JPH08507931A - ストレプトミセス・アベルミティリスからの分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物の分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードするＤＮＡ配列およびこのような配列の発現によって生産されたポリペプチドに関する。更に、本発明は、天然のアベルメクチンの生産を促進する方法および発酵によってアベルメクチンを生産する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトミセス・アベルミティリスからの 分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子 発明の背景 本発明は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物 の分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする新規のＤＮＡ配列お よびこのような配列の発現によって生産される新規のポリペプチドに関する。更 に、本発明は、天然アベルメクチンの生産を促進するおよび発酵によって新規の アベルメクチンを生産する方法に関する。 多数の医薬品は、微生物によって生産される。これらの微生物の内、ストレプ トミセス属のメンバー、すなわち、グラム陽性土壌細菌の群は、９０％を越える 治療的に有用な抗生物質を生じることでかなり注目されている。ストレプトミセ ス属は、抗生物質生合成遺伝子を単離し、新規の誘導体またはハイブリッド化合 物を生成し、調節遺伝子を単離し、そして一次および二次代謝両方に関与する調 節機序を研究するために、組換えＤＮＡクローニング技術を応用した集中的な研 究の的である。 Ｓ．アベルミティリス（ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）は、アベルメクチンと称す る８種類の異なるが近縁の駆虫性ポリケチド化合物を生産する。Ｓ．アベルミテ イリスによって生産されたアベルメクチン複合体は、４種類の主成分、Ａ１ａ、 Ａ２ａ、Ｂ１ａおよびＢ２ａ並びに４種類の微量成分、Ａ１ｂ、Ａ２ｂ、Ｂ１ｂ およびＢ２ｂを有する。各種成分の構造を以下に示す。 アベルメクチンポリケチド構造は、７種類の酢酸、５種類のプロピオン酸分子 、およびＳ（＋）−２−メチル酪酸かまたはイソ酪酸である１種類のα−分岐状 鎖脂肪酸分子に由来する。「Ａ」および「Ｂ」という呼称は、５−置換基がそれ ぞれメトキシまたはヒドロキシであるアベルメクチンを意味する。「１」という 数字は、二重結合が22−23位に存在するアベルメクチンを意味し、そして「２」 という数字は、22位に水素および23位にヒドロキシを有するアベルメクチンを意 味する。最後に、Ｃ−25は２種類の可能な置換基を有し；第二ブチル置換基（Ｌ − イソロイシンに由来する）はアベルメクチン「ａ」系列中に存在し且つイソプロ ピル置換基（Ｌ−バリンに由来する）はアベルメクチン「ｂ」系列中に存在する （論評については、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ），Ｍ．Ｈおよびムロジク（Ｍ ｒｏｚｉｋ），Ｈ.，１９８４年，「Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ ｃｓ 」，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），第４章を参 照されたい） 「天然の」アベルメクチンとは、Ｓ．アベルミティリスによって生産されたも のを意味し、前述のように、その25位置換基はイソプロピルかまたは第二ブチル である。25位基がイソプロピルまたは第二ブチル以外であるアベルメクチンを、 ここにおいて新規のまたは非天然のアベルメクチンと称する。 ＣｏＡの形のこれらのα−分岐状鎖脂肪酸への一つの代謝経路は、分岐状鎖ア ミノ酸トランスアミナーゼ反応に続いて分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ反 応を介する。（或いは、分岐状鎖脂肪アシル−ＣｏＡ誘導体は、ドゥノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成によって生産された分岐状鎖α−ケト酸に由来しうる）。これ らの代謝系経路を以下に示す。 最後に記述した酵素において分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤ Ｈ）活性が検出されないＳ．アベルミティリスの突然変異体は、以前に単離され た（ハフナー（Ｈａｆｎｅｒ）ら、１９８８年，欧州特許出願第８８３００３５ ３．５号明細書、公開第２８４１７６号明細書）。該突然変異体は、¹⁴Ｃ−１で 標識された２−オキソイソカプロン酸基質（ロイシン類似体）からの¹⁴ＣＯ₂生 産の不存在を調べるスクリーニングにおいて、Ｓ．アベルミティリス菌株ＡＴＣ Ｃ３１２７２の標準的な化学的突然変異誘発後に単離された。該突然変異体は、 突然変異体を発酵させる培地に対して、α−分岐状鎖脂肪酸またはイソプロピル 基若しくは第二ブチル（Ｓ型）基を有する前駆物質が加えられる場合以外は天然 のアベルメクチンを合成することができない。更に、該突然変異体は、シクロヘ キサンカルボン酸（ＣＨＣ）などの適当な別のカルボン酸またはその前駆物質を 含む栄養培地中において水性好気性条件下で発酵した場合、新規のまたは非天然 のアベルメクチンを生産することができる。 Ｓ．アベルミティリスをクローン化するためには、ＢＣＫＤＨが極めて望まし い。組換えＤＮＡ技術によるこれらの遺伝子の操作は、天然のおよび新規のアベ ルメクチンの生産を容易にするはずである。若干の菌株について、天然のアベル メクチンの増加した力価は、ＢＣＫＤＨ遺伝子のコピー数を増加させることによ って予想されると考えられる。更に、永久的に欠失したまたは遺伝子置換によっ て修飾されたＢＣＫＤＨ活性を有する不可逆的にブロックされたｂｋｄ菌株の世 代は、前述のように化学的突然変異誘発によって得られたこのｂｋｄ突然変異体 に対する改良された代替物であると考えられる。 α−ケト酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体、すなわち、分岐状鎖α−ケト酸デ ヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）複合体、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ） 複合体およびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＫＧＤＨ）複合体は、分岐 状鎖α−ケト酸、ピルビン酸およびα−ケトグルタル酸の酸化的脱炭酸をそれぞ れ触媒してＣＯ₂を放出し且つ対応するアシル−ＣｏＡおよびＮＡＤＨを生成す る（パーハム（Ｐｅｒｈａｍ），Ｒ．Ｎ．、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ ，３０：８５０１〜８５１２）。それぞれの複合体は、３種類の異なる触媒 酵素、すなわち、デカルボキシラーゼ（Ｅ１）、ジヒドロリポアミドアシルトラ ンスフェラーゼトランスアシラーゼ（Ｅ２）およびジヒドロリポアミドデヒドロ ゲナーゼ（Ｅ３）から成る。 分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ）は、３種類の機能的成分 、Ｅ１のデカルボキシラーゼ、Ｅ２のトランスアシラーゼおよびＥ３のリポアミ ドデヒドロゲナーゼから構成された多酵素複合体である。シュードモナス・プチ ダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ ｓ）から精製された複合体は、４種類のポリペプチドから構成される。精製され た哺乳動物複合体もまた、４種類のポリペプチド、Ｅ１α、Ｅ１β、Ｅ２および Ｅ３から成る。α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸および分岐状 鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ活性両方を有する枯草菌から単離された。この二 元機能複合体は、ピルビン酸を酸化し且つ膜リン脂質のための分岐状鎖脂肪酸を 提供する。 原核生物分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングは、シュ ードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）については報告されているが、ストレプトミセス属についてはされていない。 これらの系において、ＢＣＫＤＨをコードする遺伝子はオペロンでクラスター形 成したことが分かった。シュードモナス・プチダのＢＣＫＤＨ複合体の遺伝子は クローン化されて、そしてこの部分のヌクレオチド配列が決定された（サイクス （Ｓｙｋｅｓ）ら、１９８７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：１６１９ 〜１６２５、並びにバーンス（Ｂｕｒｎｓ）ら、１９８８年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．１７６ ：１６５〜１６９および１７６：３１１〜３１７）。Ｅ１α の分子量は４５２８９であり、Ｅ１βのは３７１３８であり、Ｅ２のは４５１３ ４であり、そしてＥ３のは４８１６４である。４種類の遺伝子は、Ｅ１α、Ｅ１ β、Ｅ２およびＥ３の配列でクラスター形成している。ノーザンブロット分析は 、これら４種類の遺伝子の発現が単一ｍＲＮＡから生じることおよびこれら遺伝 子がオペロンを構成することを示した。シュードモナス属ｂｋｄ遺伝子の構成性 発現を可能にするＥ１αコーディング領域の出発の直前には典型的な原核生物共 通プロモーターが存在する。Ｅ１βコーディング領域の開始コドンは、Ｅ１α読 み 取り枠（ＯＲＦ）の末端から４０ヌクレオチドだけ下流に位置する。対照的に、 Ｅ１βＯＲＦの停止コドンは、Ｅ２ＯＲＦの開示コドンの直前のトリプレットで あるので、Ｅ１βとＥ２ＯＲＦとの間には遺伝子間スペースがない。Ｅ２とＥ３ ＯＲＦとの間の遺伝子間スペースは、わずか２ヌクレオチドまで減少する。した がって、シュードモナス属ｂｋｄ遺伝子は密着して連鎖している。同様に、枯草 菌ＢＣＫＤＨ／ＰＤＨ二重複合体のオペロンコーディングがクローン化された（ ヘミラ（Ｈｅｍｉｌａ）ら、１９９０年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２： ５０５２〜５０６３）。このオペロンは、シュードモナス属ｂｋｄ遺伝子クラス ターのＥ１α、Ｅ１β、Ｅ２およびＥ３サブユニットと極めて相同であることが 分かっている４２、３６、４８および５０キロダルトン（ｋＤａ）寸法の４種類 のタンパク質をコードする４種類のＯＲＦを有する。最近、バチルス・ステアロ サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） からの二重ＢＣＫＤＨ／ＰＤＨ多酵素複合体のＥ１成分のαおよびβサブユニッ トをコードする遺伝子もまたクローン化され且つ配列順序決定された（αおよび βサブユニットの推定分子量は、それぞれ約４１，０００および３５，０００で ある）（ホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら、１９９０年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ ｈｅｍ． ，１９１：３３７〜３４６）。 更に、多数の真核生物Ｅ１αおよびβＢＣＫＤＨサブユニット（ヒト、ウシお よびラット）の配列が開示された。最近、多数の種からのＰＤＨおよびＢＣＫＤ Ｈ複合体のＥ１αおよびＥ１β成分両方について知られている公開された配列全 部のアミノ酸配列比較が、計算機分析によって実施された（ウェクスラー（Ｗｅ ｘｌｅr）ら、１９９１年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒs，２８２：２０９〜２１３ ）。興味深いことに、αおよびβサブユニットのいくつかの部分は、これまでに 記載された全てのＰＤＨにおいてのみならず、原核生物および真核生物両方のＢ ＣＫＤＨ複合体においても極めて保守的であることが確認された。 本発明者は、ストレプトミセス・アベルミティリスからの分岐状鎖α−ケト酸 デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングを記載する。新規の遺伝子を、２種類の 分子遺伝学技術、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および相同 性プロービングの組合わせを用いてクローン化した。相同性プロービングは、タ ンパク質のアミノ酸配列に対応する放射性標識された合成オリゴヌクレオチドプ ローブを用いてｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることを 行う。残念ながら、この技術にはいくつかの限界があり、その一つは、用いるこ とができるオリゴヌクレオチドの同義性に対するかなり厳しい制約である。更に 、スクリーニングハイブリッド形成は低緊縮で行われるので、偽陽性の数は高い ことが多い。オリゴヌクレオチドハイブリッド形成のいくつかの限界を克服する ために、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い且つ極めて同義性のオリ ゴヌクレオチドのプローブとして使用を可能にする相同性プロービングの変法が 最近開発された。この方法は、コードされたタンパク質の二つの短い部分（長さ 約７〜１０アミノ酸）のアミノ酸配列の情報のみを必要とする。それぞれのペプ チド配列に対応する２種類のオリゴヌクレオチドを、反応におけるプライマーと して用いる。各プライマーは、既知のアミノ酸配列をコードしうる可能なコドン 組合わせを全て有する十分に同義性のオリゴヌクレオチドの混合物として用いる ことができる。増幅のための鋳型は、ゲノムＤＮＡおよび超コイルの形のプラス ミドライブラリーを含むいくつかのＤＮＡ源のいずれでもよい。最近になって文 献で公開されたいくつかの報告は、多数の種からの遺伝子の識別のための、ポリ メラーゼ連鎖反応と相同性プロービングとの組合わせの有用性を実証している。 用語解説 この出願中で用いられる専門用語は、当分子遺伝学業者に周知である。それら の用語の定義は、分子遺伝学分野に献呈された多数の教本、例えば、ベンジャミ ン・レビン博士（Ｄｒ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ）による「Ｇｅｎｅｓ」 ，第二版，１９８５年，ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレーテ ッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨークで見出 される。本書類でしばしば用いられる用語を以下に定義する。抗生物質 ：細菌細胞の成長を阻害する化学薬剤。組換え細菌細胞を選択するのに 用いられる。抗生物質耐性遺伝子 ：特定の抗生物質に対して本来感受性である宿主細胞中に導 入された場合にその抗生物質に対する耐性を伝えるＤＮＡ配列。抗生物質マーカ ーとしても知られる。バクテリオファージ ：細菌に感染するウイルス。ｃＲＮＡ ：インビトロ転写によってＤＮＡから合成された、ＤＮＡに相補的な一 本鎖ＲＮＡ。染色体 ：多数の遺伝子を有するゲノムの分離単位。クローン ：単一祖先と同一の多数の細胞または分子。クローニングベクター ：異種ＤＮＡを挿入してクローン化させることができる任 意のプラスミド。それは、形質転換によって宿主細菌細胞中に異種ＤＮＡを運ぶ 。ＣｏＡ ：補酵素Ａ。付着末端配列（Ｃｏｓ） ：インビトロパッケージングを可能にするバクテリオフ ァージλに由来するＤＮＡ配列。コスミド ：バクテリオファージλｃｏｓ部位が挿入されたプラスミド；結果とし て、プラスミドＤＮＡ（異種ＤＮＡインサートを有する）をファージコート中に インビトロでパッケージングすることができる。ダルトン ：水素原子１個に対応する分子寸法に関して一般的に用いられる質量単 位。ＤＮＡ連結反応 ：ＤＮＡの二つのフラグメントを結合する化学結合の形成。真核生物細胞 ：核を取り囲む膜を有する高等生物の細胞。遺伝子クラスター ：染色体上の物理的に接近した一群の遺伝子。ゲノム ：完全な染色体セット。個体遺伝子全部の合計。ハイブリッド形成、コロニーハイブリッド形成 ：挿入されたＤＮＡがある特定の 配列と同様であるキメラベクターを有する細菌コロニーを同定するのに用いられ る技術。ｋｂ ：ＤＮＡまたはＲＮＡの１，０００塩基対の略号。ＮＡＤＨ ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド。リンカー ：１種類またはそれ以上の制限酵素の標的部位を有する短い合成二重ら せんオリゴデオキシヌクレオチド。それをベクターに加えて、新規のポリリンカ ーまたは多重クローニング部位（ＭＣＳ）を生成する。ヌクレオチド ：核酸のビルディングブロックすなわちモノマー単位。オリゴヌクレオチド ：短鎖のヌクレオチド。オペロン ：１種類または複数の調節遺伝子産物によって認識されたＤＮＡ中の構 造遺伝子、調節遺伝子および制御因子を含む、細菌遺伝子発現および調節の完全 な単位。プラスミド ：自律性で自己複製性の染色体外環状ＤＮＡ。プラスミドコピー数 ：全ての宿主染色体について細菌中で維持されたプラスミド 分子の数。プライマー ；ＤＮＡの一方の鎖と対になり且つＤＮＡポリメラーゼがデオキシリ ボヌクレオチド鎖の合成を開始する遊離３′−ＯＨ末端を与えるＤＮＡまたはＲ ＮＡの短い配列。原核生物細胞 ：大部分の微生物を含む小さい比較的単純な細胞。プロモーター ：転写の開始の原因となるＤＮＡ部分。制限酵素 ：ＤＮＡの特定の短い配列を認識し且つそれを切断する酵素。制限認識配列 ：特定の制限酵素によって特異的に認識されるＤＮＡ配列。標的部 位としても知られる。シャトルベクター ：１種類またはそれ以上の代替宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃ ｏｌｉ）およびストレプトミセス属）中で複製することができる二元機能クロー ニングベクター。サザンブロッティング ：変性ＤＮＡをアガロースゲルからニトロセルロースフィ ルターに移し、そこでそれを相補的核酸プローブとハイブリッド形成させること ができる方法。サブクローニング ：ＤＮＡのクローン化フラグメントを一つの種類のベクターか ら別のものへ、例えば、組換え体コスミドからプラスミドヘ伝達すること。次に 、新規の組換え体プラスミドを適当な宿主中に形質転換させてサブクローン菌株 を生産する。転写 ：ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成。細菌細胞の形質転換 ：追加のＤＮＡの組込みによる新規の遺伝マーカーの獲得を 意味する。 発明の概要 本発明は、ストレプトミセス属に属する微生物の分岐状鎖α−ケト酸デヒドロ ゲナーゼ複合体をコードする単離されたＤＮＡセグメントに関する。 本発明は、更に、このような分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の発 現を調節するＤＮＡ部分を更に含む上記のような単離されたＤＮＡセグメントに 関する。 本発明は、更に、ストレプトミセス・アベルミティリス分岐状鎖α−ケト酸デ ヒドロゲナーゼ複合体をコードする単離されたＤＮＡセグメントに関する。 本発明は、更に、以下に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番 号４若しくは配列番号５のＤＮＡ配列またはこのような配列の対立遺伝子変種を 含むＤＮＡセグメントに関する。更に、本発明は、前述のＤＮＡセグメントのサ ブセットであるおよび機能的に同等であるＤＮＡセグメントに関する。 本発明は、更に、（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若 しくは配列番号５のＤＮＡ配列またはこのような配列の対立遺伝子変種を含む組 換えＤＮＡ；（ｂ）このような組換えＤＮＡを含むプラスミド；および（ｃ）こ のような組換えＤＮＡが組込まれた宿主細胞に関する。 本発明は、更に、以下に定義のｐＣＤ５２８、ｐＣＤ５４５、ｐＣＤ５７４、 ｐＣＤ５５０、ｐＣＤ５５９およびｐＣＤ５７７から成る群より選択されるＤＮ Ａセグメント中に含まれた分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の遺伝子 に関する。 本発明は、更に、天然のアベルメクチンを生産する方法であって、該天然のア ベルメクチンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖 α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子のコピー数が増加したＳ ．アベルミティリスを発酵させることを含む上記方法に関する。 本発明は、更に、天然のアベルメクチンを生産する方法であって、該天然のア ベルメクチンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖 α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子の発現が、このような発 現の調節の原因となる遺伝子の操作または置換によって促進されたＳ．アベルミ ティリスを発酵させることを含む上記方法に関する。 本発明は、更に、新規のアベルメクチンを生産する方法であって、該新規のア ベルメクチンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖 α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の発現が、例えば、このような発現の原因と なる遺伝子の操作（例えば、欠失、不活性化または置換）によって減少したまた は除去されたＳ．アベルミティリスを発酵させることを含む上記方法に関する。 本発明は、更に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは 配列番号５のＤＮＡ配列またはこのような配列の対立遺伝子変種を含むＤＮＡセ グメントに関する。 本発明は、更に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは 配列番号５のＤＮＡ配列またはそれらの対立遺伝子変種のサブセットである、お よびプローブとして用いられた場合にそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番 号４若しくは配列番号５またはそれらの対立遺伝子変種に対してハイブリッド形 成することができる、或いはポリメラーゼ連鎖反応プライマーとして用いられた 場合にこのような配列の全部または一部分を増幅することができるＤＮＡ配列を 含むＤＮＡセグメントに関する。 本発明は、更に、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のア ミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドに関する。 図面の簡単な説明 図１：Ｓ．アベルミティリスＥＩ−αＢＣＫＤＨ遺伝子のフラグメントをクロ ーン化するのに用いられたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーのヌクレ オチド配列。各オリゴデオキシヌクレオチドによってコードされた推定のアミノ 酸配列を、対応するＤＮＡ配列の上に示す。矢印は増幅の方向を示す。図１Ａは 右方向プライマーであり、図１Ｂは左方向プライマーである。 図２：分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ配列比較。ストレプトミセス・ア ベルミティリス（Ｓａ）ＰＣＲクローン化ＣＤ５０３ゲノムフラグメント、バチ ルス・ステアロサーモフィルス（Ｂｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｐ）およ びヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（Ｈｓ）の推定のアミノ酸配列の整列。垂 直の印はアミノ酸同一性を示す。クローニングに用いられた右方向および左方向 ＰＣＲプライマーに対応する配列の部位を示す（それぞれ上部左右）。 図３：ストレプトミセス・アベルミティリスｂｋｄ遺伝子クラスターのゲノム 制限地図、部位およびサブクローン。地図の下の黒箱形は、ＰＣＲを用いてクロ ーン化された最初のＥ１−α特異的Ｓ．アベルミティリスＣＤ５０３ゲノムフラ グメントの部位および配向を示す。ゲノムサブクローン（ｐＧＥＭ−３Ｚ）の誘 導体）を示す。Ｅ１−α（Ｅ１ａ）、Ｅ１−β（Ｅ１ｂ）およびＥ２ＢＣＫＤＨ サブユニットをコードするｂｋｄ構造遺伝子の部位および体制も示す。識別され た読み取り枠（箱形で示された）の極性は左から右である。略号：Ｂ，ＢａｍＨ Ｉ；Ｅ，ＥｃｏＲＩ；Ｋ，ＫｐｎＩ；Ｂｇ，ＢｇｌＩＩ；およびＳ，ＳｐｈＩ。 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅおよび４Ｆ：Ｅ１−α、Ｅ１−βおよびＥ２ （部分的）ｂｋｄ読み取り枠（ＯＲＦ）を有する２，７２８−ｂｐのＳ．アベル ミティリスゲノムＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列および推定の翻訳産物 。Ｅ１−αＯＲＦは、配列の４０３〜１５４８位に延長し、Ｅ１−βＯＲＦは１ ６２２〜２６２６位に延長し、そしてＥ２ＯＲＦは２６２６位で開始する。ヌク レオチドの配列の上に番号を付す。停止コドンを星印（＊）で示す。予想される シャイン・ダルガルノリボソーム結合配列に下線を施す。ＢａｍＨＩ制限認識配 列を箱形で囲む。 図５：Ｅ２ｂｋｄＯＲＦの一部分を有する０．８−ｋｂのＢｇｌＩＩ−Ｓｐｈ Ｉ Ｓ．アベルミティリスゲノムＤＮＡフラグメント（ｐＣＤ５３９）のヌクレ オチド配列および推定の翻訳産物。２５１ｂｐを、（箱形で囲まれた）ＢｇｌＩ Ｉ部位から出発して配列順序決定した。ヌクレオチドの配列の上に番号を付す。 図６：大腸菌中でのＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子の異種発現のためのｐ Ｔ７誘導体を構築するのに用いられたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異 原性（右方向）および普遍性（左方向）プライマーのヌクレオチド配列。ＰＣＲ プライマーを用いて、Ｅ１−αまたはＥ１−βＳ．アベルミティリスｂｋｄＯＲ Ｆ（それぞれ、プライマー対５５：３１および５６：３０）の翻訳出発コドンに Ｎｄｅｌ制限部位を導入した。各突然変異原性オリゴデオキシヌクレオチドによ ってコードされた推定のアミノ酸配列を、対応するＤＮＡ配列の上に示す。制限 認識配列を示す。矢印は増幅の方向を示す。図６Ａは、右方向突然変異原性プラ イマーであり、図６Ｂは、左方向突然変異原性プライマーである。 発明の詳細な説明 Ｓ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子をクローニングする新規の方法およびＳ． アベルミティリスＢＣＫＤＨ多酵素複合体をコードする遺伝子の一次構造の決定 を以下に記載する。 最初に、「右方向」および「左方向」（図１）と称する２種類のＰＣＲプライ マーを、様々な種からの推定のＥ１−αＢＣＫＤＨペプチド配列の多重列から識 別された且つ文献から入手可能な保存部分で設計した。約０．２ｋｂ長さのＰＣ Ｒ産物を、右方向および左方向両方のプライマーを用いるＳ．アベルミティリス ゲノムＤＮＡの増幅によって検出した。そのＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを引 き続き大腸菌ベクターｐＧＥＭ−３Ｚ中にクローン化して、組換え体プラスミド ｐＣＤ５０３を生産した。次に、プラスミドｐＣＤ５０３を、大腸菌ＤＨ５−α コンピテント細胞中に形質転換させた。一つの形質転換細胞を菌株ＣＤ５０３と 称した。クローン化ＤＮＡフラグメントＣＤ５０３のＤＮＡ配列順序決定は、Ｅ １−αＢＣＫＤＨサブユニット（図２）に対して極めて相同な推定のペプチドを 有する読み取り枠の存在を示した。次に、クローン化ＣＤ５０３ゲノムＤＮＡフ ラグメントをプローブとして用いて、Ｓ．アベルミティリス染色体ライブラリー をコロニーハイブリッド形成によってスクリーニングした。４種類のコスミドク ローン、すなわち、ＣＤ５１８、ＣＤ５１９、ＣＤ５２０およびＣＤ５２１を識 別した。制限およびサザンブロット分析は、４種類のクローンが重複するゲノム フラグメントを有することを示した。サブクローン化ゲノムＤＮＡフラグメント からの重ね合わさせた欠失のＤＮＡ配列順序決定（実施例８で十分に記載される ）は、配列ＣＤ５０３が完全なｂｋｄ遺伝子クラスターの一部分であることを実 証した。クローン化Ｓ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子は、長さ約１５キロダル トンの染色体部分（図３）を包含する。ＤＮＡ配列分析は、以下、すなわち、プ ロモーター配列、Ｅ１−α、Ｅ１−βおよびＥ２読み取り枠のように組織化され たクラスターとして配列された推定上の転写プロモーター配列およびｂｋｄ構造 遺伝子の存在を示した（図４および図５）。 最後に、完全なＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子クラスターを、大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主中での発現のための強力な大腸菌Ｔ７プ ロモーターの下流にクローン化した。同様に、Ｅ１−αおよびＥ１−β読み取り 枠（ＯＲＦ）もまた、別個にかまたは一緒に該Ｔ７プロモーターの下流にクロー ン化し、そしてそれぞれの構築の発現を検査した。Ｅ１−αおよびＥ１−βＯＲ ＦのＡＴＧ翻訳開始において独特のＮｄｅＩ制限部位を導入するのに用いられた 新規のＰＣＲ突然変異原性プライマーは、実施例９で十分に記載される（図６も 参照されたい）。二重プラスミドＴ７発現系実験は、ＣＤ５０３誘導Ｓ．アベル ミティリスｂｋｄ遺伝子クラスターの少なくとも二つの読み取り枠（Ｅ１−αお よびＥ１−β）が、大腸菌で発現された場合に十分に翻訳可能であることを実証 した。更に、ＢＣＫＤＨ複合体のＥ１成分を特異的に分析することを目的とした 酵素検定は、組換え体大腸菌クローンの内の２種類、すなわち、ｂｋｄ遺伝子ク ラスター全体を有する１種類およびＥ１−αおよびＥ１−βＯＲＦを一緒に有す るもう１種類がＥ１ＢＣＫＤＨ特異的酵素活性を有していたことを決定的に確証 した（表１）。 本発明者は、アベルメクチン生産菌株ストレプトミセス・アベルミティリスか らのｂｋｄ遺伝子の単離を記載する。大形のストレプトミセス属ゲノム（約１０⁴ ｋｂ）は、大腸菌のその２倍より大である。ストレプトミセスゲノムは、グア ノシンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）含量が、天然において見られる上限に近い極め て高い（＞９０％のいくつかの範囲を含む、平均で最大７３％まで）ＤＮＡから 構成されている。これらの明白な特性は、ストレプトミセス特異的組換えＤＮＡ 技術の開発を必要とする。これらの研究例は、１９９３年４月１６日出願の米国 特許出願第０８／０４８，７１９号明細書および１９９３年３月１８日出願の米 国特許出願第０８／０３２，９２５号明細書で見出される。これらの出願は本明 細書中に援用される。 本発明の目的に対して特異的に最適化された他の技術、例えば、ＰＣＲゲノム ＤＮＡ増幅、重ね合わされた欠失の製造、ＤＮＡ配列順序決定、および大腸菌中 でのＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子の異種発現を、実施例部分で詳細に記載 する。 実験工程の説明は全てＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子のクローニングに関 係し、そして結果は以下のように得られた。 （ａ）ＰＣＲプライマーを結合するための候補部位として役立ちうるＥ１−α ＢＣＫＤＨペプチドサブユニットにおける保存部分の識別。 ヒト（フッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ら、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２６４ ：３４４８〜３４５３）、ラット（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、１９８７ 年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１５２２０〜１５２２４）、シュード モナス・プチダ（ソカッチ（Ｓｏｋａｔｃｈ）ら、１９８８年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． ，１７６：３１１〜３１７）およびバチルス・ステアロサーモフ ィルス（バーハムら、１９９０年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１：３ ３７〜３４６）からの４種類のＥ１−αＢＣＫＤＨペプチド配列を整列させて、 対応するＰＣＲプライマーを設計するのに候補配列として役立ちうる保存部分を 識別した。原核生物および真核生物両方のＢＣＫＤＨ複合体において高度に保存 されているＥ１−αサブユニット部分を識別する計算機分析は、ＧＣＧ配列分析 ソフトウェアパッケージ（マディソン、ＷＩ）からのラインアップ・アンド・プ リテイ（ＬｉｎｅＵｐ ａｎｄ Ｐｒｅｔｔｙ）プログラムを用いて行われた。 ４種類のＥ１−αＢＣＫＤＨペプチドの多重列は、いくつかの拡張された相同部 分を示した（ウェクスラー，Ｉ．Ｄ．ら、１９９１年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ ｓ ，２８２：２０９〜２１３を参照されたい）。チアミンピロリン酸結合モチー フ（パーハムら、１９８９年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２５５：７７〜８２ ）はヒトＥ１−αアミノ酸１８２〜２２９間に位置し、リン酸化部位１および２ を包含する部分であるスパニングアミノ酸２４５〜２８９は、特に、分析された ４種類全部のＥ１−αＢＣＫＤＨペプチド中に保存された。更に存在していたの は、前に記載されたアミノ酸２９１〜３０７間に位置する極めて相同性の部分で あった。この部分は、αおよびβサブユニット両方を有するα−ケト酸デヒドロ ゲナーゼに特異であると考えられ、しかも大腸菌ＰＣＤ Ｅ１中かまたは単一Ｅ １ポリペプチドのみから構成された二量体である大腸菌および酵母α−ケトグル タル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥ１成分中のいずれの配列とも相同ではない。 上述の理由のために、後者の相同部分はサブユニット相互作用においてある役割 を果たすことが示唆された（パテル（Ｐａｔｅｌ）ら、１９９１年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ，２８２：２０９〜２１３）。ＰＣＲプライマー設計用に選択さ れた保存部分は、ヒトＥ１−αＢＣＫＤＨタンパク質のアミノ酸残基１９２〜２ ００および３７０〜３７６をコードしていた。 （ｂ）ＰＣＲプライマーとして用いられるそれらのＥ１−αＢＣＫＤＨ保存部 分によって誘導される新規のオリゴヌクレオチドの設計。 前に論及されたように、Ｅ１−αＢＣＫＤＨサブユニットの二つの保存部分を 多重列実験から選択した。右方向ＰＣＲプライマー（図１）は、Ｅ１−αＢＣＫ ＤＨサブユニットの典型的なモデルとして用いられたヒトＥ１−αＢＣＫＤＨサ ブユニットのアミノ酸１９２〜２００を包含する部分で設計された。これらのア ミノ酸は、チアミンピロリン酸結合モチーフ中に位置している。左方向ＰＣＲプ ライマー（図１）は、Ｅ１−αＢＣＫＤＨサブユニットのアミノ酸３７０〜３７ ６を包含する部分で設計された。後者のアミノ酸配列は、ペプチドのＣ末端部分 の近くに位置している。ストレプトミセス属遺伝子コドン割当てを用いた（Ｆ． ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）およびＭ．Ｊ．ビッブ（Ｂｉｂｂ）、１９９２年、Ｇｅ ｎｅ ，１１３：５５〜６５）。各プライマーの５′末端には、ＰＣＲ産物のクロ ーニングを促進する制限酵素認識配列（右方向プライマー中のＥｃｏＲＩおよび 左方向プライマー中のＸｂａｌ）がある。右方向ＰＣＲプライマーの完全な配列 は、 ５′−ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣ −３′ である。 左方向ＰＣＲプライマーの完全な配列は、 ５′−ＴＣＴＡＧＡＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＣ−３′ である。 Ｅ１−αｂｋｄ遺伝子と相同ではなく且つクローニング目的のプライマー中に 包含された配列に下線を施している（図１も参照されたい）。 （ｃ）Ｓ．アベルミティリスゲノムＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅。 Ｓ．アベルミティリスゲノムＤＮＡを、高ＧＣ含量のＤＮＡに適当な、ストレ プトミセスＤＮＡの有効で且つ特異的増幅を可能にする反応条件を用いて酵素的 に増幅させた（実施例２を参照されたい）。ＰＣＲは、上記のプライマー組合わ せを用いて行った（右方向プライマー、５′−ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣ ＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣ−３′および左方向プライマー、５′− ＴＣＴＡＧＡＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＣ−３′）。増幅産物 は、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分別された。上記のＰＣＲ反応条件 下において、このプライマー組合わせを用いた場合、単一ＤＮＡバンド（約２５ ０塩基対長さ）が検出された。 （ｄ）大腸菌クローニングベクター中への増幅されたゲノムＤＮＡフラグメン トのクローニングおよび引き続きの大腸菌宿主中への形質転換。 前述のように、クローニングの便宜上、ＥｃｏＲＩ制限部位を右方向ＰＣＲプ ライマー中に包含させ、そしてＸｂａｌ制限部位を左方向プライマーの５′末端 に与えた。しかしながら、インサートおよびクローニングベクター両方をＥｃｏ ＲＩおよびＸｂａｌによって消化した場合の連結反応手順を用いることによって ０．２５ｋｂのＰＣＲフラグメントをクローン化する試みは成功しなかった。し たがって、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いてＰＣＲフラグ メント中にブラント末端を生じさせることを伴う、０．２５ｋｂのＰＣＲフラグ メントをクローン化するための別のアプローチが探求された。単一組換え体クロ ーンは、ブラント末端付きフラグメントをブラント末端付きＳｍａｌ線状化大腸 菌ベクター（ｐＧＥＭ−３Ｚ［ｆ＋］）中に挿入後に回収されて、組換え体プラ スミドｐＣＤ５０３を生じた。次に、ｐＣＤ５０３を形質転換によって大腸菌Ｄ Ｈ５−αコンピテント細胞中に導入した。選択された形質転換細胞を菌株ＣＤ５ ０３と称した。確認の制限分析は、大腸菌菌株ＣＤ５０３から単離されたプラス ミドｐＣＤ５０３が、実際に０．２５ｋｂのＳ．アベルミティリスインサートを 含んでいたことを示した。 （ｅ）バクテリオファージＭ１３中への０．２５ｋｂのＰＣＲ増幅ＤＮＡイン サートのサブクローニング、クローン化フラグメントのＤＮＡ配列順序決定およ びｂｋｄ特異的配列の識別。 プラスミドｐＣＤ５０３中に存在する０．２５ｋｂインサートを、バクテリオ ファージＭ１３中にサブクローン化した。これを達成するために、最初に、クロ ーン化インサートの両側のｐＧＥＭベクターの多重クローニング部位中に認識配 列が存在する２種類の制限酵素であるＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌによってｐＣＤ ５０３を消化することにより大腸菌ベクターからインサートを放出させた。次に 、 特異的フラグメントを、ＥｃｏＲＩ処理されＰｓｔＩ処理されたＭ１３ｍｐ１８ およびｍｐ１９ベクター両方にクローン化させた。両方のベクター中へのクロー ニングは、配列順序決定のためのインサートＤＮＡの両方の鎖から一本鎖ＤＮＡ を生じる可能性を確実にする。該特異的インサートを含む、ｍｐ１８トランスフ ェクション実験から選択された一つのクローンを菌株ＣＤ５０５と称した。該特 異的インサートも含むがｍｐ１９トランスフェクション実験から選択されたもう 一つのクローンをＣＤ５０６と称した。ＤＮＡ配列順序決定は、ジデオキシヌク レオチドーチェーンターミネーター法により、一本鎖ＤＮＡ鋳型およびタクトラ ック（ＴａｑＴｒａｃｋ）キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて行わ れた。いずれの場合にも、ＤＮＡの両方の鎖、すなわち、クローンＣＤ５０５に 由来する一方の鎖、クローンＣＤ５０６に由来する相補鎖を配列順序決定した。 クローンＣＤ５０５およびＣＤ５０６に由来するＤＮＡ配列順序決定データのコ ドン優先分析（ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、マディソン、ＷＩ）は 、ストレプトミセス遺伝子のために右コドンが用いられる読み取り枠の存在を示 した。 次に、推定上の読み取り枠を、インテリジェネティクス・スート（Ｉｎｔｅｌ ｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアのシーク・アンド・トランス レート（Ｓｅｑ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｅ）プログラム（インテリジェネテ ィクス・インコーポレーテッド、マウンテン・ビュー、カリフォルニア）を用い てアミノ配列中に翻訳した。最後に、疑問のペプチド配列についてのデータバン ク類似性探索を、インテリジェネティクスソフトウェアのＦＡＳＴＤＢプログラ ムを用いて行った。ＤＮＡデータバンク（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）およ びＥＭＢＬ）かまたはタンパク質データバンク（ＰＩＲおよびスイス・プロト（ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ））を探索するデータバンク探索はいずれも、クローンＣ Ｄ５０３に由来する配列が、原核生物および真核生物両方の起原のデータバンク で挙げられた他のＥ１−αＢＣＫＤＨペプチドのいずれに対しても極めて相同で あるが新規で且つ異なっていたことを明らかに示した。ヒト、ラット、シュード モナス・プチダおよびバチルス・ステアロサーモフィルスからの、並びに新規の ストレプトミセス・アベルミティリスＥ１−αＢＣＫＤＨ ＣＤ５０３ペプチ ド配列を含むＥ１−αＢＣＫＤＨペプチド配列の多重列を図２に示す。これらの データから、大腸菌菌株ＣＤ５０３中でクローン化された２５０ｂｐのＳ．アベ ルミティリスゲノムＰＣＲ産物は、実際に新規のＥ１−αｂｋｄ遺伝子フラグメ ントであると結論することができる。 （ｆ）Ｓ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子クラスター全体のクローニング、制 限およびサザンブロット分析、並びに染色体地図の作成。 Ｅ１−αｂｋｄ特異的Ｓ．アベルミティリスＤＮＡ配列を有する、ｐＣＤ５０ ３からの約０．２５ｋｂ長さＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを放 射性標識プローブとして用いて、コロニーハイブリッド形成によってＳ．アベル ミティリスゲノムＤＮＡコスミドライブラリーをスクリーニングした。４種類の クローン（ＣＤ５１８、ＣＤ５１９、ＣＤ５２０およびＣＤ５２１）を識別し且 つ回収した。制限およびサザンブロットハイブリッド形成分析は、４種類のクロ ーンが、同一染色体部分に由来した重複する配列を有することを示した。同様の プローブを、Ｓ．アベルミティリスＡＴＣＣ３１２７２からの消化された染色体 ＤＮＡのサザンブロットに対して高緊縮で用いた。後者の分析は、ゲノムライブ ラリーから回収されたクローンの同一性を確証した。Ｓ．アベルミティリスＣＤ ５０３配列を有するゲノム部分の制限地図を図３に示す。 （ｇ）クローンＣＤ５１８およびＣＤ５２１に由来するゲノムＤＮＡフラグメ ントのサブクローニング、並びにｂｋｄ遺伝子クラスターを含むＳ．アベルミテ ィリス染色体部分のＤＮＡ配列順序決定。 Ｓ．アベルミティリス染色体のＣＤ５０３ｂｋｄ部分全体を包含するゲノムフ ラグメント（１〜２ｋｂ長さ）を、ＤＮＡライブラリークローンＣＤ５２１およ びＣＤ５１８から大腸菌ベクターｐＧＥＭ−３Ｚ中にサブクローン化した。各プ ラスミドについての簡単な説明を含むこの研究中に作成されたサブクローンのリ ストは以下である。１．プラスミドｐＣＤ５２８は、ｐＣＤ５１８からサブクロ ーン化された７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを有し；２．プラスミドｐＣＤ５ ４５は、ｐＣＤ５２８からサブクローン化された２．３ｋｂのＳｐｈＩフラグメ ントを有し；３．プラスミドｐＣＤ５５０は、ｐＣＤ５２１からサブクローン化 された６ｋｂのＳｐｈＩフラグメントを有し；４．プラスミドｐＣＤ５５９は、 ｐＣＤ５２１からサブクローン化された７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを有し ；５．プラスミドｐＣＤ５７４は、ｐＣＤ５５０からサブクローン化された４． ２ｋｂのＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを有し；そして６．プラスミドｐＣ Ｄ５７７は、約１０．４ｋｂインサートを有する。このインサートは、互いに戻 して組み立てられた２個の隣接したゲノムフラグメント、すなわち、ｐＣＤ５５ ０からサブクローン化された４．２ｋｂのＳｐｈＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントお よびｐＣＤ５５９からサブクローン化された６．２ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨ Ｉフラグメントを含む。プラスミド制限地図、サザンハイブリッド形成およびＰ ＣＲ分析は、それぞれのサブクローンの同一性を確証した。サンガーチェーンタ ーミネーション法を、ヌクレオチド配列の決定に用いた。この目的に対して、引 き続きＳ．アベルミティリスゲノムフラグメントをＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ ｍｐ１９バクテリオファージ中にサブクローン化して、両方のＤＮＡ鎖の配列を 決定した。いくつかのＤＮＡ制限フラグメントを、上述のｐＧＥＭ誘導クローン から単離し且つＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中に連結し、そして以下の 組換えファージを生じた。 ＣＤ５３５：鋳型としてのｐＣＤ５２８ ＤＮＡ、特異的プライマー２９−Ｐ ＣＲ−ＥＸ（５′−ＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＡＧＧＣ ＣＧＴＣＧＧＣＴＡＣ−３′）および普遍的プライマー３１−ＰＣＲ−ＢＰ（実 施例９および図６を参照されたい）を用いてＰＣＲによってクローン化された０ ．４ｋｂのＳ．アベルミティリスＤＮＡフラグメント。増幅されたフラグメント をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩによって制限し且つＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ線状化Ｍ １３ｍｐ１８ＤＮＡ中にクローン化した。 ＣＤ５３６：上記のようにＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡ中にクローン化された同様の ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５３７：ｐＣＤ５２８からＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン化された配列 ＣＤ５０３を有する１．１５ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５３８：Ｍ１３ｍｐ１８中にクローン化された（上記の１．１５ｋｂのＳ ａｌＩフラグメントの上流に位置した）１．１５ｋｂのＳａｌＩ ｐＣＤ５２８ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５３９：ｐＣＤ５５０からＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン化された１． ５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＢｑｌＩＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５４０：Ｍ１３ｍｐ１８に反対方向でクローン化された上記と同様のＤＮ Ａフラグメント。 ＣＤ５４１：ｐＣＤ５２８からＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン化された０． ３５ｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５４２：ｐＣＤ５２８からＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化された０． ３５ｋｂのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５５３：ｐＣＤ５５０からＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン化された０． ８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＢｑｌＩＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５５４：ｐＣＤ５５０からＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン化された１． １ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５５５：Ｍ１３ｍｐ１８に反対方向でクローン化された上記と同様のＤＮ Ａフラグメント。 ＣＤ５５８：ｐＣＤ５５３からＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化された０． ８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５６１：ｐＣＤ５３７からＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン化された１． １５ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント（構築物ＣＤ５３７に存在するものに 対して反対方向）。 ＣＤ５６５：ｐＣＤ５３７からＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化された１． １５ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５６６：ｐＣＤ５３７からＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化された１． １５ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント（構築物ＣＤ５６５に存在するものに 対して反対方向）。 ＣＤ５６７：ｐＣＤ５３８からＭ１３ｍｐ１９中にサブクローン化された１． １５ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡフラグメント。 ＣＤ５８２：ｐＣＤ５５０からＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン化された０． ８ｋｂのＢａｍＨＩ／ＢｑｌＩＩ ＤＮＡフラグメント（ＣＤ５５３に存在する ものに対して反対方向）。 これらのクローンによって運ばれたＳ．アベルミティリスゲノムインサートを 、引き続きエキソヌクレアーゼＩＩＩによる処理によって短くして、一連のサブ クローンを提供した（「重ね合わされた欠失」、実施例８を参照されたい）。 （ｈ）クローン化されたＤＮＡフラグメントから得られたＤＮＡ配列順序決定 データの計算機分析並びにＳ．アベルミティリスＥ１−α、Ｅ１−βおよびＥ２ ｂｋｄ読み取り枠の識別。 ｂｋｄ遺伝子を有する２．７ｋｂのＳ．アベルミティリスゲノム部分のヌクレ オチド配列を図４に示す。Ｓ．アベルミティリスＥ１−α、Ｅ１−βおよびＥ２ （部分的）ｂｋｄ読み取り枠（ＯＲＦ）を有する２．７ｋｂゲノム部分のスライ ディング塩基組成物分析は、「ＤＮＡインスペクター（Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ）」 ソフトウェアを用いて行われた。この分析は、伸長長さ３０塩基およびオフセッ ト値２０を用いるＧ＋Ｃ含量の継続平均のプロフィールを提供した。Ｓ．アベル ミティリス染色体のこの部分に対応する総Ｇ＋Ｃ含量は７２％であった。低Ｇ＋ Ｃの谷（Ｇ＋Ｃ含量約５０％）、すなわち、プロモーター部分を示す部分は、ｂ ｋｄ読み取り枠の直ぐ上流に位置していた。 コドン位置の機能としてのＧ＋Ｃ含量も分析された。読み取り枠は、６４種の 遺伝子についてのストレプトミセス属コドン使用表を用いて、プログラム「コド ンプリファレンス（ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（ジェネティクス・コ ンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ） ，マディソン，ＷＩ）を用いることによって検出された（Ｆ．ライトおよびＭ． Ｊ．ビッブ、１９９２年、Ｇｅｎｅ，１１３：５５〜６５）。コドンプリファレ ンスプログラムは、それぞれのコドンの第三位におけるコドン頻度表に対するそ れらの類似性によってまたはそれらの組成（通常はＧＣ）の偏りによってタンパ ク質コーディング配列を認識することを試みる枠特異的遺伝子ファインダーであ る。ＯＲＦは、それらのそれぞれの読み枠のプロットの下に箱形として示された 。出発（ＡＴＧ）および停止コドンも全て検出された（縦線）。各読み枠で希に 見出されたコドンには、それぞれのＯＲＦプロットの下に印を付けた。Ｇ＋Ｃ含 量は２５種のコドンのスライディング窓を用いることによって計算され、その結 果、タンパク質コーディング領域の十分な衝突が観察される前に約２５種のコド ンの 遅滞が予想された。三つのプロフィールが以下のように得られた。１．トリプレ ット中の第一位；２．トリプレット中の第二位；３．トリプレット中の第三位。 この分析の結果として、三つのｂｋｄＯＲＦは、以下のＢＣＫＤＨサブユニット ：Ｅ１−α、Ｅ１−β、Ｅ２に対応して位置していた（図４および図５）。 （ｉ）ＰＣＲに基づく特定部位の突然変異誘発のためのプライマーとして用い られる新規のオリゴヌクレオチドの設計。 リンカーまたはＰＣＲに基づく特定部位の突然変異誘発を用いて、Ｎｄｅｌ制 限部位をＥ１−αおよびＥ１−βＯＲＦのＡＴＧ翻訳出発部位に導入した。以下 の新規のオリゴヌクレオチドを設計した（実施例９および図６も参照されたい） 。 左方向普遍的（ベクター）プライマー： ３０−ＰＣＲ−ＢＰ：５′−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＴＣＡＣ ＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ−３′ ３１−ＰＣＲ−ＢＰ：５′−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧ ＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡ−３′ 右方向突然変異原性プライマー： ５５−ＰＣＲ：５′−ＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＡＴＧＧ ＡＧＣＡＧＣＧＧ−３′ ５６−ＰＣＲ：５′−ＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＴＴＧ ＣＣＣＴＧＡＡＧ−３′ （ｊ）読み取り枠の上流の新規のＮｄｅｌ制限部位を生成するＳ．アベルミテ ィリスｂｋｄ遺伝子の特定部位の突然変異誘発。 発現プラスミドは、Ｅ１−α、Ｅ１−β、Ｅ１−αおよびＥ１−βのＯＲＦま たは完全なＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子クラスターを有するプラスミドｐ Ｔ７−７（Ｓ．テイバー（Ｔａｂｏｒ）、１９９０年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，１６．２．１〜１ ６．２．１１頁，グリーン・バブリッシング・アンド・ウィリー・インターサイ エンス（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅ ｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨークを参照されたい）の誘導体であった。Ｎｄｅ ｌ制限部位は、ＰＣＲに基づく特定部位の突然変異誘発によって生成された。５ 種類の発現プラスミドをこの研究用に以下のように構築した。 プラスミドｐＣＤ６７０：Ｓ．アベルミティリスＥ１−αｂｋｄ読み取り枠（ ＯＲＦ１）を有するｐＴ７−７の誘導体。ＡＴＧ出発コドンをスパニングするＮ ｄｅｌ制限部位を、ＰＣＲ突然変異原性プライマ−５５−ＰＣＲを用いる増幅お よび付随した突然変異誘発によってＳ．アベルミティリスＥ１−αｂｋｄ遺伝子 中に導入した（実施例９および図６を参照されたい）。 プラスミドｐＣＤ６６６：Ｓ．アベルミティリスＥ１−βｂｋｄ読み取り枠（ ＯＲＦ２）を有するｐＴ７−７の誘導体。ＡＴＧ出発コドンをスパニングするＮ ｄｅｌ制限部位を、ＰＣＲ突然変異原性プライマー５６−ＰＣＲを用いる増幅お よび付随した突然変異誘発によってＳ．アベルミティリスＥ１−βｂｋｄ遺伝子 中に導入した（実施例９および図６を参照されたい）。このＯＲＦの最適の発現 を達成するために、コドン７の第三位をＣからＧへ変更して、大腸菌コドン使用 と似たコドン同義性を生じた。Ｅ１−βペプチド配列はこの変化に影響されなか った。 プラスミドｐＣＤ７３６：Ｔ７プロモーターの制御下においてＥ１−α（ＯＲ Ｆ１）およびＥ１−β（ＯＲＦ２）ＯＲＦ両方を有するｐＴ７−７の誘導体。 プラスミドｐＣＤ７０５：ｐＣＤ７３６と同様であるが、誤った方向に位置し たＥ１−βＯＲＦの３′半分を有する。この構築物を、発現実験において負の対 照として用いた。 プラスミドｐＣＤ６８５：完全なＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子クラスタ ーを有するｐＴ７−７の誘導体。 （ｋ）Ｔ７二重プラスミド発現系を用いることによる大腸菌中でのＳ．アベル ミティリスｂｋｄ読み取り枠の発現。 大腸菌中でのＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子の発現は、本質的にはＳ．テ イバー（１９９０年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，１６．２．１〜１６．２．１１頁，グリーン・バブ リッシング・アンド・ウィリー・インターサイエンス，ニューヨーク）によって 記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター二重プラスミド系を用いて達成さ れた。種々のｐＴ７−７構築を含む大腸菌Ｃ６００（ｐＧＰ−１）の誘導体を分 析した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ− ＰＡＧＥ）を用いて、熱誘導後の大腸菌宿主におけるＳ．アベルミテイリスＯＲ Ｆの発現を監視した。誘導によるタンパク質プロフィールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析は、Ｅ１−αおよびＥ１−βＯＲＦについて以下のように（対応するＤＮＡ配 列から推定される）予測値と同様の寸法を有する誘導ペプチドの過剰発現を示し た。 （ｌ）組換え体大腸菌クローンの粗製抽出物における特異的検定によるＥ１Ｓ ．アベルミティリスＢＣＫＤＨ活性の検出。 以下の表１（実施例１１）にこれらの結果を要約する。ｐＣＤ７３６を含む大 腸菌細胞の粗製抽出物において実施されたＥ１特異的ＢＣＫＤＨ検定は、Ｔ７プ ロモーターの誘導による有意のＥ１活性を示した。誤った方向に配置されたイン サートの一部分を含む構築物（ｐＣＤ７０５）を有する同様の培養物は、バック グラウンドレベルの活性を示した。 更に、酵素検定は、プラスミドｐＣＤ６８５を含む大腸菌菌株からの粗製抽出 物もまた有意のＥ１ ＢＣＫＤＨ活性（＞バックグラウンドレベルの１０倍）を 有することを示した。このクローンの非誘導培養物もまた分析され、そしてバッ クグラウンドより２倍高い基礎レベルの活性を示した。後者の結果は、Ｔ７系が 、非誘導条件下でさえもクローン化遺伝子の低レベルの構成的発現を可能にする ことから予想される。 クローン化されたストレプトミセス・アベルミティリスｂｋｄ遺伝子クラスタ ーは、これらの遺伝子のコピー数を増加させることによってまたは生産菌株にお けるそれらの発現を最適化することによって天然のアベルメクチン生産を改良す る場合に有用である。クローン化ｂｋｄ遺伝子の有効な発現を達成するための一 つの可能なアプローチは、これらの遺伝子が強力なプロモーターから転写される ように、多コピー大腸菌／ストレプトミセスシャトルベクター（例えば、プラス ミドｐＣＤ２６２、デノヤ（Ｄｅｎｏｙａ）Ｃ．Ｄ．、１９９３年、「ストレプ トミセスおよび大腸菌の新規の細菌プラスミドシャトルベクター（Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｌａｓｍｉｄｓ Ｓｈｕｔｔｌｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆ ｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ ｌｉ）」，１９９３年３月１８日出願の米国特許出願第０８／０３２，９２５号 明細書）中へのこれらの遺伝子の挿入を行う。この手順は、遺伝子の有効な転写 を確実にする。更に、ある種の方策は、有効な発現を約束するように考案するこ とができる。これらとしては、（ａ）プロモーター強度；（ｂ）ｍＲＮＡの安定 性；（ｃ）調節因子の存在または不存在；（ｄ）誘導性；並びに（ｅ）リボソー ム認識および翻訳開始シグナルを改良する特定部位の突然変異誘発。ｂｋｄ遺伝 子の発現もまた、遺伝子置換技術によって野生型プロモーターおよび調節部分を 異なるプロモーターで置換することにより最適化することができると考えられる 。文献中には、ここで開示された新規のＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子の発 現を最適化するのに用いることができる有用なプロモーターの多数の例があり、 例えば、強力なｅｒｍＥプロモーター（ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）ら、１ ９８５年、「ストレプトミセス属の遺伝子操作。実験室マニュアル（Ｇｅｎｅｔ ｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，ザ・ジョン・インス・ファウンデーショ ン（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ），ノリッツジ，Ｕ Ｋ）およびチオストレプトン誘導性ｔｉｐＡプロモーター（ムラカミ（Ｍｕｒａ ｋａｍｉ）ら、１９８９年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，１４５９〜１ ４６６）である。更に、遺伝子置換技術を用いる欠失または特定部位の突然変異 誘発によるｂｋｄ遺伝子の不活性化および付随するＢＣＫＤＨ活性の不存在は、 新規のアベルメクチンの生産において有用である改良され不可逆的にブロックさ れたｂｋｄストレプトミセス・アベルミティリス菌株を発育させる。 実施例 以下は、添付図面にも図示されているＳ．アベルミティリスからのｂｋｄ遺伝 子をクローン化し且つ分析するのに用いられた実験手順の詳細な実施例である。 当分子生物学業者に周知である標準的な技法についての更に詳細および用いられ た特定の酵素の設計は、例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らによる実 験室マニュアル「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」 （コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８９年）に記載されている。 実施例１ Ｓ．アベルミティリスゲノムＤＮＡの製造 Ｓ．アベルミティリスＡＴＣＣ３１２７２菌糸体を、密集菌叢としてＹＰＤ− ２寒天培地上において２９℃で７日間増殖させた。培地は、 ディフコ・イースト・エキストラクト １０グラム （Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ） ディフコ・バクト・ペプトン １０グラム （Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎ） デキストロース ５グラム ディフコ・バクト寒天 ２０グラム 酢酸ナトリウム ２グラム ＭＯＰＳ １０グラム から成った。 ｐＨは７．０に調整された。 最終容量：１Ｌ。 １２１℃で２５分間オートクレーブ滅菌された。 次に、増殖した菌糸体を用いて、３００ｍｌ邪魔板付きフラスコ中のＡＳ−７ 培地（ハフナー（Ｈａｆｎｅｒ）ら、１９８８年、欧州特許出願第８８３００３ ５３．５号、公開第０２８４１７６号明細書を参照されたい）３０ｍｌに接種し 、それを振とうしながら（２３０ｒｐｍ）２９℃で２４時間維持した。培地は、 希薄デンプン¹ ２０グラム アルダミン（Ａｒｄａｍｉｎｅ）ｐＨ² ５グラム ファーマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）³ １５グラム 炭酸カルシウム（ＣａＣＯ₃） ２グラム から成った。 ｐＨは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）によって７．２に調整された。 最終容量：１Ｌ。 １２１℃で２５分間オートクレーブ滅菌された。 ¹バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ ｉｓ）からのα−アミラーゼによるデンプンの加水分解によって約４０％のデキ ストロース当量に調製された。 ²イースト・プロダクツ・インコーポレーテッド（Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｄｕｃ ｔｓ Ｉｎｃ．），クリフトン，ＮＪ０７０１２から。 ³トレーダーズ・プロテイン（Ｔｒａｄｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ），メンフィ ス，ＴＮ３８１０８から。 上記培養物約０．３ｍｌを用いて、修飾液体イースト・エキストラクト・マル ト・エキストラクト（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ）（ＹＥＭＥ）培地３０ｍｌが入っている別の３００ｍｌ邪魔板付きフラスコに 接種した（ビッブ，Ｍ．Ｊ．、フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ），Ｒ，Ｆ，および Ｄ．Ａ．ホップウッド、１９７７年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５ ４ ：１５５〜１６６）。修飾ＹＥＭＥ培地は、１リットルにつき、 ディフコ・イースト・エキストラクト ３グラム ディフコ・バクト・ペプトン ５グラム オキソイド・マルト・エキストラクト ３グラム スクロース ３００グラム グルコース １０グラム を含んだ。 １２１℃で４０分間オートクレーブ滅菌された。 ２．５Ｍ塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ）２ｍｌをオートク レーブ後に加えた。 最終容量はＩＬに調整された。 培養物を２９℃で４８〜７２時間増殖させた。菌糸体を遠心分離によって回収 し、そしてゲノムＤＮＡを、Ｄ．Ａ．ホップウッド博士ら著の教本「ストレプト ミセス属の遺伝子操作。実験室マニュアル」，ザ・ジョン・インス・ファウンデ ーション，ノリッジ，ＵＫ，１９８５年で見出されるプロトコル「塩化セシウム 勾配遠心分離によるストレプトミセス属全ＤＮＡの単離。操作２（Ｉｓｏｌａｔ ｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｂｙ Ｃｅｓ ｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ２）」にしたがって製造した。ＤＮＡペレットをＴＥ緩 衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ）ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）３ｍｌ中に再 懸濁させた。 実施例２ ポリメラーゼ連鎖反応Ｓ．アベルミティリスゲノムＤＮＡ増幅 Ｓ．アベルミティリスゲノムＤＮＡを、パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅ ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）熱サイクルを用いることによって酵素的に 増幅させた。ＰＣＲ反応は、Ｔａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータ ス）および製造者によって与えられた緩衝液を用い、２００μＭ ｄＮＴＰ、１ ５％グリセロール、０．５μＭの各プライマー、鋳型ＤＮＡ １０ｎｇ（Ｃの場 合、Ｓ．アベルミティリスゲノムＤＮＡ）および酵素２．５単位の存在下の最終 容量１００μｌ中において３０サイクル行われた。最初のサイクルの熱プロフィ ールは、９５℃で３分間（変性工程）、５５℃で２分間（アニーリング工程）お よび７２℃で２分間（伸長工程）であった。引き続きの２９サイクルは、変性工 程を１．５分間に短縮したこと以外は同様の熱プロフィールであった。ＤＮＡプ ライマーは、ジェノシス・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド（Ｇｅ ｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（テキサス）によっ て供給された。右方向プライマー（図１）は、 ５′−ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣ −３′であり且つ左方向プライマー（図１）は、 ５′−ＴＣＴＡＧＡＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＣ−３′ であった。増幅産物をアガロースゲル電気泳動によってサイズ分別した。ＰＣＲ 試料を、マニアティスらによって記載されたように、１Ｘ ＴＢＥ緩衝液（９０ ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、９０ｍＭホウ酸、２．５ｍＭエチレンジアミ ン四酢酸（ＥＤＴＡ）））中の水平の１．５％アガロースゲル中において１００ Ｖで１．５時間電気泳動させた。分離されたＰＣＲ ＤＮＡ産物は、臭化エチジ ウムによって染色し且つ３６５ｎｍ紫外線によって蛍光バンドを可視化すること によりゲル中に位置していた。上記のＰＣＲ条件下において、このプライマー組 合わせを用いた場合、単一ＤＮＡバンド（約２５０塩基対長さ）が検出された。 実施例３ 大腸菌ベクター中への０．２５ｋｂのＰＣＲ増幅されたＳ．アベルミティリスゲ ノムＤＮＡフラグメントのクローニングおよび大腸菌宿主中への引き続きの形質 転換。 Ａ．０．２５ｋｂ ＰＣＲ産物の回収 前述のように、０．２５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、鋳型としてのＳ．アベ ルミティリスゲノムＤＮＡ並びに右方向および左方向プライマー組合わせを用い てＰＣＲによって増幅させた。図１で示されたように、右方向プライマーは５′ 末端に位置するＥｃｏＲＩ認識部位を有し且つ左方向プライマーは５′末端にＸ ｂａＩ認識部位を有する。しかしながら、インサートおよびクローニングベクタ ー両方をＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌによって消化した場合の連結反応手順を用い ることによって０．２５ｋｂ ＰＣＲフラグメントをクローン化する試みは成功 しなかった。したがって、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用い てＰＣＲフラグメント中にブラント末端を生じさせることを伴う、０．２５ｋｂ ＰＣＲフラグメントをクローニングするための別のアプローチが探求された。 増幅後（実施例２に記載のように）、約８０μｌのＰＣＲ反応をフェノール−ク ロロホルムによって２回抽出し、エーテルで２回抽出した後、ＰＣＲ ＤＮＡ産 物を前に記載されたようにエタノール沈降させた。ＤＮＡを１８．５μｌのＨ₂ Ｏ中に再懸濁させた。次に、１０ｘニックトランスレーション緩衝液（０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．１Ｍ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）、１ｍ Ｍジチオトレイトール、ウシ血清アルブミン５００μｇ／ｍｌ）（マニアティス ら、１９８９年）２．５μｌおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラ グメント（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））２０単位を加え、そして 混合物を３７℃で５分間インキュベートした。次に、２ｍＭ ｄＮＴＰ（各２ｍ Ｍの４種のｄＮＴＰ）１μｌを加え、更に、反応を室温で１５分間インキュベー トした。０．５Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を１μｌ加えることによって修復反応 を停止させ、反応混合物の全内容物を１．５％アガロースゲルに加え且つ電気泳 動させた。０．２５ｋｂ ＤＮＡフラグメントを前記のように可視化し且つ電気 溶出によって以下のように回収した。０．２５ｋｂ ＤＮＡバンドをかみそりの 刃で切取り、そして一方向電気溶出装置（インターナショナル・バイオテクノロ ジー・インコーポレーテッド（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．），ニューヘブン，ＣＴ）を用いる１０Ｍ酢酸アンモニウ ムが満たされたＶ型ウェル中への８０Ｖで３５分間の電気溶出によってＤＮＡを アガロースゲルから回収した。次に、ＤＮＡをエタノールによって沈降させ、ペ レットにし、そして最終的にＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ）４ｍＭ塩 化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）２０μｌ中に 再溶解させた。 Ｂ．プラスミドベクターｐＧＥＭ−３ＺのＳｍａＩ消化および脱リン酸化 プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）（プロメガ・コーポレーション，マディソ ン，ＷＩ）約１μｇおよび制限酵素ＳｍａＩ（制限酵素は全て、ベーリンガー・ マンハイム・バイオケミカルズから購入された）２単位を、供給者によって指定 された検定緩衝液中の全反応容量４０マイクロリットル（μｌ）中において２５ ℃で３．５時間インキュベートして、直鎖状ブラント末端付き分子を生じた。次 に、ＳｍａＩで線状化されたベクターを、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｃ ＩＡＰ）（プロメガ・コーポレーション，マディソン，ＷＩから購入された）を 用いて、供給者から得られた指示にしたがって脱リン酸化した。反応混合物を３ ７℃で３５分間インキュベートした後、ＤＮＡを等容量のフェノール−クロロホ ルムによって２回、等容量のエーテルで２回抽出し、そして最後に、２容量の無 水エタノールを加えることによってＤＮＡを沈降させた。沈降したＤＮＡを１０ ，０００ｘＧで１０分間の遠心分離によって回収し且つ真空下で乾燥させた。最 終ペレットをＤＮＡ緩衝液２０μｌ中に再溶解させた。 Ｃ．ｐＣＤ５０３を生じる連結反応 クレノウ処理された０．２５ｋｂのＰＣＲ ＤＮＡ産物約９μｌおよびＳｍａ Ｉで線状化されてＣＩＡＰで脱リン酸化されたブラント末端付きｐＧＥＭ−３Ｚ ｆ（＋）約１μｌを、リガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂs），ＩＣ，ビバリー，ＭＡ）１単位と一緒に 、供給者によって指定された条件下で全反応容量２０μｌ中において１４℃で一 晩中インキュベートした。氷上の検定用マイクロチューブに入れることによって 反応を終結させた後、反応混合物１５μｌを用いて、マニアテイスら、１９８９ 年によって記載されたように標準法にしたがってコンピテント大腸菌ＪＭ１０９ 細胞を形質転換させた。多数のアンピシリン耐性形質転換細胞を回収した。プラ スミドベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端 フラグメントをコードする大腸菌のｌａｃオペロンに由来するＤＮＡセグメント を有する（ヤニシュ・ペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ），Ｃ．、ビエイ ラ（Ｖｉｅｉｒａ），Ｊ．およびＪ．メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、１９８５年 、Ｇｅｎｅ，３３，１０３）。イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰ ＴＧ）によって合成が誘導されうるこのフラグメントは、宿主によってコードさ れたβ−ガラクトシダーゼ欠損型と対立遺伝子（α）内相補性でありうる。イン デューサーＩＰＴＧに対して暴露された大腸菌細胞は、色素原性基質５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含む培地 上で平板培養された場合に酵素のフラグメントを合成するし且つ青色コロニーも 形成する。プラスミドのポリクローニング部位中への異種ＤＮＡの挿入は、β− ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントを不活性化させ且つα−相補性を消 滅させる。したがって、組換え体プラスミドを有する細菌は白色コロニーを生じ る。多数の白色コロニーをこの形質転換実験から回収した。これらのコロニーは 、プラスミドｐＣＤ５０３を含むはずである。これは、菌株ＣＤ５０３と称する 一つのコロニーを選択し、そして更に分析することによって確証された。大腸菌 菌株ＣＤ５０３の単一細菌コロニーを、標準的な微生物学手順にしたがって、ア ンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎ ｉ）（ＬＢ）培地中に接種した。ＬＢ培地は、 バクト・トリプトン １０グラム バクト・イースト・エキストラクト ５グラム ＮａＣｌ １０グラム から成った。 ｐＨは５Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）によって７．０に調整された。 溶液の最終容量は１Ｌに調整された。 １２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌された。 培養物を３５℃で一晩中インキュベートした。翌朝、４℃において１０，００ ０ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細菌細胞を採取した。プラスミドベクター は、デノヤ（Ｄｅｎｏｙａ）ら、１９８５年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ Ｌｅｔｔ． ，２９：８７によって記載されたように、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）お よびドリー（Ｄｏｌｙ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９７９年 ，７：１５１３）の方法の変法を用いて、新鮮な採取された大腸菌ＣＤ５０３細 胞から単離された。単離されたプラスミドＤＮＡは、最終的に、ＤＮＡ緩衝液（ １０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７． ５）中に溶解されて、緩衝液１０μｌにつき約１μｇの濃度のｐＣＤ５０３を生 じた。制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いる確認の制限分析は、予想され たように、ｐＣＤ５０３が０．２５ｋｂのＤＮＡインサートを含んでいたことを 示した。 実施例４ 放射性標識ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの製造 Ａ．均一に標識された二本鎖ＤＮＡプローブの製造 二本鎖ＤＮＡプローブは、ニックトランスレーション（この技術の概説につい ては、マニアティスら、１９８９年を参照されたい）によって製造された。最初 に、標的配列を有する特異的ＤＮＡフラグメントを、本質的には実施例１に記載 のように、適当な制限消化および電気溶出による精製によって製造した。ＤＮＡ 約１μｇを、それぞれの場合において、ＮＥＮ−デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）から 購入された［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（デオキシシチジン５′−三リン酸，テトラ（ トリエチルアンモニウム）塩，［α−³²Ｐ］−）およびＢＲＬライフ・テクノロ ジーズ・インコーポレーテッド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ ｃ．）から購入されたＢＲＬニック・トランスレーション・システムを用いて供 給者から得られた指示にしたがって標識した。典型的な反応は、５０μｌ容量中 で行われた。ストップ（Ｓｔｏｐ）緩衝液（ＢＲＬ推薦の方法に記載の）５μｌ を加えた後、供給者から得られたマニュアルにしたがって、ストラタジーン（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）プッシュカラムを用いて非組込みヌクレオチドから標識Ｄ ＮＡを分離した。１０⁸ｃｐｍ／μｇを越える十分な特異的活性を有する³²Ｐ標 識ＤＮＡは、これらの手順にしたがって慣例的に得られた。 Ｂ．標識一本鎖ＲＮＡプローブの製造 ³²Ｐ標識ＲＮＡプローブは、リボプローブ・ジェミニ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ Ｇｅｍｉｎi）転写系（プロメガ）を用いるインビトロ転写によって製造された 。標的ＤＮＡの精製フラグメントを、標準法を用いて転写ベクターｐＧＥＭ−３ Ｚ中にクローン化した。インビトロ転写反応のための鋳型プラスミドＤＮＡの製 造は実施例３に記載のように行われたが、これらの標品を混入することがある小 ヌクレオチドを選択的に除去するための以下のようなポリエチレングリコール（ ＰＥＧ）沈降工程を含む。エタノール沈降工程後、ペレットを水５２０μｌ中に 再懸濁させた。次に、５Ｍ ＮａＣｌ １００μｌおよび１３％ＰＥＧ（ＭＷ６ ，０００〜８，０００）６２０μｌを加えた。混合後、試験管を氷上で１時間イ ンキュベートし、そしてＤＮＡを４℃において１０，０００ｘＧで１５分間ペレ ットにした。ペレットを８０％冷エタノール５００μｌで１回洗浄し且つ通常ど おり再懸濁させた。鋳型プラスミドＤＮＡ約１μｇをＳａｃＩかまたはＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素を用いて線状化した後、それぞれＳＰ６またはＴ７バクテリオフ ァージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写した。ＮＥＮ− デュポンから購入されたシチジン５′−三リン酸テトラ（トリエチルアンモニウ ム）塩，［α−³²Ｐ］（ＣＴＰ）をこの反応において用いた。反応条件は供給者 による推薦にしたがった。インキュベーション後、反応混合物をＲＱ１−ＤＮア ーゼ（プロメガ）１単位で処理してＤＮＡ鋳型を分解し、フェノール−クロロホ ルムによって２回抽出した後、標準法にしたがってエタノール沈降させた。ペレ ットを乾燥させ且つＲＮアーゼ不含水（プロメガ）２０μｌ中に再懸濁させた。 標識ＲＮＡ転写物の小アリコートを、デノヤら、１９８７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ ｉｏ ｌ ．，１６９：３８５７〜３８６０によって記載のようにポリアクリルアミド− アガロースゲル電気泳動によって分析した。ここで記載の条件下において、標識 された完全長さ転写物が慣例的に得られた。 実施例５ サザンハイブリッド形成によるＳ．アベルミティリスゲノムＤＮＡの分析 精製Ｓ．アベルミティリスゲノムＤＮＡ約１０μｇを、制限酵素ＢａｍＨＩ２ 単位によって３７℃で最低２時間消化した。消化の最後に、１％アガロースゲル による電気泳動によってＤＮＡフラグメントを分離し（実施例１Ａを参照された い）、そして毛管移動法（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ），Ｅ．Ｍ．、１９７５年 、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３）を用いてナイロン膜（細孔度０．４ ５μｍ）（シュライヒャー・アンド・シュエル・ナイトラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ ｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｎｙｔｒａｎ）膜）に一晩中移動させた。翌日 、ナイロン膜をプラスチックラップで包み、そしてそれぞれの膜のＤＮＡ側を紫 外線照射源（３０２ｎｍ）に暴露してＮＤＡを膜に固定した。ナイロン膜上に固 定されたＤＮＡに対する放射性標識ＲＮＡまたはＤＮＡプローブのハイブリッド 形成は、マニアティスら（１９８９）に記載のプロトコルにしたがって行われた 。プレハイブリッド形成およびハイブリッド形成は４２℃で行われた。ハイブリ ッド形成溶液は、６ｘＳＳＣ（Ｉｘ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、 １５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１０ｘデンハート試薬［１ｘ：０ ．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清ア ルブミン］、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、変性されフラグメント化 されたサケ精子ＤＮＡ １００μｇ／ｍｌ、大腸菌ｔＲＮＡ １００μｇ／ｍｌ および５０％ホルムアミド（フルカ（Ｆｌｕｋａ））を含んだ。一晩中ハイブリ ッド形成後、膜を以下のように洗浄した。１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによって 室温で１５分間２回洗浄、そして０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによって４２ ℃で１５分間２回洗浄。いくつかの実験において、ハイブリッド形成はホルムア ミド不存在下において６５℃で行われ、ＳＳＰＥ（１ｘ：０．１８Ｍ ＮａＣｌ 、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ₄）、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ） をＳＳＣの代わりに用いた。最後に、膜をＸ線フィルムに暴露してオートラジオ グ ラフ像を得た。 実施例６ ０．２５ｋｂ ＣＤ５０３Ｓ．アベルミティリスゲノムフラグメントのバクテリ オファージＭ１３中へのクローニングおよびＤＮＡ配列順序決定 サンガー（Ｓａｎｇｅｒ′ｓ）ジデオキシ配列順序決定法（サンガーら、１９ ７７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３〜５ ４６７）において鋳型として用いるための一本鎖組換えＤＮＡの製造のために、 ０．２５ｋｂのＣＤ５０３Ｓ．アベルミティリスＤＮＡフラグメントをバクテリ オファージＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中にクローン化した。前記のミ ニプレプ法にしたがって製造されたプラスミドｐＣＤ５０３約２μｇを制限酵素 ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩによって消化して０．２５ｋｂのＳ．アベルミティリ スゲノムインサートを放出した。以前の制限分析は、ＥｃｏＲＩかまたはＰｓｔ Ｉ単独によって消化されたｐＣＤ５０３のみが直鎖状であったことを示していた 。この分析は、０．２５ｋｂインサートがＥｃｏＲＩ制限部位もＰｓｔＩ制限部 位も含んでいなかったことを実証した。消化混合物を１．２％アガロースゲル中 で電気泳動させ、そして前記のように０．２５ｋｂフラグメントを電気溶出させ 且つ沈降させた。更に、精製二本鎖複製型（ＲＦ）Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ ｍｐ１９ＤＮＡそれぞれ約１μｇをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩによって二重消化 し、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（プロメガ・コーポレーショ ン，マディソン，ＷＩから購入された）によって脱リン酸化し、そして最後に、 前記のように０．２５ｋｂ ＤＮＡフラグメントに対して連結させた。精製ＲＦ Ｍ１３クローニングベクターはニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入した。連結反応混合物を用いて、 コンピテント大腸菌ＪＭ１０９細胞をトランスフェクトさせた。ｍｐ１８トラン スフェクションから白色プラーク１個およびｍｐ１９トランスフェクションから １個を選択し、ファージ増殖させ、そして前記のように（マニアティスら、１９ ８９年）一本鎖ＤＮＡを製造した。それぞれの一本鎖ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ配列順 序決定は、Ｍ１３特異的４０配列順序決定プライマー（ニュー・イングランド・ バイオラブズ、カタログ番号１２１２）、デオキシアデノシン５′−［α−チオ ］三 リン酸，［³⁵Ｓ］（ＮＥＮ−デュポン）およびタクトラック（ＴａｑＴｒａｃｋ ）配列順序決定キット（プロメガ）を用いて、供給者（プロメガ）によって提供 された指示にしたがって行われた。ｐＣＤ５０３Ｓ．アベルミティリスゲノムフ ラグメントのＤＮＡ配列順序決定データを図４に示す。 実施例７ ｂｋｄＳ．アベルミティリス遺伝子クラスター全体のクローニングおよび染色体 地図の作成 精製ｐＣＤ５０３約５μｇをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ両方の制限酵素を用 いて二重に制限し、ＤＮＡフラグメントを１．２％アガロースゲル中の電気泳動 によって分離し、Ｓ．アベルミティリスｂｋｄＥ１−α遺伝子に特異的な配列を 有する約０．２５ｋｂ長さＤＮＡフラグメントを電気溶出によって回収し、そし て本質的には前記のようにニックトランスレーションによって標識した。次に、 ［³²Ｐ］標識ＤＮＡフラグメントをプローブとして用いて、Ｓ．アベルミティリ スゲノムコスミドライブラリーをスクリーニングした。概して、ゲノムライブラ リーの製造についての詳細な説明は、マニアティスら（１９８９）によるＭｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ で見 ることができる。ストレプトミセス染色体ライブラリー製造の完全な説明は、ホ ップウッドら（１９８５）によるＧｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ で 示されている。コスミドベクターについての説明は、デノヤＣ．Ｄ．による、１ ９９３年４月１６日出願の米国特許出願第０８／０４８，７１９号明細書、「ス トレプトミセス属ゲノムＤＮＡクローニングのコスミドベクター（Ｃｏｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮ Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」で見出される。２２００種類より大の組換え体ライブラ リークローンをスクリーニング後に、４種類のクローンを識別した。４種類のハ イブリッド形成クローン（大腸菌クローンＣＤ５１８、ＣＤ５１９、ＣＤ５２０ およびＣＤ５２１として記録された）をＬＢ培地中においてアンピシリン選択的 圧力下で増殖させた。プラスミドを前記のような各培養物から製造した。制限お よびサザンブロットハイブリッド形成分析は、４種類のクローンが関連があり、 重複する染色体部分を有することを示した。配列ＣＤ５０３を含む染色体部分全 体を包含するＳ．アベルミティリスゲノム制限地図は標準法にしたがって得られ 、それを図３に示す。 実施例８ ｂｋｄ遺伝子クラスターを有するＳ．アベルミティリス染色体部分の支配された ＤＮＡ配列順序決定のための欠失突然変異の重ね合わされたセットの生成 Ｓ．アベルミティリスｂｋｄ標的ＤＮＡの一方の末端またはもう一方から漸進 的により多くのヌクレオチドを欠く欠失突然変異の重ね合わされたセットは、本 質的にはヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ），Ｓ．（１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ，１５５：１５６）によって記載されたのと同様の手順にした がって、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて生成された。一方向欠失突然変異を 生成するために、それぞれの組換え体バクテリオファージＭ１３複製型ＤＮＡの 二本鎖ＤＮＡを、どちらも標的ＤＮＡの一端とプライマー結合部位との間に開裂 部位を有する２種類の制限酵素によって消化した。標的配列のより近くを切断す る制限酵素は、ブラント末端すなわち凹部３′末端を生成し；もう一方の酵素は 突出した３′末端を生成した。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、二本鎖ＤＮＡの凹 部すなわちブラント３′−ヒドロキシル末端からの５′モノヌクレオチドの段階 的除去を触媒する。しかしながら、突出した３′末端は、酵素の活性に対して完 全に耐性である。したがって、得られた直鎖状ＤＮＡの一方の末端のみがエキソ ヌクレアーゼＩＩＩに対して感受性であり、消化は開裂部位から離れて標的ＤＮ Ａ配列中へ一方向に進行した。 例として、ｐＣＤ５６５の重ね合わされた欠失の製造の説明は以下である。プ ラスミドｐＣＤ５６５は、Ｅ１−αＳ．アベルミティリスｂｋｄ読み取り枠の一 部分を含む１．１５ｋｂのＳａｌＩフラグメントを有するＭ１３ｍｐ１９ＲＦ誘 導体である。プラスミドｐＣＤ５６５は、マニアティスら（１９８９）によって 記載のように、塩化セシウムおよび臭化エチジウム勾配中の平衡遠心分離によっ て精製された。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、一本鎖ニックから消化を開始する ことができるので、１０％未満の弛緩環状分子を含む標品を用いることが重要で ある。プラスミドｐＣＤ５６５（「発明の詳細な説明」の項を参照されたい）約 １０μｇを制限酵素ＳａｌＩおよびＸｂａＩによって３７℃で４時間二重消化し た後、前記のようにフェノール−クロロホルムおよびエーテルによって抽出し、 そしてエタノール沈降させた。ペレットをエキソヌクレアーゼＩＩＩ反応緩衝液 （１０ｘエキソヌクレアーゼＩＩＩ緩衝液：０．６６Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８ ．０、６６ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂））６０μｌ中に再懸濁させた。 次に、ＤＮＡ溶液を、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（アンビオン・インコーポレー テッド（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．））３００単位の存在下において３７℃でイン キュベートし、そして２．５μｌアリコートを３０秒間隔で取出した。次に、試 料をヌクレアーゼＳ１と一緒にインキュベートし、そして各試料のアリコートを アガロースゲル電気泳動によって分析した。所望の寸法のＤＮＡフラグメントを 含む試料をプールし、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いるこ とによってＤＮＡを修復し、一晩中連結し、そしてコンピテント大腸菌ＪＭ１０ ９細胞中にトランスフェクトさせた。回収されたクローン中のインサート寸法は 、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限およびアガロースゲル電気泳動によって分析 された。５種類のクローン、すなわち、５６５−Ｄ１９（１．１ｋｂ）、５６５ −Ｄ７（０．８８ｋｂ）、５６５−Ｄ２４（０．７７ｋｂ）、５６５−Ｄ１（０ ．５１ｋｂ）および５６５−Ｄ１６（０．３６ｋｂ）を配列順序決定用に選択し た。 実施例９ Ｓ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子の大腸菌中での発現において用いるためのプ ラスミドｐＣＤ６７０、ｐＣＤ６６６、ｐＣＤ７３６およびｐＣＤ６８５の構築 大腸菌中でのＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子の発現は、本質的にはＳ．テ イバー（１９９０年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，１６．２．１〜１６．２．１１頁，グリーン・バブ リッシング・アンド・ウィリー・インターサイエンス，ニューヨーク）によって 記載のように、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター二重プラスミド系を用 いて達成された。 Ａ．Ｓ．アベルミティリスＥ１−αｂｋｄ ＯＲＦを有するｐＣＤ６７０の構 築 ： ＡＴＧ出発コドンをスパニングするＮｄｅｌ制限部位を、ＰＣＲに基づく手順 を用いてＳ．アベルミティリスｂｋｄＥ１−α遺伝子中に導入した。ＰＣＲのた めの鋳型は、Ｅ１−αＯＲＦのアミノ末端半分を含む７ｋｂのＳ．アベルミティ リスゲノムインサートを有するｐＧＥＭ−３Ｚ誘導体であるプラスミドｐＣＤ５ ２８であった。２種類のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応においてプライマーと して用いた（図６を参照されたい）。 １．ｐＧＥＭ−３Ｚ ＭＣＳのＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流（９１〜１１４位） に地図で示される左方向普遍的（ベクター）プライマー３１−ＰＣＲ−ＢＰ （５′−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡ ＣＧＣＣＡ−３′）。このプライマーの５′末端には、二つのＡｓ、およびＰＣ Ｒ産物のクローニングを容易にする二つの制限部位（ＢａｍＨＩおよびｐｓｔＩ ）がある。 ２．突然変異原性プライマー５５−ＰＣＲ（５′−ＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴ ＡＴＧＡＣＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧ−３′）。このプライマーの５′ 末端には、二つのＡｓ、一つのＧおよび二つの制限部位（ＢｇｌＩＩおよびＮｄ ｅｌ）がある。Ｎｄｅｌ部位は、Ｅ１−α読み取り枠のＡＴＧ開始コドンと重複 する。 ポリメラーゼ連鎖反応は前記のように行われた。反応生成物は、０．８％アガ ロースゲル中の電気泳動によって分析された。正しい寸法（約１．１ｋｂ長さ） のＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを電気溶出し、制限酵素ＮｄｅｌおよびＢａｍ ＨＩによって消化し、そしてＮｄｅｌ／ＢａｍＨＩ線状化プラスミドｐＴ７−７ 中にサブクローン化して、連結反応および大腸菌ＤＨ５−α細胞中への形質転換 によってプラスミドｐＣＤ６６３を生成した。プラスミドｐＣＤ６６３（プラス ミドミニプレプ法を用いて大腸菌菌株ＣＤ６６３から製造された）約１μｇをＢ ａｍＨＩによって線状化し、脱リン酸化し、そして最後に、プラスミドｐＣＤ５ ５０のＢａｍＨＩ消化から単離された電気溶出精製された１．１ｋｂのＢａｍＨ Ｉフラグメント約０．５μｇの存在下で連結して、プラスミドｐＣＤ６７０を生 成した。後者の構築物中の１．１ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントの正しい方向は 、インサート中に存在するＳａｌＩ部位を地図で示すことによって決定された。 最後に、プラスミドｐＣＤ６７０を、プラスミドｐＧＰ１−２（Ｔ７ ＲＮＡポ リ メラーゼ遺伝子を有するプラスミド）を有する大腸菌菌株Ｃ６００中に導入した （テイバー、１９９０年を参照されたい）。１種類の形質転換細胞を更に研究用 に選択し且つ菌株ＣＤ６７６として記録した。 Ｂ．Ｓ．アベルミティリスＥ１−βｂｋｄ ＯＲＦを有するｐＣＤ６６６の構 築 ： ＡＴＧ出発コドンをスパニングするＮｄｅｌ制限部位を、ＰＣＲに基づく手順 を用いてＳ．アベルミティリスｂｋｄＥ１−β遺伝子中に導入した。ＰＣＲのた めの鋳型は、Ｅ１−βＯＲＦを含む４．５ｋｂのＳ．アベルミティリスゲノムイ ンサートを有するｐＧＥＭ−３Ｚ誘導体であるプラスミドｐＣＤ５７４であった 。２種類のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応においてプライマーとして用いた（ 図６を参照されたい）。 １．左方向普遍的（ベクター）プライマー３０−ＰＣＲ−ＢＰ： ｐＧＥＭ−３Ｚ ＭＣＳのＥｃｏＲＩ部位の上流（２６８９〜２７１２位）に 地図で示される（５′−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ−３′）。このプライマーの５′末端には、二つのＡ ｓ、およびＰＣＲ産物のクローニングを容易にする二つの制限部位（ＢａｍＨＩ およびＰｓｔＩ）がある。 ２．右方向突然変異原性プライマー５６−ＰＣＲ： （５′−ＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＡ ＡＧ−３′）。このプライマーの５′末端には、二つのＡｓ、一つのＧおよび二 つの制限部位（ＢｇｌＩＩおよびＮｄｅｌ）がある。Ｎｄｅｌ部位は、Ｅ１−β 読み取り枠のＡＴＧ開始コドンと重複する。 ポリメラーゼ連鎖反応は前記のように行われた。反応生成物は、０．８％アガ ロースゲル中の電気泳動によって分析された。正しい寸法（約１．９ｋｂ長さ） のＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを電気溶出し、制限酵素ＮｄｅｌおよびＥｃｏ ＲＩによって消化し、そしてＮｄｅｌ／ＥｃｏＲＩ線状化プラスミドｐＴ７−７ 中にサブクローン化して、連結反応および大腸菌ＤＨ５−α細胞中への形質転換 によってプラスミドｐＣＤ６６６を生成した。最後に、プラスミドｐＣＤ６６６ を、プラスミドｐＧＰ１−２（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミ ド）を有する大腸菌菌株Ｃ６００中に導入した（テイバー、１９９０年を参照さ れたい）。１種類の形質転換細胞を更に研究用に選択し且つ菌株ＣＤ６７３とし て記録した。 Ｃ．Ｓ．アベルミティリスＥ１−αおよびＥ１−βｂｋｄ ＯＲＦを有するｐ ＣＤ７３６の構築 ： プラスミドｐＣＤ６７０約２μｇを、部分的なＢａｍＨＩ消化によって線状化 した。直鎖状の形のプラスミドｐＣＤ６７０を得るために、ＢａｍＨＩ消化混合 物のアリコートを以下の時点、すなわち、１分、３分、５分、１０分および２０ 分に採取した。アリコートを０．８％アガロースゲルによって流した。直鎖状の 形（約４．３ｋｂ長さ）を電気溶出によって回収し且つ（前記のように）ＣＩＡ Ｐを用いて脱リン酸化した。次に、脱リン酸化された直鎖状の形のプラスミドｐ ＣＤ６７０の半分を、プラスミドｐＣＤ５７７から単離された０．８ｋｂのＢａ ｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントと連結した。連結反応混合物を用いて、コンピ テント大腸菌ＤＨ５−α細胞を形質転換させた。１０種類のクローンを回収し、 そしてミニプレプ法によって製造されたプラスミドＤＮＡの制限分析によって分 析した。菌株ＣＤ７３６として記録された一つのクローンは、正しく組み立てら れたプラスミドｐＣＤ７３６を含んでいた。最後に、プラスミドｐＣＤ７３６を 、プラスミドｐＧＰ１−２を有する大腸菌菌株Ｃ６００中に導入した。１種類の 形質転換細胞を更に研究用に選択し且つ菌株ＣＤ７３７として記録した。菌株Ｃ Ｄ７０５として記録されたもう一つのクローンは、０．８ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｂ ｇｌＩＩフラグメントを誤った方向に有していたプラスミドｐＣＤ７０５を含ん でいた。構築物ｐＣＤ７０５を、発現実験において負の対照として用いた。 Ｄ．Ｓ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子クラスターを有するｐＣＤ６８５の構 築 ： 前記のように制限酵素ＢａｍＨＩによる部分的消化によって得られたプラスミ ドｐＣＤ６７０の脱リン酸化された直鎖状の形の残りの半分を、プラスミドｐＣ Ｄ５７７から単離された７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントと連結した。連結反応 混合物を用いて、コンピテント大腸菌ＤＨ５−α細胞を形質転換した。多数のク ローンを回収し、そしてそれらの内の１６種類を更に分析用に選択した。プラス ミドＤＮＡを抽出し且つ制限分析によって分析した。菌株ＣＤ６８５として記録 された一つのクローンは、正しく組み立てられたプラスミド（ｐＣＤ６８５）を 含んでいた。最後に、プラスミドｐＣＤ６８５を、プラスミドｐＧＰ１−２を有 する大腸菌菌株Ｃ６００中に導入した。１種類の形質転換細胞を更に研究用に選 択し且つ菌株ＣＤ６８７として記録した。 実施例１０ Ｔ７二重プラスミド系を用いることによるＳ．アベルミティリスｂｋｄ遺伝子の 大腸菌中での発現 種々のｐＴ７−７構築（菌株ＣＤ６７６、ＣＤ６７３、ＣＤ７３７およびＣＤ ６８７）を含む大腸菌Ｃ６００の誘導体（ｐＧＰ−１）を、カナマイシン（６０ μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（６０μｇ／ｍｌ）両方を含むＬＢ培地５ｍｌ 中において３０℃で一晩中増殖させた。次に、一晩中培養物を、新鮮なＬＢ／ア ンピシリン／カナマイシン培地が入っている試験管培養（２５ｘ１５０ｍｍ）中 に１：４０（０．２５：１０．００ｍｌ）で希釈し、そして振とう器通気を伴っ て３０℃で、約０．４の光学濃度（ＯＤ₅₉₀）が測定されるまで増殖させた。Ｔ ７ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子は、温度を４２℃まで３０分間上昇させること によって誘導され、順次に、１種類または複数の遺伝子をＴ７プロモーター制御 下で誘導した（Ｓ．テイバー、１９９０年によって記載のように）。最後に、温 度を３７℃まで低下させ、そして細胞を振とうしながら更に９０分間増殖させた 。非誘導対照培養を常に３０℃で続けた。タンパク質は、Ｃ．Ｄ．デノヤら、１ ９８６年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８：１１３３〜１１４１によって記 載のように、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳 動によって分析された。酵素活性は実施例１１に記載のように分析された。 実施例１１ 組換え体大腸菌菌株の粗製抽出物中のＥ１Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨ活性 の決定 Ａ．細胞溶解産物調製 細胞（８ｍｌ培養物に由来する）を遠心分離（４℃で冷却されたソルバル（Ｓ ｏｒｖａｌｌ）ＳＳ−３４ローターを用いて５，０００ｒｐｍすなわち３，００ ０ｘｇで５分間）によって集め、そして「切断緩衝液」（３％トリトンＸ−１０ ０、１５％グリセロール、３ｍＭジチオトレイトール、シチメンチョウ卵白トリ プシン阻害剤１ｍｇ／ｍｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０４ｍＭ ＴＰＰ［チ アミンピロリン酸］を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）５ｍ １中に再懸濁させた。再懸濁された細胞をフレンチプレスに移し、そして細胞を ５，０００ｘｐｓｉでの１回通過によって破壊した。次に、フレンチプレス産物 １．５ｍｌアリコートをミクロ遠心分離試験管に移し、そして１４，０００ｒｐ ｍでの３０秒間の遠心分離によって透明にした。それぞれの上澄み１００μｌの アリコートを酵素検定で用いた。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａ ｄｆｏｒｄ）色素結合法（ブラッドフォード，Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ． ，７２：２４８，１９７６）に基づくバイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパ ク質検定（バイオラド・ラボラトリーズ、リッチモンド、カリフオルニア）を用 いることによって決定された。 Ｂ．Ｓ．アベルミティリス分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＨ ）複合体のＥ１成分の検定 ＢＣＫＤＨ Ｅ１活性は、前記の放射性化学検定の変法によって決定された（ チュアン（Ｃｈｕａｎｇ），Ｄ．Ｔ．、１９８８年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ ｍｏｌ． ，１６６：１４６〜１５４；およびハフナー，Ｅ．Ｗ．ら、１９９１年 、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４４：３４９）。１５ｍｌガラスチンシレーシ ョンバイアルの底に、０．２５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５ ０．１４ ８ｍｌ；０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ナトリウム塩）０．００ ２ｍｌ；０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂ ０．００４ｍｌ；３．７ｍＭチアミンピロリン 酸（ＴＰＰ）０．０２ｍｌ；３７ｍＭ ＮａＡｓＯ₂ ０．０２ｍｌ；３７ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ナトリウム塩、シグマＤ−１ ８７８）０．０１ｍｌ；α−［１−¹⁴Ｃ］ケトイソカプロン酸原液（後に記載の ように製造された）０．００８ｍｌ；水０．０５８ｍｌ；および透明な細胞不含 抽出物０．１ｍｌを加えた。バイアルの口に、ソルバブル（Ｓｏｌｖａｂｌｅ） （ＮＥＮ−デュポンから購入された組織およびゲル可溶化剤）を含浸させたワッ トマン（Ｗｈａｔｍａｎ）４ＣＨＲペーパー（ワットマンカタログ番号３００４ ６１４）を直ちに被せた。次に、プラスチックキャップをバイアルにしっかりと 入れ、キャップとバイアルの上半分両方をパラフィルムで包み、そして静かに振 とうしながら３０℃で２時間インキュベートした。インキュベーション完了時に 、「レディー・セーフ（Ｒｅａｄｙ Ｓａｆｅ）」（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａ ｎ）液体シンチレーションカクテル４ｍｌが入っている７ｍｌガラスシンチレー ションバイアルに濾紙を入れて放射性活性を決定した。α−［１−¹⁴Ｃ］ケトイ ソカプロン酸原液は、２０ｍＭ α−ケトイソカプロン酸（ナトリウム塩、シグ マＫ−０６２９）５．６マイクロリットル、α−［１−¹⁴Ｃ］ケトイソカプロン 酸（５５ｍＣｉ／ミリモル、５０μＣｉ／ｍｌ）アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ））および最終容量１ｍｌまでの十分な水を混合することによって調製された 。分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼのＥ１成分の特異的活性は、以下の表１ に示されたように、放出された二酸化炭素のピコモル／分／ミリグラム（タンパ ク質）である。 配列番号の説明 配列番号１は、Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨのＥ１−αサブユニットをコ ードするＤＮＡ配列を表わす。この配列は、図４において塩基４０３〜１５４８ としても図示される。 配列番号２は、Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨのＥ１−βサブユニットをコ ードするＤＮＡ配列を表わす。この配列は、図４において塩基１６２２〜２６２ ６としても図示される。 配列番号３は、Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨのＥ２サブユニットのアミノ 末端部分をコードする読み取り枠を開始するＤＮＡ配列を表わす。この配列は、 図４において塩基２６２６〜２７２７としても図示される。 配列番号４は、ｐＣＤ５３９の塩基３〜２５１を表わすＤＮＡ配列である。こ れは、Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨのＥ２サブユニットをコードする遺伝子 の部分的内部配列である。この配列は図５においても図示される。 配列番号５は、図４に図示されている且つＳ．アベルミティリスＢＣＫＤＨの Ｅ１−α、Ｅ１−βおよびＥ２（部分的）サブユニットの読み取り枠を含むＳ． アベルミティリスゲノムＤＮＡフラグメントの２７２８塩基対を表わす。 配列番号６は、Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨのＥ１−αサブユニットのア ミノ酸配列を表わす。このアミノ酸配列は、配列番号１のＤＮＡ配列によってコ ードされている。 配列番号７は、Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨのＥ１−βサブユニットのア ミノ酸配列を表わす。このアミノ酸配列は、配列番号２のＤＮＡ配列によってコ ードされている。 配列番号８は、Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨのＥ２サブユニットのアミノ 末端部分のアミノ酸配列を表わす。このアミノ酸配列は、配列番号３のＤＮＡ配 列によってコードされている。 配列番号９は、ｐＣＤ５３９の塩基３〜２５１によって表わされたＤＮＡ配列 （配列番号４）によってコードされたアミノ酸配列を表わす。このアミノ酸配列 は、Ｓ．アベルミティリスＢＣＫＤＨのＥ２サブユニットの内部ペプチド配列を 表わす。 配列表 （２）配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１１４６塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮説：なし （ｘｉ）配列種類：配列番号：１： （２）配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１００５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列番号：２： （２）配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０２塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列番号：３： （２）配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４９塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列番号：４： （２）配列番号：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７２８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：二本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列種類：配列番号：５： （２）配列番号：６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３８１アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ペプチド （ｘｉ）配列種類：配列番号：６： （２）配列番号：７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３４アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ペプチド （ｘｉ）配列種類：配列番号：７： （２）配列番号：８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３４アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ペプチド （ｘｉ）配列種類：配列番号：８： （２）配列番号：９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８３アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）鎖：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子種類：ペプチド （ｘｉ）配列種類：配列番号：９：

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年５月３１日 【補正内容】 ［原請求の範囲を以下の新請求の範囲に差し替える］ 請求の範囲 １． ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物の分 岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする単離されたＤＮＡセグメ ントであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列 番号５のＤＮＡ配列またはこのような配列の対立遺伝子変種を含む上記ＤＮＡセ グメント ２． ストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ ｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードす る請求項１に記載の単離されたＤＮＡセグメント。 ３． 前記分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の発現を調節するＤＮ Ａ部分を更に含む請求項１に記載の単離されたＤＮＡセグメント。 ４． 前記分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の発現を調節するＤＮ Ａ部分を更に含む請求項２に記載の単離されたＤＮＡセグメント。 ５． 請求項１に記載のＤＮＡセグメントのサブセットであるおよび機能的に 同等であるＤＮＡセグメント。 ６． 請求項１に記載のＤＮＡセグメントを含む組換え体ＤＮＡ。 ７． 請求項６に記載の組換え体ＤＮＡを組込まれた宿主細胞。 ８． 請求項６に記載の組換え体ＤＮＡを含むプラスミド。 ９． ｐＣＤ５２８、ｐＣＤ５４５、ｐＣＤ５５０、ｐＣＤ５５９、ｐＣＤ５ ７４およびｐＣＤ５７７から成る群より選択されるＤＮＡセグメントであって、 図３で示されたゲノム制限地図を有する上記ＤＮＡセグメント。 １０．請求項９に記載のＤＮＡセグメントが組込まれた宿主細胞。 １１．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５ のＤＮＡ配列またはこのような配列の対立遺伝子変種の転写または翻訳を調節す るＤＮＡ部分を含む請求項１に記載のＤＮＡセグメント。 １２．請求項９に記載のＤＮＡセグメント中に含まれた分岐状鎖α−ケト酸デ ヒドロゲナーゼ複合体の遺伝子。 １３．天然のアベルメクチンを生産する方法であって、該天然のアベルメクチ ンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖α−ケト酸 デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子のコピー数が増加したＳ．アベルミ ティリスを発酵させることを含む上記方法。 １４．天然のアベルメクチンを生産する方法であって、該天然のアベルメクチ ンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖α−ケト酸 デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子の発現が、該発現の調節の原因とな る遺伝子の操作または置換によって促進されたＳ．アベルミティリスを発酵させ ることを含む上記方法。 １５．新規のアベルメクチンを生産する方法であって、該新規のアベルメクチ ンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖α−ケト酸 デヒドロゲナーゼ複合体の発現が、該発現の原因となる遺伝子の欠失、不活性化 、置換または他の操作によって減少したまたは除去されたＳ．アベルミティリス を発酵させることを含む上記方法。 １６．欠失、不活性化、置換または他の方法で操作される遺伝子が、エンハン サー、阻害剤、活性化因子またはリプレッサー遺伝子である請求項１５に記載の 方法。 １７．新規のアベルメクチンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中に おいて、分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の発現の原因となる遺伝子 が欠失または不活性化されたＳ．アベルミティリスを発酵させることを含む新規 のアベルメクチンを生産する請求項１５に記載の方法。 １８．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５ のＤＮＡ配列またはそれらの対立遺伝子変種のサブセットである、およびプロー ブとして用いられた場合にそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列 番号４若しくは配列番号５またはそれらの対立遺伝子変種に対してハイブリッド 形成することができる、或いはポリメラーゼ連鎖反応プライマーとして用いられ た場合にこのような配列の全部または一部分を増幅することができるＤＮＡ配列 を含むＤＮＡセグメント。 １９．配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列 を含む実質的に精製されたポリペプチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/68 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物の分 岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする単離されたＤＮＡセグメ ント。 ２． ストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ ｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードす る請求項１に記載の単離されたＤＮＡセグメント。 ３． 前記分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の発現を調節するＤＮ Ａ部分を更に含む請求項１に記載の単離されたＤＮＡセグメント。 ４． 前記分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の発現を調節するＤＮ Ａ部分を更に含む請求項２に記載の単離されたＤＮＡセグメント。 ５． 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５ のＤＮＡ配列またはこのような配列の対立遺伝子変種を含むＤＮＡセグメント。 ６． 請求項５に記載のＤＮＡセグメントのサブセットであるおよび機能的に 同等であるＤＮＡセグメント。 ７． 請求項５に記載のＤＮＡセグメントを含む組換え体ＤＮＡ。 ８． 請求項７に記載の組換え体ＤＮＡを組込まれた宿主細胞。 ９． 請求項７に記載の組換え体ＤＮＡを含むプラスミド。 １０．ｐＣＤ５２８、ｐＣＤ５４５、ｐＣＤ５５０、ｐＣＤ５５９、ｐＣＤ５ ７４およびｐＣＤ５７７から成る群より選択されるＤＮＡセグメント。 １１．請求項１０に記載のＤＮＡセグメントが組込まれた宿主細胞。 １２．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５ のＤＮＡ配列またはこのような配列の対立遺伝子変種の転写または翻訳を調節す るＤＮＡ部分を含む請求項５に記載のＤＮＡセグメント。 １３．請求項１０に記載のＤＮＡセグメント中に含まれた分岐状鎖α−ケト酸 デヒドロゲナーゼ複合体の遺伝子。 １４．天然のアベルメクチンを生産する方法であって、該天然のアベルメクチ ンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖α−ケト酸 デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子のコピー数が増加したＳ．アベルミ ティリスを発酵させることを含む上記方法。 １５．天然のアベルメクチンを生産する方法であって、該天然のアベルメクチ ンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖α−ケト酸 デヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子の発現が、該発現の調節の原因とな る遺伝子の操作または置換によって促進されたＳ．アベルミティリスを発酵させ ることを含む上記方法。 １６．新規のアベルメクチンを生産する方法であって、該新規のアベルメクチ ンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中において、分岐状鎖α−ケト酸 デヒドロゲナーゼ複合体の発現が、該発現の原因となる遺伝子の欠失、不活性化 、置換または他の操作によって減少したまたは除去されたＳ．アベルミティリス を発酵させることを含む上記方法。 １７．欠失、不活性化、置換または他の方法で操作される遺伝子が、エンハン サー、阻害剤、活性化因子またはリプレッサー遺伝子である請求項１６に記載の 方法。 １８．新規のアベルメクチンを生産するのに適当な条件下および発酵培地中に おいて、分岐状鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の発現の原因となる遺伝子 が欠失または不活性化されたＳ．アベルミティリスを発酵させることを含む新規 のアベルメクチンを生産する請求項１６に記載の方法。 １９．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５ のＤＮＡ配列またはそれらの対立遺伝子変種のサブセットである、およびプロー ブとして用いられた場合にそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列 番号４若しくは配列番号５またはそれらの対立遺伝子変種に対してハイブリッド 形成することができる、或いはポリメラーゼ連鎖反応プライマーとして用いられ た場合にこのような配列の全部または一部分を増幅することができるＤＮＡ配列 を含むＤＮＡセグメント。 ２０．配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列 を含む実質的に精製されたポリペプチド。 ２１．請求項８に記載の宿主細胞中での発現によって生産されたポリペプチド 。