｅ．実験法材料図１に示すアミノ酸配列と比活性１．０±０．６×１０⁸Ｕ／ｍｇ（ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液中で細胞マイトジェン生成アッセイにより測定）を有する濃度約３ｍｇ／ｍｌのｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦから出発して結晶学的情報を得た。ＹＭ１０フィルターを使用して７５ｐｓｉでＡｍｉｃｏｎ濃縮器を使用して溶液を濃縮した。溶液を典型的には４℃で１０倍に濃縮し、数カ月貯蔵した。初期スクリーニング懸垂液滴を使用して蒸気拡散平衡によりＸ線分析に適した結晶を得た。予備スクリーニングのために、（上記のように調製した）３３ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液７μｌを等容量のウェル溶液と混合し、シリコンガラスプレートに載せ、Ｌｉｎｂｒｏ組織培養プレート（ＭｃＬｅａｎ，Ｖａに所在のＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してウェル溶液上に懸垂させた。全ピペッティングはＡｃｃｕｆｌｅｘピペッターを使用して実施したが、ウェル溶液の生成後はトレーを自動ピペッターから取り外し、卓上振盪機で少なくとも１０分間十分に混合した。次にＬｉｎｂｒｏトレーを再びピペッターに取り付け、ウェル溶液及びタンパク質溶液をシリコンカバースリップに加えた。次にカバースリップを裏返し、ウェル溶液１ｍｌをシリコン油脂で覆い、密封した。自動結晶化システムの成分は以下の通りである。ＰＣ−ＤＯＳコンピューターシステムを使用して、その成分の濃度に基づいて結晶化溶液のマトリックスを設計した。これらのマトリックスは（上記）ＭＲＦ又はＬｏｔｕｓスプレッドシートのいずれかを用いて作成した。これらのプログラムの終産物はデータファイルである。このファイルは、マトリックスに示された濃度を得るために適した容量のストック溶液をピペットするためにＳＵＸプログラムにより必要とされる情報を含む。ＳＵＸプログラム情報をシリアルＩ／Ｏポートに送り、ストック溶液に対するバルブの位置、回収した後にマイクロタイタープレートのウェルにピペット分注すべき溶液の量及び各ウェルのＸＹ位置（各ウェルの行列）をＡｃｃｕｆｌｅｘピペッティングシステムに指令するためにこの情報を使用した。充填中の注射器のＺ位置（高さ）と、異なる溶液の充填間に注射器を洗浄するためにシステムを停止させるドレインの位置とを含む付加情報をピペッターに送信した。２４穴マイクロタイタープレート（Ｌｉｎｂｒｏ又はＣｒｙｓｃｈｅｍ）及びカバースリップホルダーをプレートに載せ、プレートをＸＹ面内で移動させた。プレートの移動により、ウェルにピペット分注するようにピペッターに注射器を位置決めさせた。プレートの移動により、カバースリップ及びバイアルも位置決めし、これらから溶液を抽出した。ピペット分注前に、Ｌｉｎｂｒｏマイクロタイタープレートはウェルの縁部の周囲に油脂薄膜を塗布しておいた。結晶化溶液をウェル内で調製してから、カバースリップに移す前に、マイクロタイタープレートをピペッティングシステムから取り外し、溶液を１０分間卓上振盪機で混合した。混合後、ウェル溶液をカバースリップ（懸垂液滴プロトコルの場合）又はウェルの中央ポスト（放置液滴プロトコルの場合）に移した。タンパク質をバイアルから抽出し、ウェル溶液を含有するカバースリップ液滴（又はポスト）に加えた。プラスチックテープをＣｒｙｓｃｈｅｍプレートの頂部に張り付けてウエルを密封した。生成成長結晶化条件が最適化されたら、「生成」法を使用して結晶成長を実施した。１００ｍＭＭｅｓ（ｐＨ５．８）、３８０ｍＭＭｇＣｌ₂、２２０ｍＭＬｉＳＯ₄及び８％ＰＥＧ８Ｋを含有する結晶化溶液１リットルを調製した。エッペンドルフ注射器ピペッターを使用してこの溶液の１ｍｌアリコートをＬｉｎｂｒｏプレートのウェルの各々にピペット分注した。この溶液５０％及びＧ−ＣＳＦ（３３ｍｇ／ｍｌ）５０％を含有する混合溶液を調製し、シリコンカバースリップにピペット分注した。これらの液滴の典型量は５０〜１００μｌであり、これらの液滴の寸法が大きいため、カバースリップのめくれ上がり及び液滴のウェル懸垂に細心の注意を払った。データ収集Ｒ−ＡＸＩＳ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸに所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｃｏｒｐ．）イメージングプレートデテクターで収集した２．２Å データに対してＸ−ＰＬＯＲ（Ｂｒｕｎｉｇｅｒ，Ｘ−ＰＬＯＲｖｅｒｓｉｏｎ３．０，結晶分析システム及びＮＭＲ，ＮｅｗＨａｖｅＣＴに所在のイエール大学）を用いて構造を最適化させた。ｆ．考察有効な組換えヒト治療剤として、ｒ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦは大量生産され、構造分析のためにグラムレベルが入手可能になっている。他の該当タンパク質が入手可能になるにつれ、本発明の結晶化方法は他の用途にも利用可能である。この方法は、大量のタンパク質（＞約２００ｍｇ）を有する任意の結晶学的プロジェクトに適用することができる。当業者に認識される通り、本発明の材料及び手法は変形可能であり、等価材料及び手法が他のタンパク質の結晶化に使用可能である。Ｂ．Ｇ−ＣＳＦの三次元構造を可視化するためのコンピュータープログラム添付図に示すような図はＧ−ＣＳＦの三次元構造を可視化するために有用であるが、分子を立体的観察を可能にするコンピュータープログラムが好適であると予想される。この立体観察は当業者には「バーチャルリアリティー」とも呼称され、高分子構造から原子レベルまで広範囲の分解能で全角度から構造を三次元形態で可視化することができる。本発明のコンピュータープログラムにより、例えば分子を回転させることにより、分子の観察角度の透視図を変更することもできる。本発明のプログラムは更に変更に応答するので、例えば完全アミノ酸残基を含む１個以上の原子画像を削除、追加もしくは置換えることができ、又は存在する基もしくは置換された基に化学的部分を付加することができ、構造変化を可視化することができる。他のコンピューターに基づくシステムを使用することもでき、その要素は、（ａ）例えばＧ−ＣＳＦの三次元構造の直交座標又は他の数値帰属座標等の情報を入力するための手段と、（ｂ）前記座標を表現するための手段、例えば三次元構造を観察してこのような三次元構造をアミノ酸組成等のＧ−ＣＳＦ分子の組成と相関できるようにする視覚手段と、（ｃ）任意要素として、前記三次元構造の画像が改変組成を表示するように、表現されたＧ−ＣＳＦ分子の組成を改変する情報を入力するための手段である。使用される好適コンピュータープログラムの座標を図５に示す。好適コンピュータープログラムはＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡに所在のＢｉｏｓｙｍの市販品ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ，ｖｅｒｓｉｏｎ４である。粗結晶学的構造については、回折データの観察強度（Ｆ−ｏｂｓ）及び直交座標も米国，Ｕｐｔｏｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ１１９７２３に所在のＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ，ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙに寄託されており、参考資料として本明細書の一部とする。座標をＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラムに入力すると、コンピュータースクリーン上に三次元Ｇ−ＣＳＦ分子像を容易に表示することができる。表示に好適なコンピューターシステムはＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓ３２０ＶＧＸ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）である。立体観察の際には、Ｇ−ＣＳＦ分子を三次元で立体的に観察することが可能な眼鏡（ＣｒｙｓｔａｌＥｙｅｓ，ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓ）を装着し、分子を回転させて分子設計を想像することができる。従って、本発明はコンピューターを用いてＧ−ＣＳＦ類似体を設計又は製造する方法を提供し、該方法は、（ａ）Ｇ−ＣＳＦ分子の部分の組成の表示、好ましくは各アミノ酸の三次元配置の表示、より好ましくはＧ−ＣＳＦ分子の各原子の三次元位置の表示を含めてＧ −ＣＳＦ分子の三次元構造を表示するための手段を前記コンピューターに備える段階と、（ｂ）前記表示を観察する段階と、（ｃ）前記分子の組成又は部分の位置の改変のための部位を前記表示上で選択する段階と、（ｄ）前記改変を有するＧ−ＣＳＦ類似体を製造する段階とを含む。改変は、終産物Ｇ−ＣＳＦ類似体の所望の構造特性に基づいて選択することができ、このような設計には以下に詳述する要素を考慮する。このような要素とは、特にＧ−ＣＳＦ分子の螺旋構造の内側の残基であって、このような残基を改変すると、分子の内部コアの全体構造が変化し、レセプター結合を妨げ得る疎水性アミノ酸残基の位置及び組成と、改変しても、Ｇ−ＣＳＦ分子の全体構造には影響しない外部ループ構造の位置及び組成を含む。図２〜４は、種々の方法で全体的三次元コンフォーメーションを示す。トポロジー図、リボン図、及びバレル図はいずれもＧ−ＣＳＦのコンフォーメーションの特徴を示す。図２は、Ｇ−ＣＳＦと他の分子との比較を示す。アーキテクチャーは類似しているが、これらの成長因子はそのループの局所コンフォーメーション及び螺旋束の幾何学的配置が異なる。他方、アミノ酸配列の相違にも拘わらず、これらの分子の全６種間には２つの長いクロスオーバー結合を含むアップ−アップ−ダウン −ダウントポロジーが保存されている。図３は組換えヒトＧ−ＣＳＦの二次構造を詳細に示す。このリボン図は螺旋の向きとその相対位置を示す。図４は組換えヒトＧ−ＣＳＦのコンフォーメーションを別の方法で示す。この「バレル」図は組換えヒトＧ−ＣＳＦの全体的なアーキテクチャーを示す。Ｃ．Ｍ１３突然変異誘発を用いた類似体の調製本実施例は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ８５／００８１７号（Ｓｏｕｚａら，１９８５年２月２８日公開、参考資料として本明細書の一部とする）に記載の方法に従って、１本鎖バクテリオファージＭ１３を用いる部位特異的突然変異誘発技術を使用したＧ−ＣＳＦ類似体の調製に関する。この方法は主に非突然変異誘発配列の１本鎖核酸鋳型を使用し、配列中に所望の改変を含むより小さいオリゴヌクレオチドを前記鋳型に結合することからなる。非同一配列をハイブリダイズさせるようなハイブリダイゼーション条件を使用し、残りの配列は最初の鋳型と同一になるように充填する。その結果、２本の鎖の一方が所望の改変を含むような２本鎖分子が生成される。この突然変異誘発した１本鎖を分離し、その相補鎖の鋳型として使用する。こうして所望の改変を含む２本鎖分子を生成する。使用した改変前のＧ−ＣＳＦ核酸配列を図１に示し、突然変異誘発した核酸を含むオリゴヌクレオチドを表２に示す。本明細書中でアミノ酸残基及びヌクレオチドに使用した略記は慣用通りであり、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．１９８８，裏内表紙を参照されたい。改変前のＧ−ＣＳＦ核酸配列をまず最初にベクターＭ１３ｍｐ２１に挿入した。次に改変前のＧ−ＣＳＦ配列を含む１本鎖ファージＭ１３ｍｐ２１からのＤＮＡを単離し、水に再懸濁した。各反応につきこのＤＮＡ２００ｎｇをリン酸化オリゴヌクレオチド１．５ｐｍｏｌと混合し（表２）、０．１ＭＴｒｉｓ，０．０１ＭＭｇＣｌ₂，０．００５ＭＤＴＴ，０．１ｍＭＡＴＰ（ｐＨ８．０）に懸濁した。６５℃まで加熱し、室温までゆっくりと冷却することによりＤＮＡをアニールした。冷却後、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ各０．５ｍＭ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位及び大腸菌ポリメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗフラグメント１単位を、０．１ＭＴｒｉｓ，０．０２５ＭＮａＣｌ，０．０１ＭＭｇＣｌ₂ ，０．０１ＭＤＴＴ（ｐＨ７．５）中のアニールしたＤＮＡ１単位に加えた。こうして２本鎖になった閉環状ＤＮＡをそれ以上精製せずに使用して大腸菌にトランスフェクトした。プラークをニトロセルロースフィルターで釣り上げた後、Ｐ³²で末端標識した１本鎖ＤＮＡとフィルターを１時間５５〜６０℃でハイブリダイズさせることによりプラークをスクリーニングした。ハイブリダイゼーション後、オリゴの融点（Ａ−Ｔでは２℃、Ｇ−Ｃでは４℃）よりも０〜３℃低い温度でフィルターを洗浄し、突然変異配列を含むファージを有するプラークに対応するオートラジオグラフィーシグナルを選択的に発生させた。陽性クローンを配列決定により確認した。Ｍ１３突然変異誘発法により製造した各Ｇ−ＣＳＦ類似体毎に使用したオリゴヌクレオチドを下表に示す。命名法は、改変前のアミノ酸の残基及び位置（例えば１７位リジン）と、置換したアミノ酸の残基及び位置（例えばアルギニン１７）を示す。２個以上の残基が置換されている場合には、位置を指定する上付き数字をカンマで区切るか、又はセミコロンで残基を区切る。置換でなく欠失の場合にはその旨明記した。Ｍ１３に基づく突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド配列を次の欄に示す。これらのオリゴヌクレオチドは合成により製造したが、その製法は限定的ではなく、任意の核酸合成法及び／又は装置を使用することができる。オリゴ長も示す。上述のように、これらのオリゴを１本鎖ファージベクターと接触させた後、単一ヌクレオチドを加え、Ｇ− ＣＳＦ類似体核酸配列を完成させた。Ｄ．ＤＮＡ増幅を使用したＧ−ＣＳＦ類似体の調製本実施例は、ＤＮＡ増幅技術を用いたＧ−ＣＳＦ類似体の製造方法に関する。主に、各類似体をコードするＤＮＡを別個の２部分として増幅して結合した後、完全配列を増幅した。改変前のＧ−ＣＳＦＤＮＡのどの場所に所望の改変を加えるべきかに依存して、内部プライマーを使用して改変を組み込み、２つの別個の増幅部分を生成した。例えば、所望の類似体ＤＮＡの５’末端を増幅するためには、増幅すべき領域の一端には（改変前のＧ−ＣＳＦＤＮＡの上流のプラスミドの配列に相補的な）５’フランキングプライマーを使用し、他方の末端をプライムするためには、改変前のＤＮＡとハイブリダイズすることが可能でありながら所望の改変を含み得る内部プライマーを使用した。得られた増幅領域は５’ フランキングプライマーから内部プライマーに及ぶ領域であっだ。（改変前のＧ −ＣＳＦＤＮＡの下流のプラスミドの配列に相補的な）３’フランキングプライマーと所期突然変異の領域に相補的な内部プライマーを使用して３’末端も同様に処理した。（内部プライマーの位置に依存して同一寸法でもよいし、同一寸法でなくてもよい）２つの「半部分」を増幅後、２つの「半部分」を結合した。結合後、５’フランキングプライマーと３’フランキングプライマーを使用して所望の改変を含む完全配列を増幅した。２つ以上の改変が所望される場合には、内部プライマーに改変を組み込むように上記プロセスを変更するか、又は別の内部プライマーを使用してプロセスを繰り返す。あるいは、核酸配列に改変をもたらすための他の方法、例えば上記のようなファージに基づく突然変異誘発技術と遺伝子増幅法を併用してもよい。２つ以上の改変を有する類似体を製造する方法の例を以下に記載する。下記Ｇ−ＣＳＦ類似体を生成するために使用した鋳型ＤＮＡは、図１の配列に（Ｇ−ＣＳＦコーディング領域を含むプラスミドからの）所定のフランキング領域を加えたものであった。これらのフランキング領域を以下に説明するように５ ’及び３’フランキングプライマーとして使用した。増幅反応は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン（ｐＨ８．３）を含有する４０μｌ容量中で２０℃で実施した。４０ μｌ反応溶液は更に各ｄＮＴＰ０．１ｍＭ、各プライマー１０ｐｍｏｌ及び鋳型ＤＮＡ１ｎｇを含有するものとした。各増幅は１５サイクル繰り返した。各サイクルは９４℃で０．５分間、５０℃で０．５分間、７２℃で０．７５分間から構成した。フランキングプライマーは２０ヌクレオチド長、内部プライマーは２０〜２５ヌクレオチド長であった。こうして、所望のＧ−ＣＳＦ類似体の前部又は後部をコードする２本鎖ＤＮＡの多重コピーを生成した。２つの「半部分」を結合するために、２つの反応物の各々の４０分の１を第３のＤＮＡ増幅反応で結合した。突然変異を有するこれらの２部分の末端は相補的であるので、２部分を内部プライマー位置でアニールさせ、重合サイクル後、完全長ＤＮＡ配列を得た。こうしてアニール後、５’及び３’フランキングプライマーを使用して完全類似体を増幅した。この増幅プロセスは上述のように１５サイクル繰り返した。完全増幅類似体ＤＮＡ配列をＸｂａＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、ベクターに挿入するための付着末端を生成した。切断したＤＮＡをプラスミドベクターに挿入し、このベクターを使用して大腸菌を形質転換させた。形質転換細胞を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで攻撃し、３０℃でインキュベートした。Ｇ−ＣＳＦ類似体タンパク質の生成を全細胞溶解物のポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。生成単離物から精製したプラスミドのＤＮＡ配列分析により所望の突然変異の存在を確認した。次に培養物を増殖させ、細胞を回収し、Ｇ−ＣＳＦ類似体を以下のように精製した。下表３は遺伝子増幅を使用して製造した各類似体に使用した特定プライマーを示す。１．二重突然変異の構築Ｇ−ＣＳＦ類似体Ｇｌｎ^12.21→Ｇｌｕ^12.21を製造するために、ＤＮＡ増幅を２回別々に実施し、２つのＤＮＡ突然変異体を製造した。使用した鋳型ＤＮＡは図１の配列に（Ｇ−ＣＳＦコーディング領域を含むプラスミドからの）所定のフランキング領域を加えたものである。厳密な配列は下記の通りである。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＣｅｔｕｓＤＮＡ熱サイクラーを使用して２つのＤＮＡ増幅反応の各々を実施した。４０μｌ反応混合物は、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｅｔｕｓ）、４ｄＸＴＰ（Ｃｅｔｕｓ）各０．２ｍＭ、各プライマーオリゴヌクレオチド５０ｐｍｏｌ、（プラスミドベクター上の）Ｇ−ＣＳＦ鋳型ＤＮＡ２ｎｇ及びＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）１単位から構成した。増幅プロセスは３０サイクル実施した。各サイクルは９４℃で１分間、５０℃で２分間、７２℃で３分間から構成した。ＤＮＡ増幅“Ａ”は下記オリゴヌクレオチド：を使用した。ＤＮＡ増幅“Ｂ”は下記オリゴヌクレオチド：を使用した。ＤＮＡ増幅“Ａ”後に得られた１０９塩基対２本鎖ＤＮＡ産物からＤＮＡ突然変異Ｇｌｎ¹²→Ｇｌｕ¹²を含む６４塩基対ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡフラグメントを切り出し、単離した。ＤＮＡ増幅“Ｂ”後に得られた５０９塩基対２本鎖ＤＮＡ産物からＤＮＡ突然変異Ｇｌｎ²¹→Ｇｌｕ²¹を含む１９７塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｍＩＤＮＡフラグメントを切り出し、単離した。 “Ａ”及び“Ｂ”フラグメントを４．８ｋｂｐＸｂａＩ−ＢｓｍＩＤＮＡプラスミドベクターフラグメントと連結した。連結混合物は等モルＤＮＡ制限フラグメント、連結緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，２ｍＭＤＴＴ，０．５ｍＭｒＡＴＰ及び１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼから構成し、１４℃で一晩インキュベートした。その後、ＢｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓａｒ装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用するエレクトロポレーションにより連結ＤＮＡを大腸菌ＦＭ５に形質転換した。クローンを単離し、ＤＮＡ配列決定によりプラスミド構築物が２つの突然変異を含むことを確認した。この「中間」ベクターは更に１９３塩基対ＢｓｍＩ− ＢｓｍＩＤＮＡフラグメントを欠失していた。最終プラスミドベクターは中間ベクターから２ｋｂｐＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡフラグメント、プラスミドベクターから２．８ｋｂｐＳｓｔＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメント、及びプラスミドベクターから３６０ｂｐＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントを切り出し、単離することにより得たＤＮＡフラグメントの（上記のような）連結及び形質転換により構築した。ＤＮＡ配列決定により最終構築物がＧ− ＣＳＦ遺伝子を含むことを確認した。下記のように培養物を増殖し、細胞を回収し、Ｇ−ＣＳＦ類似体を精製した。上述のように、突然変異誘発法の任意の組み合わせを使用して、１つ以上の改変を有するＧ−ＣＳＦ類似体核酸（及び発現産物）を製造することができる。Ｍ１３に基づく突然変異誘発及び遺伝子増幅に基づく突然変異誘発を使用した上記２例はその実例である。Ｅ．Ｇ−ＣＳＦ類似体ＤＮＡの発現次にＧ−ＣＳＦ類似体ＤＮＡをプラスミドベクターに挿入し、大腸菌株ＦＭ５（ＡＴＣＣ＃５３９１１）を形質転換させるために使用した。プラスミド上及び細菌宿主細胞中に含まれる本発明のＧ−ＣＳＦ類似体ＤＮＡは、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能であり、その受託番号は以下に示す。トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及びＮａＣｌ５ｇを含有するブロスで密度Ａ⁶⁰⁰＝０．５に達するまで１リットル培養物を３０℃で増殖させ、前記密度に達したら４２℃まで迅速に加熱した。フラスコを３時間振盪し続けた。他の原核又は真核宿主細胞も使用可能であり、例えば他の細菌細胞、株もしくは種、哺乳動物培養細胞（ＣＯＳ、ＣＨＯ又は他の型）、昆虫細胞もしくは多細胞器官もしくは生物、又は植物細胞もしくは多細胞器官もしくは生物を使用することができ、当業者は適切な宿主に想到しよう。本発明のＧ−ＣＳＦ類似体及び関連組成物は、例えば固相ペプチド合成法又は他の化学的製法により合成することもできる。他のクローニング及び発現系は当業者に自明である。Ｆ．Ｇ−ＣＳＦ類似体タンパク質の精製遠心分離（１０，０００×Ｇ，２０分間，４℃）により細胞を回収した。ペレット（通常は５ｇ）を１ｍＭＤＴＴ３０ｍｌに再懸濁し、１０，０００ｐｓｉのフレンチプレスセルに３回通した。破壊した細胞懸濁液を１０，０００ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを水３０〜４０ｍｌに再懸濁した。これを１０，０００×Ｇで３０分間再遠心分離し、このペレットを２％Ｓａｒｋｏｓｙｌ及び５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）２５ｍｌに溶解させた。硫酸銅を濃度４０μＭまで加え、混合物を少なくとも１５時間１５〜２５℃で撹拌した。次いで混合物を２０，０００×Ｇで３０分間遠心分離した。得られた可溶化タンパク質混合物を１３．３ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．７）で４倍に希釈し、Ｓａｒｋｏｓｙｌを除去した後、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．７）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ＷｈａｔｍａｎＤＥ−５２）カラムに上清を充填した。カラム充填及び同一緩衝液でカラムを洗浄後、類似体を２０ｍＭＴｒｉｓ／ＮａＣｌ（下記のように類似体に依存して３５ｍＭ〜１００ｍＭ）（ｐＨ７．７）で溶離した。類似体のほとんどはＤＥＡＥカラムからの溶出液を５０％酢酸でｐＨ５．４に調整し、必要に応じて（適正な導電率を得るために）５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）で希釈した。次に２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）で平衡化したＣＭ−セファロースカラムに溶液を充填した。次いで２８０ｎｍの吸光度がほぼ０になるまでカラムを２０ｍＭＮａＡｃ（ｐＨ５．４）で洗浄した。次いでＧ−ＣＳＦ類似体を下表４に記載する濃度の酢酸ナトリウム／ＮａＣｌで溶離した。ＣＭ−セファロースカラムに充填しなかった類似体のＤＥＡＥカラム溶出液を１０ｍＭＮａＡｃ（ｐＨ４．０）緩衝液で直接透析した。次いで精製Ｇ−ＣＳＦ類似体をｉｎｖｉｔｒｏ分析のために適宜単離した。類似体の溶離に使用した塩濃度は上述のように変化させた。ＤＥＡＥセルロースカラム及びＣＭ−セファロースカラムの濃度を下表に示す。上記精製法は例示であり、当業者には自明の通り、発明のＧ−ＣＳＦ類似体を得るために他の手段も使用可能である。Ｇ．生物アッセイ本発明のＧ−ＣＳＦ類似体をどの方法で製造したかに関係なく、類似体の生物活性をアッセイした。³Ｈ−チミジンアッセイを実施して細胞分裂度を確認した。他の生物アッセイを使用して所望の活性を確認することもできる。マウスＷＥＨＩ−３Ｂ（Ｄ＋）白血病細胞系に末端分化を誘導する能力をアッセイする等の生物アッセイによりＧ−ＣＳＦ活性を得ることもできる。Ｎｉｃｏｌａら，Ｂｌｏｏｄ５４：６１４−２７（１９７９）参照。生物活性を確認するために他のｉｎｖｉｔｒｏアッセイも使用できる。Ｎｉｃｏｌａ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：４５−７７（１９８９）参照。一般に、生物活性試験では（非改変Ｇ−ＣＳＦと比較した）生物活性の増加又は低下、（非改変Ｇ−ＣＳＦと比較した）生物活性の相違、レセプターアフィニティー分析又は血清半減期分析等の所望の結果を分析すべきである。これらの例に止まることなく、当業者は所望の最終結果の試験に有用な他のアッセイにも想到しよう。常法を使用して³Ｈ−チミジンアッセイを実施した。雌ＢａｌｂＣマウスを殺して骨髄を取り出した。骨髄細胞を成長培地に短時間懸濁し、遠心分離し、再懸濁した。約１０，０００個の細胞を含む１６０μｌアリコートを９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。（上記のように調製した）精製Ｇ−ＣＳＦ類似体のサンプルを各ウェルに加え、６８時間インキュベートした。³Ｈ−チミジンをウェルに加え、更に５時間インキュベートした。５時間のインキュベーション時間後、細胞を回収し、濾過し、十分に濯いだ。シンチレーション液を収容するバイアルにフィルターを加えた。β線を計数した（ＬＫＢβプレートシンチレーションカウンター）。標準及び類似体を３回ずつ分析し、標準曲線よりも実質的に上又は下に位置するサンプルを適正な希釈度で再アッセイした。ここに報告する結果は非改変組換えヒトＧ−ＣＳＦ標準結果に対する３回の類似体データの平均である。Ｈ．ＨＰＬＣ分析類似体の精製サンプルで高圧液体クロマトグラフィーを実施した。逆相ＨＰＬＣカラム上のピークの位置は２種のタンパク質間の構造類似を決定的に示すものではないが、類似の保持時間を有する類似体はＨＰＬＣカラムに対して非改変分子と同一型の疎水性相互作用を有し得る。これは全体構造の類似を示す１面である。類似体及び非改変組換えヒトＧ−ＣＳＦのサンプルを逆相（０．４６×２５ｃｍ）Ｖｙｄａｃ２１４ＴＰ５４カラム（ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）で分析した。類似体がカラム中でどのように挙動したかに依存して０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで２０ｍＭ酢酸及び４０ｍＭＮａＣｌ緩衝溶液（ｐＨ５．２）中で精製類似体Ｇ−ＣＳＦサンプルを調製した。１％イソプロパノール、５２．８％アセトニトリル及び０．３８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水溶液で予め平衡化しておいたＨＰＬＣカラムに（濃度に依存して）種々の量を充填した。サンプルを０．８６％／分のアセトニトリル及び０．００２％ＴＦＡの勾配にかけた。Ｉ．結果上記生物アッセイ及びＨＰＬＣ分析の結果を以下に示す。生物活性は３回のデータの平均であり、対照標準（非改変Ｇ−ＣＳＦ）の百分率として示す。相対ＨＰＬＣピーク位置は対照標準（非改変Ｇ−ＣＳＦ）ピークに対する類似体Ｇ−ＣＳＦの位置である。＋又は−の記号は、類似体ＨＰＬＣピークが対照標準ピークよりも（何分）先又は後に現れるかを示す。変異体の全部について相対ＨＰＬＣピークを分析した訳ではなく、分析したもののみを下表に示す。上記のように調製した本発明の類似体をコードする核酸を含む大腸菌宿主細胞のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ番号も示す。１．構造−機能関係の確認本発明の類似体を設計するために使用した第１段階は、Ｇ−ＣＳＦ分子の構造完全性にどの部分が必要であるかを決定することであった。これはアミノ酸残基レベルで実施したが、原子レベルも分析に利用できる。構造完全性に必要な残基を修飾すると、Ｇ−ＣＳＦ分子の全体構造が変化する。これは製造しようとする類似体に依存して望ましい場合と望ましくない場合がある。本実施例は、Ｇ−ＣＳＦレセプター（本項で以下に記載する「Ｇ−ＣＳＦレセプター」は造血細胞に存在する天然Ｇ−ＣＳＦレセプターを意味する）への類似体のＧ−ＣＳＦレセプター結合を維持する目的で、Ｇ−ＣＳＦ分子の全体構造完全性を維持するように設計した。Ｇ−ＣＳＦレセプター結合は上記生物アッセイにより決定されるような少なくとも１種の生物活性に必要な段階であると仮定され、本試験により確認された。図面に示すように、Ｇ−ＣＳＦ（ここでは組換えヒトｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）は４５Å×３０Å×２４Åの全体寸法を有する左巻き螺旋を有する逆平行４α螺旋束である。螺旋束内の４つの螺旋は螺旋Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと呼称され、その結合ループはＡＢ、ＢＣ及びＣＤループとして知られる。螺旋交差角度は−１６７．５゜〜−１５９．４゜である。螺旋Ａ、Ｂ及びＣは直鎖であり、螺旋Ｄは（組換えヒトｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの）Ｇｌｙ１５０及びＳｅｒ１６０に２種の構造特徴を含む。全体としてＧ−ＣＳＦ分子は外部ループにより直列に結合された４つの螺旋からなる束である。この構造情報を公知機能情報と相関させた。（１位メチオニンを含む）残基４７、２３、２４、２０、２１、４４、５３、１１３、１１０、２８及び１１４を修飾することができ、生物活性に及ぼす作用は相当のものであることが判明した。生物活性を低下させた単一突然変異の多くは３０Åの間隔で４螺旋束の異なった面に位置するＧ−ＣＳＦの２つの領域の周囲に集中していた。一方の領域はＡ螺旋とＤ螺旋の相互作用をもたらす。これは更に下記非改変分子における塩橋の存在により確認される。ここに報告する距離は図５に示すような分子Ａの距離である（３つのＧ−ＣＳＦ分子は共に結晶化し、Ａ、Ｂ及びＣと命名した）。螺旋Ａ及びＤの間には塩橋ウェブが存在し、螺旋Ａ構造を安定化させるように機能するので、Ｇ−ＣＳＦ分子の全体構造に影響する。残基Ｇｌｕ２０、Ａｒｇ２３及びＬｙｓ２４の周囲の領域はＡ螺旋の親水性面（残基２０〜３７）に存在する。２０及び２３位の非帯電アラニン残基で残基を置換すると、類似のＨＰＬＣ保持時間が得られ、構造の類似性が予想される。（本アッセイにより示されるように）これらの部位を改変すると、生物活性が変化した。Ｌｙｓ２４を置換した場合には生物活性は変化したが、他の２種の改変のように類似のＨＰＬＣ保持時間は得られなかった。改変により生物活性が低下した第２の部位はＡＢ螺旋である。４７位のグルタミンをアラニンで置換する（上記類似体１９）と、（チミジン取り込みアッセイにおいて）生物活性がゼロに低下した。ＡＢ螺旋はアミノ及びカルボキシ末端を除いて主に疎水性であり、３¹⁰螺旋１回転を含む。各末端には２個のヒスチジン（Ｈｉｓ４４及びＨｉｓ５６）と、Ｈｉｓ４４との塩架橋を形成することが可能な残基４６の付加的グルタミンとが存在する。類似体のフーリエ変換赤外スペクトログラフィー分析（ＦＴＩＲ）によると、この類似体は非改変組換えＧ−ＣＳＦ分子に構造的に類似する。更に試験した結果、この類似体は非改変組換え分子と同一条件下では結晶化しないことが判明した。カルボキシ末端の改変（Ｇｌｎ１７４、Ａｒｇ１６７及びＡｒｇ１７０）は生物活性にほとんど影響しなかった。他方、最後の８個の残基（１６７〜１７５）が欠失すると、生物活性は低下した。これらの結果から、欠失は全体構造を不安定にし、突然変異体がＧ−ＣＳＦレセプターと適正に結合するのを妨げる（その結果、シグナル変換の開始を妨げる）と予想される。一般に、Ｇ−ＣＳＦ内部コア（外部ループを欠く内部４螺旋束）では疎水性内部残基は構造完全性に必須である。例えば螺旋Ａにおいて内部疎水性残基は（メチオニンを１位として）Ｐｈｅ１４、Ｃｙｓ１８、Ｖａｌ２２、Ｉｌｅ２５、Ｉｌｅ３２及びＬｅｕ３６である。他の疎水性残基（同様にｍｅｔを１位とする）は螺旋ＢのＡｌａ７２、Ｌｅｕ７６、Ｌｅｕ７９、Ｌｅｕ８３、Ｔｙｒ８６、Ｌｅｕ９０、Ｌｅｕ９３であり、螺旋ＣのＬｅｕ１０４、Ｌｅｕ１０７、Ｖａｌ１１１、Ａｌａ１１４、Ｉｌｅ１１８、Ｍｅｔ１２２であり、螺旋ＤのＶａｌ１５４、Ｖａｌ１５８、Ｐｈｅ１６１、Ｖａｌ１６４、Ｖａｌ１６８、Ｌｅｕ１７２である。本発明により製造したＧ−ＣＳＦ類似体からの上記生物活性データによると、外部ループの改変はＧ−ＣＳＦ全体構造にほとんど影響しない。類似体製造のための好適ループはＡＢループ及びＣＤループである。ループは螺旋に比較して比較的にフレキシブルな構造である。ループは該分子のタンパク分解により分解され得る。該分子を使用する目的は生物攻撃に対する応答を発生すること、即ち好中球を選択的に刺激することであるので、Ｇ−ＣＳＦはｉｎｖｉｖｏで比較的迅速に作用する。Ｇ−ＣＳＦ代謝回転も比較的迅速である。ループのフレキシビリティーはプロテアーゼが該分子と結合する「手」を提供し、該分子を不活性化する。プロテアーゼ分解を阻止しながら（非改変Ｇ−ＣＳＦの全体構造の保持を介して）生物活性を低下させないようにループを改変することができる。この現象は恐らくＧ−ＣＳＦ分子に限定されず、図２に示すような類似の公知全体構造を有する他の分子にも共通すると思われる。例えばｈＧＨ、インターフェロンＢ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の外部ループを改変しても全体構造の変化は最小に止まる。ＧＭ− ＣＳＦ分子上の外部ループはＧ−ＣＳＦ分子上に存在する外部ループほどフレキシブルではないので、ＧＭ−ＣＳＦはその広い生物活性に一致して血清寿命が長いと予想される。従って、β−シート構造から外部ループを解放することにより、（Ｇ−ＣＳＦと同様に）ループをよりフレキシブルにし、分子をプロテアーゼ分解に対してより感受性にする（その結果、回転率を増加する）ようにＧＭ−ＣＳＦの外部ループを改変することができる。これらの外部ループの改変は、内部螺旋の１つ以上と結合することによりループを安定化することにより実施し得る。βシート、塩橋、ジスルフィド結合又は疎水性相互作用の形成等の結合手段が当業者に公知であり、他の手段も使用可能である。更に、１個以上のアミノ酸残基又はその部分等の１個以上の部分を欠失させ、短縮分子を製造し、こうして外部ループの所定の部分を除去することもできる。従って、外部ループ、好ましくはＡＢループ（ｒ−ｈｕ−ｍｅｔＧ−ＣＳＦのアミノ酸５８〜７２）又はＣＤループ（ｒ−ｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸１１９〜１４５）、これらのループより好ましくはないがアミノ末端（アミノ酸１〜１０）の改変により、Ｇ− ＣＳＦＧ−ＣＳＦレセプター結合を除去せずに生物機能を変えることができる。例えば、（１）例えばプロテアーゼがＧ−ＣＳＦ分子に作用する能力を低下させることにより又は、上記のようにＧ−ＣＳＦ分子の所定の特徴を変化させる（例えば血清もしくは他の半減期を増加させるか又は抗原性を低下させる）ように機能する１個以上のポリエチレングリコール分子もしくは経口製剤用腸溶性コーティング等の化学修飾をＧ−ＣＳＦ分子に加えることにより、Ｇ−ＣＳＦ分子の半減期を増加させる（又は例えば経口剤形を製造する）こともできるし、（２）Ｇ−ＣＳＦＧ−ＣＳＦレセプター輸送メカニズムを介する細胞侵入によりシグナル変換を行う別のサイトカイン又は別のタンパク質等の別のタンパク質の一部又は全部とＧ−ＣＳＦとを結合するなどしてハイブリッド分子を作成することもできるし、（３）例えば（非改変Ｇ−ＣＳＦ分子に比較して）好中球を選択的に刺激する能力等の生物活性を増加させることができる。このような改変は上記例に限定されない。上記データから観察される別の特徴は、安定化表面相互作用が生物活性に影響し得ることである。これは類似体２３と４０を比較すると明白である。類似体２３は２８位の中性帯電アラニン残基を同位の帯電アスパラギン残基で置換したものであり、この置換の結果、（本明細書に開示のチミジン取り込みアッセイにより測定されるように）生物活性は５０％増加した。２８位のアスパラギン残基は１１３位のアスパラギン残基との表面相互作用を有しており、両者の残基は負に帯電しているので、（同様の帯電部分の排斥により）所定量の不安定が存在する。他方、１１３位のアスパラギンを中性帯電アラニンで置換すると、（本アッセイシステムでは）生物活性はゼロまで低下する。このことから明らかなように、１１３位のアスパラギンは生物活性に重要であり、２８位のアスパラギンを除去すると、１１３位のアスパラギンが有する作用が増加する。上記のように製造した類似体及びＧ−ＣＳＦ構造に基づいてＧ−ＣＳＦレセプター結合に必要なドメインも決定した。Ｇ−ＣＳＦレセプター結合ドメインは（メチオニンを１位として）残基１１〜５７（Ａ及びＡＢ螺旋間）及び１００〜１１８（Ｂ及びＣ螺旋間）に位置する。外部ループ構造を改変し、レセプター結合領域を無傷のままにすることにより、Ｇ−ＣＳＦレセプターと結合することが可能な短縮分子を製造し、好中球を選択的に刺激するためのシグナル変換を開始することもできる。生物活性に必須であり、恐らくＧ−ＣＳＦレセプター結合又はシグナル変換にも必須であると予想される残基を同定した。二次構造の２つの異なる領域には２つの別個の部位が位置する。ここで「部位Ａ」なる部位は、螺旋束の他の２つの構成員間の塩橋接触により限定される螺旋上に位置する。第２部位「部位Ｂ」は比較的フレキシブルな螺旋ＡＢ上に位置する。ＡＢ螺旋はカルボキシ及びアミノ末端における残基の種類及び位置の理由から、局所ｐＨ変化の影響を受け易い。このフレキシブル螺旋の機能的重要性は、Ｇ−ＣＳＦレセプターとの結合時にコンフォーメンションを誘導適合できるという点にある。更に、直接突然変異及び間接相対タンパク質構造分析により確認されるように、Ｄ螺旋の延長部分もＧ− ＣＳＦレセプター結合ドメインである。ｒ−ｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのカルボキシ末端を欠失させると、ｈＧＨの場合と同様に活性が低下する（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８４（１９８９）参照）。類似のトポロジーを有すると予想されるＩＬ−６及びＧＭ−ＣＳＦ等の類似構造を有するサイトカインもＤ螺旋のカルボキシ末端に沿ってその生物活性の中心を有する（Ｂａｚａｎ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ１１：３５０−３５４（１９９０）参照）。Ｇ−ＣＳＦとｈＧＨとのＧ−ＣＳＦレセプター結合決定基の構造及び位置を比較すると、両者分子は類似のシグナル変換手段を有すると予想される。ｈＧＨでは２つの別個のＧ−ＣＳＦレセプター結合部位が確認されている（ＤｅＶｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３０６−３２（１９９１））。これらの結合部位の一方（部位Ｉと呼称する）は螺旋１及び２と螺旋４の間の結合領域であるｈＧＨの螺旋１の露出面上の残基により形成される。第２の結合部位（部位１１と呼称する）は螺旋１と螺旋３の表面残基により形成される。Ｇ−ＣＳＦに確認されたＧ−ＣＳＦレセプター結合決定基はｈＧＨに確認されると同一の相対位置に位置する。ＡＢ螺旋上の螺旋Ａ及びＢ間の結合領域に位置するＧ−ＣＳＦレセプター結合部位（部位Ａ）は、ｈＧＨの螺旋の小部分（残基３８〜４７）に報告されている位置と類似する。Ｇ−ＣＳＦのＡＢ螺旋における単一点突然変異は、（本アッセイで確認されるように）生物活性を著しく低下させるので、Ｇ−ＣＳＦレセプター−リガンド界面に作用するとも思われる。Ｇ−ＣＳＦレセプターの結合は、この領域の３¹⁰螺旋を不安定にし、リガンド／Ｇ−ＣＳＦレセプター複合体の結合エネルギーを改善するコンフォーメーション変化をもたらす。ｈＧＨレセプター複合体において、螺旋束の第１の螺旋はｈＧＨレセプターを二量体化するために必要な残基を結合部位の両方に与える。Ｇ−ＣＳＦの対応する螺旋（螺旋Ａ）の突然変異分析の結果、生物活性に必要な３個の残基が確認された。これらの３個の残基のうちでＧｌｕ２０及びＡｒｇ２４は螺旋Ｃに向かう螺旋束の１つの表面に位置し、（非対称単位における３分子のうちの２分子に存在する）Ａｒｇ２３の側鎖は螺旋Ｄに向かう束の表面に向いている。これらの生物学的に重要な残基の側鎖の位置は、ｈＧＨの場合と同様にＧ−ＣＳＦが螺旋Ａ及び螺旋Ｃ間の界面に沿って第２のＧ−ＣＳＦレセプター結合部位を有することを示す。ｈＧＨ分子とは対照的に、最初の１１個の残基の欠失は生物活性にほとんど影響しないので、Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端は制限された生物機能を有する。上述のように（例えば図２参照）、Ｇ−ＣＳＦは他のサイトカインとトポロジー類似性を有する。構造と上記生物化学試験との相関、突然変異分析及びｈＧＨレセプター複合体の特定残基の直接比較によると、Ｇ−ＣＳＦは２つのレセプター結合部位を有する。部位Ａは螺旋Ａ及びＤの界面に沿って存在し、小さいＡＢ螺旋中に残基を含む。部位ＢもＡ螺旋中に残基を含むが、螺旋Ａ及びＣの間の界面に沿って位置する。Ｇ−ＣＳＦとｈＧＨとの間の生物学的に重要な残基の構造と相対位置の保存は、共通のシグナル変換方法でレセプターが２地点で結合されることを示す１つの指標である。従って、Ｇ−ＣＳＦレセプター結合部位（残基２０〜５７及び１４５〜１７５）のいずれか一方の改変により、改変Ｇ−ＣＳＦレセプター結合ドメインを有するＧ−ＣＳＦ類似体を製造できるとみなされる。Ｇ−ＣＳＦタンパク質の三次元構造の知見と組成の相関により、Ｇ−ＣＳＦ類似体の体系的合理的製造方法が可能になる。上記実施例から明らかなように、構造のコア内の側鎖の寸法及び極性の制限は、全体構造が変化する前に分子がどの程度の変化に耐え得るかを決定する。配列表配列番号：１配列の長さ：５６５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：３０．．５５４配列配列番号：２配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：７配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：８配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：９配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１０配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１１配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１２配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１５配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１６配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１７配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１８配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：１９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２０配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２１配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２２配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２３配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２５配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２６配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２７配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２８配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：２９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３０配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３２配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３３配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３６配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３７配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３８配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：３９配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４０配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４１配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４２配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４４配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４５配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４８配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：４９配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５０配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５２配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５３配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５４配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５５配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５６配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５７配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５８配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：５９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６０配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６２配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６３配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６４配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６５配列の長さ：５４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６６配列の長さ：５９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列配列番号：６７配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：６８配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：６９配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７０配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７１配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７２配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７３配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７４配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７５配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７６配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号７７配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７８配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：７９配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８０配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８１配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８２配列の長さ：１７４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８３配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８４配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８５配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８６配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８７配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８８配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：８９配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９０配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９１配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９２配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９３配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９４配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９５配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９６配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９７配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９８配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：９９配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１００配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０１配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０２配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０３配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０４配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０５配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０６配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０７配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０８配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１０９配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号：１１０配列の長さ：１７５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０６Ｆ 17/50 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9191−5ＨＧ０６Ｆ 15/60 ４００ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）Ｇ−ＣＳＦ分子の三次元構造を含む情報を観察する段階と、（ｂ）前記観察した情報から前記Ｇ−ＣＳＦ分子上の少なくとも１つの被改変部位を選択する段階と、（ｃ）前記改変を有するＧ−ＣＳＦ分子を製造する段階と、（ｄ）任意に、前記Ｇ−ＣＳＦ分子が所望の特性を有するか否かを試験する段階とを含むＧ−ＣＳＦ類似体の製造方法。２．（ａ）Ｇ−ＣＳＦ分子の三次元構造のコンピューター表現を提供する段階と、（ｂ）前記コンピューター表現から前記Ｇ−ＣＳＦ分子上の少なくとも１つの被改変部位を選択する段階と、（ｃ）前記改変を有するＧ−ＣＳＦ分子を製造する段階と、（ｄ）任意に、前記Ｇ−ＣＳＦ分子が所望の特性を有するか否かを試験する段階とを含む、コンピューターに基づくＧ−ＣＳＦ類似体の製造方法。３．コンピューターによりＧ−ＣＳＦ類似体を製造する方法であって、（ａ）Ｇ−ＣＳＦ分子の部分の組成の表示、好ましくは各アミノ酸の三次元位置の表示、より好ましくはＧ−ＣＳＦ分子の各原子の三次元位置の表示を含めてＧ −ＣＳＦ分子の三次元構造を表示するための手段を前記コンピューターに備える段階と、（ｂ）前記表示を観察する段階と、（ｃ）前記分子の組成又は部分の位置の改変のための部位を前記表示上で選択する段階と、（ｄ）前記改変を有するＧ−ＣＳＦ類似体を製造する段階とを含む方法。４．（ａ）（ｉ）Ｇ−ＣＳＦ分子の座標を三次元空間で表現し且つ（ｉｉ）前記Ｇ−ＣＳＦ表現の変更及びその観察のための情報を入力できるように予めプログラムされたコンピューターを介してＧ−ＣＳＦ分子の三次元構造を観察する段階と、（ｂ）前記Ｇ−ＣＳＦ分子の前記視覚画像上の被改変部位を選択する段階と、（ｃ）前記コンピューターに前記改変のための情報を入力する段階と、（ｄ）前記コンピューターを介して前記改変Ｇ−ＣＳＦ分子の三次元構造を観察する段階と、（ｅ）任意に段階（ａ）〜（ｅ）を繰り返す段階と、（ｆ）前記改変を有するＧ−ＣＳＦ類似体を製造する段階と、（ｇ）任意に前記Ｇ−ＣＳＦ類似体が所望の特性を有するか否かを試験する段階とを含む、コンピューターに基づくＧ−ＣＳＦ類似体の製造方法。５．分子の三次元構造を表示するためのコンピューターに基づく装置であって、その改良が、Ｇ−ＣＳＦ分子の前記三次元構造を前記Ｇ−ＣＳＦ分子の組成と相関させるための手段を含むことを特徴とする装置。６．タンパク質の結晶化方法であって、（ａ）（ｉ）異なる塩濃度を各々有する塩溶液のアリコート又は（ｉｉ）異なる沈殿剤濃度を各々有する沈殿剤溶液のアリコートと前記のタンパク質の水性アリコートとを任意に自動化手段により結合する段階と、（ｂ）予備結晶形態の形成に基づいて前記結合したアリコートの少なくとも１つを選択するか、又は予備結晶形態が生成されない場合には、タンパク質の前記水性アリコートのタンパク質出発濃度を増加させ、段階（ａ）を繰り返す段階と、（ｃ）前記塩又は前記沈殿剤濃度を選択後、前記選択された濃度の存在下で前に選択しなかった前記溶液を用いて段階（ａ）を繰り返す段階と、（ｄ）所望の品質の結晶が得られるまで段階（ｂ）及び段階（ａ）を繰り返す段階とを含む方法。７．段階（ａ）による各結合を一定のｐＨ範囲で実施する請求項６に記載の方法。８．段階（ａ）の前記結合を核生成開始単位の存在下で実施する請求項６に記載の方法。９．（ａ）Ｎ末端メチオニンが任意である点、及び（ｂ）アミノ酸５８〜７２の１種以上が（ｉ）１種以上の別のアミノ酸で置換されているか、（ｉｉ）欠失しているか、又は（ｉｉｉ）化学的に修飾されている点において図１と異なるアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦ類似体。１０．図１のＧ−ＣＳＦ分子よりも耐タンパク分解性である請求項９に記載のＧ −ＣＳＦ類似体。１１．前記アミノ酸の少なくとも１個がポリエチレングリコール分子の付加により化学的に修飾されている請求項１０に記載のＧ−ＣＳＦ類似体。１２．（ａ）Ｎ末端メチオニンが任意である点、及び（ｂ）アミノ酸１１９〜１２５の１個以上が（ｉ）１個以上の別のアミノ酸で置換されているか、（ｉｉ）欠失しているか、（ｉｉｉ）化学的に修飾されている点において図１と異なるアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦ類似体。１３．図１のＧ−ＣＳＦ分子よりも耐タンパク分解性である請求項１２に記載のＧ−ＣＳＦ類似体。１４．前記アミノ酸の少なくとも１個がポリエチレングリコール分子の付加により化学的に修飾されている請求項１２に記載のＧ−ＣＳＦ類似体。１５．螺旋Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤの１個以上と結合することにより安定化されたＡＢループを有するＧ−ＣＳＦ分子。１６．螺旋Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤの１個以上と結合することにより安定化されたＣＤループを有するＧ−ＣＳＦ分子。１７．Ｌｙｓ１７→Ａｒｇ１７且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。１８．Ｌｙｓ³⁵→Ａｒｇ³⁵且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。１９．Ｌｙｓ⁴¹→Ａｒｇ⁴¹且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。２０．Ｌｙｓ^17.24.35→Ａｒｇ^17.24.35且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ− ＣＳＦ類似体。２１．Ｌｙｓ^17.35.41→Ａｒｇ^17.35.41且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ− ＣＳＦ類似体。２２．Ｌｙｓ^24.35.41→Ａｒｇ^24.35.41且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ− ＣＳＦ類似体。２３．Ｌｙｓ^17.24.35.41→Ａｒｇ^17.24.35.41且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。２４．Ｌｙｓ^17.24.41→Ａｒｇ^17.24.41且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ− ＣＳＦ類似体。２５．Ｇｌｎ⁶⁸→Ｇｌｕ⁶⁸且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。２６．Ｃｙｓ^37.43→Ｓｅｒ^37.43且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。２７．Ｇｌｎ²⁶→Ａｌａ²⁶且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。２８．Ｇｌｎ¹⁷⁴→Ａｌａ¹⁷⁴且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。２９．Ａｒｇ¹⁷⁰→Ａｌａ¹⁷⁰且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３０．Ａｒｇ¹⁶⁷→Ａｌａ¹⁶⁷且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３１．１６７位が欠失しており且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３２．Ｌｙｓ⁴¹→Ａｌａ⁴¹且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３３．Ｈｉｓ⁴⁴→Ｌｙｓ⁴⁴且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３４．Ｇｌｕ⁴⁷→Ａｌａ⁴⁷且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３５．Ａｒｇ²³→Ａｌａ²³且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３６．Ｌｙｓ²⁴→Ａｌａ²⁴且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３７．Ｇｌｕ²⁰→Ａｌａ²⁰且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３８．Ａｓｐ²⁸→Ａｌａ²⁸且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。３９．Ｍｅｔ¹²⁷→Ｇｌｕ¹²⁷且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４０．Ｍｅｔ¹³⁸→Ｇｌｕ¹³⁸且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４１．Ｍｅｔ¹²⁷→Ｌｅｕ¹²⁷且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４２．Ｍｅｔ¹³⁸→Ｌｅｕ¹³⁸且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４３．Ｃｙｓ¹⁸→Ａｌａ¹⁸且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４４．Ｇｌｎ^12.21→Ｇｌｕ^12.21且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４５．Ｇｌｎ^12.21.68→Ｇｌｕ^12.21.68且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ− ＣＳＦ類似体。４６．Ｇｌｕ²⁰→Ａｌａ²⁰；Ｓｅｒ¹³→Ｇｌｙ¹³且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４７．Ｍｅｔ^127.138→Ｌｅｕ^127.138且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４８．Ｓｅｒ¹³→Ａｌａ¹³且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。４９．Ｌｙｓ¹⁷→Ａｌａ¹⁷且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５０．Ｇｌｎ¹²¹→Ａｌａ¹²¹且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５１．Ｇｌｎ²¹→Ａｌａ²¹且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５２．Ｈｉｓ⁴⁴→Ａｌａ⁴⁴且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５３．Ｈｉｓ⁵³→Ａｌａ⁵³且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５４．Ａｓｐ¹¹⁰→Ａｌａ¹¹⁰且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５５．Ａｓｐ¹¹³→Ａｌａ¹¹³且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５６．Ｔｈｒ¹¹⁷→Ａｌａ¹¹⁷且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５７．Ａｓｐ²⁸→Ａｌａ²⁸；Ａｓｐ¹¹⁰→Ａｌａ¹¹⁰且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５８．Ｇｌｕ¹²⁴→Ａｌａ¹²⁴且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。５９．Ｐｈｅ¹¹⁴→Ｖａｌ¹¹⁴；Ｔｈｒ¹¹⁷→Ａｌａ¹¹⁷且つＮ末端メチオニンが任意である点においてアミノ酸配列が図１と異なる、任意に医薬的に有効なキャリヤー中のＧ−ＣＳＦ類似体。