JPH08506591A - 乳ガンの治療のためのリガンドアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 成長ホルモンはそれらのレセプターと３元複合体を生成すること、即ち、ホルモンの部位１がまずレセプターの１分子と結合し、次ぎにホルモンの部位２が他のレセプター分子と結合して１：２複合体を生成することを見いだした。この現象は、類似の配座構造をもつ他のリガンドにも見られると考えられる。この現象に基づくアッセイは、リガンドアゴニスト及びアンタゴニストの同定に有用である。部位１と２は、３元複合体を生成するリガンドのアミノ酸配列変異型の形成を促進するため構造的に同定される。新規変異型の成長ホルモン、プロラクチン、胎盤ラクトゲン及びその他の関連したリガンドが提供される。３元複合体についてのこの研究の結果、これらのリガンドのレセプターに対する選択された抗体は、リガンドアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力のあることが決定された。新規成長ホルモン及び抗成長ホルモンレセプター抗体としての新規用途が記載されている。乳ガン細胞の成長を阻害する方法もまた記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 乳ガンの治療のためのリガンドアンタゴニスト発明の背景 発明の分野 本発明はポリペプチドリガンド及ひレセプター相互作用の領域に関するもので あり、特に乳ガンの治療のためのアンタゴニストの使用に関するものである。背景技術の説明 リガンド誘導レセプターオリゴマー化は、細胞外リガンド結合領域を含むチロ シンキナーゼレセプターという大きな群へのシグナル導入の機構として提案され てきた（総説についてはYarden et al.，Ann．Rev．Biochem．57:443(1988) 及 びUllrichetal.，Cell 61:203(1990) を参照）。これらのモデルにおいて、レセ プター（Ｒ）あたりのホルモン１分子（または１サブユニット）（Ｈ）の結合は Ｈ₂Ｒ₂複合体の生成を誘発すると考えられてきた。例えば架橋および非解離的電 気泳動の研究は、表皮成長因子（ＥＧＦ）はＥＧＦレセプターの二量化とそれに 続く細胞内チロシンキナーゼの自動燐酸化と活性化を促進することを示唆してい る（Shector et al.，Nature278:835(1979); Schreiber et al.，J．Bio．Chem ．258:846(1983); Yardenetal.，Biochemistry 26:1434(1987); Yarden et al. ，Biochemistry 26:1443(1987)）。インシュリンレセプター（Kahn et al.，Pro c．Natl．Acad．Sci.，U．S．A．75:4209(1978); Kubar et al.，Biochemistry 28:1086(1989); Heffetz et al.，J．Biol．Chem．261:889(1986)、血小板由来 成長因子（ＰＤＧＦ）レセプター（Heldin et al.，J．Biol．Chem．264:8905(1 989); Hammacher et al.，EMBO J．8:2489(1989); Seifert et al.，J．Biol.Ch em．264:8771(1989)）及びインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）レセプター（ Ikari et al.，Mol．Endocrinol．2:831）を含む他のチロシンキナーゼレセプタ ーの研究は、レセプターのオリゴマー化は生物学的効果と固く結ばれていること を示している。他のグループは最近、細胞外結合領域との複合体としてポリペプ チドホルモンを結晶化した（Lambert et al.，J．Biol．Chem．264:12730(198 9); Gunther et al.，J．Biol．Chem．265:22082(1990)）。しかし、これらの及 びその他のレセプターにおけるリガンド誘導による変化の構造的摂動と必要性の 詳細な分析は、これらの膜関連系の複雑さと高度に精製した天然または組換えレ セプターの適当な量の不足のために妨げられている。 精製されたレセプターが入手できれば、ホルモン−レセプター複合体の性質が 認識されるようなアッセイ方法が構築される。アメリカ特許第５０５７４１７号 においてはｈＧＨ結合アッセイが、組換えｈＧＨレセプター（ｈＧＨｂｐ）また はｈＧＨ結合蛋白の細胞外領域と結合するため低温のｈＧＨとの¹²⁵Ｉ−ｈＧＨ を用いて行われ、生じた複合体をポリエチレングリコールを添加してｈＧＨｂｐ に対する抗体で処理し得られた複合体を沈澱させている。これらの免疫沈澱アッ セイはｈＧＨがｈＧＨｂｐと１：１の複合体を形成していることを示唆する。こ の免疫沈澱アッセイは、結合した¹²⁵Ｉ−ｈＧＨの量を正確に検出するが、１： １のモル比の指示は不正確である。 ｈＧＨレセプターおよび結合蛋白のために種々の固相アッセイが用いられてい る。そのようなアッセイは、結合ｈＧＨ量を検出するが、ｈＧＨのレセプターに 対するモル比率は検出しない。ｈＧＨレセプターを含む膜分画または固相の結合 アッセイは、活性レセプターの総量及び／または内因性ｈＧＨ結合量の検出がで きないのでｈＧＨとレセプターのモル比の決定には適当でない。ＥＧＦにおける ような過去の研究に基づき、ｈＧＨ−レセプター複合体はＨ₂Ｒ₂テトラマーであ ろうと考えられている。 ヒトの肝臓からクローニングしたｈＧＨレセプター（Leung et al.，Nature 3 30:537(1987)）は、単一の細胞外領域（約２８ｋＤ）、貫膜セグメント及び公知 のチロシンキナーゼや他の蛋白と相同でない細胞内領域（約３０ｋＤ）を持って いる。しかしながら、ｈＧＨレセプターの細胞外領域部分はプロラクチンレセプ ターの細胞外領域と構造的に関連し（Boutin et al.，Cell 53:69(1988)）そし て少なくとも８コの他のサイトカイン及び関連するレセプターと広義に関連して いる。Escherichia coli内で発現するｈＧＨｂｐは１リットルあたり数十ミリグ ラム程度分泌される（Fuh et al.，J．Biol．Chem．265:3111(1990)）。高度に 精製した ｈＧＨｂｐは、血清中に見いだされる天然のｈＧＨｂｐに比へｈＧＨに対して同 等の特異性と高度の親和性（Ｋ_Dは約０．４ｎＭ）を保持している。 ｈＨＧは、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン及びその他の成長ホルモンの遺伝 子的および種的変異型を含む相同なホルモン類の一員である（Nicoll et al.，E ndocrine Reviews7:169(1986)）。その類の中でｈＧＨは広い種特異性を持ち、 そしてクローン化した体因性の（Leung et al.，Nature 330:537(1987)）または プロラクチンレセプター（Boutin et al.，Cell 53:69(1988)）の何れかと結合 する点において特異的である。ｈＧＨにクローン化した遺伝子はEscherichia co li中の分泌形態として発現され（Chang et al.，Gene 55.189(1987)）そのＤＮ Ａ及びアミノ酸配列が報告されている（Goeddel et al.，Nature 281:544(1979) ; Gray et al.，Gene 39:247(1985)）。ｈＧＨの三次元構造はまだわかっていな い。しかしブタの成長ホルモン（ｐＧＨ）の三次元折りたたみパターンは適度の 解決と精製で報告されている（Abdel-Meguid et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． U．S．A.84:6434(1987)）。ｈＨＧレセプターと抗体結合部位は、同族体スキャ ニング突然変異誘発で同定されている（Cunningham et al.，Science 243:1330( 1989)）。Ｎ−端末アミノ酸で欠失または変異させた成長ホルモンは公知である 。次を参照せよ。Gertler et al.，Endocrinology 118:720(1986); Ashkenazi e t al.，Endocrinology 121:414(1987); Binder，Mol．Endo．7:1060(1990); WO 90/05185。ｈＧＨのアンタゴニスト変異型はChen et al.，Mol．Endo．5:148(19 91)とそこに引用の文献ならびにWO 91/05853に記載がある。ｈＧＨ変異型はCuni ngham et al.，Science244:1081(1989); Science 243:1330(1989)に開示されて いる。 多くのポリペプチドリガンドとレセプターとの相互作用の様式は明確でないの で、そのようなリガンドのアミノ酸配列変異型を作り出して所望の性質を得るこ とは困難である。本質的に、本技術においては変異型を無作意に、つまり幾つか の場合には類似の作用をもつリカンドや動物同族体の相同性分析から、またはフ ラグメント例えばトリプシン消化フラグメントの分析からの案内によって導いて いる。ついで本技術は、所望の活性たとえばアゴニストまたはアンタゴニスト活 性の候補となるべきものをスクリーニングする。このスクリーニング方法は、例 えば形質転換動物を使ったりして（WO 91/05853）長期間と高い経費がかかる。 候補品の選択の効率化の改良の方法が必要である。特にアンタゴニストやアゴニ ストとしての候補品に焦点をあてる方法が必要とされている。アンタゴニストと は天然のリカンドの生物学的活性を阻害しまたは拮抗する物質であり、一方アゴ ニストとは天然のリカンドよりもそれ自体大きな活性をもち但しそれ自体は生物 学的活性をもたないものである。 プロラクチン（ＰＲＬ）及び成長ホルモンが乳ガンの発達と進行に役割をもっ ていることは実験動物で良く確立されている（Tornell et al.，Int．J．Cancer 49:114(1991)）。例えば高い血清レベルの成長ホルモンは乳ガンの形成を誘発し （Tornell，id.）、いっぽう成長ホルモンの循環レベルの減少は乳ガンの抑制と 関連している（Phares et al.，Anticancer Res．6:845(1986)）。高い血清レベ ルの乳腺刺激ホルモンは若干の研究では乳ガン患者で見いだされているが（Madd ox et al.，Brit．J．Cancer 65:456(1992)）、ほかの研究ではそうではない（L ove et al.，Cancer 68:1401(1991)）。乳ガンの生体組織検査の４０−７０％は プロラクチンレセプターの存在が陽性である（Bonneterre et al.，Cancer Res ．47:4724(1987); Murphy et al.，Cancer Res．44:1963(1984)）。 培地におけるヒトの乳ガン細胞のほとんどはプロラクチンレセプターを含んで いる。実際、乳ガン細胞系の大多数は２−１０倍のプロラクチンレセプターを過 剰発現している（Shiu，"Prolactin，Pituitary Hormones，and Breast Cancer, " in Hormones and Breast Cancer，Pike et al.，eds.，Cold Spring Harbor L aboratory，Cold Spring Harbor，NY(1981)）。乳腺刺激ホルモンは培地におい てヒト乳ガン細胞系ＭＣＦ−７の成長を誘導することが見いだされている（Bisw as et al.，Cancer Res．47:3509(1987)）。Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ−７ヒト乳ガン 細胞系は共に、ヌードマウスでの固形腫瘍として成長するとプロラクチンおよび 成長ホルモンに感応する（Welsch et al.，Cancer Lett．14:309(1981)）。Ｔ４ ７Ｄ及びＭＣＦ−７は何れも高いレベルのプロラクチンレセプターを含んでおり 、しばしば乳腺刺激ホルモンや乳ガンの関連性のためのモデルとして用いられる （Shiu，id.）。 従って本発明の目的は、アゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドリガン ドの効率的な選択のための改良された方法を提供することである。 他の目的はリガンドレセプターと１：２の逐次複合体を形成するリガンドを検 出する方法の提供である。 別の目的は、そのようなリガンド−レセプターの１：２複合体の形成を阻害し または促進する能力のある候補物質をアッセイすることである。 追加的な目的は、アゴニストやアンタゴニストとして作用する能力のあるポリ ペプチドリガンドのアミノ酸配列変異型の提供である。 他の目的は、ガン細胞による例えばプロラクチンレセプターのような成長ホル モンレセプターまたは成長ホルモン類似体レセプターの発現を特徴とする、乳ガ ンまたはその他のガンの治療の提供である。 本発明のその他の目的、内容や特徴は次の説明や請求の範囲を検討することか ら更に明瞭となるであろう。発明の概要 予期しなかったことに我々は次のことを見いだした。すなわち成長ホルモン及 びそれに属する一群の配座リガンドは、最初のリガンド部位（部位１）が一つの レセプターと結合し次いで第２の部位（部位２）が他のレセプター分子と結合し て１：２複合体を生じる、という具合にレセプターと１：２複合体を形成する能 力があることを見いだした。本発明の適用されるリガンドは、非ヘリックス（ら せん）アミノ酸配列で両端が分離され終わっている４つの両親媒性の逆平行アル ファヘリックス領域を含む単量体リガンドである。以下に詳細に説明するように 、部位１及び／または部位２へアミノ酸配列変異型を導入することにより、該リ ガンドのアゴニストまたはアンタゴニストアミノ酸配列変異型を効果的にデザイ ンすることが、成長ホルモン、プロラクチン及び胎盤ラクトゲンについての我々 の研究との類推で可能となった。 ２つの部位の複合体形成アッセイは、リガンドアゴニストまたはアンタゴニス トである物質のスクリーニングに用いられる。そのような物質は本質的に限定が なく、かつリガンドや結合蛋白またはレセプター変種のアミノ酸配列変種と同様 に有機の非蛋白化合物を含むものである。 そのようなアルファヘリックスリガンドの新規なアミノ酸配列変種もまた記載 される。特に、リガンドの部位２でのレセプターとの親和性を減少させまたは消 滅させる部位２におけるアミノ酸配列変異から成るところのポリペプチドリガン ドのアンタゴニストが提供される。理想的にはリガンドアンタゴニスト類似体は 、部位２のレセプター親和性が低いかまたは無く、そして部位１のレセプター親 和性が高い。 更には、一方または両方の部位でのリガンド親和性を上昇する部位１または／ 及び部位２で変異をもつアゴニストリガンドアミノ酸配列変種が提供される。好 ましい実施態様においては両方の部位の速度定数は、２量体複合体のリガンドの 平均滞留時間が所望の反応をおこす複合体に必要な時間より大きいか同等である ように選択される。リガンドのポリペプチドアゴニスト変種は以下から成る方法 で同定される。すなわち（ａ）変異をリガンドに導入してアゴニスト候補を作成 する；（ｂ）候補がその第一のリガンド部位を介してレセプターに結合する親和 性を決定する；（ｃ）候補がその第二のリガンド部位を介してレセプターに結合 する親和性を決定する；そして（ｄ）もしアゴニストが天然のリガンドより大き い親和性で第一および第二の部位の一方または両方で結合したときは、そのアゴ ニストを候補として選択する。 本発明によれば、通常、まず第一のリガンド部位を介してレセプターポリペプ チドに結合し次いで第一部位とは別の第二のリガンド部位を介してレセプターポ リペプチドの第二のコピーに結合するポリペプチドリガンドのアゴニストまたは アンタゴニストを検出する方法を提供する。その方法はリガンドの第二のレセプ ター結合部位における、レセプターへのポリペプチドリガンドの親和性に対する 候補品の効果を決定することから成る。部位１の相互作用は、上述のＭａｂ５の ような部位２をブロックする抗体を用いる免疫沈澱で決定される。もしくは実質 的にレセプターと１：１の複合体のみを形成する野生型のリガンドの量を決定し 、次いでその比率でレセプターと天然のリガンドと拮抗する候補品の能力を決定 する。部位２の相互作用は三元複合体を形成する候補品の能力を調べることによ り アッセイされる。 候補品がリガンドのポリペプチド類似体であるときは、部位２での類似体の結 合の欠如をアンタゴニスト活性と積極的に関運づけることができる。レセプター 部位２に対して天然のリガンドより大きい親和性で結合する能力は、アゴニスト 活性と関連している。アンタゴニスト及びアゴニスト活性は共に、天然のリガン ドよりも大きい親和性で部位１に結合する候補の能力と積極的に関連している。 小さい分子や他の非類似の候補は、部位１及び／または部位２への天然のリガン ドの結合を促進または抑圧する能力についてアッセイされる。アンタゴニストは 、部位１及び／または部位２、但し好ましくは部位２ての天然のリガンド−レセ プター結合を阻害する能力についてスクリーニングされる。これは、たとえは部 位２不能のリガンド変異型をポジティブコントロールとして用いることにより、 部位１でリガンドレセプター結合を抑圧せず部位２で阻害するアンタゴニストの 同定を許容する。 候補品の効果は、天然のポリペプチドリガンドの存在下、または天然のポリペ プチドリガンドの活性と比較して測定することが出来る。最初のやりかたにおい ては、野生型リガンドによるレセプター相互作用における候補品の効果が測定さ れる。次の場合においては野生型リガンドの活性が正の対照として使用され、候 補品（通常はリガンドのアミノ酸配列変異型）のレセプター結合特性を野生型リ ガンドの不存在下に測定する。しかし一般的にはアゴニストやアンタゴニスト候 補のアッセイは、野生型リガンドの存在下での競合アッセイで最も良く行われる 。 我々はまたＧＨレセプターを結合する能力のある選択された抗体はＧＨのアン タゴニストまたはアゴニストとして作用することを決定した。従って成長ホルモ ンの欠乏または過剰の治療におけるＧＨのアンタゴニズムやアゴニズムの方法が 提供される。 本発明の他の観点は、細胞を成長ホルモン類似体の効果的量と接触させ、プロ ラクチンレセプターを発現する細胞の成長を阻害する方法を提供する（ここで、 該類似体はプロラクチンレセプターと結合するアンタゴニストである）。 本発明の他の観点では、患者に成長ホルモン類似体の効果的量を投与し、患者 の乳ガンの治療方法を提供する（ここで、類似体はプロラクチンレセプターと結 合するアンタゴニストである）。図面の簡単な説明 図１ａ及び１ｂ。図１ａ：ｈＧＨとｈＧＨｂｐの間の複合体の結晶。このｈＧ Ｈ／ｈＧＨｂｐ複合体は、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）と１００ｍＭのＮａＣ ｌで平衡化したセファデックスＧ７５−１００サイズの排除カラム上で複合体を 精製することによって得られる。複合体を含む高分子量のピークは、遊離のｈＧ Ｈから分離し、プールし、濃縮する。成分は、１ｍｌ／ｍｉｎの流量で線形アセ トニトリル勾配でアイソクラチックに溶離する（図１ｂ）。勾配は破線で示した 矢印のところで開始する；２１４ｎｍでの吸収を実線で示す。 図２。４：３、３：１、２：１、１：１及び０．５：１に対応する種々の比率 のｈＧＨｂｐとｈＧＨのゲル濾過クロマトグラフィーである。各々の混合物にお けるｈＧＨ濃度（ｈＧＨが各々２０μＭ及び４０μＭである場合の１：１及び０ ．５：１の比率のときを除き１０μＭに固定）とｈＧＨｂｐ濃度は、２８０ｎｍ での吸収に基づく。セファローズ１２ＦＰＬＣカラム（Pharmacia）に１００マ イクロリットルの蛋白サンプルを加え、そして溶離した。ピークは２８０ｎｍに おける吸収で監視した。 図３。複合体が種々の抗モノクローナル抗体で沈澱されるｈＧＨｂｐへのｈＧ Ｈの結合のスキャッチャード分析である。 図４。ｈＧＨｂｐと結合するため作り出されたｈＧＨｂｐとヒトプロラクチン （パネルＡ）もしくはヒト胎盤ラクトゲン（パネルＢ）の変種との２：１比率ま たはｈＧＨ（パネルＣ）のゲル濾過クロマトグラフィー。 図５。ｈＧＨとｈＧＨｂｐとの滴定熱量測定。ｈＧＨｂｐ（１０ｍＭトリス（ ｐＨ：８.０）中１５μＭ）を１．３７ｍｌの滴定セル（ＭＣ２滴定熱量計、Mic rocal Incorporated，Northampton，MA）に入れ、２５℃で平衡化する。この溶 液にｈＧＨ（１０ｍＭトリス（ｐＨ：８．０）中４３７μＭ）を４μＬ増加分加 える。各々の注入はそれらの間に５分間の間隔をとって８秒間おこなう。 図６。ｈＧＨとｈＨＧｂｐを１：１の比率で混合する前（−）及び後（．．） のそれらの個々のスペクトルの和の遠紫外部（パネルＡ）または近紫外部（パネ ルＢ）における円二色性スペクトル。遠紫外および近紫外スペクトルは、各々０ ．０１ｃｍと１．０ｃｍのセル中で０．２ｎｍおよび０．５ｎｍの間隔で集めた 。 図７。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを１：１の比率で混合する前（−）及び後（．．） のそれらの個々のスペクトルの和の蛍光発光スペクトル。 図８。ｈＧＨの順次の添加による１０ｎＭＳ２３７Ｃ−ＡＦのホモクエンチン グ。培養後、島津ＲＦ５０００Ｕ分光蛍光光度計を用い４９０ｎｍの励起１と５ １２ｎｍの発光１（バンド幅は各々３ｎｍ及び１０ｎｍ）で蛍光測定を行った。 図９。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのｈＧＨ誘導二量化のＩＣ₅₀測定。結合緩衝液（20mM Tris.HCl pH 7.5，0.1% BSA，0.02% NaN₃）中のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（図８に記載 のようにして製造）の系列的希釈（３倍）を２０ｎＭから０．０８ｎＭの範囲で 行い、１．０ｍｌのアリコートをアッセイ管に分配した。同様にｈＧＨを系列的 に但し１ｍＭから０．００４ｍＭの範囲で希釈した。ｈＧＨ希釈のアリコート１ ０ｍｌ（ｈＧＨとＳ２３７Ｃ−ＡＦモル比は１：２）と緩衝液のみをアッセイ管 を含むＳ２３７Ｃ−ＡＦに加え、混合し、そして暗所で２５℃に５時間かけて平 衡化した。平衡化のあと、励起バンド幅を１０ｎＭとした以外は前述と同様（図 ８）にして蛍光を測定した。ＩＣ₅₀値を、４パラメーターの曲線適合から得た半 極大値Ｄ Ｆ／Ｆｏを与えるｈＧＨ濃度として計算した。６つの独立した実験の 平均から０．５４（±０．１４）というＩＣ₅₀値を計算した。 図１０。過剰のｈＧＨまたはｈＧＨ変異体によるｈＧＨ誘発Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ 二量化の反転。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦとｈＧＨを各々１０ｎＭ及ひ５ｎＭの濃度まで 結合緩衝液で希釈し、１．０ｍｌのアリコートをアッセイ管に入れる。次いでｈ ＧＨ、変異体または緩衝液の系列的希釈のみを加え、混合物を暗所で２５℃に５ 時間培養して平衡化させ、図１で述べたようにして蛍光を測定する。データの点 は３回の測定の平均値で、１はｈＧＨ、ｓはＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ、ｎはｈＰ Ｌリクルートを表す。誤差のバーはＳＥＭを与える。 図１１。ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂の結晶構造。太い線の中央の上部はｈＧＨ分 子を表す。このｈＧＨ分子は２つのｈＧＨｂｐ分子（一つは左側、そしてもう一 つは右側）に結合する。これらｈＧＨｂｐ分子の各々は、単一鎖で結合した２つ の領域をもつ；上方の領域はｈＧＨ分子と同じ高さであり、他の領域は垂直で図 の下方へと突出している。ｈＧＨｂｐのこれらの最後の２つの領域は最下部で互 いに接触している。 図１２。成長ホルモンレセプターに特異的な抗体に対応する体重増加。モノク ローナル抗体であるＭａｂ２６３を８匹のラットに投与（１．０５ｋｇ／ｋｇ） し、対照群には希釈剤のみを投与する。毎日の体重を測定する。 図１３。ｈＧＨ−ｍＧ−ＣＳＦハイブリッドレセプター含有の、ｈＧＨ−誘発 ＦＤＣ−Ｐ１細胞の増殖（Bass et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．88: 4498(1991)）。細胞を、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−３、１０μＭのｂ−メルカプトエ タノール及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地 中において３７℃、５％ＣＯ₂で成長させる。細胞をＩＬ−３無しに同じ培地で 洗浄しそして、高い濃度のｈＧＨで１８時間処理する前に、４ｘ１０⁵／ｍｌ（ １）、２ｘ１０⁵／ｍｌ（１）及び１ｘ１０⁵／ｍｌ（ｎ）密度の１００μｌのア リコート中の９６−ウエルのプレートに植える。ＤＮＡ合成を測定するため、細 胞を２０μｌの培地内で１μＣｉ／ウエルの添加によって［³Ｈ］−チミジンで パルスを行う。４時間後、細胞を収集しガラスフィルター上で洗浄する。シンチ レーションカクテルの２ミリリットルを添加し、ベックマンＬＳ１７０１シンチ レーションカウンターで計数を行う。各々のデータ点は３回の測定の平均であり 、誤差のバーは標準偏差である。 図１４。ｈＧＨ変異型によるｈＨＧ−誘発細胞増殖のアンタゴニズム。細胞を 図１３のようにして作成し、高い濃度の部位１変異体（Ｋ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ ）（１）、部位２変異体（Ｇ１２０Ｒ）（ｎ）、部位１変異体／部位２変異体の 結合増強物（Ｈ２１Ａ／Ｒ６４Ｋ／Ｅ１７４Ａ／Ｇ１２０Ｒ）（ｎ）及び野生型 ｈＧＨ（１）を加えた１ｎＭのｈＧＨで培養する。 図１５ａ、１５ｂ及び１５ｃ。ＩＬ−６アンタゴニストまたはアゴニストを作 成における変異に適したヘリックス部位を仮定した車輪状のプロット。これらの 図の残基の番号づけはＮ−末端を前残基として開始していることに注意。 図１６。ｈＧＨ、ＰＲＬまたはＧ１２０Ｒに対するＴ４７Ｄ細胞の応答。Ｔ４ ７Ｄ細胞を、示されたホルモン濃度で培養する。細胞濃度は１０⁵／ｍｌであり 、最終容量は１００μｌであった。誤差のバーは３回の測定からの標準偏差であ る。白ヌキのバーは亜鉛の追加のないアッセイを表し、灰色のバーは２５μＭの 硫酸亜鉛でのアッセイを表す。対照はアッセイ培地のみである。 Ｔ４７Ｄ細胞増殖のアゴニスト（Ａ）またはアンタゴニスト（Ｂ）としてのｈ ＧＨまたはＧ１２０Ｒの用量依存的アッセイ。（Ａ）ではｈＧＨまたはＧ１２０ Ｒを２５μｌの硫酸亜鉛と共にまたは無しでＴ４７Ｄ細胞で培養し、増殖を³Ｈ −チミジンの取り込みによって測定する。（Ｂ）においてはＴ４７Ｄ細胞を硫酸 亜鉛と共にまたは無しで１ｎＭのｈＧＨと共に高い濃度のＧ１２０Ｒで培養する 。 図１８。ＭＣＦ−７細胞の、種々のｈＨＧ類似体に対する応答。ＭＣＦ−７細 胞を、５０μＭの硫酸亜鉛と共に（灰色のバー）または無しに（白ヌキのバー） ３日間ｈＧＨ、ＰＲＬまたはＧ１２０Ｒと共に培養する。好ましい実施態様の説明 本発明の方法はアゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドリガンドの同定 を容易にする。一般的に、本発明は次のように実施される。 まず、レセプターと１：２の３成分複合体となるリガンドを同定するために、 リガンドとそのレセプターの会合の化学量論を決める。会合の化学量論は、下記 の方法の一つを用いる生理学的条件下でリガンドとレセプターに対する比率を測 定して決定される。すなわちＸ線結晶学、セファローズゲルを用いたサイズ排除 クロマトグラフィ、抗体結合研究、走査熱量測定、ＢＩＡ−コア分析およびＣＤ または蛍光スペクトル分析。リガンド−レセプター複合体のＸ線結晶構造は有用 であるが、決して記載の化学量論を決定するに必要なものでない事を了解すべき である。好ましくは、蛍光ホモクエンチング方法は以下に述べるようにして用い られる。この方法においてはレセプターは次のように位置したフルオレセインで ラベルされる。すなわちレセプター２分子が滴定で定められたようにリガンドで 結合されたとき、フルオレセイン分子は互いにクエンチし溶液のフルオレセイン は減少する。ここに記載の技術はそれ自体が公知であり、当業者の技術範囲内に ある。 好ましくはレセプターの細胞外領域が化学量論分析で用いられる。すなわち分 析は、膜挿入または疎水性会合の能力のなし削除されたまたはその他の処理をさ れたトランスメンブラン領域を持つレセプター変異型と共に試験管内で溶液中で 行われる。必要に応じ、細胞質領域もまた削除される。そのようなレセプターは 公知であり、組換え細胞培養内で発現しそしてそこから回収できる。 もしレセプターが１コより多いポリペプチド鎖を含有しておれば、好ましくは レセプター製造はレセプターポリペプチド鎖の全てを含有する。また、もしも３ 成分複合体が２つの異なったレセプター鎖から成っておれば（例えばα及びβ鎖 を含むＩＬ−２またはＩＬ−３レセプター複合体の場合；Teshigawa et al.，J. Exp．Med．165:223(1978)など）、分析は両方の鎖で行われる。この場合、各々 のレセプター鎖への結合は連続して一元的にのみ進行する。会合の順序は、異な るレセプター分子が含まれているときは容易に決定される。 幾つかのレセプターは１：２複合体をつくるが、レセプターは各々が１つより 多い鎖を含むことがある。もしリガンドが鎖の１コと結合するのみで他のものは 結合鎖の適当なコンホメーションの保持に必要でないときは多鎖レセプターの使 用は不要であろう；リガンド結合に必要な鎖のみ存在が必要である。 １：２複合体を形成するリガンドは、２つの別の結合部位を介してそれらのレ セプターと結合する。レセプター類がまず一つの部位（部位１）にそして次に他 の部位（部位２）に、連続的な順序で２つの部位に結合することが見いだされた ことが本発明の顕著な特徴である。この逆の順序の発生は見いだされていない。 この理解はアンタゴニストリガンドの生成のために特に重要である。第一の部位 へのリガンドの親和性が保存される（もし高められるのでなければ）ことは重要 である。さもなくばリガンド類似体は全くレセプターと結合しない。その一方、 第２の部位の結合の効果的な破壊または阻害はアンタゴニスト活性のための属性 である。 本発明によってリガンド結合部位とその添加順序が定められる。部位１と２は 、以下に詳しく説明するように候補リガンドのコンホメーションを成長ホルモン のそれと比較することによって同定される。それらはアラニン走査または他の系 統的な変異誘発方法、たとえばカセット突然変異、ＰＣＲ突然変異またはアラニ ン走査などで更に十分に解決される。コンホメーションの分析は変異型を作成し スクリーニングする前にかなり狭められるべき潜在的部位１と２残基の分野を許 容する。 いずれの場合においても、機能的部位１と不能部位２変異を持つリガンド類似 体は、それが三元のリガンド：レセプター複合体を形成できないことで同定され る。ただしそのような変異型はレセプターと１：１の複合体を形成可能であろう 。一方、機能的部位２と不能部位１変異を持つ類似体は、レセプターとは全く結 合できないであろう。この決定のために用いるアッセイはポリペプチドの会合の 検出に用いるいかなるアッセイであってもよい。ゲル濾過などと同じように以下 に示すホモクエンチングアッセイが用い得る。 コンホメーション分析は、両親媒性のαヘリックス性モノマーリガンド類から のリガンド候補の選択性を高める。そのようなリガンドは成長ホルモン、胎盤ラ クトゲン及びプロラクチンとコンホメーション的に関連しているので、成長ホル モン構造からの類推によりこれらのリガンドの部位１と２と決定することは簡単 である。反語的には、例えばＥＰＯ、α−インターフェロン、β−インターフェ ロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ並びにインターロイキン−２、３、４、６、及 び７のようなリガンドの一次アミノ酸配列は、成長ホルモン、胎盤ラクトゲンま たはプロラクチンとあまり類似していない。しかしこれらのリガンド（普通はサ イトカインまたはホルモン）が一般のコンホメーション構造原理で分析されると き（Bazan et al.，Immunol．Today 11:350(1991); Chou et al.，Biochemistry 13:222(1974)）は、それらはある共通の構造特性を持つものである。最も顕著 なことはそれらは、各々が実質的に非ヘリックス構造（蛋白端末のＮ−及びＣ− 端末配列とヘリックスのあいだのループ）によって先行され及び後行されている ４つの優位の両親媒性のαヘリックスで特徴づけられている。優位のαヘリック ス は典型的には約１５−３０の残基長さをもっている。それらはＮ−端末からの順 序によりＡ−Ｄと命名される。短いヘリックスセグメントは、優位のヘリックス と結合したループとして存在し得る。 このようなリガンド類のαヘリックスは両親媒性である。換言すれば普通それ らは、ヘリックスの片側に疎水性残基を、そして反対側に親水性残基を持ってい る。ヘリックスの各３．６の逐次残基を、ヘリックスはしごの意味においてター ン（turn）と命名する。ヘリックスの末端での若干の小さな論争が考えられる。 すなわち各々のαヘリックス末端は、用いたアルゴリズムと技術者の判断に応じ て約１−３残基の変動があり得る。この種のリガンド類の間の相同性の全体的な 欠如にも関わらず、若干の保守的な残基がヘリックスにおいて見いだされ、それ らは成長ホルモンと共にリガンドの構造配列を援助するのに用いることが出来る 。 成長ホルモンおよび相同のリガンドプロラクチンと胎盤ラクトゲンについての 我々の分析は、このグループの４級αヘリックスサイトカイン及びホルモンの部 位２は本質的に（ａ）Ｎ−端末からおおむね最初の３〜４ターンまで延びる配列 と（ｂ）ヘリックスＣのおおむね中央の４〜５ターンから成ることを示した。す なわち部位２は非連続であり、両セグメントは蛋白中で密接しており、その態様 でレセプターと相互作用している。部位２領域の片方または両方は変異されてい る。ヘリックス形の疎水性残基は一般に変異誘発の候補選択の目的のためには無 視されるが、時折はそれらは候補の機能的完全性に影響する。加えて、部位２中 のすべての残基がレセプター結合に機能的または構造的関与をもつものではない であろう。しかしこの原則の適用は、アンタゴニストまたはアゴニスト活性をス クリーニングの必要のある候補の数を大いに減少するものである。 アンタゴニスト変異型は、以下に詳しく説明するように候補位置にある固有の 残基の電荷、疎水性または大きさの実質的変化によって特徴づけられる。これは 一般に、問題の残基を置換するが削除することにより達成される。若干の例にお いては所望の効果は、機能的または構造的に活性な部位２残基の隣接位置へ残基 を挿入することで達成可能である。アンタゴニストの生成の目的は、部位２にお けるレセプター結合の除去または固有のリガンドに対して少なくとも約２倍減少 することである。これは、レセプターとの構造的相互作用（水素結合、塩架橋、 疎水性相互作用など）に重要である固有残基の一つまたはそれ以上の特性の劇的 な変化によって最も効果的に達成される。そのような残基は接触残基と呼ばれる 。または残基は、レセプターと直接接触せずに接触相互作用に関与する残基の適 切な位置ぎめに重要な位置で選択される。そのような残基は機能的残基と呼ばれ る。 典型的には、約２０以下の位置（残基）が部位２変異型の生成に潜在的興味が ある（但し疎水性両親媒性残基を除く）。これらのうち各アミノ酸グループの代 表的なものだけが候補の創製に用いられる。すなわち、通常、部位２中の各々の 残基について、１９の天然残基を残した１９の変異体のスクリーニングが必要な 訳ではない。そのかわりに残基グループの代表的なものが選択される。一般的に これらのグループは、（ａ）正に荷電した残基（Ｋ，Ｒ及びＨ）、（ｂ）負に荷 電した残基（Ｄ及びＥ）、（ｃ）アミド（Ｎ及びＱ）、（ｄ）芳香族（Ｆ、Ｙ及 びＷ）、（ｅ）疎水性基（Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭ）並びに（ｆ）無電荷 の親水性残基（Ｓ及びＴ）である。更に、アンタゴニスト候補を作成するときは 、５クラスの代表残基のスクリーニングよりもむしろ、適切な残基におけるいか なる実質的変異型も部位２を無力にするので、典型的には１−３クラスを選択す るだけで十分である。下記の表Ｉａを参照のこと。最末端の置換は向かい側との 結合の選択で生産される。例えばもしも元来の残基がアラニン（少し疎水性）で あれば、向かい側の置換基は親水性、嵩高、そして荷電されているグルタミン酸 であろう。更に残基が、進化多様性を示すものから選ばれる。すなわち、もし動 物種リカンドがｈｕレセプター部位２に結合しなかったときは、変異型残基は候 補として選択される。そのようにしてアンタゴニストを含むような変異体の適切 なプールは典型的には約２０から約６０の部位２変異型を含むであろう。部位２ のアゴニストの候補の選択のためには、すこし別の戦略が用いられる。部位１に 関する下記の討論を参照のこと。そのようなプールの生産とスクリーニングは不 適切な実験を含まず、そして当業者の技術範囲の中にある。 置換アミノ酸の選択はまた、残基かαヘリックス中にあるか非ヘリックス構造 の中にあるかを考慮せねばならぬ。もしも残基がヘリックスターンの一部分であ れば、置換は好ましくはプロリンやグリシンのような、ヘリックスブレーカーで はない。その一方、もしもプロリンやグリシンが野生型ヘリックス中に見られた ならば、それらの置換はヘリックスコンホメーションを不安定化しないので自由 に置換してよい。 部位１はまた不連続部位でもある。それは（ａ）ヘリックスＡの中央部４０％ （多分ヘリックスＡの部位２のＣ−端末と重複して）、（ｂ）ヘリックスＡとＢ を結合するループのＣ−末端２／３ｒｄ（好ましくはＣ−末端１／２）及び（ｃ ）ヘリックスＤのＣ−末端１／２（好ましくは１／３）に位置する３つのセグメ ントから成る。この比率はアミノ酸残基の線形配列を表す。部位２アンタゴニス ト変異で用いた戦略と対照的に、部位１領域にある残基は修飾されておらず（ア ンタゴニストの場合、部位２のみが変異により不能化される）または修飾される 場合、部位１への変化は結合を分裂させぬように選択される。その理由は、部位 １を不能化することは大抵の実施態様では好ましくないからである。そのかわり 、目的は部位１の親和性を約１０％から２倍を越えるまで増加させることである 。すなわちこれらの領域中の残基は一般的に（削除または隣接挿入よりもむしろ ）置換され、そして最初のスクリーニングは阻害決定因子（特に荷電したときに 嵩高い側鎖がリガンド−レセプター結合相互作用を阻害または妨害する残基）を 同定するためにアラニン走査と共に行われる。いったん阻害残基が同定されると 、アゴニストまたはアンタゴニストの部位１置換は、表Ｉａの「アゴニスト」置 換から選択される。種多様性分析はまたアゴニストの同定においても役に立つで あろう。再び、部位１変異のために約２０以下の位置が選択される必要があろう 。一般に各々の位置における変異は、もとの残基グループの残余のものや、より かさの低い側鎖を有する、次に最も密接に関連したグループ（表Ｉａ）の残基に よる置換及び／又は不変である。 例示グループは指定の野生型残基を除く；グループのメンバーは上記の本文中に 記載してある。 各々の部位は幾つかの不連続的領域を含んでいるので、変異が領域のどれか一 つに導入される。すなわち与えられた部位の各々の領域を変えることは必要でな い。部位２のヘリックス領域（ヘリックスＡまたはＣ）好ましくはヘリックスＣ は、部位２のための好ましい変異誘発位置である。部位１のヘリックス領域（ヘ リックスＡまたはＤ）好ましくはヘリックスＤは、部位１のための好ましい変異 位置である。典型的には、１つの残基のみが各部位に対して変異される。但し各 々の部位の各々の領域中の少なくとも１つの残基（部位２には２コ；部位２には ３コ）を変異するのが本発明の範囲に入る。他の実施態様では２つまたはそれよ り多い残基、通常は約５コまでの残基が各領域で変異される。 変異誘発または変異のためのヘリックス残基の選択は、図１５ａ、ｂ及びｃに 示すようなヘリックス車輪ダイアグラムの構築によって促進される。これらは通 常のやりかたで作製され、部位１及び２のヘリックス部分中の変異の標的位置の 同定に有用である。興味ある特定の残基は、ヘリックスコンホメーションを不安 定化する残基、非嵩高残基および親水性残基である。 置換、挿入、削除または結合はスクリーニングの候補の作製には有用であるが 、残基変更の効果は残基それ自体以外に延び得る。例えばレセプター結合を防ぐ 部位２を修飾する方法は、部位２にＮ−またはＯ−結合グリコシル化部位を導入 することである。この部位は酵母や高級真核細胞中に発現するときにグリコシル 化され、そして立体障害により部位２結合と拮抗するであろう。このやりかたの 一つの利点は、近隣の嵩高いグループの挿入が結合阻害に要するすべてであるた めに、部位２構造残基の正確な位置を決定するのに必要なことである。他の利点 は循環半減期を調節（たとえば増加）し、また変異型の免疫原性を減少する能力 である。従って例えば本発明は、ここにおけるリガンド（例えばＩＬ−２）のヘ リックスＡ及び／またはＣ（好ましくはＣ）中のグリコシル化部位の挿入を包含 する。 次に候補アゴニスト及びアンタゴニストの安定性を、アゴニストまたはアンタ ゴニストとして機能的に働くことの候補の能力についてスクリーニングする。そ のようなアッセイは通常のもので広く知られている。例えば典型的には、野生型 のリガンドの能力と活性を調べるのに用いる通常のアッセイがある。その変わり にまたはそれに加えて、レセプター化学量論を決定するのに用いるアッセイが用 いられる（特に、部位２でなく部位１に結合するアンタゴニストを同定するため に）。これらのアッセイそれ自体はルーチンなもので、特別の実験を必要としな い。 ヒトの成長ホルモンに関して部位２構造残基は、Ｔ３、１４、Ｌ６、Ｌ９、Ｎ １２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｑ２２、Ｙ１０３、Ｎ１０９、Ｄ１１６、Ｅ１ １９、Ｇ１２０及びＴ１２３を含む。部位２機能的残基はＦ１、１４、Ｌ６、Ｒ ８、Ｄ１１６及びＥ１１９を含む。いかなる残基もこれらの位置のどれか一つま たはそれより多いところで置換され、元来の残基は削除されるか他の残基がその 近辺に挿入される。上記したように、または通常はアンタゴニストまたはアゴニ スト効果が求められているかどうかに依って同じかまたは別のクラスのメンバー が置換される。これらの位置の一つもしくはそれ以上のところまたはその近傍に 導入された変異は、部位２結合に影響するであろう。一般に変異に好ましい残基 は、少なくとも１つの変異をＮ−末端領域／ヘリックスＡ中の指定領域に、そし て他の１つをＣヘリックス特にＦ１、１４、Ｌ６、Ｄ１１９及びＧ１２０中に含 む。ｈＧＨアンタゴニストの例は次のものを含む。すなわちＩ４Ａ／Ｌ６Ａ／Ｇ １２０ＡｈＧＨ、Ｉ４Ａ／Ｌ６Ａ／Ｇ１２０Ａ／Ｔ１２３ＡｈＧＨ、Ｆ１Ａ／Ｉ ４Ａ／Ｇ１２０Ｉ／Ｔ１２３ＡｈＧＨ、ＦＩＡ／Ｉ４Ａ／Ｇ１２０ＦｈＧＨ及び ＦＩＴ／１４Ｆ／Ｌ６Ｒ／Ｇ１２０Ｒ／Ｔ１２３ＤｈＧＨ、更には部位１とその レセプターの親和性を増大するようなＥ１７４、Ｈ２１、Ｒ６４、Ｋ１７２及び ／またはＦ１７６のような残基での付加的な変異をもつ既述のいかなるものも含 む。例えばＥ１７４は好ましくはＳに変異され、しかしまた他の実施態様ではG ，V，L，I，A，T，D，N，Q，H，K，R，M，F，Y，WまたはPから選択される残基に 変異される。Ｆ１７６は好ましくはＹに変異され、そして最適にはＥ１７４Ｓ、 Ｒ１６８Ｎ、Ｄ１７１Ｓ／Ａ及び／またはＩ１７９Ｔ（ヘリックスせんＤからの ）と、並びにヘリックスＡ、Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ及びＨ２１Ｎからと 共に用いられる。２つの部位１ｈＧＨ変異型は、野生型ホルモン（F10A/M14W/H1 8D/H21N/R167N/D171SまたはA/E174S/F176Y/I179T）であるＧＨｂｐと約３０倍強 固な結合をもつファージミッドスクリーニング（Phageimid Screening）で同定 されている。これらの部位での変異は、アゴニストまたはアンタゴニストを生成 するために部位２で上述の変異と結合される。アンタゴニストの例は次のようで ある。すなわちF1A/I4A/F10A/M14W/H18D/H21/G120R，F，Y，W，D，Eまた はI/R167N/D171SまたはA/E174SまたはA/F176Y/I179T hGH; F1A/I4A/H21A/R4K/E1 74A hGH，I4A/G120R/E174A hGHまたはI4A/G120I/E174A hGH。 他のアンタゴニストの実施態様ではＩ４Ａ、Ｌ６Ａ、Ｆ１及び／またはＧ１２ ０が削除されこれらの残基の一つまたはそれ以上力削除され、その一方では残る 残基は置換され、そして／または一つまたはそれ以上の残基がこれら残基の近傍 に挿入される。置換、削除および挿入の結合は有用である。それらの選択は単に 成長ホルモンの活性の最適化の問題である。そのような結合は次のものを含む。 すなわちF1（D）/I4A/G120I/E174A及びI4（D）/G120（K）/E174A。 部位１と２の位置での変異の効果は一般に結合と親和性を抑圧するであろう。 但しこれらの部位での選択的修飾はまたルーチンなスクリーニングで決定される 親和性の増大をもたらし得る。例えばＥ１７４（Ｓ、Ｇ、ＡまたはＴ）並びに２ １、１８及び６４位置での変異はＧＨｂｐに対する部位１の親和性を増大するこ とがわかっている。 ｈＧＨ部位１構造的残基は次のようである。すなわちH18，H21，Q22，F25，K4 1，Y42，L45，Q46，P61，S62，N63，R64，E66，R167，K168，D171，K172，T175 ，R178，C189。部位１の機能に影響する側鎖をもつ残基は次のようである。すな わちP5，R6，F10，M14，F54，E56，I58，S62，N63，R64，E66，Q68，Y164，D171 ，K172，E174，T175，F176，R178，I179，C182，V185。レセプターに対する部位 １の親和性を増大する好ましい残基はＨ２１、Ｒ６４及びＥ１７４である。一般 的に部位１残基は単に置換されるのみで削除はされずまたその近傍に挿入もされ ない。更に部位１置換は一般に、表Ｉａからわかるように、元来の残基と同じか または密接に関連する基から取り出される。通常はアゴニストとアンタゴニスト 活性は部位１がレセプターに結合することを必要とするので、部位１を重度に動 揺させることは好ましくない。にもかかわらず、例えばＥ１７４Ａのような例外 があるので、最適のものを決定するには置換のパネルをスクリーニングするのが 望ましい。 他の成長ホルモン中の類似の残基は同様にして容易に同定され修飾される。例 えばｈＧＨ中の１４は、ｂＧＨ中のＭ４に対応する。残基の数の幾つかの変化は 、 成長ホルモンをｈＧＨの他のアレレや他の種から比較すると存在し得ることに注 意せよ。もしも動物ＧＨが相同の位置にヒトＧＨと同じ残基を含まないならば、 置換した残基は動物残基からのものとは異なっており、そして好ましくはその位 置でヒトの残基とは異なっている。さもなければ変異誘発のための残基の選択は 既述のものと同じやりかたで行われる。 構造分析または分子モデル化は、他のリガンド、すなわち４つの逆平行の両親 媒性のαヘリックスを含むモノマーポリペプチドリガンドでの変異のための類似 の配列を同定するために用いられる。候補リガンドの構造はChow Fassman分析を 用いて決定され、次に各々のリガンドに対する部位１と２中に位置する類似の残 基が同定される。幾つかの例においては構造研究は既に発表されており、種々の 領域中の残基を成長ホルモンと比較して部位１と２を同定するのが必要なことの 全てである。単量体リガンドは、正常の生理学的条件下での循環におけるモノマ ーとして見いだされたものである。 そのようなリガンドの現在知られている実例は次のものを含む。すなわちＥＰ Ｏ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン２、３、４、６及び７、胎盤 ラクトゲン及びプロラクチン、α−インターフェロン、β−インターフェロン。 これ以外のものは将来同定され得るし、本発明の教示はそれにもまた同等に適用 できる。 これらのリガンドのアンタゴニスト候補の生成のために、実質的な変異を次の ２つの領域の一つまたは両方に導入する。（ａ）Ｎ−端末からＡヘリックスのＮ −端末１／３へ；（ｂ）Ｃヘリックスの概ね中央１／２（好ましくは１／３）。 これらの領域はｈＧＨの部位２領域に対応する。アゴニストは、あまり嵩高でな く及び／またはあまり荷電してない置換を部位１及び／または２に導入して行わ れる。最適のアンタゴニストはレセプター結合を防ぐか実質的に削除するために 部位２お変異するか、またはそのレセプターに対する親和性を増大するために部 位１を変異することによって生成される。ここに見られるように、部位１はアゴ ニスト及びアンタゴニスト実施態様の両方においてレセプターに対する親和性を 増大するために修飾される。 成長ホルモン以外のリガンドのアンタゴニストやアゴニスト変異型が製造され るようなやりかたの説明として、後記の表Ｉｂが参照される。該表はｈＰＲＬ、 ＩＬ−２、ＬＫ−４、ＩＬ−４、ＩＬ−６，ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＥＰ Ｏのために必要な部位１と２の主要なそして大切な決定因子を開示する。各部位 のヘリックス決定因子は各リガンドのヘリックス領域を同定しそしてｈＧＨの類 似領域と比較することによって選択される。同様な分析は、ｈＧＨ以外のリカン ドの構造または機能に貢献する非ヘリックス領域の同定に用いられる。表Ｉｂは 、アンタゴニスト変異型はＮ−端末の部位２領域よりもむしろ部位２のヘリック ス残基を標的として好ましくは行われるという本発明者の考えを反映している。 しかし部位１と２のための非ヘリックスの類似残基もまた変異し得る。部位１と ２のための表Ｉｂの残基は、表示するリガンドのためのレセプターと構造的また は機能的に相互作用する少なくとも１つの残基を含むものと信じられる。これは 、Ｏ−またはＮ−結合グリコシル化部位を創製するように３つの領域の一つまた はそれ以上で残基を置換するか、その領域または部分を削除することによりその ３つのヘリックス領域または部分の１−３コのブロックアラニンスキャニングま たはホモローグスキャンニングで容易に確認できる。いったん領域の活性が確認 されると、鍵となる機能的または構造的残基を同定するために残基から残基への アラニンスキャンニングを用いることは容易である。 表Ｉｂのためのヘリックス構造情報は次から得た。すなわちDeVos et al.，Sc ience 225:306(1992)(hGH); Bazan et al.，Immunol．Today 11:350(1991)（hPR L，IL-6，IL-2 and EPO）; Lokker et al.，EMBO J．10:2125(1991); Bazan et al.，op.cit．（IL-2）; Diederichs et al.，Science 254:1779(19**)(GM-CSF) 。 上述のように他のリガンドに関するこのような情報はモデル化、ＮＭＲまたは好 ましくはＸ線結晶学的分析で得られる。 表Ｉｂにおける部位の指示は、ヘリックスＡの０．０７から０．５の長さ及び ヘリックスＣの０．５から０．８の長さの部位２に基づくコンタクトパッチの計 算で得られた。これらの部位は概略と考えられ、適当な精製を必要とするであろ う。各々の部位は配列から±１〜５残基に位置しているであろう。 アンタゴニストの作成において標的のヘリックス残基中へ導入される残基また は構造はふつうは同じもの（上記参照）でなく、好ましくは置換される残基より も一段と嵩高いものである。ほかの実施態様では部位残基は削除され、または他 の残基（例えばＧやＰのような、ヘリックスブレーカー）が部位残基の近傍に挿 入される。次に候補の一群が作成され、最適の候補を同定するためにここに述べ る方法でスクリーニングされる。しかし、たとえ変異型リガンドが元来のリガン ドに比べてアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できなくてもその変異型 はリガンドのために普通に用いられるものとして（ここで変異型は元来のリガン ドと概ね同じ活性を保持している）またはレセプターと結合できない免疫試薬（ 例えば診断試薬）として有用であることは強調されねばならない。 ＩＬ−２アンタゴニスト候補の作成の代表的な概要表Ｉｃに示す。この概要で 表Ｉｂで同定した推定上の部位２残基は、減少したレセプター結合のために好ま しくはアミノ酸で置換される。付加的な他の置換もまた表に示してある。 ＩＬ−６ヘリックスＡ、Ｃ及びＤの代表的なヘリックスホイールプロットは各 々図１５ａ、ｂ及びｃに示す。ヘリックスＡで潜在的に興味あるのはＤ５４、Ｒ ５８、Ｅ５１、Ｋ５５、Ｔ４８、Ｒ５２、Ｑ５６及びＳ４９であり、ヘリックス ＣにおけるそれはＫ１５７、Ａ１５８、Ｑ１５５、Ｑ１５２、Ｋ１５６及びＶ１ ４９である。 ｈＰＲＬに対する類似のプロットは、修飾部位２のための位置は次の残基であ ることを示唆する。すなわちH58，D69，H55，D48，N59，V52，D45，Y56，R49（ ヘリックスＡ）；K143，Q150，G157，E146，Q164，R153，L160，S142，E149，S1 63，V145，K152，E148，H166，E156，E159（ヘリックスＣ）。 興味のあるｈＰＲＬ部位１（ヘリックスＤ）残基は次のようである。すなわち C202，R220，S191，K209，N198，L216，R205，S194，N212，H201，C219，E190， H208，Y197，K215，R204，D211，L193，L200，K21。ｈＰＲＬ残基は前配列＝１ のＮ−端末Ｍから番号づけを始める。 無論ここのアゴニストやアンタゴニストはまた、部位１及び／または２に見ら れるものより付加的な残基中へ変異が導入されるリガンドを含む。例えば候補は 免疫親和性精製を促進するために他のポリペプチドと融合され、領域または残基 を削除され、例えばリガンドの活性フラグメントをつくるため所望の活性に関与 せず正当なコンホメーションの保持に不要なものを置換または挿入し、または通 常のやりかたで変異される。 リガンドがレセプターに結合するＫａ、すなわち親和性定数は、問題の部位で レセプターからリガンドが解離する速度（「オフ」の速度）でリガンドがレセプ ターに結合する速度（「オン」の速度）を割った比率である。高度親和性相互作 用はオン速度が優先的である。アンタゴニストは普通は部位１で高度親和性変異 をもつであろう。たいていどちらかの部位での高度親和性変異は、レセプターの 性質に応じて所望される。もしリガンドがレセプターに結合し、三元レセプター 複合体が連続シグナルよりもむしろ単一を出すならば、レセプターに極めて高度 親和性をもつリガンド類似体は、アンタゴニストとして作用し始めるほど長くレ セプターを占拠し得る。例えばもし細胞の特性変化のシグナルを出すのに二量体 レセプターにとっては２０−３０分必要であれは（例えば蛋白を解放したり有糸 分裂を促進したり）、アゴニストリガンドが速度定数をもつことは不要でありレ セプターを何時間も占拠することになる。すなわちアゴニスト親和性はもっとも よく最適化されるべきで、それによって変異は、レセプターシグナル事項を完結 するに要するのと概ね同じ時間後にレセプターから解離される。高い部位１のＫ ａは不活性部位２を持つアンタゴニストにとって完全に望ましく、何故ならばこ れはアンタゴニストによるレセプター部位１の占拠を高めそれにより元来のリガ ンドに有り得るレセプターを結合するからである。すなわちアゴニスト変異は最 も好ましくは二量体レセプターのシグナル特性と速度定数一致性をもち、一方ア ンタゴニストは部位１では高い親和性をもち部位２では親和性が低いかまたは無 い。Ｋａは、与えられたリガンド変異型について例えばファルマシア社から商業 的に入手可能なＢＩＡ−コア装置を用いて容易に測定できる。 三元複合体を形成するリガンドとそのレセプターの能力はまた、複合体の形成 に影響を与えるが但しリガンドアミノ酸配列変異型でない物質の終末点の便利な アッセイとして役立つ。例えばもしアゴニストまたはアンタゴニスト効果のため に一群の非ペプチドまたは短いペプチド分子候補をスクリーニングしたいときは 、候補の存在または非存在下で三元複合体の形成を調べるだけでよい。複合体の 形成を抑圧する候補はアンタゴニストとして作用し、複合体形成に必要なリガン トとレセプターの量を減少するものはアゴニスト候補である。レセプターまたは リガンドに対する非特異的効果、たとえば蛋白変性はＣＤ研究のような通常の分 析から排除される。 同様にこのアッセイ方法は変異型レセプターとそれらの活性の検出に有用であ る。例えば変異体レセプターは、リガンド結合部位について元来のレセプターと 競合する能力を測定することで、その結合能力を正確にアッセイできる。ホモク エンチングを用いるそのようなアッセイにおいてフルオレセインでラベルしたレ セプターは、限られた量の元来のリガンドに加えられ、そしてラベルしたレセプ ターと競合する候補レセプターの能力を標準レセプターと比べての蛍光の増大に よって測定する。蛍光のクエンチングもしくは増大はまた、レセプター数の半分 を１つの発蛍光団でラベルし残り半分を増大もしくはクエンチした分子でラベル して検出することができる。そのようなやりかたは広く知られており、一般に三 元アッセイに適用可能である。このアッセイはまた、単に複合体の分子サイズを みるだけで部位１と２の結合の分析ができるように変更できる。もしリガンドと レセプターが適当な比率にも関わらずまったく複合体を形成しないときは、部位 １は欠陥があるかまたは（レセプターが候補のときは）リガンド部位１に対する レセプター結合部位が不完全である。もし１：１複合体のみが形成されれば（た とえ適切な量のリガンドまたはレセプターが存在していても）、リガンド部位２ （または使用候補に応じてそのレセプター部位）がレセプターとの結合能力にお いて不完全である。同様の分析は、野生型の蛋白よりも大きい親和性のある部位 １または２で結合できるリガンドまたはレセプターを同定するのに用いられる。 複合体形成のアッセイ 三元複合体の検出のためのアッセイ方法は次のものを含む。すなわち複合体の 分子量の測定、レセプター上のラベル間の蛍光発光または蛍光消光またはその他 のエネルギー移転測定、バイアコア（Biacore）分析、ゲル排除クロマトグラフ ィー、天然ゲル電気泳動、等電点電気泳動、沈降法および透析法。この他の適当 な方法は次のようである。すなわちレセプター−リガンド部位に結合する抗体の 使用、偏光の旋光、クロマトグラフィー及び核磁気共鳴。クロマトグラフィーに はゲル濾過、イオン交換および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の種類 がある。非複合のリガンド及び／またはレセプターの背景において三元複合体形 成の測定ができるような如何なる分析方法も用い得る。 リガンドとそのレセプター 構造的に分析されそしてもし適当ならば変異されているリガンドは例えば次の ようである。すなわち成長ホルモン、インシュリン様の成長因子、副甲状腺ホル モン、インシュリン、レラキシン、糖蛋白ホルモン例えば濾胞刺激ホルモン（Ｆ ＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）、造血成 長因子、肝臓増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、 腫瘍壊死因子（α及びβ）、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連ペ プチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボ ポイエチン、神経成長因子たとえばＮＧＦ−ｂ、血小板誘導成長因子、形質転換 成長因子（ＴＧＦ）（例えばＴＦＦ−α及びＴＧＦ−β）、インシュリン様成長 因子ＩおよびＩＩ、ＥＰＯ、骨誘導因子（Osteoinductive Factors）、インター フェロン（例えばインターフェロン−α、β及びγ）、コロニー刺激因子（ＣＳ Ｆｓ）例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ、インターロイキン類（ ＩＬｓ）例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６ 、ＩＬ−７、ＩＬ−８並びにその他のポリペプチド因子類。好ましいリガンドは 例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、 ＩＬ−７、ＥＰＯ、成長ホルモン、胎盤ラクトゲン及びプロラクチンのようなヘ リックス形のモノマーサイトカイン類／ホルモン類である。これらのリガンドの レセプターは、上に選択され記載されたｈＧＨ、アンタゴニストまたはアゴニス トと同様なやりかたで用いられる。 以上の議論はアミノ酸変異に焦点があてられた。しかし同様の目的はまた、イ ンビトロ方法によって標的残基を共有的に修飾して達成される。これは、レセプ ターに結合する標的位置の残基の側鎖の能力を阻止しまたは修飾する化学的修飾 の如何なるタイプによってでも行われる。得られる効果は、もしも共有修飾が標 的残基に対して十分に特異的であれば、例えば置換的変異と同じである。特異性 は、所望の側鎖と好ましく反応する物質の選択によって得られる。追加的な特異 性は、保護されるべき領域と結合する抗体で他の側鎖をブロックして達成される 。修飾は結合に直接関与する一つまたはそれ以上のアミノ酸であり得る（構造残 基）。またはコンホメーションの保持を行うレセプター結合の領域中もしくは近 傍のアミノ酸がインビトロで共有的に置換される。共有的修飾は例えば酸化、還 元、 アミド化、脱アミド化、縮合などの反応や、例えばポリサッカライドやポリエチ レングリコールのような嵩高い基の置換を包含する。蛋白にそのような基（例え ばポリエチレングリコール）を共有的に加えるための方法は公知である（例えば David，et al.，U．S．Pat．No．4,179,337参照）。 システイン残基は、クロロ酢酸やクロロアセタミドのようなハロアセテート（ 及び対応するアミン）と最もふつうに反応してカルボキシメチルまたはカルボキ シアミドメチル誘導体を与える。システイン残基はまたブロモトリフルオロアセ トン、ａ−ブロモ−ｂ−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホ スフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド 、メチル１−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−ク ロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オ キサ−１，３−ジアゾールと反応して誘導体化される。 ヒスチジル残基はｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボネートと反応して 誘導体化される。何故ならばこのものは比較的ヒスチジル側鎖に特異的だからで ある。パラブロモフェナシルブロミドもまた有用である。この反応はｐＨ６．０ で０．１Ｍカコジル酸ソーダ中で好ましく行われる。 リジニル及びアミノ端末残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応す る。これらの化合物での誘導体化はリジニル残基の電荷を逆にする効果がある。 アミノ含有残基の誘導体化のこれ以外の適当な試薬は次のものを含む。すなわち イミドエステル例えばメチルピコリンイミデート；ピリドキサルホスフェート； ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼネスルフォン酸； Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；並びにグルオキシレート及びポ リエチレングリコールやその他の嵩高い置換基のエステルとのトランスアミナー ゼで触媒された反応。 アルギニル残基は若干の通常の試薬たとえばフェニルグリオキサール、２，３ −ブタジノン、１，２−シクロヘキサンジオン及びフェニルグリオキサールの一 つまたはそれ以上との反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、 グアニジン機能基の高いｐＫａのためにアルカリ性条件で行う必要がある。更に これらの試薬はアルギニンε−アミノ基と同様、リジン基と反応できる。 チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物やテトラニトロメタ ンとの反応によるチロシル残基へのスペクトルラベルの導入に特に興味をもって 行われる。最も普通にはＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を得るた めにはＮ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを各々用いる。チロシ ル残基は、ラジオイッムノアッセイに使用するラベルした蛋白を作るために¹²⁵ Ｉまたは^I31Ｉでヨード化する。既述のクロラミンＴ方法が適当である。 カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ’ −Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応で選択的に修飾される。ここにＲとＲ’は異なる アルキルであって、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリニル−４ −エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジ メチルペンチル）カルボジイミドである。更にアスパルチル及びグルタミル残基 はアンモニウムイオンと反応してアスパラギル及びグルタミニル残基に変換され る。 グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば脱アミド化されて各々対応す るグルタミル及びアスパラチル残基となる。またはこれらの残基は穏和な酸性条 件下で脱アミド化される。これら残基のいずれの形も、本発明の範囲に入る。 その他の修飾は次のものを含む。すなわちプロリンとリジンのヒドロキシル化 、セリルまたはスレオニル残基の水酸基のホスホリル化、リジン、アルギニン及 びヒスチジン側鎖のａ−アミノ基のメチル化（T．E．Creighton，Proteins: Str ucture and Molecular Properties，W．H．Freeman & Co.，San Francisco，pp. 79-86(1983)）、Ｎ−末端アミンのアセチル化ならびにいろんなＣ−末端カルボ キシル基のアミド化。 ｈＧＨｂｐの２つの結合部位の証拠は抗体結合から生じる。ｈＧＨのｈＧＨｂ ｐへの親和性は、ｈＧＨｂｐから［¹²⁵Ｉ］ｈＧＨを置換し、グリコシル化した ウサギＧＨレセプターから得た抗レセプターモノクローナル抗体（Ｍａｂ５）と の複合体を沈澱することによって測定される（Barnard et al.，Encocrinology 115:1805(1984); Barnard et al.，Biochem．J．231:459(1985)）。このアッセ イ を用いてのスキャッチャード分析は、ｈＧＨとｈＧＨｂｐが１：１の複合体を形 成することを示す（Leung et al.，Nature 330:537(1987); Fuhet al.，J．Biol ．Chem．265:3111(1990); Barnard et al.，Endocrinology 115:1805(1984); Ba rnard et al.，Biochem．J．231:459(1985); Spencer et al.，J．Biol Chem．2 63:7862(1988)）。別のＭＡｂｓセット（ＭＡｂ３８７または３Ｄ７）を使って の置換曲線のスキャッチャード分析は、１つのｈＧＨｂｐに対して０．５のｈＧ Ｈの化学等量を与える。これらの結果は、もしＭａｂ５がｈＧＨの第２の部位へ の結合のためのｈＧＨｂｐの決定因子をブロックするものであるとすれば説明可 能である。 各々のｈＧＨポリペプチド上の２つの結合部位の証拠は、ｈＧＨ（Cunningham et al.，Science 244:1081(1989)）とｈＧＨｂｐ（実施例２）の間の結合決定 因子のスキャニング−変異分析でモノクローナル抗体を用いることによって開発 された。これらの研究で同定された決定因子は１：１複合体の形成の調整に重要 である。このデータに基づいて、本発明者はこれらの決定因子をｈＧＨの非結合 同族体へあてはめ、そしてｈＧＨｂｐへ固く結合した類似体を製造した（Cunnin gham et al.，Science 247:1461(1990)）。８つの置換基をｈＰＲＬへ、または ５つをｈＰＬへ導入して本発明者はｈＧＨｂｐと結合し１：1複合体を形成する 変異型を製造した。 これらのｈＰＲＬまたはＲＬ変異型（図４Ａ及びＢ）がｈＧＨｂｐの１または ２分子と結合するかどうかの決定のためにゲル濾過を行った。ｈＧＨｂｐとホル モンの比が２：１のとき、ｈＰＲＬの両方の結合変異型はｈＧＨｂｐとの１：１ 複合体に対応する２つの対象的なピークを示した。 さらに化学量論と反応熱を評価するために、走査熱量計を用いた。何故ならば 結合は、複合体を分離するために抗体またはクロマトグラフィーを用いる必要な しに溶液中で容易に研究可能だからである（図５）。この実験は反応熱と、ｈＧ Ｈｂｐに結合したｈＧＨの当量の測定を可能とした。 野生型ｈＧＨ並びにｈＧＨ及びｈＰＲＬの変異型の滴定終末点を表１１に示す 。全てのｈＧＨｂｐと結合するに必要なｈＧＨの比率は約０．５〜１である。こ れ らのデータ全体は、ｈＰＲＬとｈＰＬはｈＧＨｂｐの二量化のための重要な決定 因子を欠いていることを示す。これらの決定因子はｈＧＨの単一アラニン変異体 中に大量に保存されているが、ｈＰＲＬやｈＰＬ変異型中にはそうではない。こ のことは、ｈＧＨ上にはｈＧＨｂｐに対する２つの結合部位があることを示唆す る。これら部位の１つは、各々Ｍａｂ５またはＭａｂ２６３免疫沈澱アッセイを 用いてｈＧＨ（Cunningham et al.，Science 244:1081(1989)）またはｈＧＨｂ ｐのアラニン走査変異により詳しく機能的に特徴づけられている。ｈＧＨ及びｈ ＧＨｂｐ上の２つめの部位は未解決のままである。 ｈＧＨのｈＧＨｂｐとの結合は、成分において僅かのスペクトル変化をもたら す。本発明者は複合物形成における円二色性（ＣＤ）及び蛍光スペクトルの変化 を調べた。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを混ぜると、遠紫外線ＣＤスペクトルがｈＧＨと ｈＧＨｂｐのスペクトルの和と事実上おなじになる（図６Ａ）。この結果は、複 合体の形成における規則的な第二の構造の大きな変化の欠如を示す。近紫外線Ｃ Ｄスペクトル（図６Ｂ）は、芳香族アミノ酸側鎖の非対象的環境を反映している （Bewley，Recent Progress in Hormone Research 35:1555(1979); Bewley et a l.，Archives of Biochemistry and Biophysics 233:219(1984)）。ｈＧＨとｈ ＧＨｂｐのＵＶ吸収スペクトル間には大きな差があり、これは主にｈＧＨに比べ てのｈＧＨｂｐの大きなトリプトファン含量の結果である（１対９）。しかしス ペクトルの強度の増大を除き、個々のスペクトルの和は混合後に得られるものと 本質的に同一である。 蛍光スペクトルにおいては、ｈＧＨのｈＧＨｂｐとの結合により３４０ｎｍか ら３３４ｎｍへの青色のシフトと、蛍光強度の僅かの減少がある（図７）。ヨー ドの消光とスターン−ヴォルマー分析は、ホルモンレセプター複合体においてト リプトファンの露出の減少がある。これはｈＧＨの結合でｈＧＨｂｐの中に１つ またはそれ以上のＴｒｐ残基が埋め込まれた結果であろう。何故ならば蛍光クエ ンチング研究は、ｈＧＨの中のトリプトファンは溶媒に露出されないことを示し ているからである（Bewley，Recent Progress in Hormone Researh 35:1555(197 9); Bewley et al.，Archives of Biochemistry and Biophysics 233:219(1984) ）。 それと対照的に、ｈＧＨｂｐの変異分析はＴｒｐ１０４がｈＧＨとの結合におい て特に重要であることを示している。 上述のように、ｈＧＨの結果は、例えばホルモン−レセプターやサイトカイン −レセプター系のようなポリペプチドリガンドに合致している。成長ホルモンと プロラクチンレセプターは、インターロイキン２、３、４、５、６、７、エリス ロマイシン、マクロファージコロニー刺激因子及びその他のものに対するサイト カインレセプターの大きな一群に関連している。これらのレセプターの細胞内領 域が、もし配列が類似ならば僅かしか共有せず、そしてどれも公知のチロシンキ ナーゼと相同でないのは驚くべきことである。にもかかわらず、ＧＨ（Carter-S u et al.，J．Biol．Chem．264:18654(1989)）、ＩＬ−２（Asao et al.，J．Ex p．Med．k171:637(1990)）及びＩＬ−３（Itoh et al.，Science 247:324(1990) ）レセプターがホルモンとの結合のすぐあとでホスホリル化される。ＩＬ−２（ Sharon et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．87:4869(1990)）及びＩＬ− ６（Taga et al.，Cell 58:573(1989)）レセプターの場合は、補助的な蛋白及び ／またはレセプターはシグナルの形質導入に関与していないことを示す証拠があ る。ｈＧＨとその結合蛋白についてのこの結果は、ｈＧＨ結合が細胞質の（また は膜に結合した）成分と相互作用し得る活性領域をつくるべく細胞内領域と共に くるレセプターの細胞外部分の二量化を誘発するようなｈＧＨレセプターの活性 化のモデルを支持する。これは複雑な成分のコンホメーションの実質的変化なし に生起しまたはしない。 他の２つのグループが最近に細胞外結合領域で結合したポリペプチドホルモン を結晶化させた（Lambet et al.，J．Biol．Chem．264:12730(1989); Gunther e t al.，J．Bio．Chem．265:22082(1990)）。しかし何れもレセプターの二量化の 結論的な証拠を報告していない。ヒトＩＬ−２は、ＩＬ−２レセプターのヒトｐ ５５成分の可溶性組換え体との１：１複合体で優先的に結晶化される。ただし少 量のジスルフィド結合ｐ５５二量体が観察される。橋かけ研究は、機能的なＩＬ −２レセプター複合体はＩＬ−２、ｐ５５及び別のレセプター成分（ｐ５０と呼 ばれる）の間に形成されるヘテロダイマーであることを示唆する（Saragori et al.，J．Immunol．139:1918(1987); Ogura et al.，Mol．Biol．Med．5:123(198 8)）。ＥＧＦレセプター（ＥＧＦｂｐ）の細胞外領域は、１分子のＥＧＦと共に なって結晶化された（Gunther et al.，J．Biol．Chem．265:22082(1990)）。結 合の研究と沈降の分析は、溶液中での１：１のＥＧＦ・ＥＧＦｂｐ複合体の形成 を示す。これらのデータは、細胞外領域はホルモン誘発二量化を行うには不十分 であることを示唆する。しかし結合研究が、複合体の沈澱のために抗ＥＧＦレセ プターポリクローナル抗体を用いたことは注意すべきことである。更に結晶化及 び沈降実験はレセプターに比し大過剰のホルモンを用いている。本発明の場合、 Ｍａｂｓは天然のＧＨレセプターブロック二量化（図３）に対して多く、そして 大過剰のｈＧＨがモノマー複合体（図２）の中へｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）₂複合 体を解離する。 この後者の効果は重要な薬理学的意味をもつであろう。ｈＧＨは天然には血清 中５ｎＭを越える濃度で脈拍中で生産され、その濃度は１ｎＭの極めて下方まで 急速に下がる（Tayler et al.，J．Clin．Invest．48:2349(1969); Thompson et al.，J．Clin．Invest．51:3193(1972); Ho et al.，J．Clin．Endocrinol．Me tab．64:51(1987)）。しかしｈＧＨｂｐは天然に血清中に約０．５〜１ｎＭとい う一定の濃度で存在する（Baumann et al.，J．Clin．Endocrinol．Metab．62:1 34(1986); Herington et al.，J．Clin．Invest．77:1817(1986)）。すなわちｈ ＧＨがｈＧＨｂｐに比べて過剰に送られるので、細胞レセプターと相互作用でき る遊離のｈＧＨと同様にｈＧＨｂｐと１：１の複合体を生成することが予期され る（ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ・ｈＧＨ膜−レセプターの形のヘテロダイマー的複合体 さえも生成しよう）。 本発明者はｈＧＨはｈＧＨｂｐと相互作用を行ってｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂の 形の複合体を作ることを確認し、そして得られた細胞外レセプター領域の二量化 はこのホルモンに体因性のシグナルトランスダクションを開始することを提案し た。回収したｈＰＬとｈＰＲＬ同族体（実施例４）はｈＧＨｂｐの二量化を促進 しないので、ｈＰＬとｈＰＲＬ骨格は、レセプター認識と結合に必要なものから 明白な必須の二量化決定因子を欠いていると結論することができる。関係する領 域を局所化するため、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ類似体置換した一連のｈＧＨ変異体 および２つの削除類似体を、ホルモン誘発レセプター二量化の減少のためにスク リーニングした。次に重要な側鎖を、更に詳細なアラニン走査戦略で同定した。 ｈＧＨｂｐ変異型（Ｓ２３７Ｃ）を構築し蛍光でラベルした。蛍光クエンチン グを、図８に示すようにホルモン誘発二量化をモニターして測定した。このクエ ンチングはｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：２モル比を示した（図４）。ｈＬＰとｈＰ ＲＬセグメント置換のある一連の同族体走査ｈＧＨ変異型を、蛍光アッセイで試 験した（表ＩＩＩ）。これらのうち４つは、ホルモン誘発ｈＧＨｂｐ二量化の著 しい減少を示した（実施例４）。他の２つのｈＧＨ削除類似体においては、ｈＧ Ｈｂｐの二量化の損失は、第二部位のｈＧＨｂｐ結合の分裂に起因するもののよ うである（表ＩＩＩ）。 ｈＧＨｂｐ変異体（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ）を蛍光的にラベルする。この蛍光シグ ナルは、図８に示すようにホルモン誘発二量化のモニターに用いる。ｈＧＨは１ ０ｎＭの定濃度のＳ２３７−ＡＦで系列的に希釈し、そして平衡で蛍光クエンチ ングを測定する。フルオレセインラベルのホモクエンチングはｈＧＨの添加と共 に増大し、０．５モル当量のｈＧＨにおいて最大となる。しかし極めて顕著なこ とにはこのクエンチングは高い濃度のｈＧＨでは逆転し、これは過剰のｈＧＨの 存在下ではｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）₂はｈＧＨ・ｈＧＨｂｐのモノマー複合体に 解離することを示している。 ｈＰＬとｈＰＲＬセグメント置換の一連の同族体走査ｈＧＨ変異体を、Ｓ２３ ７Ｃ−ＡＦに基づくアッセイで試験した（表ＩＩ）。これらのうち３つ、すなわ ちｈＰＲＬ（１２−１９）、ｈＰＲＬ（５４−７４）及びｈＰＲＬ（１１１−１ ０９）は著しい減少を示した（１８倍、６倍及び１００倍以上）。これらの変異 体に結合する一次部位（部位１）の損失は、観察されたｈＧＨｂｐの二量化の減 少に大いに関係するようである。更に、結合親和性を減少させる一次部位決定因 子（例えばＲ６４Ａ及びＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）の変異体もまたｈＧＨｂｐ親 和性を高めることが示され、そして一次部位のｈＧＨｂｐ親和性を高めることが 示されたｈＧＨ変異体（Ｅ１７４Ａ）もまた本発明者のアッセイの測定では二量 化を高める。同族体走査変異体に加えて、ｈＧＨ削除類似体（１−８削除）は、 ｈＧＨｂｐ二量化誘発能力において、劇的な減少（１００倍を越える）を示した （実施例４）。ｈＧＨｂｐの二量化におけるこの損失はまた、二次部位ｈＧＨｂ ｐ結合における分裂に基づくもののようである。 第２の部位ｈＧＨｂｐ結合に関係する特定アミノ酸の特定側鎖は、アラニン走 査でプローブされる（実施例６）。２６のアラニン変異体の分析（表ＩＶ）は、 ｈＧＨｂｐ二量化で１０倍より大きい分裂をおこす２つの変異体（Ｆ１ＡとＩ４ Ａ）及び２倍より大きい分裂をもつもう４つ（Ｌ６Ａ、Ｒ８Ａ、Ｄ１１６ＡとＥ １１９Ａ）を見いだしたのみであった。これらの決定因子は、１次部位結合に決 定的なものとは異なるものである。逐次的なｈＧＨ添加を行った実験で一定濃度 のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（１００ｎＭ）とし、そして蛍光ホモクエンチングはｈＧＨ 誘発二量化には迅速な平衡時間（３分より短い）を、過剰のｈＧＨによる次の二 量化の反転には遅い平衡時間（３０分より長い）を示した。これは、二量化の反 転は速度以外の限定があることを示唆する（メカニズムについては実施例６）。 ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂結晶の生成は、Blundell and Johnson，Academic Pres s，London，1976に記載の方法によるＸ線結晶写真技術を用いるｈＧＨ（ｈＧＨ ｂｐ）₂の３次元構造の決定を可能とする。この構造は図１１に示され、そして 以下の実施例７で説明する。図１１の構造は、各々のｈＧＨは２つのｈＧＨレセ プターまたはｈＧＨｂｐに結合していることを示す。各々のｈＧＨｂｐはｈＧＨ の異なる位置に接触している；最初のｈＧＨｂｐは表ＩＶのアミノ酸と接触し、 そして２つめのｈＧＨｂｐと接触するｈＧＨアミノ酸は表ＶＩに示してある。２ つのｈＧＨｂｐの間の接触アミノ酸は図６に示される。 ｈＧＨの変異体はこれらのアミノ酸接触点で作られ、本発明のアッセイ方法で 検出される。同様にｈＧＨｂｐ変異体は、ｈＧＨと結合するところで、または２ つのｈＧＨｂｐそれ自体の間で作られる。そのようなｈＧＨｂｐ変異体は、野生 型ｈＧＨ及びｈＧＨＢｐを用いて本発明のアッセイ方法で検出できる。治療組成物と投与 ここにいう「成長ホルモン類似体」とは、成長ホルモン並びにその他のラクト ゲンホルモン類、例えば胎盤ラクトゲン、プロラクチン及び他の成長ホルモンの 遺伝子的や種の変異体、それにアミノ酸置換、挿入または削除で作成したこれら の蛋白の変異体を包含するものである。成長ホルモン類似体は、レセプターに対 する類似体の結合をも含めて成長ホルモン類似体の活性のアンタゴニストまたは アゴニストをも含むことができる。 リガンド類似体またはＧＨｂｐ抗体の治療処方は、所望の生成度のリガンド類 似体蛋白を任意的な生理的に許容される担体、希釈剤または安定剤（Remington' s Pharmaceutical Sciences，supra）を混合し凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の 形態で貯蔵用に製造される。許容し得る担体、希釈剤または安定剤は使用用量や 濃度で被投与者に毒性がないものであって例えば次のようである。すなわち緩衝 剤たとえば燐酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸；抗酸化剤たとえばアスコ ルビン酸；低い分子量（約１０残基より少ない）のポリペプチド（メトキシドの 形成を避けるため）；蛋白たとえばアルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン ；親水性ポリマーたとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸たとえばグリシン、 グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類および他 の炭水化物たとえばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤た とえばＥＤＴＡ；糖アルコールたとえばマンニトールやソルビトール；塩形成性 の対イオン例えばナトリウム；及び／または非イオン性の界面活性剤たとえばツ ーン、プルロニックまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。 インビボ投与に用いるリガンド類似体やＧＨｂｐ抗体は無菌でなければならぬ 。これは凍結乾燥や再構築の前または後に無菌濾過膜で濾過することで容易に達 成できる。リガンド類似体またはリガンド類似体に対する抗体は通常は凍結乾燥 形態または溶液で貯蔵される。 治療用のリガンド類似体またはリガンド類似体特異性抗体は一般に、無菌アク セスポート例えば皮下注射針貫通可能な栓をもつ静脈注射溶液バッグまたはバイ アルに入れられる。 リガンド類似体またはＧＨｂｐ抗体の投与ルートは、例えば静脈内、腹腔内、 脳内、筋肉内、眼内、動脈内または傷害部内への注射や注入、さらには後記のよ うな持続投与系のような公知の方法による。リガンド類似体は注入や丸薬注射に より連続投与される。ＧＨｂｐ抗体も同様なやりかたで、または血流やリンパ液 の中へ投与される。 持続放出型製剤の適当な例は、フィルムやマイクロカプセルのような有形物品 の形態のマトリックスの蛋白を含有する固形疎水性ポリマーの半浸透性マトリッ クスを含む。持続放出マトリックスの例は次のようである。すなわちポリエステ ル、ヒドロゲル（例えばLanger et al.，J．Biomec．Mater．Res．15:167(1981) ; Langer，Chem．Tech．1298(1982)に記載のポリ（２−ヒドロキシエチルメタク リレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（U．S．Pat No． 3,773,919; EP 58,481）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメート（ Sidman et al.，Biopolymers 22:547(1983)）、非分解性エチレン−ビニルアセ テート（Langer et al.，supra）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー例えば Lupron Depot（乳酸−グリコール酸コポリマーとリュープロライドアセテートか ら成る注射可能のマイクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪 酸（EP 133,988）。エチレン−ビニルアセテートや乳酸−グリコール酸のような ポリマーは１００日にわたって分子を放出できる一方、ある種のヒドロゲルは短 期間のあいだ蛋白を放出する。カプセル化した蛋白が長時間体内に残るときは、 ３７℃で水分に露出される結果として変性または凝縮し、生物学的活性損失や免 疫遺伝的変化をおこす。合理的な戦略は、関係するメカニズムによる蛋白の安定 化によって工夫される。例えばもし凝縮メカニズムがチオジスルフィド交換によ る分子間Ｓ−Ｓ結合形成であるときは、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、 酸性溶液から凍結乾燥し、水分を調節し、適切な添加物を用いそして特定のポリ マーマトリックス組成物を発達させることで得られる。 持続放出リガンド類似体または抗体組成物はまた、リポソーム的に包まれたリ ガンド類似体や抗体を含む。リガンド類似体や抗体を含むリポソームは、それ自 体公知の方法で作成される。例えば DE 3,218,121; Epstein et al.，Proc．Nat l．Acad．Scl．U．S．A．82:3688(1985); Hwang et al.，Proc．Natl．Acad．Sc i．U．S．A．77:4030(1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese Patent Application 83-118008; U．S．Pat．No．4,485, 045; U．S．Pat．No．4,544,545; EP 102,324。通常はリポソームは、脂質含量 が約３０モル％より大きいコレステロール（選択された比率は最適のリガンド類 似体治療によて調節される）である小型（約２００−８００オングストローム） の単ラメラ型のものである。高められた循環時間のリポソームは、アメリカ特許 第５０１３５５６号に開示されている。変異型の用途 本発明のアッセイで選択されるアンタゴニストリガンド変異体は治療処方に用 いられるか、天然存在のリガンドの作用をブロックするアンタゴニストとして作 用する形質転換動物を発現する。例えばアンタゴニストは、成長ホルモン類似体 のレセプターの発現で特徴づけられるガンや他の病気の治療に有用である。形質 転換動物は新規なものとして、または実験モデルとして有用である。他の選択さ れたリガンド変異型は、アゴニストとして作用すべく治療的処方で用いられ、天 然存在サイトカインによるものと類似の応答を増大または促進すべく投与される 。例えばｈＧＨ変異体は医薬的に効果のある用量処方で用いられる（例えばアメ リカ特許第５０９６８８５号；１９８８年４月１５日出願）。リガンド変異体は 、天然のサイトカインと類似の活性をもち、但し好ましくない副作用は少ないか または無いという利点があり、その一例は糖尿病を誘発する活性の無いｈＧＨ変 異型である。アゴニストとしてもアンタゴニストとしても生物学的活性のないリ ガンド変異型は、少なくとも１つのリガンド免疫エピトープを保持しているため に野生型リガンドまたはその抗体のインムノアッセイに有用である。 ここで治療目的に使用される成長ホルモン類似体、変異型およびアンタゴニス トは、個々の患者の臨床的状態、組成物の到達部位、投与の方法、投与のスケジ ュール及びそのほか実務者に公知の因子を考慮に入れ、善良な医学的実務に則っ たやりかたで処方され投与される。ここで、目的のための化合物の「効果的な量 」はそのようなことを考慮して決定され、それは細胞成長を阻害または防御する 最低量である。そのような量は好ましくは哺乳動物に毒性を示す量より低いもの である。モノクローナル抗体とレセプターの刺激 幾つかの抗体はｈＧＨレセプターを刺激する能力があることがわかった。すな わちそれらはレセプターを、３元複合体を形成しレセプターを活性化する能力を 模倣するようなやりかたでレセプターを架橋結合する能力がある。そのようなア ゴニスト抗体の例は本発明の時点で既に公知であったが、それらがｈＧＨのアゴ ニストとして作用する能力は認められていなかった。適当な抗体はＭＡｂ２６３ である（Barnard et al.，Endocrinology 115:1805(1984); Barnard et al.，Bi ochem.J．231:459(1985)）。他の例はＭＡｂｓ１３Ｅ１及び３Ｄ９であり、下記 の方法で製造される。必要に応じこれらの抗体は、意図した宿主内の親の抗体よ り免疫性の低いＣＤＲグラフト型またはキメラを生成するのに用いる。抗体は好 ましくはヒトのレセプターに指向される。ｈＧＨのアゴニストは少なくとも２価 でなければならぬ。しかしＦＡｂフラグメントのような１コのレセプター分子と しか結合しない１価の抗体はアンタゴニストとして有用である。 ２価の抗体は若干の実施態様では２特異的である。すなわち抗体の１つのアー ムはひとつのレセプターエピトームに向けられ、もう１つのアームはレセプター 上の他のエピトームに向けられている。アンタゴニスト抗体の実施態様は、ひと つのアームがレセプターに向かい（好ましくはそのレセプター−レセプター接触 領域）他のアームがＧＨレセプター以外の抗原に向かうことを含む。抗体は通常 のハイブリドーマ方法または組換え方法で作られ、ここで組換え細胞は各々のア ームをコード化する重いそして軽い鎖で転換される。２特異的抗体は組換え方法 で作られ、細胞培養からアフィニティー精製で回収されるか、または抗体は別個 に作られそして通常の方法でインビトロで組換えされる。 これらの結果は獣医学の分野で特に興味がある。何故ならば、活性免疫により ＧＨアゴニストを生成するように成長ホルモンレセプターまたはそのフラグメン トに対してヒトを免疫することによりインビボでそのような抗体を培養すること が今や可能だからである。すなわち抗体は（外因性抗体の投与により）受動的か 、またはレセプターでの免疫により活発的に投与される。 アゴニスト抗体は、成長ホルモンに対する親和性に基づく用量で投与される。 哺乳動物についてのこれ以上の用量は、上述のラットの成長研究から容易に外挿 法できめられる。アンタゴニスト抗体は、もしも小動物が対象のときは正常量ま たはそれより低い範囲に効果的活性を減少させるように十分な成長ホルモンで計 算した用量で投与する。 抗体は、上述のリカンド類似体と実質的に同様なやりかたで処方され投与され る。アゴニスト抗体は、成長ホルモンが用いれた上記と同じ目的のために用いら れる。 次の実施例は本発明を行うために現在最良のやりかたを説明するためのもので あり、本発明はこれらの実施例に限定されると理解してはならない。 実施例１。ｈＧＨ−レセプター複合体の構造 本発明のアッセイ方法は、ｈＧＨ−レセプター複合体構造（すなわち１つのｈ ＧＨと２つのｈＧＨレセプターまたは結合蛋白が、検出されるべき安定な複合体 を形成しているもの）に基づくものである。これらのアッセイ方法はｈＧＨ（ｈ ＧＨｂｐ）₂複合体のアッセイ方法で例示される。 ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）₂複合体の結晶化 ｈＧＨ（２ｋＤ）とｈＧＨｂｐ（２８ｋＤ）（図１ａ）の間の複合体の結晶は 、蒸気相拡散で成長する（A．McPherson，in Preparation and Analysis of Pro tein Crystals，John Wiley & Sons，New York (1982)）。結晶は少なくとも２ ．７Åで回折され、そしてａ＝１４５．８Å、ｂ＝６８．６Å、ｃ＝７６．０Å の単位細胞パラメータの空間群（Ｐ２₁２₁２）に属する。これらの結晶の非対称 単位の量は、複合体がｈＧＨ・ｈＧＨｂｐまたは（ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ）₂の何 れかの形を持たないようなものである。特に溶媒含量は１：１複合体にはあまり にも高く（６８％）また単位細胞の２：２複合体にはあまりにも低い（３２％） 。結晶の典型的な溶媒量は約５０％（Matthews，J．Mol．Biol．33:491(1968)） なので、これらの結晶は成分の非対称的混合物を含有するようである。 結晶の精密な組成を調べるために、それを０．１％のトリフルオロ酢酸に溶か し、変性条件下でクロマト処理する（図１ｂ）。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの量を、２ １４ｎｍでモニターしつつ対応するピークの積分で定量する。それはペプチド結 合の不存在に対応する。４つの独立した測定から、ｈＧＨｂｐピークに対するｈ ＧＨピークのＡ₂₁₄の比率は０．４２±０．０２であった。ｈＧＨ・（ｈＧＨｂ ｐ）₂の形を持つ複合体について、積分ピーク面積の予測比率は、各々の成分中 の残基数（ｈＧＨでは１９１残基；ｈＧＨｂｐでは２３８残基）に基づいて０． ４０である。対照実験においてｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：２混合物は本質的に図 １Ｂと同一のクロマトグラムを示し、なお生成した２：１と１：１の混合物は予 期された異なるクロマトグラムを示した。従って図１の結晶はｈＧＨとｈＧＨｂ ｐの１：２のモル比を含有している。溶液中で安定な複合体を形成するｈＧＨと ｈＧＨｂｐの能力は、複合体形成は信頼できるアッセイパラメータであることを 確認する。 溶液中でのｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂複合体の形成 ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂複合体の存在は、サイズ排除クロマトグラフィーによ って溶液中で確認された。ｈＧＨとｈＧＨｂｐを１：４、１：３、１：２、１： １及び１：０．５の比で混合し、成分をSuperose 12 FPLC カラム（図２）上で ゲル濾過によって分離する。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：４の比のところで（図２ ）、各々ｈＧＨ・（ｈＢＨｂｐ）₂複合体と遊離のｈＧＨｂｐに対応する分子量 が約 ¹%がｈＧＨ１２より２．９倍高いのでｈＧＨｂｐの不存在で支配される。純粋な ｈＧＨｂｐは２．３５ｃｍ^-1である。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの１：３及び１：２の 比率において（図２Ｂ及び２Ｃ）、複合体ピークの形や位置には変化がない。し かし遊離のｈＧＨｂｐに対応するピークは顕著に減少してゼロとなる。すなわち １：２比においては、実質上すべてのｈＧＨとｈＧＨｂｐは複合体に結合する。 ｈＧＨとｈＧＨｂｐの比を１：１に調節し最終的に１：０．５とすると（図２Ｄ 、２Ｅ）、複合体ピークの位置は小さいサイズへと変化し（約５５ｋＤ）、非対 称的となり、そして遊離のｈＧＨが蓄積するので、ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）₂、 ｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ及びモノマーのｈＧＨに対応する種の混合物が示唆される。 これらのピークを越えて採取された蛋白サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、与えら れた 組成を確認する。追加的の対照実験は、遊離の成分はモノマー蛋白として挙動す ることを示し、これは二量化はこれらの条件下でｈＧＨとｈＧＨｂｐの両方の存 在を必要とすることを示している。従って複合体の形成は複数のアッセイ方法で 検出可能であり、ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）₂複合体形成は細胞レセプターへのｈ ＧＨの結合を示すものとして役立つ。同様にして、ｈＧＨ−ｈＧＨレセプター複 合体に類似のサイトカイン−サイトカインレセプター複合体を形成するサイトカ インレセプターを通じて作用するいかなるサイトカインも、そのようなアッセイ 方法で評価することができる。 実施例２ ｈＧＨレセプターの結合部位 ｈＧＨ結合蛋白またはｈＧＨレセプターへのｈＧＨ結合部位の性質は、結合蛋 白またはレセプターへのｈＧＨ結合部位をブロックした抗体を用いて特性化され た。ｈＧＨｂｐ上の２つの結合部位の証拠は次のようである。 ｈＧＨｂｐへのｈＧＨの親和性は、ｈＧＨｂｐからの［¹²⁵Ｉ］ｈＧＨの置換 およびグルコシル化したウサギＧＨレセプターから生産した抗レセプターモノク ローナル抗体（Ｍａｂ５）との複合体の沈澱によって典型的に測定される（Barn ard et al.，Endocrinology 115:1805(1984); Barnard et al.，Biochem．J．23 1:459(1985)）。このアッセイを用いたスキャッチャード分析は、ｈＧＨとｈＧ Ｈｂｐは１：１の複合体が形成可能であることを示した（Leung et al.，Nature 330:537(1987); Fuh et al.，J．Biol．Chem．265:3111(1990); Barnard，R．e t al.，Endocrinology 115:1805(1984); Barnard et al.，Biochem．J．231:459 (1985); Spencer et al.，J．Biol．Chem．263:7862(1988); Spencer et al.，J ．Biol．Chem．263:7862(1988)）。 最近、追加的なＭａｂがE．coliから精製した非グリコシル化ｈＧＨｂｐで免 疫して製造された（Fuh et al.，J．Biol．Chem．265:3111(1990)）。複合体を 沈澱させるためこれらの抗ｈＧＨｂｐＭａｂ（３Ｂ７及び３Ｄ９）の２つを用い ての置換曲線のスキャッチャード分析は、より高い結合親和性（Ｍａｂ５の０． ４ｎＭに対してＫ_D０．１ｎＭ）と化学量論（１ｈＧＨｂｐに対し０．５ｈＧＨ ）を与える。これらの結果はもしＭａｂ５が、ｈＧＨの第２の部位に結合するｈ Ｇ Ｈｂｐの決定因子をブロックするとすれば説明可能である。Ｍａｂ３Ｂ７と３Ｄ ９を用いてのアッセイにおける協力性の欠如は、１：１複合体におけるｈＧＨの 親和性（Ｍａｂ５を用いての測定）が１：２複合体のもの（Ｍａｂ３Ｂ７及び３ Ｄ９を用いての測定）よりも僅かに約４倍弱いのみであるという事実を反映して いるようである。さらに大きい示差親和性が、スキャッチャードプロットで上部 への反映による積極的な協力性を得るために必要であろう。さらにＭａｂ３Ｂ７ と３Ｄ９は、いかなる協力性をも弱めるであろう１：１及び１：２の複合体の両 方を沈澱させる。従ってｈＧＨの第２の結合部位のブロッキングは１：１ｈＧＨ −ｈＧＨｂｐモル比をもたらす；一方では第２の結合部位をブロックしない抗体 は１：２モル比をもたらす。 ｈＧＨの２つの結合部位の証拠は次のようである。Ｍａｂ５を、ｈＧＨとｈＧ Ｈｂｐ間の結合決定因子の走査−変異分析に用いた。従ってこれらの研究で同定 した決定因子は、１：１複合体の形成を調節するにはこれらが重要であることを 示す。このデータに基づいて本発明者はこれら決定因子を、非結合性のｈＧＨ同 族体およびｈＧＨｂｐと強固に結合する作成された類似体の中へ取り込んだ（Cu nningham et al.，Science 247:1461(1990)）。例えば野生型のヒトプロラクチ ン（ｈＰＲＬ）またはヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）は、ｈＧＨよりもｈＧＨｂ ｐに対して各々１０⁵倍または１０³倍以上弱く結合する。８つの置換分をｈＰＲ Ｌに入れたり（E62S/D63N/Q66E/H171D/E174A/N175T/Y176F/K178R; Cunningham e t al.，Science 247:1461(1990)）または５つをｈＰＬに入れたり（V4I/D56E/M6 4K/E174A/M179I）して、本発明者はｈＧＨよりも僅かに６．２倍または１．４倍 弱くｈＧＨｂｐと結合する変異型を製造した。 本発明者は、これら変異型がｈＧＨｂｐの１または２分子と結合できるか否か を決定すべくゲル濾過を行った（図４）。ｈＧＨｂｐ：ホルモンが２：１の比の とき、ｈＰＲＬ（図４Ａ）及びｈＰＬ（図４Ｂ）の両方の結合変異体は、ｈＧＨ ｂｐとの１：１複合体に対応する２つのピーク（分子量は約５５ｋＤ）並びに化 学量論的過剰のｈＧＨｂｐを表す低い分子量のピーク（３０ｋＤ）を示した。同 じ条件下で野生型ｈＧＨは、ｈＧＨ・（ｈＨｂｐ）₂複合体に対応する単一のピ ーク（分子量は約７７ｋＤ）を生じた（図４Ｃ）。図４Ｃにおける小さい衛星的 ピークは、小過剰のｈＧＨｂｐからのものである。ピーク組成はＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認した。 更に化学量論と反応熱を評価するために走査熱量計を用いた。何故ならば結合 は、複合体を分離するために抗体またはクロマトグラフィーを用いる必要なしに 溶液中で自由に研究できるからである。一定のｈＧＨｂｐ濃度（１５μＭ）を含 む溶液へｈＧＨを加え、それ以上のエンタルピー変化がなくなるまで反応熱を測 定した（図５）。この実験で、反応熱とｈＧＨｂｐに結合するｈＧＨの当量を測 定することができた。 野生型ｈＧＨとｈＧＨ及びｈＰＲＬ変異体の滴定終末点と反応熱を表ＩＩに要 約する。すべてのｈＧＨｂｐを結合するに必要なｈＧＨ比率は約０．５から１で ある。更に、結合を減少させる（２０倍まで）かまたは結合を高める（４．５倍 まで）一連の単一アラニン変異体は、反応のエンタルピーの変化にもかかわらず 野生型ｈＧＨのｈＧＨｂｐへの結合と同じ化学量論を与える。これと対象的に、 ｈＰＲＬ変異型のｈＧＨｂｐに対する結合の化学量論は０．８５から１である。 これらのデータ全体はｈＰＲＬとｈＰＬ変異型は、ｈＧＨｂｐの２量化のため の隠れた重要な決定因子であることを強く示す。これらの決定因子はｈＧＨの単 一アラニン変異体内に多く保存されているが、ｈＰＲＬまたはｈＰＬ変異型内に はない。このことは、ｈＧＨｂｐに対しｈＧＨ上には２つの結合部位のあること を示唆する。これらの部位の１つは各々Ｍａｂ５免疫沈澱アッセイを用いるｈＧ ＨｂｐまたはｈＧＨ（Cuningham et al.，Science 244:1081(1989)）のアラニン 走査変異で詳しく機能的に特徴づけられる。ｈＧＨとｈＧＨｂｐの上の２番めの 部位は未解決であり下記される。 実施例３ ｈＧＨ−レセプター複合体とスペクトルの変化 ｈＧＨとそのレセプターの結合は成分に少しのスペクトル変化をおこす。ｈＧ ＨのｈＧＨｂｐへの結合が成分の２次的または３次的構造に変化をおこすか否か を決めるために、複合体形成における円２色性（ＣＤ）及び蛍光スペクトルの変 化を調べた。０．０１ＭトリスｐＨ８．０と２００ｍＭのＮａＣｌ中の約１．０ ｍｇ／ｍｌの蛋白を透析して、分光分析のための蛋白を作成した。透析のあと、 溶液を濾過（０．２２μ、ミリポア）しそして吸収スペクトルを得た。スペクト ルを光の散乱に対して補正し（Shauenstein et al，J．Polymer Sci．16:45(195 5)）そして蛋白濃度ｗ２８０ｎｍの吸収で測定した。精製サンプルの吸収および 組成 ２．３５ｃｍ^-1である。ｈＧＨは、その４つの束ねられた構造（Abdel-Meguid e t al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．84:6434(1987)）に特徴的な強いａ− ヘリックスＣＤスペクトル（Bewley et al.，Arch．Biochem．Biophys．138:338 (1970)）を持つ。対照的にｈＧＨｂｐのＣＤスペクトルは、ジスルフィド結合で 接続するターンやループ（Cleary et al.，Biochemistry 31:45(1989); Hilder et al.，Biophysical Chemistry 31:45(1988)）から主に成る蛋白に特徴的であ る。ｈＧＨｂｐは３つの隣接的に結合したジスルフィド結合を含む（Fuh et al. ，J．Biol．Chem．265:3111(1990)）。冷凍細胞ペーストを低等張の緩衝液（10m M Tris pH8.0，1mM PMSF（Sigma），2mM EDTA）で解凍する。懸濁液をホモジナ イズし、４℃で１時間攪拌し、ついで１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離する 。上澄み液に２６０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを加え、溶解するまで攪拌する。 蛋白の沈澱を１０，０００ｘｇで３０分間遠心して採取する。ペレットを１０ｍ Ｍトリス（ｐＨ：８．０）と１ｍＭのＰＭＳＦに再懸濁し、同じ緩衝液に透析す る。透析液を１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中のＱセファローズカラム（Pharma cia）にかけ、０．０から０．５Ｍの線形勾配のＮａＣｌで溶離する。ｈＧＨｂ ｐ含有のピーク分画をｈＧＨ親和性カラムの上に直接おく。洗浄後、カラムを４ ＭのＭｇＣｌ₂と１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）で溶離する。ピーク分画を合 併し、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で透析し、モノＱカラムにかけ、洗浄し、 そして１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）と０．０〜０．２Ｍの線形勾配のＮａＣｌ で溶離する。 ｈＧＨとｈＧＨｂｐを混ぜると、遠紫外ＣＤスペクトルはｈＧＨとｈＧＨｂｐ のスペクトルの和と実質的に同じとなる（図６Ａ）。この結果は、複合に際して 通常の２次的構造に大きな変化がないことを示す。近紫外ＣＤスペクトル（図６ Ｂ）は、芳香族アミノ酸側鎖の非対象的環境を反映している（Bewley，Recent P rogress in Hormone Research 35:1555(1979); Bewley et al.，Archives of Bi ochemistry and Biophysics 233:219(1984)）。ｈＧＨに比べてｈＧＨｂｐのも つ大きなトリプトファンの量（１対９）が大きく影響し、ｈＧＨとｈＧＨｂｐの 紫外吸収スペクトルの間には大きな相違がある。しかしスペクトルの強度の増大 を除き、個々のスペクトルの和は混合後に得たものと本質的に同一である。 蛍光スペクトルにおいて、３４０ｎｍから３３４ｎｍへの青色のシフトがあり 、ｈＧＨのｈＧＨｂｐへの結合に際し蛍光強度の僅かな減少がある（図７）。ヨ ード消光とシュテルン−ボルマー分析は、ホルモンとレセプターの複合体ではト リプトファンの露出の減少のあることを示す。これは、ｈＧＨとの結合において ｈ ＧＨｂｐ中の１つまたそれ以上のＴｒｐ残基が埋め込まれた結果のようである。 何故ならば蛍光消光研究は、ｈＧＨの中のトリプトファンは溶媒によく露出しな いことを示しているからである（Bewley，Recent Progres in Hormone Research 35:1555(1979); Bewley et al.，Archives of Biochemistry and Biophysics 2 33:219(1984)）。対照的に、ｈＧＨｂｐの変異分析はＴｒｐ１０４がｈＧＨとの 結合に特に重要であることを示す。これらのスペクトル研究はｈＧＨとｈＧＨｂ ｐの結合に僅かのコンホメーション変化しか示さないけれども、これらの方法は 芳香族の基の位置変化（近紫外ＣＤ及び蛍光消光）と通常の２次構造の構造的変 化（遠紫外ＣＤ）に偏っている。従って複合および遊離の成分の高分解能構造は なおコンホメーションの変化をあらわす。 実施例４ アッセイ方法と修飾ｈＧＨ 修飾ポリペプチドホルモンをアッセイ方法で評価した。１セットのｈＧＨ残基 （F10，F54，E56，158，R64，Q68，D171，K172，E174，F176，R178，V185を含む ）はｈＧＨｂｐとの高度親和性の化学量論結合に重要なことが知られている（WO 9O/04788）。これらの決定因子はｈＧＨｂｐを強固に結合するｈＰＬ及びｈＰ ＲＬ類似体を同定するため（Ｋｄは各々１ｎＭ及び６ｎＭ）ｈＧＨｂｐ結合不能 のｈＧＨ同族体、ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）及びヒトプロラクチン（ｈＰＲ Ｌ）に取り入れられた。既述のように、ｈＧＨはｈＧＨｂｐと相互作用しｈＧＨ （ｈＧＨｂｐ）₂の形の複合体をつくる。補充したｈＰＬ及びｈＰＲＬ類似体は ｈＧＨｂｐの２量化を促進しないのでｈＰＬ及びｈＰＲＬ材料は、最初のレセプ ター認識および結合に必要なものとは別の必要な２量化決定因子を欠如している と結論する。ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂の形成に関係する領域を局在化するために 、ｈＰＬまたはｈＰＲＬ同族体置換した一連のｈＧＨ変異体並びに２つの削除類 似体を、ホルモン誘発レセプター２量化の減少のためにスクリーニングした。次 に重要な側鎖は、さらに詳細なアラニン走査戦略で同定した。 ホルモン誘発ｈＧＨｂｐの２量化の定量のために、蛍光でラベルしたｈＧＨｂ ｐのホモクエンチングを測定する感度アッセイを用いた。変異体のｈＧＨｂｐ（ Ｓ２３７Ｃ）を構築し、精製し、そして５−ヨードアセタミドフルオレセイン（ ５ −ＩＡＦ）と反応して蛍光的にラベルしたｈＧＨｂｐ（Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ）を得 た。得られたＳ２３７Ｃ−ＡＦ試薬はｐＧＨｂｐあたり１コのラベルをもち、競 合的結合アッセイでは十分な結合活性を保持する。フルオレセインは、重なりあ う励起および発光スペクトルをもっているのでこの蛍光プローブは分子が互いに 接近するときにホモクエンチングを受ける。このシグナルは、図８に示すように Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのホルモン誘発２量化をモニターするのに用いる。 図８には、ｈＧＨの順次添加による１０ｎＭのＳ２３７Ｃ−ＡＦのホモクエン チングを示す。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦを結合緩衝液（20mM Tris.HCl，pH7.5; 0.1%BS A; 0.02% NaN₃）の中で１０ｎＭ濃度に希釈し、そして１．０ｍｌのアリコート を１２ｘ７５ｍｍのポリプロピレンアッセイ管に入れる。１２０ｍＭから０．０ ０２ｍＭの範囲でｈＧＨの別々の希釈を行う。次に緩衝液またはｈＧＨ希釈液の アリコート（１０ｍｌ）のみをＳ２３７Ｃ−ＡＦ管に加え、混合物を暗所で２５ ℃に５時間培養して平衡化させる。培養後、島津のＲＦ５０００Ｕ分光蛍光計で ４９０ｎｍの励起１と５１２ｎｍの発光１（バンド幅は各々３ｎｍと１０ｎｍ） を用いて蛍光を測定する。Ｆ／Ｆｏ比を３回の測定から計算し、ｈＧＨ濃度に対 してプロットする。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦの製造は次のようである。変異体Ｓ２３７ Ｃ−ｈＧＨｂｐを構築し前述のようにして精製する。１ｍｇ／ｍｌのＳ２３７Ｃ 溶液を２５ｍＭシステイン塩酸塩と２５ｍＭのＮａＨＣＯ₃に加え、４℃で２時 間培養して２３７の位置でシステインを脱ブロックする。５０ｍＭトリス塩酸塩 （ｐＨ８）で平衡化したＰＤ１０（Pharmacia）ミニカラムで脱塩し、直ちに暗 所で５００ｍＭの５−ＩＡＦ（Molcular Probes）と４℃で１６時間反応させる 。５−ＩＡＦ添加前の脱ブロックＳ２３７ＣのＤＴＮＢ分析は、Ｓ２３７Ｃ分子 あたり平均１つの遊離チオール基を示す（２２ｍＭの遊離ＳＨに対して１７ｍＭ のＳ２３７Ｃ）。５−ＩＡＦの反応したＳ２３７Ｃは、２０ｍＭトリス塩酸塩（ ｐＨ７．５）で平衡化した別のＰＤ１０ミニカラムを用い遊離のフルオルフォア （Fluorfore）から精製する。精製したＳ２３７Ｃ−ＡＦのアリコートを−８０ ℃で貯蔵し、使用直前に解凍する。Ｓ２３７Ｃ−ＡＦの吸収スペクトル分析は、 ７１３００（４９４ｎｍで）と６４８００（２８０ｎｍで）のモル吸光係数を用 い２ ８０ｎＭでの５−ＩＡＦ吸収干渉を補正することで、１．０ｍＭのＳ２３７Ｃあ たり０．８４ｍＭのフルオレセイン結合を示す。 ここに、ｈＧＨは一定の１０ｎＭ濃度のＳ２３７Ｃ−ＡＦに対し系列的に希釈 され、そして蛍光クエンチングを平衡点で測定する。ホモクエンチングはｈＧＨ の添加と共に増加し、ｈＧＨの０．５モル当量（５ｎＭ）で最大（ＤＦ／Ｆｏ＝ １１％）となる。しかし極めて顕著なことには、このホモクエンチングはｈＧＨ の高濃度では逆転し、これはｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）₂は過剰のｈＧＨの存在下 で（すなわちｈＧＨ／ｈＧＨｂｐが０．５よりも大きいとき）ｈＧＨ・ｈＧＨｂ ｐモノマー複合体に解離することを示す。測定された蛍光ホモクエンチングは、 供与体（Ｓ２３７Ｃ−ＡＥＤＡＮＳ）蛍光クエンチンクと受容体（Ｓ２３７Ｃ− ＡＦ）蛍光励起の両方を測定するため非同一の供与体／受容体のペアを用いた実 験から示されるような正当のフォルスターエネルギー転移を反映している。大過 剰のｈＧＨ（７０ｎＭより大きい）の存在下でおこるところのＦ／Ｆｏが１より 大きい値の測定蛍光値の上昇は、結合したｈＧＨ・Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ複合体に対 する遊離のＳ２３７Ｃ−ＡＦの高い非特異性結合によるもののようである。この 現象はアッセイで得た（図９）ＩＣ₅₀値を僅かに歪めるようであるが、我々の分 析の基礎である相対的ＩＣ₅₀値は影響を受けないで保持されるべきである。 図９において、Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのｈＧＨ誘発２量化のＩＣ₅₀測定が行われた 。結合緩衝液（20mM Tris.HCl，pH7.5; 0.1% BSA; 0.02% NaN₃）中のＳ２３７Ｃ −ＡＦの系列的希釈（３倍）（図８に示すようにして作成）は６０ｎＭから０． ０８ｎＭの範囲にわたって作られ、そして１．０ｍｌのアリコートをアッセイ管 に入れる。同様に、ｈＧＨを系列的に希釈したが、ただしその範囲は３ｍＭから ０．００４ｍＭとする。ｈＧＨ希釈（ｈＧＨ：Ｓ２３７Ｃ−ＡＦのモル比は１： ２）のアリコート（１０ｍｌ）と緩衝液のみを、Ｓ２３７Ｃ−ＡＦ含有のアッセ イ管に添加し（３回）、混合し、そして暗所で平衡に達するまで２５℃で５時間 培養する。平衡のあと、既述のようにして（図８）蛍光を測定する。但し励起バ ンド幅は１０ｎＭとする。ＩＣ₅₀値を、最大の半分のＤＦ／Ｆｏ値を与えるｈＧ Ｈ濃度として計算する。 表ＩＩＩには、ｈＧＨの削除変異体および同族体置換で誘導されたＳ２３７Ｃ −ＡＦの２量化のＩＣ₅₀値が示されている。ｈＧＨ変異体の同等性を次のように 示す。削除はＤ；ヒト胎盤ラクトゲン置換はｈＰＬ；そしてヒトプロラクチン置 換はｈＰＲＬ。削除または置換した領域はカッコで示す。ＩＣ₅₀値は図２で説明 したようにして測定する。標準偏差はふつうは文献値の＋／−５０％よりも少な い。 まずｈＰＬ及びｈＰＲＬセグメント置換の一連の同族体走査ｈＧＨ変異体をＳ ２３７Ｃ−ＡＦに基づくアッセイで試験した（表ＩＩＩ）。そのうち３つ、すな わちｈＰＲＬ（１２−１９）、ｈＰＲＬ（７５−７４）及びｈＰＲＬ（１１１− １２９）は、ホルモン誘発ｈＧＨｂｐ２量化において著しい減少（各々１８、６ 及び１００倍より大きい）を示した。しかしｈＰＲＬ１２−１９及びｈＰＲＬ５ ４−７４は、１次部位結合に決定的な残基を分裂させ、この部位のｈＧＨｂｐ親 和性を実質的に減少させた。これらの変異体に対する１次部位結合の損失は、ｈ ＧＨｂｐの２量化について観察された減少に大いに関係しているようである。実 際、野生型のｈＧＨによるＳ２３７Ｃ−ＡＦホモクエンチングで観察された５０ ０ｐＭＩＣ₅₀は、１次部位ｈＧＨｂｐ親和性に関して報告されたもの（Ｋｄ＝４ ００ｐＭ）と殆ど同等である。更には、結合親和性を減少する１次部位決定因子 の変異体（たとえばＲ６４Ａ及びＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａ）もまた２量化を減少 し、そして１次部位のｈＧＨｂｐ親和性を高めるｈＧＨ変異体（Ｅ１７４Ａ）も 我々のアッセイでは２量化を高める。他の同族変異体すなわちｈＰＲＬ（１１１ −１２９）は、１次部位結合には影響しないけれども、サイズ排除クロマトグラ フィーで分析したとき不均一性の証拠を示し、９０％はｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ複合 体のみを形成するが残りの１０％はｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）₂を形成する。比較 的完全な２次部位結合のこの変異体の副分画の存在は、この変異体の効果は蛋白 の保持不全または翻訳後修飾に帰せれれることを示唆する。 同族体走査変異体に加えて２つのｈＧＨ削除類似体、すなわち１つはＮ−末端 から８つの残基を除いたもの［Ｄ（１−９）］もう１つは３２−４６残基を削除 した天然の変異型（２０ＫｈＧＨ、アメリカ特許第４４４６２３５号）を試験し た（表ＩＩＩ）。Δ（１−８）変異体はｈＧＨｂｐ２量化誘発能力において劇的 な減少を示した（１００倍より大きい）。この変異体は１次部位結合に僅かの効 果しかないので（Ｋｄ_mut／Ｋｄ_wt＝４）、ｈＧＨｂｐ２量化での損失は２次部 位ｈＧＨｂｐ結合の分裂によるものであろう。 実施例５ ｈＧＨ変異体のアラニン走査 ２次部位ｈＧＨｂｐ結合に関与する特定の側鎖を解明するために、アラニン走 査によってＤ（１−８）、ｈＰＲＬ（１１−１９）及びｈＰＲＬ（１１１−１２ ９）変異体で同定された領域を調査した。同族性置換で同定した２つの領域はブ タ成長ホルモンのＸ線結晶構造によればヘリックス形で高度に両親媒性なので、 我々は変異体について残基が溶媒に露出されているこれらのヘリックスの親水性 面に位置するもののスクリーニングに焦点をあてた。これらの領域に加えて、我 々は更にＣ−末端に近い３つの変異体（Ｅ１８６Ａ、Ｓ１８８Ａ及びＦ１９１Ａ ）をスクリーニングした。何故ならば我々はこの領域における適当な同族的置換 類似体を欠いているからである。 ２６のアラニン変異体のセット（表ＩＶ）から我々は、ｈＧＨｂｐ２量化で大 きい分裂（３３及び５６倍）を惹き起す２つの変異体すなわちＦ１Ａ及びＩ４Ａ 並びに２倍以上の減少を惹き起すもう４つのもの（Ｌ６Ａ、Ｒ８Ａ、Ｄ１１６Ａ 及びＥ１１９Ａ）を発見した。アラニン走査は、Ｎ末端におけるＦ１Ａ及びＩ４ Ａの近傍の残基はヘリックスＡとＣのＣ末端領域の残基と同様に、２次部位ｈＧ Ｈｂｐ結合に顕著に貢献しないことを示す。Ｎ末端領域からＦ１とＰ２を削除し たｈＧＨ類似体［Ｄ（１，２）］からの付加的データはＤ（１，２）を示しＦ１ Ａ単独が起こすようなものより大きく２量化を分裂しない。このことはＮ末端ア ミンまたはカルボニル基ではなくてフェニルアラニン側鎖が重要であることを示 す。アラニン走査分析は２次部位ｈＧＨｂｐ結合とレセプター２量化に最も関係 するｈＧＨ決定因子はＦ１とＩ４の疎水性の側鎖であることを示す。これらの決 定因子は、支配的な親水特性の多くの残基から成る（Matthews，J．Mol．Biol． 33:491(1968)）１次部位結合に必須なものとは全く異なっている（Boutin et al .，Cell 53:69(1988)）。 アラニン置換ｈＧＨ変異体で誘発されたＳ２３７Ｃ−ＡＦ２量化のＩＣ₅₀値を 表ＩＶに示す。変異体は、野生型残基とアミノ酸配列内の位置、そして変異体残 基（この場合はアラニン）から命名される。アミノ酸は１次コードで次のように 表す。A，Ala; C，Cys; D，Asp; E，Glu; F，Phe; G，Gly; H，His; I，Ile; K ，Lys; L，Leu; M，Met; N，Asn; P，Pro; Q，Gln; R，Arg; S，Ser; T，Thr; V ，Val; W，Trp; Y，Tyr。発現されなかった変異体はＮＥと表示する。ＩＣ₅₀値 は図２に示すようにして計算する。標準偏差はふつう文献値または既述の値の＋ ／−５０％より少ない。 実施例６ 蛍光のホモクエンチング 一定濃度のＳ２３７Ｃ−ＡＦ（１００ｎＭ）にｈＧＨを逐次的に加え蛍光ホモ クエンチングをリアルタイムでモニター（実施例４）したところ、ｈＧＨ誘発２ 量化では迅速な平衡時間（３分より短い）を、そして過剰のｈＧＨの２量化（ｈ ＧＨ／ｈＧＨｂｐ比は０．５より大）では緩徐な平衡時間（３０分より長い）を 示した。これは２量化の反転が、次のメカニズムによるオフ速度限定（off-rate limited）であることを示唆する。 ＨＲ₁Ｒ₂ ｆｉ ＨＲ_x ＋ Ｒ ｆｉ^+excessHfi ２ＨＲ ここに化学量論結合は過剰のｈＧＨ（Ｈ＝ｈＧＨ、Ｒ＝遊離ｈＧＨｂｐ、Ｒ₁＝ １次部位ｈＧＨｂｐ、Ｒ₂＝２次部位ｈＧＨｂｐ）条件下で２量化と競合する。 １次部位化学量論的結合がおこり、従ってｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂複合体生成と 競合することはわかっている。化学量論的２次部位結合が起こるかどうかの決定 のために、２量化に競合する能力について１次部位を除去した類似体を試験した 。ｈＧＨｂｐ親和性を５００倍減少する１次部位の中央にある変異による二重変 異体であるＫ１７２Ａ／Ｆ１７６Ａは、２次部位を保持している。図１０は、ｈ ＧＨｂｐはたとえ１６０倍過剰（８００ｎＭ）で存在していても過剰のＫ１７２ Ａ／Ｆ１７６Ａによって反転されないことを示す。対照してみると、作りだした １ 次部位をもつが２次部位決定因子を欠如する公知のｈＰＬ変異型は、２量化を２ ０ｎＭ（４倍過剰）のＩＣ₅₀で効果的にブロックする。このデータは、化学量論 的２次部位結合はおこらないこと、そして２量化は連続的な結合メカニズム、す なわち Ｈ ＋ Ｒ ｆｉ ＨＲ₁ ｆｉ ＋ ^R ｆｉ ＨＲ₁Ｒ₂ によって進行することを示す。 ２次部位ｈＧＨｂｐ結合は化学量論的な１次部位複合体形成を必要とするので 、この結合はｈＧＨ単独ではなくて、ｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）の中に存在する決 定因子に依存せねばならぬ。そのようにこれらの決定因子は、最初のｈＧＨｂｐ 結合によって引き出されるコンホメーション的変化及び／または１次部位ｈＧＨ ｂｐから誘導されねばならぬ。 実施例７ Ｘ線結晶学に基づくｈＧＨ−ｈＧＨｂｐアミノ酸相互作用 ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂結晶の生成は、Blundell and Johnson，Academic Pres s，London，1976 に記載の方法に従うＸ線結晶学技術を用いてｈＧＨ（ｈＧＨｂ ｐ）₂複合体の３次元構造の決定を可能とする。複合体の結晶は、結晶種添加の 反復と共に存在する液滴の蒸気拡散を組み合わせて成長させる。結晶の貯蔵液は 、ｈＧＨｂｐにｍｅｔ^-ｈＧＨを僅かに２：１モル過剰で添加し４℃で２４時間 培養して製造される。次に複合体を濃縮し、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭの 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び１ｍＭのＰＭＳＦで平衡化したサイズ排除カ ラム（G75-120 Sephade (Sigma)）上におく。複合体を含む分画をプールし、濃 縮し、そして５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と１ｍＭのＰＭＳＦで脱塩 する。得られたストック液中の複合体濃度は４ｍｇ／ｍｌであった。Ｅ₂₈₀（０ ．１％）＝１．６７ｃｍ^-1。複合体のストック溶液は、飽和硫酸アンモニウム（ 超精製したもの；Schwarz-Mann）を添加して１０％飽和溶液とした０．１Ｍビス トリス液（ｐＨ６．５）を用いて１．７ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＭＰＤ（Aldric h）を、最終濃度が１％になるように添加した。次に混合物５０μｌをパイレッ クス ガラスの滴板にピペットで加え、結晶種添加の前に１５０ｍｍｘ２５ｍｍのプラ スチックの培養皿の中で室温で２日間４０％硫酸アンモニウムで平衡化する。２ 週間のうちに、４５ｋＶ、１１０ｍＡで作動する回転陽極ゼネレータ上で２．７ オングストロームで回折する１ｘ０．５ｘ０．１ｍｍの大きさの結晶を得る。 ｈＧＨ（ｈＧＨｂｐ）₂結晶構造の３次元ポリペプチド構造を図１１に示す。 中央上の領域の太線はｈＧＨ分子を表し、αヘリックスは明瞭に見える。このｈ ＧＨ分子は２つのｈＧＨｂｐ分子と結合し、その１つは左側、もう１つは右側で ある。これらのｈＧＨｂｐ分子の各々は一本鎖で結合する２つの領域をもち、上 の領域はｈＧＨ分子と同じ高さで、他の領域は垂直に位置し図の下のほうへ出て いる。ｈＧＨｂｐのこれら最後の２つの領域は、図１１の下端で互いに接触して いる。この底部での接触は、２つのｈＧＨｂｐ分子間の唯一の接触領域であり、 その接触点は以下に記載する。この構造に基づいて、３つのポリペプチドの相互 作用アミノ酸の分析が行われた。それらは次の３つのカテゴリーに分けられる： １）表Ｖに示すｈＧＨとｈＧＨｂｐ１（結合すべき最初のｈＧＨｂｐ）の間の相 互作用；２）表ＶＩに示すｈＧＨとｈＧＨｂｐ２（結合すべき２番目のｈＧＨｂ ｐ）の間の相互作用；３）表ＶＩＩに示す複合体の２つのｈＧＨｂｐの間の相互 作用。表ＶとＶＩは、そこに示す特異なｈＧＨｂｐアミノ酸へ結合する特異な個 々のｈＧＨアミノ酸を開示する。特定の基の結合と化学的相互作用の性質もまた 記載してある。命名は標準的なアミノ酸１文字命名法に従い、天然のｈＧＨまた はｈＧＨｂｐのアミノ末端から数えるときのアミノ酸の数に従う。表Ｖ、ＶＩ及 びＶＩＩにおけるその他の記号の意味は次のようである。ＭＣ＝主鎖、ＳＣ＝側 鎖、ＳＳ＝ジスルフィド、ＨＢ＝水素結合、ＳＢ＝塩橋、ＶＷ＝ファンデルワー ルス。これらの表は全ての部位１−及び２−影響残基を包含するものではない。 実施例８ モノクローナル抗体のｈＧＨレセプター刺激のための使用 本発明のアッセイは、成長ホルモンレセプターに向けられたモノクローナル抗 体のスクリーニングに用いられる。得られたモノクローナル抗体は、成長促進の 相対的能力をインビボで評価できる。モノクローナル抗体ＭＡｂ２６３（Agen B iochemical Ltd.，Queensland，Australia）を、グリコシル化ラットとウサギレ セプターを免疫源として作成する。ＭＡｂ２６３を、ラットで１５５ｍｇ／ｋｇ のｈＧＨ用量とモル比で当量の用量で下垂体切除ラットの皮下注射で毎日投与す ると、図１２に示すように著しい体重増加が認められる。 １群８匹のラットから成る２群に対して、ＭＡｂ２６３（１．０５ｍｇ／ｋｇ ）と共にまたは無しで希釈緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８、０．１％ウシ血清 アルブミン）を投与する。ラットには食餌と水を要求に応じて与える。毎日の体 重を図１２に示す。第６日目の終わりにラットの体重を測定し、結果を下の表Ｖ ＩＩＩに示す。 従って成長ホルモンレセプターに対するモノクローナル抗体は、体重増加をお こさせるために投与することができる。 実施例９ アゴニストまたはアンタゴニスト活性のための細胞アッセイ 新規な細胞に基づいた生物活性アッセイ系をここに提供する。それは、ホルモ ンまたはサイトカインレセプターへＣ末端で自由にしたＧＨレセプターの細胞外 ＧＨ結合領域、例えばＥＰＯ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、 ＧＭ−ＣＳＦ，Ｃ−ＣＳＦ、プロラクチン、胎盤ラクトゲンまたはインターロイ キン２、３、４、６もしくは７のそれ、ホルモンまたはサイトカインに通常応答 する細胞系およびホルモンまたはサイトカインのレセプターを通常含有する細胞 系から成るところのハイブリッドレセプター（アメリカ特許第４８５９６０９号 ）形質転換細胞系に基づくものである。通常は、Ｎ末端とＧＨレセプターフラグ メントが融合したホルモンまたはサイトカインレセプターの貫膜および内質部分 のみが用いられる。細胞の応答性は、測定可能な特性たとえば膜特性の変化、増 殖、有糸分裂性、被検体の放出（たとえば脱顆粒）などである。 ｈＧＨレセプターは、インターロイキン３（ＩＬ−３）や顆粒球コロニー刺激 因子（Ｇ−ＣＳＦ）レセプターを含む造血起源のレセプターの一大グループに属 する（Bazan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．87:6934(1990); Cosman et al. ，Trends Biochem．Sci．15:265(1990); Patthy，Cell 61:13(1990)）。ナガタ とその共同研究者（Fukunaga et al.，EMBO J．10:2855(1991)）は、全長のネズ ミＧ−ＣＳＦレセプターでトランスフェクトしたＩＬ−３依存性骨髄白血病細胞 系（ＦＤＣ−Ｐ１）ばＩＬ−３無しのＧ−ＣＳＦの添加によって増殖することを 示した。ハイブリッドレセプター（アメリカ特許第４８５９８０９及び５０３０ ５７６号）が大阪生科学研究所のイシザカ−イケダエツコ及びナガタシゲカズ博 士によって構築された。このものはＧ−ＣＳＦ結合領域を欠如し但し３つの細胞 外フィブロネクチン反復、貫膜および細胞内領域を含むｍＧ−ＣＳＦレセプター の形に結合したｈＧＨｂｐを含有している。フィブロネクチン領域はＧ−ＣＳＦ の結合に関与せず、ｍＧ−ＣＳＦレセプターの良好な発現に必要である（Fukuna ga et al.，EMBO J．10:2855(1991)）。 ハイブリッドルセプターは、ｍＧ−ＣＳＦレセプター（３つのフィブロネクチ ン領域ならびに全貫膜および細胞内領域をコードしているもの）のエキソン７か ら１５までに結合しているｈＧＨレセプター（分泌シグナルと細胞そとｈＧＨ結 合領域をコードしているもの）のエキソン１から５までを含有するｃＤＮＡから 構築された。ｈＧＨレセプターから誘導される配列（Leung et al.，Nature 330 :537(1987)）は、ＦＤＣ−Ｐ１細胞のハイブリッドレセプターの発現を許すベク ター、すなわちｐＢＯＳ−Ｉ６１（Fukunaga et al.，EMBO J．10:2855(1991)） の中へＰＣＲでクローンされた。単一のシステインは、２つのレセプターフラグ メントの接続部で生産された。安定なＦＤＣ−Ｐ１細胞のトランスフェクション と培養は（上に）述べたとおりであった。 全細胞でのハイブリッドレセプターからの［¹²⁵Ｉ］ｈＧＨの競合的置換は、 細胞あたりのレセプターの概数と親和性を調べるために用いた。ＩＬ−３で成長 させた細胞は、アッセイの前に燐酸塩で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）と１０％ＦＢ Ｓで洗浄する。細胞を４℃で１８時間、１０ｐＭの［¹²⁵Ｉ］ｈＧＨ（Ｙ１０３ ）の存在下にｈＧＨの系列的希釈で培養（１．２ｘ１０⁶／ｍｌ）する。次に細 胞をＰＳＣで２回洗浄して過剰のラベルを除去する。Ｙ１０３Ａは、第２のｈＧ Ｈｂｐの結合を部分的にブロックするであろうＹ１０３のヨード化を防ぐのに用 いる（Bass et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．88:4498(1991)）。 幾つかの独立した結合実験において、ｈＧＨのＫ_d値は０．１±０．０３ｎＭ であり、細胞あたり１０００±３００のレセプターがあった。この親和性は、可 溶性のｈＧＨｂｐへのｈＧＨ結合より約３倍強力で、細胞のレセプターへのｈＧ Ｈの結合の結合活性効果を反映している。非トランスフェクト細胞は、ｈＧＨの 特異的結合部位を欠いている（Bass et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A ．88:4498(1991)）。図１３は、細胞増殖を誘発するｈＧＨの能力におけるｈＧ Ｈ濃度の増大効果を示す。低濃度ではｈＧＨはこのアッセイでは、細胞全体にお けるＫ_d（約１００ｐＭ）より若干低い約２０ｐＭのＥＣ₅₀で潜在的アゴニスト として作用する。これは、１００％のレセプター占拠率より低いところで最大の 細胞増殖がおこっているであろうことを反映する。 突然変異分析（Cunningham et al.，Science 254:821(1992); Cunnngham et a l.，Science 244:1081(1989)）及び構造研究（De Vos et al.，Science 255:306 (1992)）は、各々のｈＧＨ分子は２価でｈＧＨｂｐを結合するのに２つの別々の 部位を含有していることを示す。対照的に、ｈＧＨｂｐは効果的に１価である。 何故ならばその各々は、ｈＧＨの部位１または２と結合するのに実質的に同じ決 定因子を用いるからである。過剰のｈＧＨはｈＧＨ・（ｈＧＨｂｐ）₂複合体を 分解してｈＧＨ・ｈＧＨｂｐ複合体とし、ここでｈＧＨはｈＧＨｂｐの部位１に のみ結合する。すなわち本発明者は過剰のｈＧＨはシグナル化をアンタゴナイズ すると考える（図１）。事実、きわめて高いｈＧＨ濃度では増殖活性は失われる （ＩＣ₅₀＠２μＭ）。ＩＬ−３誘発の細胞増殖は、高い濃度のｈＧＨ（８μＭ） の存在下では変化せず、ｈＧＨは細胞増殖に毒性的でないことを示す。アゴニス トもアンタゴニストもその変曲点は細胞密度に依存せず（図１３）、これはこの 効果が細胞間の橋かけ結合レセプターまたは他の細胞−細胞相互作用を含まない ことを示す。更に、全長ｍＧ−ＣＳＦを含有するＦＤＣ−Ｐ１細胞はｈＧＨに応 答せず、ハイブリッドレセプターを含有する細胞はＧ−ＣＳＦに応答しない。 実施例１０ ハイブリッドレセプター細胞増殖アッセイをシグナルするｈＧＨｂｐの２量化 に必要なものを更に調べるため本発明者は、ｈＧＨｂｐに対して指向されるそれ ら（ＦＡＣｓ）から誘導される１価のフラグメントと２価のモノクローナル抗体 （ＭＡｂｓ）を用いた。低濃度の４つの異なる抗レセプターＭＡｂｓのうちの３ つを高濃度で添加したところ、細胞増殖を誘発するためにはｈＧＨと同程度に活 性であった（表ＩＸ）。Ｎｏｎｅは効果のないことを表し、ＮＤは測定してない ことを表す。 ＭＡｂ５と２６３はArgen，Inc.（New Jersey）から入手し、Waters及び共同 研究者（Barnhard et al.，Endocrinology 115:1805(1984); Barnard et al.，B iochem.J．231:459(1985)に記載されている。ＭＡｂｓ１３Ｅ１と３Ｄ９はジェ ネンチックハイブリドーマグループから入手し、その性質はいろんなところに記 載がある（Cunningaham et al.，Science 254:821(1992)）。簡単にいえば、Ｍ Ａｂｓはマウスの腹水症液をプロテインＡセファローズと結合させ、０．１Ｍの 酢酸塩（ｐＨ３．０）で溶離して精製する。ＦＡｂフラグメントは、１０ｍＭシ ステインを添加したＰＢＳの中で、ジチオスレイトールで活性化したパパインで ＭＡｂｓを１時間処理（ＭＡｂとパパインは５０：１の重量比）して製造する。 ０．１Ｍのヨードアセタミドを添加して消化を停止させる。Ｆｃと残りのＭＡｂ は、プロテインＡセファローズに２回吸着させＳｕｐｅｒｏｓｅ１２（Pharmaci a）上でゲル濾過して除去する。 各々のＭＡｂ（０．３〜１ｎＭ）のＥＣ₅₀値は通常は、ＥＬＩＳＡで測定した Ｋ_dよりも若干低い（表ＩＸ）。ｈＧＨについてはこれは、細胞全体への結合活 性効果を反映しているか及び／またはその最大シグナル化は１００％より少ない レセプター占拠率で得られる。さらに高い濃度（２０ｎＭ〜１０μＭ以上）では 、これらのＭＡｂｓのうち２つは活性を失う。これは多分過剰のＭＡｂが、ｈＧ Ｈｂｐとの１価結合によってレセプターの橋かけ結合をブロックするからである 。対応する１価のＦＡｂフラグメントは実質的に不活性であり（図ＩＸ）これは 更に２価がシグナル活性に必要であることを示す。 これらのＭＡｂｓの用量依存性曲線における相違は、それらのｈＧＨｂｐへの 結合において異なったやりかたがあることで説明できる。ＭＡｂ５は、たぶん両 方のレセプターが互いに接触している領域への結合により（図１１）、ｈＧＨ・ ｈＧＨｂｐへの第２のｈＧＨｂｐの結合を防ぐ（Cunnningham et al.，Science 254:821(1992)）。ＭＡｂ５が最も効果が低いという事実は、レセプターは最大 シグナル化のために互いに近接する必要があることを示す。ＭＡｂ１３Ｅ１はｈ ＧＨ結合をブロックし（Cunningham et al.，Science 247:1461(1990)）ｈＧＨ の効果を模倣する。このＭＡｂは広いプラトーを示し、アンタゴニストの相を示 さない。これは多分我々がそれを観察するほど十分に高い濃度に達していないか らであろう。我々はこの中和ＭＡｂはｈＧＨのように結合し極めて安定なレセプ ター２量体を形成することを示唆する。対照的にＭＡｂｓ２６３と３Ｄ９は、ホ ルモンとレセプターの界面から離れたところを結合して類似のアゴニスト及びア ン タゴニスト相を示す。これら２つの相は、ｈＧＨほど広くは隔たっていない。こ れは多分２量体は最良のレセプター−レセプター接触をもっていないからであろ う。ＭＡｂｓ３２６３と３Ｄ９がアゴニストであるという事実は、活性２量体を 形成する構造上の必要はかなり緩やかであることを示唆する。 ＭＡｂ１３Ｅ１またはＭＡｂ５から誘導されたＦＡｂフラグメントはｈＧＨ− 誘発の細胞増殖に拮抗し、いっぽうＭＡｂ２６３及び３Ｄ９から誘導されたもの はそうではない（表Ｘ）。これらの実験において細胞は、１ｎＭのｈＧＨに高濃 度のＦＡｂまたはｈＧＨ類似体を加えたもので培養する。半分最大阻止濃度は、 ｈＧＨの細胞増殖活性の５０％をブロックするに必要な濃度である。Ｎｏｎｅは 、１０μＭまでにＦＡｂまたはｈＧＨ類似体では阻止が認められなかったことを 表す。これらの研究は、ＭＡｂ１３Ｅ１及びＭＡｂ５のエピトープはホルモン− レセプターまたはレセプター−レセプター界面をブロックするという事実と一致 する。 実施例１１ ２量化のためのｈＧＨの構造必要性を更に決定するために（図１１）、我々は 部位１または２へのレセプターの結合を減少させるように設計したｈＧＨの変異 体を調べた。部位２決定因子は保存するが部位１の重要な側鎖を変化させる二重 変異体（Elberg et al.，J．Biol．Chem．265:14770(1990)）は細胞増殖を促進 する。しかしＥＣ₅₀は野生型のｈＧＨよりも約１０³倍も高い濃度にシフトされ る（表ＩＸ）。これは、インビボで測定した部位１のＫ_dにおける５６０倍の減 少と一致する（Elberg et al.，J．Biol．Chem．265:14770(1990)）。我々はＫ １７２Ａ／Ｆ１７６Ａの滴定において不活性な相を観察するのに十分高い濃度に 到達できなかった。単一のｈＧＨ変異体（Ｇ１２０Ｒ）は機能的な部位１を保持 しているが、部位２を立体的にブロックしている。この変異体はいかなる濃度に おいても実質的に不活性である。すなわち部位１または２への結合は必要である が、細胞増殖の促進には十分ではない。 変異体が部位２に結合をブロックする（但し部位１の結合はブロックしない） という逐次的シグナル化のメカニズムはｈＧＨ−誘発細胞増殖と拮抗すべきこと が予想される。これを調べるために、９０％最大細胞増殖を支持するに十分な濃 度（１ｎＭ）のｈＧＨに高い濃度の野生型ｈＧＨまたは部位１の変異体（Ｋ１７ ２Ａ／Ｆ１７６Ａ）もしくは部位２の変異体（Ｇ１２０Ｒ）を加えたもので細胞 を培養した。予期したように部位２変異体はｈＧＨを拮抗し、いっぽう部位１変 異体はまったく効果がなかった。実際、部位２変異体は野生型ｈＧＨよりもアン タゴニストとして殆ど１００倍も強力であった（ＩＣ₅₀はＧ１２０Ｒでは１０ｎ Ｍ、ｈＧＨでは２０μＭ；表Ｘ）。これは我々が予測してなかったものである。 何故ならば、いったんＧ１２０Ｒが結合するとそれは２量化されずレセプターを 拮抗できないからである。すなわちＧ１２０Ｒ（５ｈＧＨの間の競合は、部位１ による遊離ホルモン分子結合になお一層限定される。これと対照的にアンタゴニ スト的となるべきｈＧＨについては遊離ホルモンは、結合ｈＧＨ中間体が反応す る前に占有されてないレセプターと反応する必要がある。これは高濃度のｈＧＨ を要する。 Ｇ１２０ＲはｈＧＨよりも極めて良好なアンタゴニストであるが、５０％の拮 抗性に必要な変異体の濃度は、このアッセイでのｈＧＨのそれよりも約２０倍高 い（表Ｘ）。これは、単量体であるＧ１２０Ｒ・レセプター複合体におけるＧ１ ２０Ｒよりも２量体であるｈＧＨ・（レセプター）₂においてｈＧＨはより強力 に結合するという事実を反映している。または、最大シグナル化は１００％のレ セプター占有を必要としないであろう。いずれの場合でもＧ１２０Ｒ変異体にお ける部位１の親和性の改善は、それをさらに強力なアンタゴニストとするであろ う。 ｈＧＨ変異体は、部位１によってｈＧＨｂｐに更に強固に結合する突然変異誘 発により生産される（Cunningham et al.，Science 24：1081（1989）；Itoh et al.，Science 247：324（1990））。これらの変異型の結合（Ｈ２１Ａ／Ｒ６４ Ｋ／Ｅ１７４Ａ）は、ｈＧＨｂｐへ３０倍も強固に結合する（表Ｘ）。この変異 型はｈＧＨと比較し得るＥＣ₅₀をもっているが、自己拮抗作用のＩＣ₅₀はｈＧＨ の約３０倍低い。これは自己拮抗作用は、結合したホルモン−レセプター中間体 の部位２と可溶性ホルモンの遊離部位１の間の競合から生じるという考えと一致 する。部位１の結合の改善はアゴニストとしてのこのホルモンを改善しないとい う事実は、レセプターの２量化は速度限定的であり従って部位１と２の両方へア ゴニスト変異体を導入するのが望ましいことを反映する。我々は更にこの変異型 を、Ｇ１２０Ｒを含有するように変異した。テトラ変異体の変異型は、ｈＧＨア ンタゴニストとしてＧ１２０Ｒよりも１０倍強力であった（図１４、表Ｘ）。こ れは拮抗作用に対する部位１の結合親和性の重要性の更なる証拠である。 我々の研究は、ｈＧＨ、ＭＡｂｓ及びそれらの誘導体によっておこされる拮抗 作用または自己拮抗作用はレセプター２量化のブロッキングでありレセプターの 下方調節でないことを示す。まず、ｈＧＨでなくＩＬ−３で増殖された細胞は、 より大きなｈＧＨ応答またはｈＧＨレセプター数を示さない。レセプターの下方 調節はふつうレセプター活性化と密接に関連している。この場合、ｈＧＨの用量 依存性曲線の拮抗作用的部分は、ｈＧＨの生理学的に適切な濃度（１μＭではな く）から開始されると期待される。更にＭＡｂｓとｈＧＨの各々のＥＣ₅₀対ＩＣ₅₀ の比は広範に変化し、これはレセプター活性化は単に結合性質を変えることで 阻害とは容易に無関係にすることができることを示す。最後に、Ｇ１２０Ｒ変異 体は不活性であるが、それでもｈＧＨよりも更に強力なアンタゴニストであり、 そしてＧ１２０Ｒによる細胞の前処理はその拮抗作用の効果を高めない。すなわ ちＧ１２０Ｒの拮抗作用の効果は単純なレセプターの下方調節と一致しない。高 い濃度で自己拮抗作用をもつ他のリガンドがレセプターの２量化のブロッキング に関与することは可能であり、そしてこれは本発明の実施に有用なリガンドの同 定の追加的な基礎として役立つ。 実施例１２ この研究においては、乳ガン細胞系に影響する泌乳刺激ホルモンの能力を調べ た。細胞系ＭＣＦ−７とＴ４７ＤはＡＴＣＣ（American Type Culture Collecti on）から入手した。ＭＣＤ−７は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Hyclone）を 添加したＦ−１２：ＤＭＥＭ（５０：５０）培地中に保持した。Ｔ４７Ｄは１０ ％ＦＢＳ添加のＲＰＭＩで保持した。 トリプシン化した細胞を９６ウエルの培養皿に３回入れ、最終細胞密度を１０⁴ ／ウエル／０．１ｍｌ培地とした。アッセイ用培地は、１％のダイフィルトレ ートしたウシ胎児血清と抗生物質を添加したＦ１２：ＤＭＥＭ（５０：５０）で ある。３〜４日後、細胞を５〜６時間１μＣｉ／ウエルのＨ³−チミジンでパル ス標識した。細胞を５ｍＭのＥＤＴＡで処理して採取を容易にした。 ｈＧＨおよびプロラクチンは共に、図１６に示すようにＴ４７Ｄ細胞の増殖を 誘発し得た。しかしｈＧＨ類似体のＧ１２０Ｒは単に不活性な成長刺激体である のみならず、成長刺激濃度のｈＧＨと共培養したときのアンタゴニストでもある （図１６）。亜鉛の添加は何らの明白な相違を示さなかった。Ｇ１２０Ｒそれ自 体が対照よりも少ないチミジン補集をするという事実は、アッセイ培地に存在す るラクトゲンに対する拮抗作用効果からくるものであろう。 Ｔ４７Ｄ細胞成長におけるｈＧＨまたはＧ１２０Ｒの用量依存的効果を図１７ に示す。ベルの形をした曲線は、上記のプロラクチンレセプター及びｈＧＨレセ プターと結合するｈＧＨの逐次的２量化モデルに対応する。手短にいって、ｈＧ Ｈ濃度の低いときは、ｈＧＨの第一レセプターへの結合に次いで、１対２の複合 体を生成する第二のレセプターへの結合がおこり、それはシグナルのトランスダ クションと生物学的機能を活性化する。ｈＧＨ濃度が増大するときｈＧＨモノマ ーは、部位１のレセプター結合と競合し、そして生物学的応答を不活性にする１ 対２複合体を生成する。 プロラクチンレセプターへのｈＧＨの結合には亜鉛が必要である（Cunningham et al.，Science 250:1709(1990)）。すなわち亜鉛の添加がｈＧＨの成長刺激 活性を増大させるという観察は、プロラクチンレセプターは観察された成長刺激 効果に主として関係することを示す。 上記のアンタゴニストＧ１２０Ｒは成長刺激剤としては不活性であった。１ｎ ＭのｈＧＨと拮抗するＧ１２０Ｒの用量依存的効果を図１７Ｂに示す。 ＭＣＦ−７細胞については図１８に示すように、アッセイ培地での５０μＭの 亜鉛の添加は、単にｈＧＨ活性のみならずバックグラウンド成長においてもまた 顕著な差異をもたらす。プロラクチンでなくてｈＧＨは、対照のアッセイ培地と 比較してＭＣＦ−７細胞の成長を増大した。亜鉛の現実の役割は将来の研究を必 要とする。Calvallo ほかは、乳ガン患者は著しく高い血清亜鉛レベルをもつと 報告している（Cancer 67:738(1991)）。アッセイに必要な亜鉛の量を滴定した とき、ＭＣＦ−７細胞は、試験したすべての他の胸部肉腫細胞系よりも約２〜３ 倍も高いレベルの亜鉛を必要とした（データは示さず）。しかし亜鉛が存在する と、ｈＧＨ及びｈＧＨ類似体のＧ１２０ＲはＭＣＦ−７細胞中ではＴ４７Ｄ細胞 中でと同じようには機能しなかった。 すなわちこれらの実験結果は成長ホルモン類似体のＧ１２０Ｒは、２つの乳ガ ン細胞系の増殖における成長ホルモンの成長刺激活性と拮抗するのに効果的であ った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞を有効量の成長ホルモン類似体と接触させることから成るプロラクチ ンレセプターを発現する細胞の成長を阻害する方法（ここで、該類似体はプロラ クチンレセプターと結合するアンタゴニストである）。 ２．細胞が乳ガン細胞である第１項の方法。 ３．類似体がＧ１２０Ｒである第１項の方法。 ４．類似体がレセプターと１：１の複合体を形成する第１項の方法。 ５．類似体が、成長ホルモンとレセプターの１：２複合体を解離する第１項の 方法。 ６．成長ホルモン類似体の有効量を患者に投与することから成る患者の乳ガン を治療する方法（ここで、該類似体はプロラクチンレセプターと結合するアンタ ゴニストである）。