CZ289866B6 - Způsob výroby přírodního avermektinu - Google Patents

Abstract

Zp sob v²roby p° rodn ho avermektinu, p°i n m se za podm nek a ve fermenta n m m diu vhodn m pro produkci takov ho p° rodn ho avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, v n m byl zv² en po et kopi gen k duj c ch komplex rozv tven .alfa.-ketokyselina dehydrogen zy nebo zv² ena jejich exprese manipulac nebo nahrazen m gen zodpov dn²ch za regulaci t to exprese.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů výroby přírodního avermektinu fermentací Streptomyces avermitilis.

Mikroorganismy produkují četné farmaceutické produkty. Z těchto mikroorganismů byla podstatná pozornost zaměřena na příslušníky rodu Streptomyces. Tato skupina gram-pozitivních zemních bakterií poskytla až dosud více než 90 % terapeuticky užitečných antibiotik. Streptomycetes jsou v ohnisku intenzivního výzkumu využívajícího technik klonování rekombinantní DNA za účelem izolace antibiotických biosyntetických genů, vytvoření nových derivátů nebo hybridních sloučenin, izolace regulačních genů a zkoumání regulačních mechanismů podílejících se jak na primárním, tak na sekundárním metabolismu.

Streptomyces avermitilis produkuje osm rozdílných, ale příbuzných antiparazitických polyketidových sloučenin, které jsou označovány názvem avermektiny. Avermektinový komplex produkovaný S. avermitilis obsahuje čtyři hlavní složky: Ala, A2a, Bia a B2a a čtyři vedlejší složky: Alb, A2b, Blba B2b. Struktura těchto různých složek je znázorněna dále.

Ala

Alb

A2a

A2b

Bia

Blb

B2a

B2b sek-butyl izopropyl sek-butyl izopropyl sek-butyl izopropyl sek-butyl izopropyl

CH=CH CH=CH CHr-CH(OH) CHr-CH(OH)

CH=CH

CH=CH CHr-CH(OH) CHr-CH(OH)

Polyketidová struktura avermektinu je odvozena od sedmi acetátových molekul, pěti propionátových molekul a jedné molekuly α-rozvětvené mastné kyseliny, kterou je buď S(+)-2-methylmáselná kyselina nebo izomáselná kyselina. Označení „A“ se vztahuje k avermektinu, v němž je 5-substituentem methoxyskupina a označení „B“ se vztahuje k avermektinu, v němž je 5-substituentem hydroxyskupina. Označení „1“ se vztahuje k avermektinům, v nichž je dvojná

-1 CZ 289866 B6 vazba přítomna v poloze 22-23 a označení „2“ k avermektinům, obsahujícím v poloze 22 vodík a v poloze 23 hydroxyskupinu. Konečně v poloze C-25 jsou možné dva substituenty: v avermektinech ze série „a“ je přítomna sek.butylskupina (odvozená od L-izoleucinu) a v avermektinech ze série „b“ je přítomna izopropyl skupina (odvozená od L-valinu). Přehled 5 viz Fisher Μ. H. a Mrozik H., 1984, „Macrolide Antibiotics“, Academie Press, kapitola 14.

Pod označením „přírodní avermektiny“ se rozumějí avermektiny produkované S. avermitilis, v nichž je substituentem v poloze 25, jak již bylo uvedeno, buď izopropylskupina nebo sek.butylskupina. Avermektiny, které v poloze 25 obsahují jinou skupinu než izopropylskupinu nebo 10 sek.butylskupinu, jsou v tomto popisu označovány názvem „nové“ nebo „nepřirozené“ avermektiny.

Jedna metabolická dráha vedoucí k těmto α-rozvětveným mastným kyselinám ve formě Co A zahrnuje reakci s rozvětvená aminokyselina transaminázou, po níž se provede reakce 15 s rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázou. (Alternativně mohou vzniknout rozvětvený alifatický acyl-CoA-deriváty novou syntézou z rozvětvených α-ketokyselin.) Tyto metabolické dráhy jsou znázorněny dále.

-2CZ 289866 B6

CHgCHCH (NH₂) COOH) I ch₃ valin

CH3CH2CHCH (NH₂) COOH

I ch₃ isoleucin rozvětvená aminokyselina transamináza transamináza

CH3CHCOCOOH

I

CH₃

2-oxoisovalerová kyselina

CH3CH2CHCOCOOH

I

CH₃

2-oxo-3-methy1valerová kyselina nová syntéza komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázy nová syntéza

CH3CHC0.SCOA I	CH3CH2CHC0.SC0A |
1 ch3 isobutyryl-CoA	1 CH3 2-methylbutyryl-CoA I
degradační dráha (propionyl-CoA/ me thy lma lony 1 -CoA)	l degradační dráha (acetyl-CoA, propionyl-CoA, methylmalonyl-CoA)

Biosyntéza avermektinu

Ri \

CHCO.SCoA /

R.2 ‘.

Ri \ CHCOOH /

R2 exogenní rozvětvená mastná kyselina

Nedávno byl izolován mutant S. avermitilis, který nevykazuje žádnou detegovatelnou aktivitu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázy (BCKDH) v posledně uvedeném enzymu (Hafner et 5 al., 1988, Evropská patentová přihláška číslo podání 88300353.5 s publikačním číslem 0284176).

Tento mutant byl izolován po standardní chemické mutagenezi kmene S. avermitilis

-3CZ 289866 B6

ATCC 31 272 za použití screeningu na nepřítomnost produkce ^I4CO₂ z ¹⁴C-1 značené 2-oxoizokapronové kyseliny (analog leucinu), jako substrátu. Tento mutant není schopen syntetizovat přírodní avermektiny, pokud se k médiu, v němž je fermentován, nepřidá α-rozvětvená mastná kyselina nebo její prekurzor nesoucí izopropylovou nebo sek.butylovou skupinu (v S-formě). Tento mutant je dále schopen produkovat nové či nepřirozené avermektiny při fermentaci za vodných aerobních podmínek v živné půdě obsahující příslušnou alternativní karboxylovou kyselinu, jako cyklohexankarboxylovou kyselinu (CHC) nebo její prekurzor.

Klonování BCKDH z S. avermitilis je vysoce žádoucí. Manipulace těchto genů pomocí technik s rekombinantní DNA by měla umožnit produkci přírodních a nových avermektinů. U některých kmenů by bylo možno očekávat zvýšení titru přírodních avermektinů na základě zvýšení počtu kopií genů BCKDH. Kromě toho, vytvoření ireverzibilně blokovaného kmene bkd, vykazujícího permanentně vypuštěnou nebo modifikovanou aktivitu BCKDH prostřednictvím nahrazení genu, by představovalo zlepšenou alternativu k běžnému mutantu bkd, který byl získán, jak je uvedeno výše, chemickou mutagenezí.

Multienzymové komplexy α-ketokyselina dehydrogenázy, tj. komplex rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenáza (BCKDH), komplex pyruvát dehydrogenáza (PDH) a komplex a-ketoglutarát dehydrogenáza (KGDH), katalyzují oxidační dekarboxylace a-ketokyselin s rozvětveným řetězcem, pyruvátu a α-ketoglutarátu, které jsou spojeny s uvolňováním oxidu uhličitého a tvorbou odpovídajících acyl-CoA a NADH (Perham, R. N., 1991, Biochemistiy 30:8501 až 8512). Každý z těchto komplexů sestává ze tří různých katalytických enzymů; dekarboxylázy (El), dihydrolipoamid acyltransferázy transacylázy (E2) a dihydrolipoamid dehydrogenázy (E3).

Rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenáza (BCKDH) je multienzymovým komplexem, který se skládá ze tří funkčních složek: dekarboxylázy (El), transacylázy (E2) a lipoamid dehydrogenázy (E3). Purifikované komplexy z Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa a Bacillus subtilis se skládají ze čtyř polypeptidů. Také purifikované savčí komplexy se skládají ze čtyř polypeptidů, Ela, Εΐβ, E2 a E3. Komplex α-ketokyselina dehydrogenázy byl izolován z Bacillus subtilis vykazujícího jak pyruvát, tak rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázovou aktivitu. Tento komplex s dvojí funkcí oxiduje pyruvát a poskytuje mastné kyseliny s rozvětveným řetězcem pro membránové fosfolipidy.

Klonování prokaryontních rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázových genů bylo oznámeno v případě Pseudomonas a Bacillus, ale nikoliv v případě Streptomyces. Zjistilo se, že v těchto systémech vytvářejí geny kódující BCKDH shluk voperonu. Geny komplexu BCKDH Pseudomonas putida byly klonovány a byla stanovena nukleotidová sekvence této oblasti (Sykes et al., 1987, J. Bacteriol. 169: 1619 až 1625 a Bums et al., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 165 až 169 a 176: 311 až 317). Molekulová hmotnost Ela je 45 289, Εΐβ 37 138, E2 45 134 a E3 48 164. Tyto čtyři geny jsou spojeny do shluku o sekvenci Ela, Εΐβ, E2 a E3. Analýza Northem blot ukazuje, že exprese těchto čtyř genů probíhá z jediné mRNA a že tyto geny tvoří operon. Bezprostředně před počátkem Ela kódující oblasti je zde přítomen typický prokaryontní konvenční (consensus) promotor, který umožňuje konstitutivní expresi genů Pseudomonas bkd. Iniciátorový kodon pro Εΐβ kódující oblast je umístěn jen 40 nukleotidů za koncem otevřeného čtecího rámce (ORF) Ela. Naproti tomu mezi ORF Εΐβ a ORF E2 neexistuje žádný intergenový prostor, poněvadž stop kodon ORF Elβ představuje triplet bezprostředně předcházející iniciátorový kodon ORF E2. Intergenový prostor mezi ORF E2 a ORF E3 je redukován pouze na dva nukleotidy. Geny Pseudomonas bkd jsou tedy těsně spojeny. Podobně byl klonován operon kódující duální komplex Bacillus subtilis BCKDH/PDH (Hemila et al., 1990, J. Bacteriol., 172: 5052 až 5053). Tento operon obsahuje čtyři otevřené čtecí rámce kódující čtyři proteiny o velikosti 42, 35, 43 a 50 kilodalton (kDa), u nichž byla prokázána vysoká homologie s podjednotkami Ela, Εΐβ, E2 a E3 shluku Pseudomonas bkd. Nedávno byly také klonovány a sekvenovány geny kódující a a β podjednotky složky El duálního multienzymového komplexu

-4CZ 289866 B6

BCKDH/PDH z Bacillus stearothermophilus (odhadovaná molekulová hmotnost a podjednotky je přibližně 41 000 a β podjednotky přibližně 35 000) (Hawkins et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337 až 346).

Dále byly také publikovány sekvence četných eukaryontních podjednotek Ela a β BCKDH (humánního, hovězího a krysího původu). Nedávno bylo počítačovou analýzou provedeno srovnání všech publikovaných sekvencí známých pro Ela a Εΐβ složky komplexů PDH a BCKDH z několika druhů (Wexler et al. 1991, FEBS Letters, 282: 209 až 213). Zjistila se zajímavá skutečnost, že několik identifikovaných oblastí a a β podjednotek má vysoce konzervovaný charakter nejen ve všech až dosud popsaných PDH, nýbrž i v jak prokaryontních, tak eukaryontních komplexech BCKDH.

V tomto textu se popisuje klonování rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázových genů ze Streptomyces avermitilis. Tyto nové geny byly klonovány za použití kombinace dvou technik molekulární genetiky, tj. řetězové reakce katalyzované DNA polymerázou (PCR) a zkoušení homologie próbami (zkušebními látkami), tj. próbováním homologie (homology probing). Próbování homologie zahrnuje screening cDNA nebo genomových knihoven pomocí radioaktivně značených syntetických oligonukleotidových prób odpovídajících aminokyselinovým sekvencím proteinu. Tato technika má však svá omezení, z nichž jedním je dost přísně omezená, pokud se týče degenerace oligonukleotidu, kterého lze použít. Screeningová hybridizace se kromě toho provádí za podmínek nízké stringence, takže počet falešných pozitivních výsledků je často vysoký. Pro překonání některých z těchto omezení hybridizace oligonukleotidu bylo nedávno vyvinuto variantní próbování homologie, které zahrnuje řetězovou reakcí sDNA polymerázou (PCR) a které umožňuje použít jako prób vysoce degenerovaných nukleotidů. Tato metoda vyžaduje pouze znalost aminokyselinové sekvence dvou krátkých oblastí (přibližně v délce 7 až 10 aminokyselin) v kódovaném proteinu. Jako primerů se při této reakci používá dvou oligonukleotidů odpovídajících těmto peptidovým sekvencím. Každého primerů se může použít ve formě směsi úplně degenerovaných oligonukleotidů obsahující všechny možné kodonové kombinace, které by mohly kódovat známé aminokyselinové sekvence. Jako templátu pro amplifikaci se může použít kteréhokoliv z několika zdrojů DNA, včetně genomové DNA a superhelixových forem plazmidových knihoven. Několik zpráv, které byly nedávno publikovány v literatuře, ukazuje užitečnost kombinace řetězové reakce katalyzované polymerázou s próbováním homologie pro identifikaci genu z několika druhů.

Technické termíny, kterých se používá v tomto popisu, jsou dobře známy odborníkům v oboru molekulární genetiky. Definice těchto termínů je možno nalézt v mnoha učebnicích a příručkách, které se věnují molekulární biologii, jako je „Genes“, II. vydání, dr. Benjamin Lewin, 1985, John Wiley & Sons, lne. New York, USA. Definice termínů, kterých se v tomto popisu často používá, jsou uvedeny dále.

Pod označením „antibiotikum“ se rozumí chemické činidlo inhibující růst bakteriálních buněk. Antibiotik se používá pro selekci rekombinantních bakteriálních buněk.

Pod označením „gen rezistence vůči antibiotiku“ se rozumí sekvence DNA, která po zavedení do hostitelské buňky, jež je přirozeně sensitivní vůči určitému antibiotiku, uděluje buňce rezistenci vůči tomuto antibiotiku. Tento gen bývá také označován názvem „antibiotický markér“.

Pod označením „bakteriofágy“ se rozumějí viry infikující bakterie.

Pod označením „cRNA' se rozumí jednořetězcová RNA, která je komplementární vůči DNA a je z ní syntetizována transkripcí in vitro.

Pod označením „chromozom“ se rozumí oddělená jednotka genomu nesoucí mnoho genů.

-5CZ 289866 B6

Pod označením „klon“ se rozumí velký počet buněk nebo molekul, které jsou identické sjedním předkem.

Pod pojmem „klonovací vektor“ se rozumí jakýkoliv plazmid, do kterého je možno vložit cizí DNA, jež má být klonována. Klonovací vektor vnáší při transformaci cizí DNA do hostitelské bakteriální buňky.

Pod označením „CoA“ se rozumí koenzym A.

Pod označením „kohezní (lepivá) koncová sekvence“ (Cos) se rozumí sekvence DNA pocházející z bakteriofágu lambda a umožňující sbalování in vitro.

Pod označením „kozmid“ se rozumí plazmid, do něhož byla vložena bakteriofágová lambda cos místa. V důsledku toho může dojít ke sbalení plazmidové DNA (nesoucí cizí inzerty DNA) in vitro ve fágovém povlaku.

Pod označením „Dalton“ se rozumí jednotka hmotnosti, které se obvykle používá ve spojení s rozměry molekul. Tato jednotka odpovídá hmotnosti jednoho atomu vodíku.

Pod označením „ligace DNA“ se rozumí tvorba chemické vazby spojující dva fragmenty DNA.

Pod označením „eukaryontní buňky“ se rozumějí buňky vyšších organismů, které obsahují jádro obklopené membránou.

Pod označením „shluk genů“ (gene cluster) se rozumí skupina genů, které se v chromozomu nacházejí ve fyzické blízkosti.

Pod označením „genom“ se rozumí celý soubor chromozomů, tj. celý soubor všech genů jednotlivce.

Pod označením „hybridizace“ nebo „hybridizace kolonií“ se rozumí technika, které se používá pro identifikaci bakteriálních kolonií nesoucích chimérické vektory, jejichž vložená DNA se podobá určité konkrétní sekvenci.

Pod zkratkou „kb“ se rozumí tisíc bázových párů DNA nebo RNA.

Pod označením „NADH“ se rozumí redukovaný nikotin-amid-adeninový dinukleotid.

Pod označením „linker“ se rozumí krátký syntetický duplexní oligodeoxynukleotid obsahující cílové místo pro jeden nebo více restrikčních enzymů. Zavádí se do vektoru pro vytvoření nového polylinkeru nebo několikanásobného klonovacího místa (MCS).

Pod označením „nukleotid“ se rozumí stavební kámen, či monomemí jednotka, nukleových kyselin.

Pod označením „oligonukleotid“ se rozumí krátký řetězec nukleotidů.

Pod označením „operon“ se rozumí úplná jednotka exprese a regulace bakteriálního genu zahrnující strukturní geny, regulátorové geny a kontrolní prvky v DNA rozpoznatelné produktem nebo produkty regulátorového genu.

Pod označením „plazmid“ se rozumí autonomní extrachromozomální kružnicová DNA, která se sama replikuje.

-6CZ 289866 B6

Pod označením „počet plazmidových kopií“ se rozumí počet plazmidových molekul udržovaných v bakterii pro každý hostitelský chromozom.

Pod označením „primer“ se rozumí krátká sekvence DNA nebo RNA, která vytvoří pár s jedním řetězcem DNA a dodá volný 3’-OH konec, na němž může DNA polymeráza zahájit syntézu deoxyribonukleotidového řetězce.

Pod označením „prokaryontní buňka“ se rozumí malá, poměrně jednoduchá buňka. Většina mikroorganismů zahrnuje tyto buňky.

Pod označením „promotor“ se rozumí oblast DNA, která je zodpovědná za iniciaci nebo transkripci.

Pod označením „restrikční enzym“ se rozumí enzym, který je schopen rozpoznat a rozštěpit specifickou krátkou sekvenci DNA.

Pod označením „sekvence rozpoznávání a restrikce“ se rozumí sekvence DNA, která je specificky rozpoznána určitým restrikčním enzymem. Rovněž se označuje názvem „cílové místo.

Pod označením „vektor shuttle“ se rozumí bifunkční klonovací vektor, který je schopen se replikovat v jednom nebo více alternativních hostitelích (například E. coli a Streptomyces).

Pod označením „Southem Blotting“ se rozumí postup spočívající v přenesení denaturované DNA z agarozového gelu na nitrocelulozový filtr, kde může být hybridizována s komplementární nukleokyselinovou próbou.

Pod označením „subklonování“ se rozumí přenášení klonovaných fragmentů DNA z jednoho typu vektoru do jiného, například z rekombinantního kozmidu do plazmidu. Nový rekombinantní plazmid se potom transformuje do vhodné hostitelské buňky za vzniku subklonového kmene.

Pod označením „transkripce“ se rozumí syntéza RNA z templátové DNA.

Pod označením „transformace bakteriálních buněk“ se rozumí získání nových genetických markérů zavedením přídavné DNA.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob výroby přírodního avermektinu, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, v němž byl zvýšen počet kopií genů kódujících komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázy nebo zvýšena jejich exprese manipulaci nebo nahrazením genů zodpovědných za regulaci této exprese.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna nukleotidová sekvence primerů pro řetězovou reakci katalyzovanou polymerázou (PCR) použitých pro klonování fragmentu genu S. avermitilis El-α BCKDH. Dedukovaná aminokyselinová sekvence kódovaná každým oligodeoxynukleotidem je znázorněna nad odpovídající sekvencí DNA. Šipky ukazují směs amplifikace. Na obr. IA je znázorněn pravosměmý primer a na obr. 1B levosměmý primer.

-7CZ 289866 B6

Na obr. 2 je uvedeno porovnání sekvencí rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázy. Do vzájemného zákrytu jsou zde vyrovnány dedukované aminokyselinové sekvence PCR-klonovaného genomového fragmentu CD503 pro Streptomyces avermitilis (Sa), Bacillus stearothermophilus (Bs), Pseudomonas putida (Pp) a Homo sapiens (Hs). Vertikální značky označují totožnost aminokyselin. Umístění sekvencí odpovídajících pravosměmému alevosměmému PCR primeru použitému pro klonování je označeno nahoře nalevo a napravo.

Na obr. 3 je znázorněna genomová restrikční mapa, umístění genového shluku Streptomyces avermitilis bkd a subklony pro tento shluk. Černé obdélníčky pod mapou označují umístění a orientaci počátečního ΕΙ-α-specifického genomového fragmentu CD503 z S. avermitilis klonovaného za použití PCR. Jsou zde označeny genomové subklony (deriváty pGEM-3Z). Také je zde uvedeno umístění a organizace strukturních genů bkd kódujících podjednotky El-α (Ela), El-β (Elb) a E2 BCKDH. Polarita identifikovaných otevřených čtecích rámců (označených obdélníčky) je zleva doprava. Používá se těchto zkratek: B = BamHI, E = EcoRI, K = KpnI, Bg = BglII a S = SphI.

Na obr. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E a 4F jsou uvedeny nukleotidové sekvence a dedukované translační produkty 2 728bp genomového DNA fragmentu z S. avermitilis obsahující otevřené čtecí rámce (ORF) El-a, El-β a E2 (zčásti) bkd. El-α ORF leží od polohy 403 do polohy 1548 této sekvence, El-β ORF leží od polohy 1622 do polohy 2626 a E3 ORF začíná v poloze 2626. Nukleotidy jsou číslovány nad řádky sekvence. Stop kodony jsou označeny hvězdičkou. Pravděpodobné Shine-Dalgamovy ribozomální vazebné sekvence jsou podtrženy. Sekvence rozpoznávané a štěpené restrikčním enzymem BamHI jsou orámovány.

Na obr. 5 je uvedena nukleotidové sekvence a dedukované translační produkty 0,8kb BglII-Sphl genomového DNA fragmentu z S. avermitilis (pCD539) obsahujícího část E2 bkd ORF. 251 bp bylo podrobeno sekvenaci, počínaje od místa BglII (je orámováno). Nukleotidy jsou číslovány nad řádky sekvence.

Na obr. 6 je znázorněná nukleotidové sekvence PCR mutagenního (pravosměmého) a univerzálního (levosměmého) primeru použitého pro konstrukci pT7 derivátů pro heterologní expresi genů z S. avermitilis bkd v E. coli. PCR primérů bylo použito pro zavedení restrikčního místa Ndel v místě translačního start kodonu otevřeného čtecího rámce El-α nebo El-β S. avermitilis bkd (dvojice primérů 55:31 a 56 : 30). Dedukovaná aminokyselinová sekvence kódovaná každým mutagenním oligodeoxynukleotidem je uvedena nad odpovídající sekvencí DNA. Jsou zde také uvedeny restrikční a rozpoznatelné sekvence. Šipkami je znázorněn směr amplifikace. Na obr. 6A jsou znázorněny pravosměmé mutagenní primeiy a na obr. 6B levosměmé mutagenní primery.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Nové postupy klonování genů S. avermitilis bkd stanovení primární struktury genů kódujících multienzymový komplex S. avermitilis BCKDH jsou popsány dále.

Nejprve se zkonstruují dva PCR primery označené názvy „pravosměmý“ a „levosměmý“ (viz obr. 1) nad konzervovanými oblastmi identifikovanými ze seřazení několika dedukovaných sekvencí El-α BCKDH peptidů z různých druhů a dostupných z literatury. PCR produkt o délce přibližně 0,2 kb se deteguje amplifikaci genomové DNA z S. avermitilis za použití jak pravosměmého, tak levosměmého primem. PCR-amplifikovaný fragment DNA se potom klonuje do E. coli vektoru pGEM-3Z za vzniku rekombinantního plazmidu pCD503. Potom se plazmid pCD503 transformuje do E. coli DH5-a kompetentních buněk. Jeden z transformantů se označí jako kmen CD503. Sekvenování DNA klonovaného fragmentu DNA CD503 ukazuje existenci otevřeného čtecího rámce s dedukovaným peptidem, který je vysoce homologický vzhledem kEl-α BCKDH podjednotce (viz obr. 2). Klonovaného fragmentu genomové DNA

-8CZ 289866 B6

CD503 se potom použije jako próby pro screening chromozómové knihovny S. avermitilis hybridizací kolonií. Jsou identifikovány čtyři kozmidové klony, totiž CD518, CD519, CD520 aCD521. Restrikční analýza a analýza Southem Blot ukazuje, že tyto čtyři klony nesou překrývající se genomové fragmenty. DNA sekvenování hnízdových delecí ze subklonovaných genomových DNA fragmentů (jak je to podrobně vysvětleno v příkladu 8) ukazují, že sekvence CD503 je součástí úplného shluku genů bkd. Klonované geny S. avermitilis bkd zahrnují oblast chromozomu o délce přibližně 15 kb (viz obr. 3). Analýza sekvence DNA ukazuje přítomnost pravděpodobných transkripčních promotorových sekvencí a strukturních genů BKD uspořádaných do shluku, který je organizován následujícím způsobem: promotorová sekvence, ORF El-α, ORF El-β a ORF E2 (viz obr. 4 a 5).

Konečně se úplný shluk genů S. avermitilis bkd klonuje za silný promotor T7 z Escherichia coli pro expresi v hostiteli E. coli. Podobně se také klonují otevřené čtecí rámce pro El-α a El-β, a to buď odděleně nebo dohromady za promotor T7 a každý ze získaných konstruktů se zkouší na expresi. Nové PCR mutagenní primery použité pro zavedení jediného restrikčního místa Ndel na ATG translačním startu ORF El-α a ORF El-β jsou podrobně popsány v příkladu 9 (viz též obr. 6). Studie s duálním plazmidovým T7 expresním systémem ukazuje, že alespoň dva otevřené čtecí rámce shluku genů (El-α a El-β) z S. avermitilis bkd CD503 jsou plně přeložitelné při expresi v E. coli. Kromě toho enzymatická stanovení zaměřená na specifickou analýzu složky El komplexu BCKDH jednoznačně potvrzují, že dva z rekombinantních klonů E. coli (jeden, který nese celý shluk genů bkd, a druhý, který nese společně otevřený čtecí rámec El-α a El-β) obsahují BCKDH-specifíckou enzymatickou aktivitu (viz tabulka 1).

V tomto popisu se uvádí izolace genů bkd z producentu avermektinu, kterým je Streptomyces avermitilis. Genom streptomyces je rozměrný (asi 10⁴ kb), což je více než dvojnásobek ve srovnání s genomem Escherichia coli. Genom streptomycetes se skládá z DNA s velmi vysokým celkovým obsahem guanosinu a cytosinu (G + C), který činí v průběhu až 73 % a v některých oblastech více než 90 %, což je hodnota blížící se horní mezi pozorované v přírodě. Tyto výrazné charakteristiky vyžadují vývoj rekombinantní DNA techniky specificky přizpůsobené streptomycetes. Příklady takového úsilí je možno nalézt v patentové přihlášce USA s pořadovým číslem 08/048719, podané 16. dubna 1993 a v patentové přihlášce USA s pořadovým číslem 08/032925 podané 18. března 1993. Uvedené přihlášky jsou zde citovány náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Jiné techniky, které jsou specificky optimalizovány pro účely tohoto vynálezu, jako je PCR, amplifíkace genomové DNA, tvorba hnízdových delecí, sekvenování DNA a heterologická exprese genů S. avermitilis bkd v E. coli, jsou podrobně popsány v příkladové části tohoto popisu.

Úplný popis experimentálních stupňů prováděných při klonování genů S. avermitilis bkd a dosažené výsledky jsou uvedeny dále:

(a) Identifikace konzervovaných oblastí v podjednotce peptidů El-a BCKDH, které by mohly sloužit jako potenciální místa pro navázání PCR primerů

Čtyři peptidové sekvence El-a. BCKDH, tj. z člověka (Fisher et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 3448-3453), krysy (Zhang et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch et al., 1968, Eur. J. Biochem. 176: 311-317) a Bacillus stearothermophilus (Perham et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337-346), se seřadí do zákrytu, aby bylo možno identifikovat konzervované oblasti, které by mohly sloužit jako potenciální sekvence pro konstrukci odpovídajících PCR primerů. Počítačová analýza pro identifikaci oblastí podjednotky El-a, které jsou vysoce konzervovány jak v prokaryontních, tak eukaryontních komplexech BCKDH, se provádí za použití programů LineUp a Pretty z balíku programů pro analýzu GCG sekvence (Madison, WI, USA). Ze seřazení těchto čtyř El-α BCKDH peptidů je zřejmé, že existuje

-9CZ 289866 B6 několik oblastí s prodlouženou homologií. (Wexler I. D. et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209-213). Thiaminpyrofosfátový vazebný motiv (Perham et al., 1989, FEBS Letters, 255: 77-82) umístěný mezi humánními El-α aminokyselinami 182 až 229 a oblast zahrnující fosforylační místa 1 a 2 v rozmezí aminokyselin 245 až 288 jsou pozoruhodně konzervovány ve všech čtyřech analyzovaných peptidech El-α BCKDH. Také je zde přítomna již dříve popsaná oblast s vysokou homologií, která leží v rozmezí aminokyseliny 291 až 307. Tata oblast se zdá být jedinečnou pro α-ketokyselina dehydrogenázy, které obsahují jak α-, tak β-podjednotky a není homologická s žádnou sekvencí v E. coli PDC El nebo ve složkách El α-ketoglutarát dehydrogenázových komplexů E. coli a kvasinek, což jsou dimery, které se skládají pouze zjediného El polypeptidu. Z výše uvedených důvodů se předpokládá, že posledně uvedená oblast homologie bude hrát roli při interakci podjednotky (Patel et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209 až 213). Konzervované oblasti zvolené pro konstrukci PCR primem kódují aminokyselinové zbytky 192 až 200 a 370 až 376 humánního El-α BCKDH proteinu.

(b) Konstrukce nových oligonukleotidů vyrobených na konzervovaných oblastech El-a BCKDH, kterých mé být použito jako PCR primem

Jak již bylo uvedeno výše, při studii seřazení čtyř El-α BCKDH peptidových sekvencí se zvolí dvě konzervované oblasti. Pravosměmý PCR primer (obr. 1) se zkonstruuje na oblasti zahrnující aminokyseliny 192 až 200 z humánní El-α BCKDH podjednotky, které se použije jako reprezentativního modelu El-α BCKDH podjednotky. Tyto aminokyseliny jsou umístěny v thiaminpyrofosfátovém vazebném motivu. Levosměmý PCR primer (obr. 1) se zkonstruuje na oblasti zahrnující aminokyseliny 370 až 376 El-α BCKDH podjednotky. Posledně uvedená aminokyselinová sekvence je umístěna v blízkosti C-terminální oblasti peptidů. Používá se přiřazení kodonu genu Streptomyces (F. Wright a M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55 až 65). U 5’ konce každého primem je umístěna sekvence rozpoznávaná restrikčním enzymem (EcoRI u pravosměmého primem a Xbal u levosměmého primem), která usnadňuje klonování PCR produktů. Úplná sekvence pravosměmého PCR primem je

5’-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3’ a úplná sekvence levosměmého PCR primem je

5’-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3’.

Sekvence, které nejsou homologické vzhledem kEl-α bkd genům, zavedené do primem pro účely klonování jsou podtrženy (viz obr. 1).

(c) PCR amplifikace fragmentu genomové DNA S. avermitilis

Genomová DNA S. avermitilis se enzymaticky amplifikuje za reakčních podmínek vhodných pro DNA s vysokým obsahem GC, které umožňují účinnou a specifickou amplifikaci DNA ze streptomycetes (viz příklad 2). PCR se provádí za použití kombinace primerů popsané výše (pravosměmý primer: 5’-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3’ a levosměmý primer: 5’-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3’). Amplifikační produkty se frakcionují podle velikosti elektroforézou na agarozovém gelu. Za PCR podmínek popsaných výše a za použití výše uvedené kombinace primem se deteguje jediný pás DNA (o délce přibližně 250 bázových párů).

(d) Klonování amplifikovaného fragmentu genomové DNA do klonovacího vektom Escherichia coli a následující transformace do hostitele E. coli

Jak již bylo uvedeno výše, do pravosměmého PCR primem se pro usnadnění klonování zavede restrikční místo EcoRI, přičemž u 5’ konce levosměmého primem je přítomno restrikční místo

-10CZ 289866 B6

Xbal. Pokusy o klonování 0,25 kb PCR fragmentu za použití ligačního postupu, při němž se jak inzert, tak klonovací vektor štěpí EcoRI a Xbal, však nejsou úspěšné. Proto se pro klonování 0,25 kb PCR fragmentu pokusně použije alternativního postupu zahrnujícího použití fragmentu Klenow DNA polymerázy I za účelem vytvoření tupých konců ve fragmentu PCR. Po vložení fragmentu s tupými konci do Smal-linearizovaného E. coli vektoru s tupými konci (pGEM3Z[f+]) se izoluje jediný rekombinantní klon tvořený rekombinantním plazmidem pCD503. Plazmid pCD503 se potom transformací zavede do E. coli DH5-a-kompetentních buněk. Zvolený transformant se označí jako kmen CD503. Potvrzující restrikční analýza ukazuje, že plazmid pCD503 izolovaný z E. coli kmene CD503 skutečně obsahuje 0,25kb inzert z S. avermitilis.

(e) Subklonování 0,25kb PCR-amplifikovaného DNA inzertu do bakteriofágu M13, sekvenování DNA klonovaného fragmentu a identifikace bkd-specifíckých sekvencí

0,25kb inzert přítomný v plazmidu pCD503 se subklonuje do bakteriofágu M13. Při tom se nejprve inzert uvolní z E. coli vektoru štěpením pCD503 pomocí EcoRI a Pstl, tj. dvěma restrikčními enzymy, jimiž rozpoznatelné sekvence jsou přítomny v několikanásobném klonovacím místě vektoru pGEM na obou stranách klonovaného inzertu. Tento specifický fragment se potom klonuje do EcoRI a Pstl zpracovaných vektorů M13 mpl8 a mpl9. Klonování do obou vektorů zajišťuje možnost produkovat jednořetězcovou DNA obou řetězců inzertu DNA pro sekvenování. Jeden klon obsahující specifický inzert vybraný zmpl8 transfekčního experimentu se označí jako kmen CD505. Jiný klon, který také obsahuje specifický inzert, ale vybraný zmpl9 transfekčního experimentu, se označí jako CD506. Sekvenování DNA se provádí metodou zahrnující terminaci dideoxynukleotidových řetězců. Za použití jednořetězcového DNA templátu a soupravy TaqTrack kit (Promega) ve všech případech se sekvenují oba řetězce DNA, tj. jeden získaný z klonu CD505 a komplementární řetězec získaný z klonu CD506. Kodonová preferenční analýza (balík software programů GCG Sequence Analysis, Madison, WI, USA) sekvenečních dat získaných z klonů CD505 a CD506 ukazuje přítomnost otevřeného čtecího rámce vykazujícího správné použití v kodonu u genu streptomycetes.

Potom se pravděpodobný otevřený čtecí rámec přeloží do aminokyselinové sekvence za použití programů Seq and Translate, IntelliGenetics Suitě software (IntelliGenetics lne. Mountain View, Califomia, USA). Nakonec se provede zjišťování podobnosti zkoumané peptidové sekvence pomocí databanky a programu FASTDB ze software IntelliGenetics. Všechny rešerše v databance, ať již se prohledávají databanky DNA (GenBank a EMBL) nebo proteinové databanky Swiss-Prot), neomylně ukazují, že sekvence získaná z klonu CD503 je vysoce homologická, ale nová a odlišná od všech ostatních El-α BCKDH peptidů uvedených v těchto databankách, ať již se jedná o peptidy prokaryontního nebo eukaryontního původu. Na obr. 2 jsou do vzájemného zákrytu vyrovnány El-α BCKDH peptidové sekvence z člověka, krysy, Pseudomonas putida a Bacillus stearothermophilus, a je zde znázorněna nová peptidová sekvence Streptomyces avermitilis El-α BCKDH CD503. Z výše uvedených dat je možno učinit závěr, že 250 bp genomový PCR produkt z S. avermitilis klonovaný v E. coli kmene CD503 skutečně představuje nový El-a bkd genový fragment.

(f) Klonování úplného genového shluku z S. avermitilis bkd, restrikce a analýza Southem Blot a konstrukce chromozomové mapy

Přibližně 0,25 kb dlouhý BamHI/EcoRI DNA fragment z pCD503 nesoucí El-α bkd specifickou sekvenci DNA z S. avermitilis se použije jako radioaktivně značené próby pro screening genomové kozmidové knihovny S. avermitilis prostřednictvím hybridizace kolonií. Jsou identifikovány a získány čtyři klony (CD518, CD519, CD520 a CD521). Analýza restrikcí ahybridizací Southem Blot ukazuje, že tyto čtyři klony obsahují překrývající se sekvence pocházející ze stejné chromozomové oblasti. Stejné próby se použije za podmínek vysoké stringence proti Southem blotům štěpené chromozomové DNA z S. avermitilis ATCC 31272.

-11 CZ 289866 B6

Posledně uvedená analýza potvrzuje totožnost těchto klonů získaných zgenomové knihovny. Restrikční mapa genomové oblasti obsahující sekvenci S. avermitilis CD503 je znázorněna na obr. 3.

(g) Subklonování genomových DNA fragmentů získaných z klonů CD518 a CD521 a sekvenování DNA z chromozomální oblasti z S. avermitilis nesoucí bkd genový shluk

Genomové fragmenty (o délce 1 až 2 kb) pokrývající celou oblast CD503 bkd chromozomu S. avermitilis se subklonují z klonů CD521 a CD518 z DNA knihovny do E. coli vektoru pGEM-3Z. Seznam subklonů zkonstruovaných během této práce zahrnuje následující krátký popis každého plazmidu: 1. plazmid pCD528 obsahuje 7kb BamHI fragment subklonovaný zpCD518; 2. plazmid pCD545 obsahuje 2,3kb Sphl fragment subklonovaný zpCD528; plazmid pCD550 obsahuje 6kb Sphl fragment subklonovaný z pCD521; 4. plazmid pCD559 obsahuje 7kb BamHI fragment subklonovaný zpCD521; 5. plazmid pCD574 obsahuje 4,2kb SphI/BglII fragment subklonovaný z pCD550; a plazmid pCD577 obsahuje přibližně 10,4kb inzert. Tento inzert obsahuje dva znovu spojené sousední genomové fragmenty: 4,2kb SphI/BglII fragment subklonovaný zpCD550 a 6,2kb BglII/BamHi fragment subklonovaný zpCD559. Totožnost každého subklonu se potvrdí pomocí restrikčního mapování, hybridizace Southem a analýzy PCR plazmidu. Pro stanovení nukleotidové sekvence se použije Sangerovy metody terminace řetězců. K tomuto účelu se genomové fragmenty avermitilis subklonují do bakteriofágů M13mpl8 aM13mpl9 za účelem stanovení sekvence obou řetězců DNA. Z pGEM-odvozených klonů uvedených výše se izoluje několik DNA restrikčních fragmentů a ty se ligují do M13mpl8 a M13mpl9, za vzniku následujících rekombinantních fágů:

CD535: 0,40kb S. avermitilis DNA fragment klonovaný PCR za použití pCD528 DNA jako templátu, specifického primerů 20-PCR-EX(5’-aaGAATTCTCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCGGCTAC-3’) a univerzálního primerů 31-PCR-BP (viz příklad 9 a obr. 6). Amplifikovaný fragment se štěpí EcoRI a Pstl a klonuje do EcoRI/Pstl linearizované M13mpl8 DNA.

CD536: podobný DNA fragment, jaký je popsán výše, klonovaný do M13mpl9 DNA.

CD537: l,15kb Sáli DNA fragment nesoucí sekvenci CD503 subklonovanou zpCD528 do M13mpl8.

CD538: 1,15kb Sáli pCD528 DNA fragment (umístěný před 1,15kb Sáli fragmentem popsaným výše) klonovaný do M13mpl8.

CD539: 1,5kb BamHI/BglII DNA fragment subklonovaný z pCD550 do M13mpl8.

CD540: podobný DNA fragment, jaký je popsán výše, ale klonovaný do M13mpl8 s opačnou orientací.

CD541: 0,35kb SalI/BamHI DNA fragment subklonovaný z pCD528 do M13mpl8.

CD542: 0,35kb SalI/BamHI DNA fragment subklonovaný z pCD528 do M13mpl9.

CD553: 0,8kb BamHI/BglII DNA fragment subklonovaný z pCD55O do M13mpl8.

CD554: 1,1 kb BamHI DNA fragment subklonovaný z pCE550 do M13mpl8.

CD555: podobný DNA fragment, jako je fragment popsaný výše, ale klonovaný do M13mpl8 s opačnou orientací.

CD558: 0,8kb BamHI/HindlII DNA fragment subklonovaný z pCD553 do M13mpl9.

- 12CZ 289866 B6

CD561: 1,15 kb Sáli DNA fragment subklonovaný z pCD537 do M13mpl8 (opačná orientace ve srovnání s orientací přítomnou v konstruktu CD537).

CD565: 1,15kb Sáli DNA fragment subklonovaný z pCD537 do M13mpl9.

CD566: 1,15kb Sáli DNA fragment subklonovaný z pCD537 do M13mpl9 (opačná orientace než je přítomna v konstruktu CD565).

CD567: 1,15kb Sall DNA fragment subklonovaný z pCD538 do M13mpl9.

CD582: 0,8kb BamHI/BglII DNA fragment subklonovaný zpCD550 do M13mpl8 (opačná orientace než je přítomna v konstruktu CD553).

Genomové inzerty S. avermitilis nesené těmito klony se potom zkrátí působením enzymu Exonuclease III za vzniku série subklonů („hnízdové delece“, viz příklad 8).

(h) Počítačová analýza dat ze sekvenování DNA získaných při analýze klonovaných fragmentů DNA a identifikace otevřených čtecích rámců S. avermitilis El-a, El-β a E2 bkd

Nukleotidová sekvence 2,7kb genomové oblasti S. avermitilis obsahující geny bkd je znázorněna na obr. 4. Klouzavá analýza složení (sliding base composition analysis) 2,7kb genomové oblasti obsahující otevřené čtecí rámce (ORF) S. avermitilis El-a, El-β a E2 (zčásti) bkd se provede použití software „DNA Inspector“. Tato analýza poskytuje profil zahrnující běžný průměrný obsah (running average) G+C za použití protažené délky (stretch length) 30 bází a přesahové hodnoty (offset value) 20. Celkový obsah G+C odpovídající této oblasti chromozomu S. avermitilis je 72 %. Nízká sedlová hodnota „valley“ G+C (obsah G+C asi 50 %) indikativní pro promotorovou oblast leží bezprostředně před otevřenými čtecími rámci bkd.

Také se analyzuje obsah G+C v závislosti na poloze kodonu. Otevřené čtecí rámce se detegují za použití programu „CodonPreference“ (Genetics Computer Group, Madison, WI, USA) a za použití tabulky „Streptomyces codon usage“ pro 64 genů (F. Wright a M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55 až 65). Program CodonPreference je rámcově specifický hledač genů, který se snaží rozpoznat kódující sekvence proteinu na základě jejich podobnosti s tabulkou kodonových frekvencí nebo na základě kompoziční tendence (obvykle GC) ve 3. poloze každého kodonu. Otevřené čtecí rámce jsou znázorněny jako čtverečky pod grafem příslušných čtecích rámců. Také se detegují všechny start kodony (ATC) a stop kodony (vertikální čárky). Pod každým grafem ORF jsou také označeny vzácné kodony nalezené v každém otevřeném čtecím rámci. Obsah G+C se vypočítá za použití klouzavého okénka (sliding window) 25 kodonů, takže se očekává interval (lag) asi 25 kodonů před kódující oblastí proteinu. Získají se následující tři profily: 1. první poloha v tripletu; 2. druhá poloha v tripletu a 3. třetí poloha v tripletu. Na základě této analýzy se lokalizují tři otevřené čtecí rámce bkd, které odpovídají následujícím podjednotkám BCKDH: El-a, El-β, E2 (obr. 4 a 5).

(i) Konstrukce nových oligonukleotidů pro použití jako primerů při místně orientované mutagenezi na bázi PCR

Pro zavedení restrikčního místa NDE1 v počátečním místě translace (ATG) otevřeného čtecího rámce El-a a El-β se použije místně orientované mutageneze na bázi linkerové nebo PCR techniky. Zkonstruují se následující nové oligonukleotidy (viz příklad 9 a obr. 6):

Levosměmé univerzální (vektorové) primery:

30- PCR-BP: 5’-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3 ’

31- PCR-BP: 5’-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3’

-13CZ 289866 B6

Pravosměmé mutagenní příměry:

55- PCR: 5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3 ’

56- PCR: 5-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3’ (j) Místně orientovaná mutageneze genů S. avermitilis bkd účelem vytvoření nového restrikčního místa NDEI před otevřeným čtecím rámcem

Jako expresních plazmidů se použije derivátů plazmidu pt7—7 (viz S. Tábor, 1990, Current Protocols in Molecular Biology str: 16.2.1 až 16.2.11, Greene Publishing and WileyInterscience, New York) nesoucích otevřené čtecí rámce El-α, El—β nebo El-a + El-β nebo úplný shluk genů S. avermitilis bkd. Restrikční místa Ndel se vytvoří místně orientovanou mutagenezí na bázi PCR. Pro tuto studii se zkonstruuje následujících pět expresních plazmidů:

Plazmid pCD670: derivát pt7-7 nesoucí otevřený čtecí rámec S. avermitilis El-α bkd (ORF1), Do genu S. avermitilis El-α bkd se zavede restrikční místo Ndel u start kodonu ATG amplifikací a současnou mutagenezí za použití PCR mutagenního primerů 55-PCR (viz příklad 9 a obr. 6).

Plazmid pCD666: derivát pt7-7 nesoucí otevřený čtecí rámec S. avermitilis El-β bkd (ORF2). Do genu S. avermitilis El-β bkd se zavede restrikční místo Ndel u start kodonu ATG amplifikací a současnou mutagenezí za použití PCR mutagenního primerů 56-PCR (viz příklad 9 a obr. 6), pro dosažení optimální exprese tohoto otevřeného čtecího rámce se třetí poloha kodonu 7 změní z C na G za vzniku synonymního kodonu podobajícího se kodonu použitému v E. coli. Sekvence peptidu El-β není touto změnou ovlivněna.

Plazmid pCD736: derivát pt7-7 nesoucí společně jak otevřený čtecí rámec El-α (ORF 1), tak El-β (ORF 2), kteréžto ORF jsou pod kontrolou T7-promotoru.

Plazmid pCD705: tento plazmid se podobá plazmidu pCD736, ale obsahuje 3’ polovinu otevřeného čtecího rámce El-β ve špatné orientaci. Tohoto konstruktu se používá jako negativní kontroly při experimentální expresi.

Plazmid pCD785: derivát pt7-7 nesoucí úplný shluk genů S. avermitilis bkd.

(k) Exprese otevřených čtecích rámců S. avermitilis bkd v E. coli za použití duálního plazmidového expresního systému T7

Exprese genů S. avermitilis bkd v E. coli se provede za použití duálního plazmidového systému T7 RNA polymeráza/promotor v podstatě, jak je popsán v S. Tábor, 1990 v Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1 až 16.2.11, Greene publishing and Wiley-Interscience, New York, USA. Analyzují se deriváty E. coli C600 (pGP-1) obsahující odlišné konstrukce pT7-7. Pro monitorování exprese otevřených čtecích rámců z S. avermitilis v hostiteli E. coli po tepelné indukci se použije elektroforézy na polyakrylamidovém gelu za použití natriumdodecylsulfátu (SDS-PAGE). Analýza metodou SDS-PAGE proteinového profilu po indukci vykazuje nadexpresi indukovaných peptidů, které mají velikost podobnou předvídané hodnotě (na základě dedukce z odpovídající sekvence DNA) pro otevřený čtecí rámec El-α a El-β:

Předvídaná velikost (Pa)

Pozorovaná velikost

ORF1 (El-a)

ORF2 (El-β)

000

000 (Pa)

000

000

- 14CZ 289866 B6 (1) Detekce aktivity El S. avermitilis BCKDH pomocí specifického stanovení v surovém extraktu rekombinantního klonu E. coli

Výsledky (příklad 11) jsou sumarizovány v tabulce I. El-specifická stanovení BCKDH prováděná na surových extraktech buněk B. coli nesoucích pCD736 vykazují významnou El-aktivitu po indukci promotoru T7. Podobná kultura nesoucí konstrukt, v němž je část inzertu umístěna ve špatné orientaci (pCD705) vykazuje aktivitu, jejíž úroveň odpovídá pozadí.

Kromě toho enzymatická stanovení ukazují, že surové extrakty z kmene E. coli obsahujícího plazmid pCD685 také vykazují významnou aktivitu El BCKDH (více než desetinásobnou, vzhledem k úrovni pozadí). Analyzuje se také neindukovaná kultura tohoto klonu, a zjistí se, že základní úroveň aktivity je o dvojnásobek hodnoty pozadí vyšší než hodnota pozadí. Tento výsledek je očekáván, poněvadž o systému T7 je známo, že umožňuje nízkou konstitutivní expresi klonovaných genů i za neindukovaných podmínek.

Klonovaný shluk genů Streptomyces avermitilis bkd je užitečný při zlepšování přirozené produkce avermektinu prostřednictvím zvýšení počtu kopií těchto genů nebo optimalizace jejich exprese v produkčních kmenech. Jeden z možných přístupů pro dosažení účinné exprese klonovaných genů bkd zahrnuje vložení těchto genů do mnohakopiového E. coli/ streptomycetes shuttle vektoru (například plazmidů pCD262, Denoya C. D., 1993, „Novel Bacterial Plazmids Shuttle Vectors for Streptomycetes and Escherichia coli“ US patentová přihláška č. 08/032,925, podaná 10. března 1993) tak, že jsou geny transkribovány ze silného promotoru. Tento postup zajišťuje účinnou transkripci genů. Kromě toho lze navrhnout určité strategie zaručující účinnou expresí. Tyto strategie zahrnují následující faktory: a) sílu promotoru, b) stabilitu mRNA, c) přítomnost nebo nepřítomnost regulačních faktorů, d) indukovatelnost a e) místně orientovanou mutagenezi pro zlepšení rozpoznání ribozomu a translace signálů iniciace. Expresi genů bkd by také bylo možno optimalizovat nahrazením promotoru divokého typu a regulačních oblastí odlišnými promotory za použití technik výměny genů. V literatuře je uvedeno mnoho příkladů užitečných promotorů, kterých by bylo možno použít pro optimalizaci exprese nových genů S. avermitilis bkd popsaných v tomto textu, například silný ermE promotor (Hopwood et al., 1985, „Genetic Manipulation Streptomyces: A Laboratory Manual“, The John Innes Foundation, Norwich, Velká Británie) a thiostreptonem indukovatelný tipA promotor (Murakami et al., 1939, J. Bacteriol, 171, 1459-1466). Kromě toho inaktivací bkd genů s průvodní absencí aktivity BCKDH, které se dosahuje vypuštěním místně orientované mutageneze za použití technik výměny genů, se vyvinou zlepšené nevratné blokované kmeny Streptomyces avermitilis bkd, které jsou užitečné při produkci nových avermektinů.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady představují podrobné příklady experimentálních postupů použitých pro klonování a analýzu genů bkd z S. avermitilis, které jsou rovněž ilustrovány v přiložených výkresech. Přídavné podrobnosti standardních technik, které jsou dobře známy odborníkům v oboru molekulární biologie a označování specifických enzymů je například popsáno v laboratorní příručce „Molecular Cloning, Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

-15CZ 289866 B6

Příklad 1

Příprava genomové DNA z S. avermitilis

Mycelium S. avermitilis ATCC 31272 se napěstuje v podobě konfluentního porostu na agarovém médiu YPD-2 v průběhu 7 dnů při 29 °C. Toto médium obsahuje:

kvasinkový extrakt Difco baktopepton Difco dextrózu baktoagar Difco octan sodný MOPS g

g

5g 20 g

2g g

hodnota pH přizpůsobena na 7,0 konečný objem: 1 litr médium zpracováno v autoklávu 25 minut při 121 °C

Narostlého mycélia se potom použije pro inokulaci 30 ml média AS-7 (viz Hafner et al., 1988, evropská patentová přihláška č. 88300353.5, publikační číslo 0 284 176) ve 300ml baňce s narážkami, která se třepe (230 min^-1) při 29 °C po dobu 24 hodin. Toto médium obsahuje:

modifikovaný škrob¹ 20 g

Ardamin pH²

Pharmamedia³ uhličitan vápenatý (CaCO₃)

5g g

2g pH nastaveno hydroxidem sodným na 7,2 konečný objem: 1 litr médium zpracováno v autoklávu 25 minut při 121 °C ¹ vyrobí se hydrolýzou škrobu působením a-amylázy z Bacillus licheniformis do dextrózového ekvivalentu přibližně 40 %, ² od firmy Yeast Products lne., Clifton, NJ 07012, USA, ³ od firmy Traders Protein, Memphis, TN 38108, USA.

Přibližně 0,3 ml výše uvedené kultury se použije pro inokulaci další 300ml baňky s narážkami s obsahem 30 ml modifikovaného kapalného média s kvasinkovým a sladovým extraktem (Yeast Extract Malt Extract (YEME) medium) (Bibb, M. J., Freeman, R. F. a D. A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154: 155-166). Modifikované médium YEME obsahuje v 1 litru kvasinkový extrakt Difco 3g baktopepton Difco 5g sladový extrakt Oxoid 3g sacharóza 300g glukóza 10g

Médium se 40 minut zpracovává v autoklávu při 121 °C a potom se k němu přidají 2 ml 2,5M roztoku hexahydrátu chloridu hořečnatého a výsledný objem se nastaví na 1 litr.

Kultury se nechají růst 48 až 72 hodin při 29 °C. Mycelium se oddělí centrifugám' a genomová DNA se připraví podle protokolu „Isolation of Streptomyces Total DNA by Cesium Chloride Gradient Centrifugation: Proceduře 2“ uvedeného v příručce „Genetic Manipulation of Streptomyces, A. Laboratoiy Manual“, The John Innes Foundation, Norwich, Velká Británie,

-16CZ 289866 B6

1985, autoři Dr. D. A. Hopwood et al. Pelety DNA se resuspendují ve 3 ml pufru TE (lOmM tris-HCl, pH 8,0, lmM EDTA).

Příklad 2

Amplifikace genomové DNA z S. avermitilis řetězovou reakcí za použití polymerázy

Genomová DNA z S. avermitilis se enzymaticky amplifíkuje za použití tepelného cyklovače Perkin-Elmer Cetus. Reakce PCR se provádí za použití polymerázy Taq (Perkin-Elmer Cetus) a pufru dodaného výrobcem za přítomnosti 200 μΜ dNTP, 15% glycerolu, 0,5 μΜ každého z primeru, 50 ng templátové DNA (v tomto případě genomové DNA z S. avermitilis) a 2,5 jednotky enzymu v konečném objemu 100 μΐ v celkem 30 cyklech. Tepelný profil prvního cykluje následující: 95 °C po dobu 3 minut (denaturační stupeň), 55 °C po dobu 2 minut (stupeň tepelné hybridizace) a 72 °C po dobu 2 minut (prodlužovací stupeň). Následujících 29 cyklů má podobný tepelný profil, pouze stím rozdílem, že denaturační stupeň je zkrácen na 1,5 minuty. DNA primery jsou dodány od firmy Genosys Biotechnologies lne. (Texas, USA). Pravosměmý primer (viz obr. 1) má sekvenci ’-GAATTCGGCGACGGCGCC ACCTCCGAGGGCGAC-3 ’ a úplná sekvence levosměmého PCR primerů (obr. 1) je ’-TCTAGACCGC AGGTGGTCCGGCATCTC-3 ’.

Amplifikační produkty se frakcionují podle velikosti elektroforézou na agarozovém gelu. Vzorek PCR se zpracovává elektroforézou na horizontálním 1,5% agarozovém gelu v 1XTBE pufru (90mM Tris-HCl, pH 8,5, 90mM kyselina boritá, 2,5mM ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA)), 1,5 hodiny při 100 V (viz výše uvedená citace Maniatis et al.). Oddělené PCR DNA produkty se na gelu lokalizují barvením ethidium-bromidem a vizualizují jako fluorescentní pásy v ultrafialovém světle 365 nm. Za podmínek PCR uvedených výše a za použití výše uvedené kombinace primerů se deteguje jediný pás DNA (přibližně o délce 250 bp).

Příklad 3

Klonování 0,25kb PCR-amplifikovaného fragmentu genomové DNA z S. avermitilis do vektoru E. coli a následující transformace do hostitele E. coli

A. Izolace 0,25kb PCR produktu

Jak již bylo uvedeno výše, 0,25kb fragment DNA se amplifíkuje PCR za použití genomové DNA z S. avermitilis jako templátu a výše uvedené kombinace pravosměmého a levosměmého primeru. Jak je zřejmé z obr. 1, pravosměmý primer obsahuje místo rozpoznávané restrikčním enzymem EcoRI u 5’ konce a levosměmý primer obsahuje místo rozpoznávané restrikčním enzymem Xbal u 5’ konce. Pokusy klonovat 0,25kb PCR fragment za použití ligačního postupu, při němž se jak inzert, tak klonovací vektor štěpí EcoRI a Xbal, však nebyly úspěšné. Proto se vyzkouší alternativní pokus klonovat 0,25kb PCR fragment za použití Klenowova fragmentu DNA polymerázy I za vzniku tupých konců v PCR fragmentu. Po amplifikaci, která se provádí způsobem popsaným v příkladu 2, se přibližně 80 μΐ PCR reakční směsi extrahuje dvakrát směsí fenolu a chloroformu, dvakrát etherem a potom se PCR DNA produkt vysráží ethanolem, jak to bylo popsáno výše. DNA se resuspenduje v 18,5 μΐ vody, k suspenzi se přidá 2,5 μΐ lOx translačního pufru „nick“ (0,5M Tris-HCl, pH 7,2, 0,lM síran hořečnatý, lmM dithiothreitol, 500 mg/ml hovězí sérový albumin) (Maniatis et al., výše uvedená citace z roku 1989) a 21 jednotek Klenowova fragmentu E. coli DNA polymerázy I (Boehringer Mannheim

-17CZ 289866 B6

Biochemicals) a směs se 5 minut inkubuje při 37 °C. Potom se přidá 1 μΐ 2μΜ dNTP (2 mM každého ze čtyř dNTP) a reakční směs se dále inkubuje 15 minut při teplotě místnosti. Opravná reakce se zastaví přídavkem 1 μΐ 0,5M kyseliny ethylendiamintetraoctové o pH 8,0 a celá reakční směs se nanese na 1,5% agarozový gel, kde se podrobí elektroforéze. 0,25kb DNA fragment se vizualizuje způsobem popsaným výše a izoluje elektroelucí, která se provádí takto: 0,25kb DNA pás se sejme holicí čepelkou a DNA se izoluje z agarozového gelu 35minutovou elektroelucí při 80 V do jímky tvaru písmene V, naplněné 10M octanem amonným, za použití jednosměrného elektroelutoru (Intemational Biotechnology Inc. New Haven, CT, USA). Potom se DNA vysráží ethanolem, peletizuje a nakonec znovu rozpustí ve 20 μΐ DNA pufru (lOmM Tris-HCl, 4mM chlorid sodný, 0,1 mM EDTA, pH 7,5).

B. Štěpení Smál a defosforylace plazmidového vektoru pGEM-3Z

Přibližně 1 pg plazmidu pGEM-3Zf(+) (Promega Corp. Madison, WI, USA) a 2 jednotky restrikčního enzymu Smál (všechny restrikční enzymy byly zakoupeny od firmy Boehringer Mannheim Biochemicals) se inkubují v pufru pro stanovení (specifikovaném dodavatelem) při 25 °C po dobu 3,5 hodiny v celkovém reakčním objemu 40 μΐ. Tak se získají lineární molekuly s tupými konci. Potom se Smal-linearizovaný vektor defosforyluje za použití alkalické fosfatázy z telecího střeva (CIAP) (zakoupena od firmy Promega Corp. Madison, WI, USA) podle instrukcí dodavatele. Reakční směs se 35 minut inkubuje při 37 °C a potom se DNA extrahuje dvakrát stejným objemem směsi fenolu a chloroformu, dvakrát stejným objemem etheru a nakonec se DNA vysráží přídavkem dvou objemů absolutního ethanolu. Vysrážená DNA se izoluje lOminutovou centrifugací při 10 000 x g a vysuší se za vakua. Získaná peleta se znovu rozpustí ve 20 μΐ DNA-pufru.

C. Ligace za vzniku pCD503

Přibližně 10 μΐ 0,29kb PCR DNA produktu zpracovaného Klenowovým fragmentem a asi 1 μΐ Smal-linearizovaného CIAP-defosforylovaného pGEM-3Zf(+) s tupými konci se inkubuje přes noc s 1 jednotkou ligázy (New England BioLabs, IC, Beverly, MA, USA) za podmínek specifikovaných dodavatelem při 14 °C v celkovém reakčním objemu 20 μΐ. Reakce se ukončí tím, že se mikrozkumavka, ve které se stanovení provádí, vloží do ledu. Získaných 15 μΐ reakční směsi se potom použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli JM109 za použití standardního postupu popsaného ve výše uvedené citaci Maniatis et al. z roku 1989. Získá se mnoho ampicilin-rezistentních transformantů. Plazmidový vektor p-GEM-3Zf(+) obsahuje segment DNA pocházející z lac operonu Escherichia coli, který kóduje aminoterminální fragment β-galaktosidázy (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. a J. Messing, 1985, Gene, 33, 103). Tento fragment, jehož syntézu je možno indukovat izopropylthio-fl-D-galaktosidem (IPTG) je schopen intra-allelové (a) komplementace s defektní formou β-galaktosidázy kódovanou hostitelem. Buňky E. coli po expozici indukčnímu IPTG syntetizují oba fragmenty enzymu a na miskách s médiem obsahujícím chromogenní substrát 5-brom-4-chlor-3-indolyl-p-D-galaktosid (X-gal) vytvářejí modré kolonie. Vložení cizí DNA do polyklonovacího místa plazmidu inaktivuje aminoterminální fragment β-galaktosidázy a ruší α-komplementaci. Bakterie nesoucí rekombinantní plazmidy proto vytvářejí bílé kolonie. Při tomto transformačním pokuse se izolují četné bílé kolonie. Tyto kolonie by měly obsahovat plazmid pCD503. Tato skutečnost se potvrdí následujícím pokusem. Vybere se jedna kolonie, která se označí jako kmen CD503, a podrobí se další analýze. Jediná bakteriální kolonie E. coli kmene CD503 se inokuluje na kapalné médium Luria-Bertani (LB) s obsahem 50 mg/ml ampicilinu za použití standardních mikrobiologických postupů. Použitá LB médium obsahuje:

-18CZ 289866 B6 baktotrypton bakto-kvasinkový extrakt chlorid sodný lOg

5g

10g hodnota pH nastavena na 7,0 5N roztokem hydroxidu sodného konečný objem roztoku nastaven na 1 litr médium sterilizováno v autoklávu 20 minut při 121 °C

Kultura se inkubuje přes noc při 35 °C. Následujícího rána se bakteriální buňky sklidí 5minutovou centrifugací při frekvenci otáčení 10 000 min¹ a teplotě 4 °C. Plazmidový vektor se izoluje z čerstvě sklizených buněk Escherichia coli CD503 za použití modifikace Bimboimovy aDolyho metody (Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1513); tato modifikace je popsána vDenoya et al., 1985, Microbios Lett. 29: 87. Izolovaná plazmidová DNA se potom rozpustí v DNA pufru (lOmM Tris-HCl, 4mM chlorid sodný, 0,1 mM kyselina ethylendiamintetraoctová, pH7,5) na koncentraci přibližně 1 pg pCD503 νΙΟμΙ pufru. Potvrzující restrikční analýza za použití restrikčních enzymů EcoRI a Pstl ukazuje, že podle očekávání pCD503 nese 0,25kb inzert DNA.

Příklad 4

Příprava radioznačených DNA a RNA prób

A. Příprava rovnoměrně značených dvouřetězcových DNA prób

Dvouřetězcové DNA próby se připraví translací „nick“ (obecný postup této techniky je popsán v publikaci Maniatis et al. z roku 1989 citované výše). Nejprve se připraví specifický fragment DNA nesoucí cílovou sekvenci vhodným restrikčním štěpením a tento fragment se purifikuje elektroelucí v podstatě za podmínek uvedených v příkladu 1. Přibližně 1 pg DNA se vždy označí za použití [a-³²P]dCTP ([a-³²P]-značená tetra(triethylamoniová) sůl deoxycytidin-5’-trifosfátu), zakoupené od firmy NEN-Dupont, a systému BRL Nick Translation Systém (výrobek zakoupen od firmy BRL Life Technologies lne.) podle instrukcí získaných od dodavatele. Obvykle se tato reakce provádí v objemu 50 μΐ. Po přidání 5 μΐ Stop pufru (jak je to popsáno v doporučeném postupu od firmy BRL) se značená DNA oddělí od neinkorporovaných nukleotidů pomocí protlačovacího sloupce Stratagene způsobem uvedeným v instrukčním manuálu dodavatele. Těmito postupy se vždy rutinním způsobem získá ³²P-značená DNA se specifickou aktivitou zaručeně vyšší než 10⁸ cpm/pg.

B. Příprava značených jednořetězcových RNA prób ³²P-značené RNA próby se připraví in vitro transkripcí za použití transkripčního systému Riboprobe Gemini (Promega). Purifikovaný fragment cílové DNA se klonuje do transkripčního vektoru pGEM-3Z za použití standardních postupů. Příprava templátové plazmidové DNA pro in vitro transkripční reakce se provádí způsobem popsaným v příkladu 3, ale zahrnuje srážecí stupeň za použití polyethylenglykolu (PEG) za účelem selektivního odstranění malých nukleotidů, které by mohly kontaminovat tyto přípravky. Posledně uvedený stupeň se provádí takto: Po stupni srážení ethanolem se peleta resuspenduje v 520 μΐ vody. K suspenzi se přidá 100 μΐ 5M roztoku chloridu sodného a 620 μΐ 13% polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 6 000 až 8 000. Po promíchání se zkumavka jednu hodinu inkubuje na ledu a DNA se peletizuje 15minutovým odstřeďováním při lOOOOxg a teplotě 4 °C. Získaná peleta se promyje jednou 500 μΐ 80% chladného ethanolu a potom obvyklým způsobem resuspenduje. Přibližně 1 pg templátové plazmidové DNA se linearizuje za použití restrikčního enzymu Sací nebo HindlII a potom se podrobí in vitro transkripci za použití SP6 nebo T7 bakteriofágová DNA-dependentní RNA polymerázy. Při této reakci se použije [a-³²P]-značené tetra(triethylamoniové) soli cytidin—5’— trifosfátu (CTP) zakoupené od firmy NEN-Dupont. Pracuje se za reakčních podmínek

-19CZ 289866 B6 doporučených dodavatelem. Po inkubaci se na reakční směs působí jednou jednotkou RQl-DNázy (Promega), za účelem degradace DNA templátu, reakční směs se extrahuje dvakrát směsí fenolu a chloroformu a potom se produkt standardními technikami srazí ethanolem. Peleta se vysuší a resuspenduje ve 20 μΐ vody neobsahující RNázu (RNase-free Water, Promega). Malý alikvot značeného RNA transkriptu se analyzuje elektroforézou na polyakrylamid-agarozovém gelu způsobem popsaným vDenoya et al., 1987, J. Bacteriol, 169: 3857 až 3860. Za výše uvedených podmínek je rutinním způsobem možno získat značené transkripty s úplnou délkou.

Příklad 5

Analýza genomové DNA z S. avermitilis hybridizací Southem

Přibližně 10 pg purifikované genomové DNA z S. avermitilis se štěpí 2 jednotkami restrikčního enzymu BamHI při 37 °C nejméně po dobu 2 hodin. Na konci štěpení se fragmenty DNA oddělí elektroforézou na 1% agarozovém gelu (viz příklad IA) a přes noc se přenesou na nylonovou membránu o velikosti pórů 0,45 pm (Schleicherovy a Schuell Nytranovy membrány) za použití kapilární přenosové metody (Southem, E.M. 1975, J. Mol. Biol. 98: 503). Následujícího dne se nylonové membrány zabalí do plastového obalu a ta strana každé membrány, která obsahuje DNA, se exponuje zdroji ultrafialového záření (302 nm), aby se DNA fixovala k membráně. Hybridizace radioznačených RNA a DNA prób k DNA imobilizované na nylonové membráně se provádí podle protokolu popsaného ve výše uvedené publikaci Maniatis et al. z roku 1989. Prehybridizace a hybridizace se provádí při 42 °C. Hybridizační roztok obsahuje: 6xSSC (lx: 0,15M chlorid sodný, 15mM citran sodný, pH 7,0), lOx Denhardtovo činidlo (lx: 0,02% ficoll, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% hovězí sérový albumin), 1% SDS (natriumdodecylsulfátu), 100pg/ml denaturovanou fragmentovanou DNA z lososího sperma, 100pg/ml E. coli tRNA a 50% formamid (Fluka). Hybridizace se provádí přes noc a potom se membrány opláchnou následujícím způsobem: dva oplachy 1 x SSC, 0,1% SDS při teplotě místnosti po dobu 15 minut a 2 oplachy 0,1 x SSC, 0,1% SDS při 42 °C po dobu 15 minut. Při některých pokusech se hybridizace provádí při 65 °C za nepřítomnosti formamidu a používá se SSPE (lx: 0,18M chlorid sodný, lOmM fosforečnan sodný (NaPO₄), pH7,7, lmM EDTA) místo SSC. Nakonec se membrány exponují na rentgenografický film, aby se získal autoradiografický obraz.

Příklad 6

Klonování 0,25kb genomového fragmentu CD503 z S. avermitilis do bakteriofágu M10 a sekvenování DNA

0,25kb fragment DNA CD503 z S. avermitilis se klonuje do bakteriofágu M13mpl8 M13mpl9 za účelem přípravy jednořetězcových rekombinantních DNA pro použití jako templátů při Sangerově dideoxy-sekvenační metodě (Sanger et al., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463 až 5467). Asi 2 pg plazmidů pCD503 vyrobeného minipreparačním postupem popsaným výše se štěpí restrikčními enzymy EcoRI a Pstl za účelem uvolnění 0,25kb genomového inzertu S. avermitilis. Restrikční analýza ukazuje, že pCD503 štěpený samotným enzymem EcoRI nebo Pstl je lineární. Tato analýza také ukazuje, že 0,25kb inzert neobsahuje specifická místa pro EcoRI nebo Pstl. Po štěpení se směs podrobí elektroforéze na 1,2% agarozovém gelu a 0,25kb fragment se podrobí elektroeluci a vysráží se výše uvedeným způsobem. Kromě toho se asi 1 pg každé purifikované dvouřetězcové replikační formy (RF) DNA zM13mpl8 a M13mpl9 dvojnásobně štěpí EcoRI a Pstl, defosforyluje alkalickou fosfatázou z telecího střeva (CIAP) (enzym zakoupen od firmy Promega Corp., Madison, WI, USA) a nakonec liguje k 0,25kb DNA fragmentu způsobem popsaným výše. Purifikované klonovací vektory RF M13 jsou zakoupeny od firmy New England BioLabs. Ligačních směsí se použije pro transfekci kompetentních buněk E. coli JM109. Z mpl8 a mpl9 transfekce se vždy vybere jeden bílý plak, podrobí se fágovému

-20CZ 289866 B6 růstu a jednořetězcová DNA se připraví způsobem popsaným ve výše uvedené citaci Maniatis et al. z roku 1989. Sekvenování DNA každého jednořetězcového DNA templátu se provádí za použití M13-specifického -40 sekvenačního primerů (New England BioLabs, katalogové číslo 1212), deoxyadenosin-5’-(a-thio)trifosfátu, [³⁵C](NEN-Dupont) a sekvenační soupravy TaqTrack (Promega) podle instrukcí dodavatele, tj. Promega. DNA sekvenační data pCD503 S. avermitilis genomového fragmentu jsou uvedena na obr. 4.

Příklad 7

Klonování úplného shluku genů z S. avermitilis bkd a sestrojení chromozomální mapy

Přibližně 5 pg purifíkovaného pCD503 se dvakrát štěpí za použití restrikčního enzymu BamHI a EcoRI. Fragmenty DNA se oddělí elektroforézou na 1,2% agarózovém gelu, elektroelucí se získá přibližně 0,25 kb dlouhý DNA fragment nesoucí sekvenci specifickou pro gen E-la z S. avermitilis bkd a ten se značí nick translací v podstatě způsobem popsaným výše. Získaného [³²P]-značeného DNA fragmentu se potom použije jako próby pro screening genomové kozmidové knihovny S. avermitilis. Podrobný obecný popis přípravy genomových knihoven je možno nalézt v příručce Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al., (1989). Úplný popis přípravy chromozomální knihovny streptomycetes je uveden v příručce Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual, Hopwood et al. (1985). Popis kozmidového vektoru je možno nalézt v americké patentové přihlášce č. 08/048,719, podané 16. dubna 1993 o názvu „Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA Cloning“ původce Denoya C. D. Při screeningu více než 2200 rekombinantních klonů v knihovně jsou identifikovány čtyři klony. Tyto čtyři hybridizující klony (označené jako klony E. coli CD518, CD519, CD520 a CD521) se nechají růst na LB médiu za ampicilinového selekčního tlaku. Z každé kultury se výše uvedeným způsobem připraví plazmid. Restrikční analýza a hybridizační analýza Southem blot ukazuje, že tyto čtyři klony jsou příbuzné a obsahují překrývající se chromozomové oblasti. Standardními postupy se také získá restrikční mapa genomu S. avermitilis pokrývající celou chromozomovou oblast včetně sekvence CD5O3 (tato restrikční mapa je znázorněna na obr. 3).

Příklad 8

Vytvoření hnízdových souborů delečních mutantů pro orientované sekvenování DNA oblasti chromozomu nesoucí shluk genů bkd z S. avermitilis

Hnízdové soubory delečních mutantů, kterým chybí postupně stále větší počet nukleotidů na jednom nebo druhém konci cílové DNA z S. avermitilis bkd se vytvoří za použití enzymu Exonuklease ΠΙ v podstatě za použití postupů, které se podobají postupům popsaným S. Henikoffem (S. Henikoff, 1987, Methods Enzymol, 155: 156). Pro vytvoření jednosměrných delečních mutantů se dvouřetězcová DNA každé rekombinantní bakteriofágové Ml3 replikační formy DNA štěpí dvěma restrikčními enzymy, přičemž obě obsahují místa štěpení mezi jedním koncem cílové DNA a vazebným místem primerů. Restrikční enzym, který štěpí ve větší blízkosti k cílové sekvenci, vytváří tupý konec nebo „zahloubený“ 3’ konec. Zbývající enzym vytváří „vystupující“ 3’ konec. Enzym Exonuclease III katalyzuje postupné odštěpování 5’ mononukleotidů od zahloubeného nebo tupého 3’ hydroxylového konce dvouřetězcové DNA. Vystupující 3’ konce jsou však vůči této enzymatické aktivitě úplně rezistentní. Vůči Exonuclease III je tedy susceptibilní pouze jeden konec výsledné lineární DNA a štěpení probíhá jednosměrně od místa štěpení do cílových DNA sekvencí.

Jako příklad je možno uvést popis přípravy hnízdových delecí pCD565. Plazmid pCD565 je M13mpl9RF derivát nesoucí l,15kb Sáli fragment, který obsahuje část otevřeného čtecího rámce El-α S. avermitilis bkd. Plazmid pCD565 se purifikuje rovnovážnou centrifugací

-21 CZ 289866 B6 v gradientu chloridu cezného a ethidiumbromidu způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Maniatis et al. z roku 1989. Enzym Exonuclease III je schopen iniciovat štěpení od jednořetězcových nicků, takže je důležité použít přípravku obsahujícího méně než 10% relaxovaných kružnicových molekul. Přibližně 10 pg plazmidu pCD565 (viz část zabývající se podrobným popisem tohoto vynálezu) se dvakrát štěpí restrikčními enzymy Sací a Xbal při 37 °C po dobu 4 hodin, vzniklá směs se extrahuje směsí fenolu a chloroformu a etherem a potom se výše uvedeným způsobem produkt srazí ethanolem. Vzniklá peleta se resuspenduje v 60 μΐ reakčního pufru s Exonuclease III (lOx reakční pufr s Exonuclease: 0,66M Tris-HCl, pH 8,0, 66mM chlorid hořečnatý (MgCl₂)). Roztok DNA se potom při 37 °C inkubuje za přítomnosti 300 jednotek Exonuclease III (Ambion lne.) a ve 30sekundových intervalech se odebírají 2,5μ1 alikvoty. Odebrané vzorky se potom inkubují snukleázou SI a alikvot každého vzorku se analyzuje elektroforézou na agarózovém gelu. Vzorky obsahující fragmenty DNA požadované délky se spojí, DNA se opraví za použití Klenowova fragmentu DNA polymerázy I, přes noc se provede ligace a potom následuje transfekce do kompetentních buněk E. coli JMI09. Velikost inzertu v získaných klonech se analyzuje restrikcí EcoRI/HindlII a elektroforézou na agarózovém gelu. Pro sekvenování se vybere 5 klonů: 565-D19 (1,1 kb), 565-D7 (0,88 kb), 565-d24 (0,77 kb), 565-D1 (0,51 kb) a 565-D16 (0,36 kb). Z každého z těchto klonů se připraví jednořetězcové DNA, která se výše uvedeným způsobem sekvenuje.

Příklad 9

Sestrojení plazmidů pCD670, pCD666, pCD736 a pCD685 pro použití při expresi genů S. avermitilis bkd v E. coli

Exprese genů S. avermitilis bkd v E. coli se provede za použití duálního plazmidového systému T7 RNA polymeráza/promotor v podstatě, jak je popsán v S. Tábor, 1990 v Current Protocols in Molecular Biology, str. 16.2.1 až 16.2.11, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, USA.

A. Sestrojení pCD570 nesoucího otevřený čtecí rámec S. avermitilis El-a bkd

Postupem založeným na PCR se do S. avermitilis bkd El-a genu zavede restrikční místo pro Ndel oddělující ATG start kodon. Templátem pro PCR je plazmid pCD528, pGEM-3Z derivát nesoucí 7kb S. avermitilis genomový inzert obsahující aminoterminální polovinu otevřeného čtecího rámce El-a. Jako primerů se při PCR reakci použije dvou oligonukleotidů (viz obr. 6), kterými jsou

1. levosměmý univerzální (vektorový) primer

31-PCR-BP: 5 ’-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3’, který mapuje za místem pro HindlII pGEM-3Z MCS (polohy 91 až 114). Na 5’ konci tohoto primerů jsou dva, zbytky As a dvě restrikční místa (BamHI a Pstl) pro usnadnění klonování PCR produktů;

2. mutagenní primer

55-PCR: 5’-AAGAGATCTCATATGACGGTCATGGAGCAGCGG-3’, na jehož 5’ konci jsou dva zbytky As, jeden G a dvě restrikční místa (BglII a Ndel). Místo Ndel se překrývá s kodonem ATG iniciátoru otevřeného čtecího rámce El-a.

-22CZ 289866 B6

Řetězová reakce působením polymerázy se provádí výše popsaným způsobem. Reakční produkty se analyzují elektroforézou na 0,8% agarozovém gelu. PCR-amplifikovaný DNA fragment o správné velikosti (délka asi 1,1 kb) se elektroeluuje, štěpí restrikčními enzymy Ndel a BamHI a subklonuje do Ndel/BamHI-linearizovaného plazmidu pT7-7, z něhož se ligací a transformací do buněk E. coli DH-5-α získá plazmid pCD663. Přibližně 1 pg plazmidu pCD663 (připraveného z buněk E. coli kmene CD663 za použití minipreparačního postupu pro plazmid) se linearizuje působením BamHI, defosforyluje a nakonec liguje za přítomnosti asi 0,5 pg elektroeluovaného purifikovaného 1,1 kb BamHI fragmentu izolovaného z reakční směsi po štěpení plazmidu pCD550 působením BamHI, čímž se získá plazmid pCD670. Správná orientace 1,1 kb BamHI fragmentu v posledně uvedeném konstruktu se určí mapováním míst Sáli v inzertu. Nakonec se plazmid pCD670 zavede do E. coli kmene C600 nesoucího plazmid pGPl-2 (plazmid obsahující gen pro T7 RNA polymerázu) (viz Tábor, výše uvedená citace z roku 1990). Pro další práci se vybere jeden transformant, který se označí jako CD676.

B. Sestrojení pCD560 nesoucího otevřený čtecí rámec S. avermitilis El-β bkd

Postupem založeným na PCR se do S. avermitilis bkd El-β genu zavede restrikční místo pro Ndel oddělující ATG start kodon. Templátem pro PCR je plazmid pCD574, pGEM-3Z derivát nesoucí 4,5kb S. avermitilis genomový inzert obsahující otevřený čtecí rámec El-α. Jako primerů se při PCR reakci použije dvou oligonukleotidů (viz obr. 6), kterými jsou

1. levosměmý univerzální (vektorový) primer

30-PCR-BP: 5’-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3’, který mapuje před místem pro EcoRI pGEM-3Z MCS (polohy 2689 až 3712). Na 5’ konci tohoto primeru jsou dva zbytky As a dvě restrikční místa (BamHI a Pstl) pro usnadnění klonování B produktů;

2. pravosměmý mutagenní primer

56-PCR: 5’-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3’, na jehož 5’ konci jsou dva zbytky As, jeden G a dvě restrikční místa (BglII a Ndel). Místo Ndel se překrývá s kodonem ATG iniciátoru otevřeného čtecího rámce El-β.

Řetězová reakce působením polymerázy se provádí výše popsaným způsobem. Reakční produkty se analyzují elektroforézou na 0,8% agarozovém gelu. PCR-amplifikovaný DNA fragment o správné velikosti (délka asi 1,9 kb) se elektroeluuje, štěpí restrikčními enzymy Ndel a EcoRI a subklonuje do Ndel/EcoRI-linearizovaného plazmidu pT7-7, z něhož se ligací a transformací do buněk E. coli DH-5-α získá plazmid pCD666. Nakonec se plazmid pCD666 zavede do E. coli kmene C600 nesoucího plazmid pGPl-2 (plazmid obsahující gen pro T7 RNA polymerázu) (viz Tábor, výše uvedená citace z roku 1990). Pro další práci se vybere jeden transformant, který se označí jako CD673.

C. Sestrojení pCD736 nesoucího otevřené čtecí rámce S. avermitilis El-α a 41—β bkd

Přibližně 2 pg plazmidu pCD670 se linearizují částečným štěpením BamHI. Pro získání lineární formy plazmidu pCD670 se odebírají alikvotní vzorky směsi štěpené BamHI po jedné, třech, pěti, deseti a dvaceti minutách. Alikvoty se podrobí elektroforéze na 0,8% agarozovém gelu. Lineární forma (o délce asi 4,3 kb) se izoluje elektroelucí a defosforyluje se působením CIAP (viz výše). Potom se polovina defosforylované lineární formy plazmidu pCD670 liguje s 0,8kb BamHI/BglII fragmentem izolovaným z plazmidu pCD577. Ligační směsi se použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli DH5-a. Izoluje se deset klonů, které se analyzují restrikční

-23CZ 289866 B6 analýzou plazmidové DNA získané při minipreparačním postupu. Jeden klon označený jako CD736 obsahuje správně uspořádaný plazmid pCD736. Nakonec se plazmid pCD736 zavede do E. coli kmene C600 nesoucího plazmid pGPl-2. Pro další práci se zvolí jeden transformant, který se označí jako kmen CD737. Jiný klon označený jako kmen CE705 obsahuje plazmid pCE705 nesoucí 0,8kb BamHI/BglII fragment v nesprávné orientaci. Konstruktu pCD705 se použije jako negativní kontroly při pokusech o expresi.

D. Sestrojení pCD685 nesoucího shluk genů S. avermitilis bkd

Zbývající polovina defosforylované lineární formy plazmidu pCD670 získaná výše uvedeným způsobem částečným štěpením pomocí restrikčního enzymu BamHI se liguje s 7kb BamHI fragmentem izolovaným z plazmidu pCD577. Ligační směs se použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli DH5-a. Získá se mnoho klonů a 16 z nich se zvolí pro další analýzu. Extrahuje se plazmidová DNA, a ta se analyzuje restrikční analýzou. Jeden z klonů označený jako kmen CD685 obsahuje správně uspořádaný plazmid pCD685. Nakonec se plazmid pCD685 zavede do E. coli kmene C600 nesoucího plazmid pCGl-2. Jeden transformant se vybere pro další práci a označí se jako kmen CD687.

Příklad 10

Exprese genů z S. avermitilis bkd v Escherichia coli za použití duálního plazmidového systému T7

Deriváty E. coli C600 (pGP-1) obsahující různé konstrukce pT7-7 (kmeny CD676, CD673, CD737 a CD687) se nechají růst v 5 ml LB média obsahujícího kanamycin (60 pg/ml) a ampicilin (60 pg/ml) přes noc při 30 °C. Noční kultury se zředí v poměru 1 :40 (0,25 : 10,00 ml) a převedou do kultivační zkumavky (25 x 150 mm) obsahující čerstvé LB médium s ampicilinem a kanamycinem. Kultura se nechá růst za provzdušňování protřepáváním při 30 °C až do naměřené optické hustoty (OD590) přibližně 0,4. Gen pro T7 RNA polymerázu se indukuje zvýšením teploty na 42 °C na dobu 30 minut, čímž dojde k indukci genů, které jsou pod kontrolou T7 promotoru (jak to popisuje S. Tábor ve výše uvedené publikaci z roku 1990). Nakonec se teplota sníží na 37 °C a buňky se nechají dalších 90 minut růst za protřepávání. Neindukované kontrolní kultury se vždy udržují při 30 °C. Proteiny se analyzují elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s natriumdodecylsulfátem (SDS) způsobem popsaným v C. D. Denoya et al., 1980, J. Bacteriol. 168: 1133 až 1141. Enzymatická účinnost se analyzuje způsobem popsaným v příkladu 11.

Příklad 11

Stanovení BCKDH aktivity El S. avermitilis v surových extraktech rekombinantních kmenů

E. coli

A. Příprava buněčného lyzátu

Buňky (získané z 8ml kultur) se oddělí centrifugací (5 minut při 5 000 min'¹, asi 3 000 x g, za použití rotoru Sorvall SS-34 a chlazení na 4 °C) a resuspendují v 5 ml „rozbíjecího pufru“ [0,05M pufr na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,0 obsahující 3% Tritonu X-100, 15% glycerolu, dithiothreitol (3mM) a trypsinový inhibitor z krůtího vaječného bílku (1 mg/ml), EDTA (5mM) a TPP[thiaminpyrofosfát] (0,04mM)J. Resuspendované buňky se převedou do francouzského lisu a rozbijí se jedním průchodem za tlaku 34,3 MPa. Alikvot o objemu 1,5 ml produktu prošlého lisem se převede do mikrocentrifugační zkumavky a čeří se 30sekundovou centrifugací při frekvenci otáčení 14 000 min'¹. Alikvotu každého supematantu (100 μΐ) se použije pro enzymatické stanovení. Koncentrace proteinu se stanoví za použití soupravy pro

-24CZ 289866 B6 stanovení proteinu Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Califomia, USA), která je založena na Bratfordově postupu vazby barviva (Bratford, M., Anal. Biochem. 72: 248,1976).

B. Stanovení El komponenty komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázy (BCKDH) z S. avermitilis

Aktivita BCKDH El se stanoví modifikovaným postupem radiochemického stanovení popsaného výše (Chuang D. T., 1988, Methods Enzymol., 160: 146-154 a Hafner E. W. et al., 1995, J. Antibiotics 44: 349). Na dno 15ml skleněné scintilační nádoby se přidá 0,148 ml 0,25M pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 6,5; 0,002 ml 0,lM ethylendiamintetraoctové kyseliny (dvojsodné soli EDTA); 0,004 ml 0,lM chloridu draselného (MgCl₂); 0,02 ml 3,7mM thiaminpyrofosfátu (TPP); 0,02 ml 37mM arzenitanu sodného NaAsO₂; 0,01 ml 37mM 2,6-dichlorfenolindofenolu (sodná sůl, Sigma D-1878); 0,008 ml a-[l-¹⁴C]ketoizokaproátového zásobního roztoku (vyrobeného dále popsaným způsobem); 0,058 ml vody; a 0,1 ml vyčeřeného bezbuněčného extraktu. Hrdlo lahvičky se ihned zakryje papírem Whatman 4CHR (Whatman katalogové číslo 3004614), který je napuštěn prostředkem Solvable (tkáňový a gelový solubilizátor zakoupený od firmy NEN-Dupont). Lahvička se potom těsně uzavře plastovým uzávěrem, přičemž jak uzávěr, tak homí polovina lahvičky se obalí parafilmem. Inkubace za mírného protřepávání se provádí 2 hodiny při 30 °C. Po skončení inkubace se filtrační papír přenese do 7ml skleněné scintilační kyvety obsahující 4 ml kapalného scintilačního koktejlu „Ready Safe“ (Beckman) za účelem stanovení radioaktivity.

a-(l-¹⁴C]ketoizokaproátový zásobní roztok se vyrobí tak, že se smíchá 5,6 μΐ 20mM a-ketoizokaproátu (sodná sůl, Sigma, K-0629), 50 μΐ a-(l-¹⁴C]ketoizokaproátu (50mCi/mmol, 50 pCi/ml, Amersham) s dostatečným množstvím vody do celkového objemu 1 ml.

Specifická aktivita El složky rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenáza se uvádí v pmol oxidu uhličitého uvolněného na minutu na 1 mg proteinu (viz tabulka I).

Tabulka 1

Aktivita rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázy z El Streptomyces avermitilis v surových extraktech rekombinantních buněk E. coli

Konstrukce	Plazmid	Kmen	Indukce	Specifická aktivita ’ El BCKDH
žádný inzert	pT7-7	CD677	+	0,9
Wl-a	pCD670	CD676	-	0,6
			+	0,8
El-b	pCD666	CD673	-	0,5
			+	0,7
El[a+b]	pCD736	CD637		2,0
			+	13,7
El-[a+b]3	pCD705	CD705	-	0,9
			+	0,5
El-[a+b]-E2-E3	pCD685	CD687	-	2,9
			+	6,0

¹ Specifická aktivita složky El rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázy je vyjádřena v pmol oxidu uhličitého uvolněného za minutu, vztaženo na 1 mg proteinu.

Výsledky jsou střední hodnoty ze dvou stanovení.

-25CZ 289866 B6

Tento konstrukt nese C-terminální část E1—β otevřeného čtecího rámce ve špatné orientaci a používá se ho jako negativní kontroly.

Popis sekvencí podle čísel

SEQ ID NO: 1 představuje sekvenci DNA kódující El-α podjednotku S. avermitilis BCKDH. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 4 (báze 403 až 1548).

SEQ ID NO: 2 představuje sekvenci DNA kódující El—β podjednotku S. avermitilis BCKDH. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 4 (báze 1622 až 2626).

SEQ ID NO: 3 představuje sekvenci DNA, která zahrnuje otevřený čtecí rámec kódující aminoterminální oblast E2 podjednotky S. avermitilis BCKDH. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 4 (báze 2626 až 2727).

SEQ ID NO: 4 představuje sekvenci DNA zahrnující báze 3 až 251 zpCD539. Jedná se o částečnou vnitřní sekvenci genu kódujícího E2 podjednotku S. avermitilis BCKDH. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 5.

SEQ ID NO: 5 představuje 2728 bp fragmentu genomové DNA S. avermitilis znázorněného na obr. 4 a zahrnuje otevřené čtecí rámce El-α, ΕΙ-β a E2 (částečně) podjednotek S. avermitilis BCKDH.

SEQ ID NO: 6 představuje aminokyselinovou sekvenci El-α podjednotky S. avermitilis

BCKDH. Tato aminokyselinová sekvence je kódována sekvencí DNA SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 7 představuje aminokyselinovou sekvenci El-β podjednotky S. avermitilis

BCKDH. Tato aminokyselinová sekvence je kódována sekvencí DNA SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 8 představuje aminokyselinovou sekvenci aminoterminální části E2 podjednotky S. avermitilis BCKDH. Tato aminokyselinová sekvence je kódována sekvencí DNA SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 9 představuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou sekvencí DNA reprezentovanou bázemi 3 až 251 zpCD539 (SEQ ID NO: 4). Tato aminokyselinová sekvence představuje vnitřní peptidový fragment E2 podjednotky S. avermitilis BCKDH.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL (pro všechny designované státy s výjimkou USA):

(A) JMÉNO: Pfízerlnc.

(B) ULICE: 235 East 42nd Street, 20th Floor (C) MĚSTO: New York (D) STÁT: New York (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 10017-5755

-26CZ 289866 B6 (i) PŘIHLAŠOVATEL (pouze pro USA):

(A) JMÉNO: Claudio D. Denoya (B) ULICE: 80 Spyglass Circle (C) MĚSTO: Croton (D) STÁT: Conecticut (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ:06340 (iii) NÁZEV VYNÁLEZU: Geny kódující komplex rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenázy z Streptomyces avermitilis (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Peter C. Richardson (B) ULICE: Pfizer lne., 235 East 42nd Street, 20th Floor (C) MĚSTO: New York (D) STÁT: New York (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 10017-5755 (v) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: 08/100,518 (B) DATUM PODÁNÍ: 30. července 1993 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

(vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K DŘÍVĚJŠÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/100,518 (B) DATUM PODÁNÍ: 30. července 1993 (vii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Sheyka, Robert F.

(B) ČÍSLO LICENCE: 31,304 (C) SPISOVÁ ZNAČKA: PC8346 (viii) INFORMACE O TELEKOMUNIKAČNÍM SPOJENÍ (A) TELEFON: (212)573-1189 (B) TELEFAX: (212)573-1939 (C) TELEX: N/A (ix) POČET SEKVENCÍ: 9 (x) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, verze #1.25

-27CZ 289866 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1 146 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

ATGACGGTCA TGGAGCAGCG GGGCGCTTAC CGGCCCACAC CGCCGCCCGC CTGGCAGCCC60

CGCACCGACC CCGCGCCACT GCTGCCCGAC GCGCTGCCCC ACCGCGTCCT GGGCACCGAG120

GCGGCCGCGG AGGCCGACCC GCTACTGCTG CGCCGCCTGT ACGCGGAGCT GGTGCGCGGC180

CGCCGCTACA ACACGCAGGC CACGGCTCTC ACCAAGCAGG GCCGGCTCGC CGTCTACCCG240

TCGAGCACGG GCCAGGAGGC CTGCGAGGTC GCCGCCGCGC TCGTGCTGGA GGAGCGCGAC300

TGGCTCTTCC CCAGCTACCG GGACACCCTC GCCGCCGTCG CCCGCGGCCT CGATCCCGTC360

CAGGCGCTCA CCCTCCTGCG CGGCGACTGG CACACCGGGT ACGACCCCCG TGAGCACCGC420

ATCGCGCCCC TGTGCACCCC TCTCGCGACC CAGCTCCCGC ACGCCGTCGG CCTCGCGCAC480

GCCGCCCGCC TCAAGGGCGA CGACGTGGTC GCGCTCGCCC TGGTCGGCGA CGGCGGCACC 540

AGCGAGGGCG ACTTCCACGA GGCACTGAAC TTCGCCGCCG TCTGGCAGGC GCCGGTCGTC600

TTCCTCGTGC AGAACAACGG CTTCGCCATC TCCGTCCCGC TCGCCAAGCA GACCGCCGCC660

CCGTCGCTGG CCCACAAGGC CGTCGGCTAC GGGATGCCGG GCCGCCTGGT CGACGGCAAC720

GACGCGGCGG CCGTGCACGA GGTCCTCAGC GACGCCGTGG CCCACGCGCG CGCGGGAGGG780

GGGCCGACGC TCGTGGAGGC GGTGACCTAC CGCATCGACG CCCACACCAA CGCCGACGAC840

GCGACGCGCT ACCGGGGGGA CTCCGAGGTG GAGGCCTGGC GCGCGCACGA CCCGATCGCG900

CTCCTGGAGC ACGAGTTGAC CGAACGCGGG CTGCTCGACG AGGACGGCAT CCGGGCCGCC960

CGCGAGGACG CCGAGGCGAT GGCCGCGGAC CTGCGCGCAC GCATGAACCA GGATCCGGCC1020

CTGGACCCCA TGGACCTGTT CGCCCATGTG TATGCCGAGC CCACCCCCCA GCTGCGGGAG1080

CAGGAAGCCC AGTTGCGGGC CGAGCTGGCA GCGGAGGCCG ACGGGCCCCA AGGAGTCGGC1140

CGATGA1146

-28CZ 289866 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1 005 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:2:

ATGACCACCG TTGCCCTCAA GCCGGCCACC ATGGCGCAGG CACTCACACG CGCGTTGCGT 60

GACGCCATGG CCGCCGACCC CGCCGTCCAC GTGATGGGCG AGGACGTCGG CACGCTCGGC 120

GGGGTCTTCC GGGTCACCGA CGGGCTCGCC AAGGAGTTCG GCGAGGACCG CTGCACGGAC 180

ACGCCGCTCG CCGAGGCAGG CATCCTCGGC ACGGCCGTCG GCATGGCGAT GTACGGGCTG 240

CGGCCGGTCG TCGAGATGCA GTTCGACGCG TTCGCGTACC CGGCGTTCGA GCAGCTCATC 300

AGCCATGTCG CGCGGGATGC GCAACGCACC CGCGGGGCGA TGCCGCTGCC GATCACCATC 360

CGTGTCCCCT ACGGCGGCGG AATCGGCGGA GTCGAACACC ACAGCGACTC CTCCGAGGCG 420

TACTACATGG CGACTCCGGG GCTCCATGTC GTCACGCCCG CCACGGTCGC CGACGCGTAC 480

GGGCTGCTGC GCGCCGCCAT CGCCTCCGAC GACCCGGTCG TCTTCCTGGA GCCCAAGCGG540

CTGTACTGGT CGAAGGACTC CTGGAACCCG GACGAGCCGG GGACCGTTGA ACCGATAGGC600

CGCGCGGTGG TGCGGCGCTC GGGCCGGAGC GCCACGCTCA TCACGTACGG GCCTTCCCTG660

CCCGTCTGCC TGGAGGCGGC CGAGGCGGCC CGGGCCGAGG GCTGGGACCT CGAAGTCGTC720

GATCTGCGCT CCCTGGTGCC CTTCGACGAC GAGACGGTTG TGCGCGTCGG TGCGCGGACC780

GGACGCGCCG TCGTCGTGCA CGAGTCGGGT GGTTACGGCG GCCCGGGCGG GGAGATCGCC840

GCGGGCATCA CCGAGCGCTG CTTCCACCAT CTGGAGGCGC CGGTGCTGCG CGTCGCCGGG900

TTCGACATCC CGTATCCGCC GCCGATGCTG GAGCGCCATC ATCTGCCCGG TGTCGACCGG960

ATCCTGGACG CGGTGGGGCG GCTTCAGTGG GAGGCGGGGA GCTGA1005

-29CZ 289866 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 102 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:3:

ATGGCCCAGG TGCTCGAGTT CAAGCTCCCC GACCTCGGGG AGGGCCTGAC CGAGGCCGAG 60

ATCGTCCGCT GGCTGGTGCA GGTCGGCGAC GTCGTGGCGA TC 102 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 249 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:4:

ATCTCCCTCA TCGCGCTGCT CGCCAGGATC TGCACCGCCG CACTGGCCCG CTTCCCCGAG60

CTCAACTCCA CCGTCGACAT GGACGCCCGC GAGGTCGTAC GGCTCGACCA GGTGCACCTG120

GGCTTCGCCG CGCAGACCGA ACGGGGGCTC GTCGTCCCGG TCGTGCGGGA CGCGCACGCG180

CGGGACGCCG AGTCGCTCAG CGCCGAGTTC GCGCGGCTGA CCGAGGCCGC CCGGACCGGC240

ACCCTCACA249

-30CZ 289866 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2 728 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:5:

GTCGACGCGG GCTCCGAAAC CGCGGATCAC GCCGTCGTCG ATGAGCCGGT TGATTCGCGC60

GTAGGCATTG GCACGCGACA CGTGGGCGCG CTCGGCCACG GACCGTATCG AGGCGCGGCC120

GTCCGCCTGG AGCATCTGGA GGATGTCCTG ATCGATGGCG TCCAGCGGGC GGGCGGGCGG180

CAGGGGTACC CCGGGCTCCG CTCCCTCGGC CATTTGTTCA GGTGCCATGT CCTCCGGCCT240

CCTTACCATG GACGTAGTGC GTTCATTCCA GGCTGTGGAG AACCGTTTGT CCACAGCCTG300

ACGGTGCCTG TAGCCAAAAT GTGCCGACGA CCGAACAATC GGTAGGTGAG GCGCCTCACA360

CCCGTGGCGC GCCCAAAGCC GCTCCCACGA GGAGGTGCCG TCATGACGGT CATGGAGCAG420

CGGGGCGCTT ACCGGCCCAC ACCGCCGCCC GCCTGGCAGC CCCGCACCGA CCCCGCGCCA480

CTGCTGCCCG ACGCGCTGCC CCACCGCGTC CTGGGCACCG AGGCGGCCGC GGAGGCCGAC540

CCGCTACTGC TGCGCCGCCT GTACGCGGAG CTGGTGCGCG GCCGCCGCTA CAACACGCAG600

GCCACGGCTC TCACCAAGCA GGGCCGGCTC GCCGTCTACC CGTCGAGCAC GGGCCAGGAG660

GCCTGCGAGG TCGCCGCCGC GCTCGTGCTG GAGGAGCGCG ACTGGCTCTT CCCCAGCTAC720

CGGGACACCC TCGCCGCCGT CGCCCGCGGC CTCGATCCCG TCCAGGCGCT CACCCTCCTG780

CGCGGCGACT GGCACACCGG GTACGACCCC CGTGAGCACC GCATCGCGCC CCTGTGCACC840

CCTCTCGCGA CCCAGCTCCC GCACGCCGTC GGCCTCGCGC ACGCCGCCCG CCTCAAGGGC900

GACGACGTGG TCGCGCTCGC CCTGGTCGGC GACGGCGGCA CCAGCGAGGG CGACTTCCAC960

GAGGCACTGA ACTTCGCCGC CGTCTGGCAG GCGCCGGTCG TCTTCČTCGT GCAGAACAAC1020

GGCTTCGCCA TCTCCGTCCC GCTCGCCAAG CAGACCGCCG CCCCGTCGCT GGCCCACAAG1080

GCCGTCGGCT ACGGGATGCC GGGCCGCCTG GTCGACGGCA ACGACGCGGC GGCCGTGCAC1140

GAGGTCCTCA GCGACGCCGT GGCCCACGCG CGCGCGGGAG GGGGGCCGAC GCTCGTGGAG1200

GCGGTGACCT ACCGCATCGA CGCCCACACC AACGCCGACG ACGCGACGCG CTACCGGGGG1260

GACTCCGAGG TGGAGGCCTG GCGCGCGCAC GACCCGATCG CGCTCCTGGA GCACGAGTTG1320

ACCGAACGCG GGCTGCTCGA CGAGGACGGC ATCCGGGCCG CCCGCGAGGA CGCCGAGGCG1380

ATGGCCGCGG ACCTGCGCGC ACGCATGAAC CAGGATCCGG CCCTGGACCC CATGGACCTG1440

TTCGCCCATG TGTATGCCGA GCCCACCCCC CAGCTGCGGG AGCAGGAAGC CCAGTTGCGG1500

GCCGAGCTGG CAGCGGAGGC CGACGGGCCC CAAGGAGTCG GCCGATGAAG AGAGTTGACC1560

-31 CZ 289866 B6

ATCGGGCCCC GAGAAGCGGG CCGATGACCT CCGTTGGCCT TTGGCCGGAA GGAGCCGGGC 1620

GATGACCACC GTTGCCCTCA AGCCGGCCAC CATGGCGCAG GCACTCACAC GCGCGTTGCG 1680

TGACGCCATG GCCGCCGACC CCGCCGTCCA CGTGATGGGC GAGGACGTCG GCACGCTCGG 1740

CGGGGTCTTC CGGGTCACCG ACGGGCTCGC CAAGGAGTTC GGCGAGGACC GCTGCACGGA 1800

CACGCCGCTC GCCGAGGCAG GCATCCTCGG CACGGCCGTC GGCATGGCGA TGTACGGGCT 1860

GCGGCCGGTC GTCGAGATGC AGTTCGACGC GTTCGCGTAC CCGGCGTTCG AGCAGCTCAT 1920

CAGCCATGTC GCGCGGGATG CGCAACGCAC CCGCGGGGCG ATGCCGCTGC CGATCACCAT 1980

CCGTGTCCCC TACGGCGGCG GAATCGGCGG AGTCGAACAC CACAGCGACT CCTCCGAGGC 2040

GTACTACATG GCGACTCCGG GGCTCCATGT CGTCACGCCC GCCACGGTCG CCGACGCGTA 2100

CGGGCTGCTG CGCGCCGCCA TCGCCTCCGA CGACCCGGTC GTCTTCCTGG AGCCCAAGCG 2160

GCTGTACTGG TCGAAGGACT CCTGGAACCC GGACGAGCCG GGGACCGTTG AACCGATAGG 2220

CCGCGCGGTG GTGCGGCGCT CGGGCCGGAG CGCCACGCTC ATCACGTACG GGCCTTCCCT 2280

GCCCGTCTGC CTGGAGGCGG CCGAGGCGGC CCGGGCCGAG GGCTGGGACC TCGAAGTCGT 2340

CGATCTGCGC TCCCTGGTGC CCTTCGACGA CGAGACGGTT GTGCGCGTCG GTGCGCGGAC 2400

CGGACGCGCC GTCGTCGTGC ACGAGTCGGG TGGTťACGGC GGCCCGGGCG GGGAGATCGC 2460

CGCGGGCATC ACCGAGCGCT GCTTCCACCA TCTGGAGGCG CCGGTGCTGC GCGTCGCCGG 2520

GTTCGACATC CCGTATCCGC CGCCGATGCT GGAGCGCCAT CATCTGCCCG GTGTCGACCG 2580

GATCCTGGAC GCGGTGGGGC GGCTTCAGTG GGAGGCGGGG AGCTGATGGC CCAGGTGCTC 2640

GAGTTCAAGC TCCCCGACCT CGGGGAGGGC CTGACCGAGG CCGAGATCGT CCGCTGGCTG 2700

GTGCAGGTCG GCGACGTCGT GGCGATCG 2728 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:6:

(A) DÉLKA: 381 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

-32CZ 289866 B6

Met 1

Thr Val Het

Glu Gin Arg Gly Ala Tyr Arg Pro Thr Pro Pro Pro

5

10

15

Ala

Trp

Gin

Pro

Arg

Thr

Asp

Pro

Ala

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Ala

Leu

20

25

30

Pro

His

Arg

Val

Leu

Gly

Thr

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Asp

Pro

Leu

35

40

45

Leu

Leu

Arg

Arg

Leu

Tyr

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Gly

Arg

Arg

Tyr

Asn

50

55

60

Thr

Gin

Ala

Thr

Ala

Leu

Thr

Lys

Gin

Gly

Arg

Leu

Ala

Val

Tyr

Pro

65

70

75

80

Ser

Ser

Thr

Gly

Gin

Glu

Ala

Cye

Glu

Val

Ala

Ala

Ala

Leu

Val

Leu

85

90

95

Glu

Glu

Arg

Asp

Trp

Leu

Phe

Pro

Ser

Tyr Arg

Asp

Thr

Leu

Ala

Ala

100

105

110

Val

Ala

Arg

Gly

Leu

Asp

Pro

Val

Gin

Ala

Leu

Thr

Leu

Leu

Arg

Gly

115

120

125

Asp

Trp

His

Thr

Gly

Tyr

Asp

Pro

Arg

Glu

His

Arg

Ile

Ala

Pro

Leu

130

135

140

Cys

Thr

Pro

Leu

Ala

Thr

Gin

Leu

Pro

Híb

Ala

Val

Gly

Leu

Ala

His

145

150

155

160

Ala

Ala

Arg

Leu

Lys

Gly

Aep

Asp

Val

Val

Ala

Leu

Ala

Leu

Val

Gly

165

170

175

Asp

Gly

Gly

Thr

Ser

Glu

Gly

Asp

Phe

His

Glu

Ala

Leu

Asn

Phe

Ala

180

185

190

Ala

Val

Trp

Gin

Ala

Pro

Val

Val

Phe

Leu

Val

Gin

Asn

Asn

Gly

Phe

195

200

205

Ala

Ile

Ser

Val

Pro

Leu

Ala

Lys

Gin

Thr

Ala

Ala

Pro

Ser

Leu

Ala

210

215

220

His

Lys

Ala

val

Gly

Tyr

Gly

Met

Pro

Gly

Arg

Leu

Val

Asp

Gly

Asn

225

230

235

240

Asp

Ala

Ala

Ala

Val

His

Glu

Val

Leu

Ser

Asp

Ala

Val

Ala

His

Ala

245

250

255

Arg

Ala

Gly

Gly

Gly

Pro

Thr

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Thr

Tyr

Arg

Ile

260

265

270

Asp

Ala

His

Thr

Asn

Ala

Asp Asp

Ala

Thr

Arg

Tyr Arg

Gly

Asp

Ser

275

280

285

G1U

Val

Glu

Ala

Trp Arg

Ala

His

Asp

Pro

Ile

Ala

Leu

lau

Glu

His

290

295

30Ů

Glu

Leu

Thr

Glu

Arg

Gly

Leu

Leu

Asp

Glu

Asp

Gly

Ile

Arg

Ala

Ala

305

310

315

320

Arg

Glu

Asp

Ala

Glu

Ala

Met

Ala

Ala

Asp

Leu

Arg

Ala

Arg

Het

Asn

325

330

335

Gin

Asp

Pro

Ala

Leu

Asp

Pro

Met

Asp

Leu

Phe

Ala

His

Val

Tyr

Ala

340

345

350

Glu

Pro

Thr

Pro

Gin

Leu

Arg Glu

Gin

Glu

Ala

Gin

Leu

Arg

Ala

Glu

355

360

365

Leu

Ala

Ala

Glu

Ala

Asp

Gly Pro

Gin

Gly

Val

Gly

Arg

370

375

380

-33CZ 289866 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID N0:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 334 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:7:

Met

Thr

Thr

Val

Ala

Leu

Lys

Pro

Ala

Thr

Met

Ala

Gin

Ala

Leu

Thr

1

5

10

15

Arg

Ala

Leu

Arg

Asp

Ala

Met

Ala

Ala

Asp

Pro

Ala

Val

His

Val

Met

20

25

30

Gly

Glu

Aap

Val

Gly

Thr

Leu

Gly Gly

Val

Phe

Arg

Val

Thr

Asp Gly

35

40

45

Leu

Ala

Lys

Glu

Phe

Gly

Glu

Asp

Arg

Cys

Thr

Asp

Thr

Pro

Leu

Ala

50

55

60

Glu

Ala

Gly

Ile

Leu

Gly

Thr

Ala

Val

Gly

Met

Ala

Met

Tyr

Gly

Leu

65

70

75

80

Arg

Pro

Val

Val

Glu

Met

Gin

Phe

Asp

Ala

Phe

Ala

Tyr

Pro

Ala

Phe

85

90

95

Glu

Gin

Leu

Zle

Ser

His

Val

Ala

Arg Asp

Ala

Gin

Arg

Thr

Arg

Gly

100

105

110

Ala

Met

Pro

Leu

Pro

Ile

Thr

Ile

Arg

Val

Pro

Tyr

Gly

Gly Gly

Ile

115

120

125

Gly

Gly

Val

Glu

His

His

Ser

Asp

Ser

Ser

Glu

Ala

Tyr

Tyr

Met

Ala

130

135

140

Thr

Pro

Gly

Leu

His

Val

Val

Thr

Pro

Ala

Thr

Val

Ala

Asp

Ala

Tyr

145

150

155

160

Gly

Leu

Leu Arg

Ala

Ala

Zle

Ala

Ser

Asp Asp

Pro

Val

Val

Phe

Leu

165

170

175

Glu

Pro

Lys

Arg

Leu

Tyr

Trp

Ser

Lys

Asp

Ser

Trp

Asn

Pro

Asp

Glu

180

185

190

Pro

Gly

Thr

Val

Glu

Pro

Zle

Gly

Arg

Ala

Val

Val

Arg

Arg

Ser

Gly

195

200

205

Arg

Ser

Ala

Thr

Leu

Zle

Thr

Tyr

Gly

Pro

Ser

Leu

Pro

Val

Cys

Leu

210

215

220

Glu

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Arg

Ala

Glu

Gly

Trp Asp

Leu

Glu

Val

Val

225

230

235

240

Asp Leu Arg Ser Leu Val Pro Phe Asp Asp Glu Thr Val Val Arg Val

245 250 255

-34CZ 289866 B6

Gly

Ala

Arg

Thr

Gly

Arg

Ala

Val

Val

Val

His

Glu

Ser

Gly

Gly

Tyr

260

265

270

Gly

Gly

Pro

Gly

Gly

Glu

Ile

Ala

Ala

Gly

Ile

Thr

Glu

Arg

Cys

Phe

275

280

285

His

Híb

Leu

Glu

Ala

Pro

Val

Leu

Arg

Val

Ala

Gly

Phe

Asp

Ile

Pro

290

295

300

Tyr

Pro

Pro

Pro

Met

Leu

Glu

Arg

His

His

Leu

Pro

Gly

Val

Asp

Arg

305

310

315

320

Ile

Leu

Asp

Ala

Val

Gly

Arg

Leu

Gin

Trp

Glu

Ala

Gly

Ser

325

330

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ío (C) ŘETĚZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Met Ala Gin Val Leu Glu Phe Lys Leu Pro Asp Leu Gly Glu Gly Leu 15 10 15

Thr Glu Ala Glu Ile val Arg Trp Leu Val Gin Val Gly Asp Val Val 20 25 30

Ala Ile

-35CZ 289866 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 83 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:9:

Ile ser Leu Ile Ala Leu Leu Ala Arg Ile Cys Thr Ala Ala Leu Ala

1

5

10

15

Arg

Phe

Pro

Glu

Leu

Asn

Ser

Thr

Val

Asp

Met

Asp

Ala

Arg

Glu

Val

20

25

30

Val

Arg

Leu

Asp

Gin

Val

His

Leu

Gly

Phe

Ala

Ala

Gin

Thr

Glu

Arg

35

40

45

Gly

Leu

Val

Val

Pro

Val

Val

Arg

Asp

Ala

His

Ala

Arg

Asp

Ala

Glu

50

55

60

Ser

Leu

Ser

Ala

Glu

Phe

Ala

Arg

Leu

Thr

Glu

Ala

Ala

Arg

Thr

Gly

65

70

75

80

Thr Leu Thr

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (1)

1. Způsob výroby přírodního avermektinu, vyznačující se tím, že se za podmínek ave fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, v němž byl zvýšen počet kopií genů kódujících komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenázy nebo zvýšena jejich exprese manipulací nebo nahrazením genů zodpovědných za regulaci této exprese.