NO321077B1 - Isolert DNA-segment som koder for forgrenet alfa-ketosyredehydrogenasekompleks, rekombinant DNA som omfatter DNA-segmentet, vertscelle og plasmid som omfatter rekombinant DNA, samt polypeptid. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler isolert DNA-segment som koder for forgrenet alfa-ketosyredehydrogenasekompleks, rekombinant DNA som omfatter DNA-segmentet, vertscelle og plasmid som omfatter rekombinant DNA, samt polypeptid.

Nærmere bestemt angår oppfinnelsen nye DNA-sekvenser som koder for forgrenet alfa-ketosyredehydrogenasekompleks fra en organisme tilhørende slekten Streptomyces, og nye polypeptider produsert ved ekspresjon av slike sekvenser.

Mange farmasøytiske produkter blir produsert av mikroorganismer. Blant disse organismene har medlemmer av slekten Streptomyces, en gruppe gram-positive jordbakterier, fått

mye oppmerksomhet, idet de har gitt mer enn 90% av de terapeu-tisk nyttige antibiotika.. Streptomycetes er i fokus for intens forskning hvor det anvendes rekombinante DNA-klonings-teknikker for å isolere antibiotiske biosyntetiske gener, danne nye derivater eller hybride forbindelser, isolere regulatoriske gener og undersøke regulatoriske mekanismer som er involvert i både primær og sekundær metabolisme.

S. avermitilis produserer åtte forskjellige, men nært beslektede, antiparasittiske polyketid-forbindelser kalt avermektiner. Avermektin-komplekset produsert av S. avermitilis har fire store komponenter, Ala, A2a, Bla og B2a, og fire mindre komponenter, Alb, A2b, Blb og B2b. Strukturen til de forskjellige komponentene er illustrert nedenfor.

Avermektin-polyketidstrukturen er avledet fra syv acetat-, fem propionatmolekyler og ett alfa-forgrenet fettsyremolekyl, som er enten S(+)-2-metyl-smørsyre eller isosmørsyre. Betegnelsene "A" og "B" refererer til avermektiner hvor 5-substituenten er hhv. metoksy eller hydroksy. Tallet "1" refererer til avermektiner hvor en dobbeltbinding er til stede i 22-23 stillingen, og tallet "2" til avermektiner som har hydrogen i 22-stillingen og hydroksy i 23-stillingen. Endelig har C-25 to mulige substituenter: sek-butyl-substituenten (avledet fra L-isoleucin) er til stede i avermektin "a"-seriene, og isopropylsubstituenten (avledet fra L-valin) er til stede i avermektin "b"-seriene (for en oversikt se Fisher, M.H. og Mrozik, H., 1984, "Macrolide Antibiotics", Academic Press, kapittel 14).

Med "naturlige" avermektiner menes de avermektiner som produseres av S. avermitilis hvor substituenten i 25-stilling, som nevnt ovenfor, enten er isopropyl eller sek-butyl. Avermektiner hvor gruppen i 25-stillingen er annet enn isopropyl eller sek-butyl er her referert til som nye eller ikke-naturlige avermektiner.

En metabolsk rute for disse alfa-forgrenede fettsyrer i deres CoA-form er gjennom en forgrenet aminosyre-transaminase-reaksjon, etterfulgt av en forgrenet alfa-ketosyre-dehydrogenasereaksjon. (Alternativt kan forgrenet fett-acylCoA-derivater oppstå fra forgrenede alfa-ketosyrer som er produsert ved de novo-syntese). Disse metabolske veiene er illustrert nedenfor.

En mutant av S. avermitilis uten noen detekterbar forgrenet alfa-ketosyredehydrogenase- (BCKDH) aktivitet i det sist nevnte enzymet er tidligere isolert (Hafner et al., 1988, europeisk patentsøknad nr. 88300353.5, publikasjon nr. 0 284176). Mutanten ble isolert ved å følge standard kjemisk mutagenese av S. avermitilis stamme ATCC 31272 i en undersø-kelse etter fravær av 14C02-produksjon fra <14>C-l-merket 2-oksoisokapronsyresubstrat (leucin-analog). Mutanten mangler evnen til å syntetisere naturlige avermektiner, unntatt når alfa-forgrenet fettsyre eller en forløper som bærer isopropyl-eller sek-butyl- (S-form) gruppen blir satt til mediet hvor mutantene blir fermentert. Mutanten har også evnen til å produsere nye eller ikke-naturlige avermektiner, når den blir fermentert under vandige aerobe betingelser i et næringsmedium som omfatter en passende alternativ karboksylsyre, så som cykloheksan-karboksylsyre (CHC) eller en forløper.

Å klone S. avermitilis BCKDH er meget ønskelig. Manipu-lering av disse genene gjennom rekombinante DNA-teknikker vil forenkle produksjonen av naturlige og nye avermektiner. For noen stammer vil det forventes en høyere titer for naturlige avermektiner når kopitallet for BCKDH-genene økes. I tillegg vil generering av en irreversibelt blokkert bkd-stamme, som har BCKHD-aktiviteten permanent deletert eller modifisert ved gen-erstatning, være et forbedret alternativ i forhold til den nåværende bkd-mutanten som, som tidligere nevnt, ble dannet ved kjemisk mutagenese.

Alfa-ketosyredehydrogenase-multienzymkomplekser -forgrenet alfa-ketosyredehydrogenase- (BCKDH) komplekset, pyruvat-dehydrogenase- (PDH) komplekset og alfa-ketoglutarat-dehydrogenase- (KGDH) komplekset katalyserer oksydativ dekarboksylering av hhv. forgrenede alfa-ketosyrer, pyruvat og alfa-ketoglutarat, frigjør C02 og genererer de tilsvarende Acyl-CoA og NADH (Perham, R.N., 1991, Biochemistry 30:8501-8512). Hvert kompleks består av tre ulike katalytiske enzy-mer: dekarboksylase (El), dihydrolipoamid-acyltransferase-transacylase (E2) og dihydrolipoamid-dehydrogenase (E3).

Forgrenet alfa-ketosyredehydrogenase (BCKDH) er et multi-enzymkompleks som består av tre funksjonelle komponenter, El, dekarboksylasen, E2, transacylasen og E3, lipoamid-dehydro-genasen. De rensede kompleksene fra Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, og Bacillus subtilis er sammensatt av fire polypeptider. De rensede pattedyr-kompleksene består også av fire polypeptider, Elalfa, Elbeta, E2 og E3. Et alfa-ketosyredehydrogenasekompleks er isolert fra Bacillus subtilis, som har både pyruvat og forgrenet alfa-ketosyredehydrogenase -aktivitet . Dette doble funksjonskomplekset oksyderer pyruvat og fremskaffer forgrenede fettsyrer for membran-fosfolipider.

Kloning av prokaryote forgrenet alfa-ketosyredehydro-genasegener er rapportert for Pseudomonas og Bacillus, men ikke for Streptomyces. I disse systemene ble det funnet at genene som koder for BCKDH var samlet i et operon. Genene for BCKDH-komplekset i Pseudomonas putida er klonet, og nukleotidsekvensen i denne regionen bestemt (Sykes et al., 1987, J. Bacteriol. 169:1619-1625, og Burns et al., 1988, Eur. J. Biochem, 176:165-169, og 176:311-317). Molekylvekten til Elalfa er 45289, til Elbeta 37138, til E2 45134 og til E3 48164. De fire genene er samlet i sekvensen: Elalfa, Elbeta, E2 og E3. Northern blott-analyse indikerte at ekspresjonen av disse fire genene skjedde fra et enkelt mRNA, og at disse genene utgjorde et operon. Det er en typisk prokaryot konsensus-promoter rett foran starten til den Elalfa-kodende regionen som tillater konstitutiv ekspresjon av Pseudomonas bkd-genene. Initierings-kodonet for den Elbeta- kodende regionen er lokalisert bare 40 nukleotider nedstrøms for enden til den Elalfa åpne-leserammen (ORF). I motsetning er det ikke noe intergenisk mellomrom mellom Elbeta og E2 ORFene, siden stoppkodonet for Elbeta ORF er tripletten rett før initieringskodonet til E2 ORF. Det intergeniske mellomrommet mellom E2 og E3 ORFene er redusert til bare 2 nukleotider. Pseudomonas bkd-genene er derfor tett koblet. På lignende måte er operonet som koder for Bacillus subtilis BCKDH/PDH dobbelt-komplékset klonet (Hemila et al., 1990, J. Bacteriol., 172:5052-5063). Dette operonet omfatter fire ORFer som koder for fire proteiner på 42, 36, 48 og 50 kilodalton (kDa) i størrelse, som er vist å ha en høy homologi med Elalfa-, Elbeta-, E2- og E3-subenheter til Pseudomonas bkd-klusteret. Nylig ble også genene som koder for alfa- og beta-subenhetene til El-komponenten i det doble BCKDH/PDH-multienzymkomplekset fra Bacillus stearothermophilus klonet og sekvensert (estimer-te molekylvekter for alfa- og beta-subenhetene er hhv. omtrent 41,000 og 35,000) (Hawkins et al., 1990, Eur.J.Biochem., 191:337-346).

I tillegg er sekvensen fra en rekke eukaryote El-alfa og -beta BCKDH-subenheter (menneske, storfe og rotte) funnet. En aminosyresekvenssammenligning av alle de publiserte sekvensene kjent for både Elalfa og Elbeta-komponentene fra PDH- og BCKDH-kompleksene fra en rekke arter ble nylig utført ved computer-analyse (Wexler et al., 1991, FEBS Letters, 282:209-213). Det ble identifisert flere regioner av alfa- og beta-subenhetene som er høyt konservert, ikke bare i alle PDH som til nå er beskrevet, men også i både prokaryote og eukaryote BCKDH-komplekser.

Vi beskriver kloningen av forgrenet alfa-ketosyredehydrogenase -gener fra Streptomyces avermitilis. De nye genene ble klonet ved å anvende en kombinasjon av to molekylære genetiske teknikker, DNA-polymerasekjedereaksjon (PCR) og homologi-probing. Homologi-probing involverer under-søkelse av cDNA eller genomiske biblioteker med radioaktivt merkede syntetiske oligonukleotidprober som korresponderer med aminosyresekvensen til proteinet. Denne teknikken har dess-verre visse begrensinger, hvorav en er den sterke begren-sningen på degenerasjonen av oligonukleotidet som kan bli anvendt. I tillegg blir undersøkelseshybridisering utført ved lav stringens, slik at antall falske positiver ofte er høyt. For å unngå noen av begrensningene ved oligonukleotid-hybridisering ble det nylig utviklet en variasjon av homologi-probing som involverer DNA-polymerasekjedereaksjon (PCR), og som tillater anvendelse av meget degenererte oligonukleotider som prober. Denne metoden krever bare kunnskap om aminosyresekvensen i to korte regioner (omkring 7-10 aminosyrer lange) fra det kodete proteinet. To oligonukleotider som korresponderer med hver peptidsekvens er anvendt som primere i reaksjonen. Hver primer kan bli anvendt som en blanding av fullstendig degenererte oligonukleotider som omfatter alle mulige kodon-kombinasjoner som kan kode for de kjente aminosyresekvensene. Templater for amplifiseringen kan være hvilken som helst av ulike DNA-kilder, omfattende genomisk DNA og supercoilede former for plasmidbiblioteker. Flere rapporter som nylig er publisert i litteraturen har demonstrert nytten av å kombinere polymerasekjedereaksjonen med homologi-probing for identifisering av et gen fra mange arter.

Ordliste

Tekniske begreper anvendt i foreliggende søknad er vel-kjente for fagfolk innen feltet molekylærgenetikk. Definisjon av disse begrepene finnes i mange lærebøker innen feltet molekylærbiologi, så som "Genes", annen utgave, av Dr. Benja-min Lewin, 1985, John Wiley & Sons, Inc. New York. Begreper som er mye brukt i dette dokumentet er definert nedenfor: Antibiotikum: Et kjemisk agens som hemmer vekst av bakterieceller. Anvendt for å selektere rekombinante bakterieceller. Antibiotikum- resistensgen: DNA-sekvens som gir resistens mot antibiotika ved innføring i en vertscelle som naturlig er sensitiv for dette spesielle antibiotikum. Også kjent som antibiotisk markør.

Bakteriofager: Virus som infiserer bakterier.

cRNA: Enkeltrådet RNA som er komplementært med et DNA, syntetisert fra sist nevnte ved in vitro-transkripsjon. Kromosom: Adskilt enhet av genomet som bærer mange gener. Klon: Stort antall celler eller molekyler som er identiske, med en enkelt forløper.

Kloningsvektor: Hvilket som helst plasmid hvor et fremmed DNA kan bli satt inn for å bli klonet. Den bringer fremmed DNA inn i en vertsbakteriecelle ved transformasjon.

CoA: Coenzym A.

Kohesiv endesekvens ( Cos): DNA-sekvens avledet fra bakteriofag lambda, noe som tillater in vitro-pakking.

Kosmid: Plasmid hvor bakteriofag lambda cos-seter er satt inn; som et resultat kan plasmid DNAet (som bærer fremmed DNA-innskudd) bli pakket in vitro i fagens kappe.

Dalton. Enhet for masse som er vanlig brukt i forbindelse med molekylære dimensjoner korresponderende med ett hydrogenatom. DNA- ligering: Dannelse av en kjemisk binding som kobler to DNA-fragmenter.

Eukaryote celler: Celler fra høyere organismer som inneholder en membranomringet kjerne.

Gen- kluster: En gruppe gener som er fysisk nær på kromosomet. Genom: Et helt kromosomsett. Den totale summen av alle genene til et individ.

Hybridisering, koloni- hybridisering: Teknikk anvendt for å identifisere bakterie-kolonier som bærer kimære vektorer, hvis DNA-innskudd ligner en spesiell sekvens.

kb: Forkortelse for 1000 basepar av DNA eller RNA.

NADH: Redusert nikotinamid-adenindinukleotid.

Linker: Kort syntetisk oligodeoksynukleotid-dupleks som omfatter målsetet for ett eller flere restriksjonsenzymer. Det er tilført en vektor for å skape en ny polylinker eller multippelt kloningssete (MCS).

Nukleotid: Byggesten, eller monomer enhet, for nukleinsyrer. Oligonukleotid: Kort kjede av oligonukleotider.

Operon: En fullstendig enhet for bakteriell genekspresjon og regulering, omfattende strukturelle gener, regulatoriske gener og kontrollelementer i DNA som gjenkjennes av regulatorgen-produkt(er).

Plasmid: Autonomt, selvreplikerende, ekstrakromosomalt sirkulært DNA.

Plasmid kopitall: Antall plasmidmolekyler opprettholdt i bakterien for hvert vertskromosom.

Primer: Kort DNA- eller RNA-sekvens som parres med en DNA-tråd og gir en i 3'-0H-ende hvor en DNA-polymerase starter syntese av en deoksyribonukleotidkjede.

Prokaryote celler: Små, relativt enkle celler, omfattende de fleste mikroorganismer.

Promoter: Region av DNA som er ansvarlig for transkripsjons-initiering.

Restriksjonsenzym: Enzym som gjenkjenner en kort, spesifikk DNA-sekvens, og spalter denne.

Restriksjons- gjenkjenningssekvens: DNA-sekvens som blir spesifikt gjenkjent av et spesielt restriksjonsenzym. Også kjent som målsete.

Pendel- vektor: Bifunksjonell kloningsvektor som kan replikere i en eller flere alternative verter (f.eks E. coli og Streptomyces).

Southern blotting: Prosedyren for å overføre denaturert DNA fra en agarosegel til et nitrocellulosefilter hvor det kan bli hybridisert med en komplementær nukleinsyreprobe.

Subkloning: Overføring av klonede DNA-fragmenter fra en type vektor til en annen, f.eks fra et rekombinant kosmid til et plasmid. Det nye rekombinante plasmidet blir så transformert inn i en egnet vertscelle for å produsere en subklon-stamme. Transkripsjon: Syntese av RNA fra et DNA-templat. Transformasjon av bakterieceller: Beskriver ervervelse av nye genetiske markører ved innføring av tilsatt DNA.

Foreliggende oppfinnelsen angår et isolert DNA-segment som koder for forgrenet alfa-ketosyredehydrogenasekomplekset fra en organisme som tilhører slekten Streptomyces, kjenne-tegnet ved at nevnte DNA-segment omfatter DNA-sekvensen i

SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID

NR:4, eller SEKVENS ID NR:5 eller en allelisk variasjon av slike sekvenser.

Foreliggende oppfinnelse angår også et isolert DNA-segment, som beskrevet ovenfor, som videre omfatter en DNA-region som regulerer ekspresjonen av et slikt forgrenet alfa-ketosyredehydrogenasekompleks.

Foreliggende oppfinnelsen angår også et isolert DNA-segment som koder for Streptomyces avermitilis forgrenet alfa-ketosyre-dehydrogenasekomplekset.

Foreliggende oppfinnelsen angår også et DNA-segment som omfatter DNA-sekvensen i SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID NR:4 eller SEKVENS ID NR:5, som beskrevet nedenfor, eller en allelisk variasjon av slik sekvens. Den angår også et DNA-segment som er en del av fore-gående DNA-segmentet, og funksjonell ekvivalent med denne.

Foreliggende oppfinnelse angår også (a) rekombinant DNA som omfatter DNA-sekvensen i SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID NR:4 eller SEKVENS ID NR:5 eller en allelisk variasjon av slike sekvenser; (b) et plasmid omfattende slik rekombinant DNA; og (c) en vertscelle i hvilken slikt rekombinant DNA er blitt innført.

Foreliggende oppfinnelse angår også genene for forgrenet alfa-ketosyredehydrogenasekompleks omfattet i et DNA-segment valgt fra gruppen bestående av pCD528, pCD545, pCD574, pCD550, pCD559 og pCD577, som definert nedenfor.

Foreliggende oppfinnelsen angår også et DNA-segment som omfatter DNA-sekvensen i SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID NR:4 eller SEKVENS ID NR:5, eller en allelisk variasjon av slike sekvenser.

Foreliggende oppfinnelse angår også et DNA-segment som omfatter en DNA-sekvens som er en undergruppe av DNA-sekvensen

i SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS

ID NR:4, eller SEKVENS ID NR:5, eller en allelisk variasjon derav, og som kan hybridisere under stringente betngelser til henholdsvis SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID NR:4, eller SEKVENS ID NR:5, eller en allelisk variasjon derav, når det anvendes som probe, eller amplifisere hele eller deler av slike sekvenser når det anvendes som polymerasekjedereaksjonsprimer.

Foreliggende oppfinnelsen angår også et vesentlig renset polypeptid omfattende aminosyresekvensen i SEKVENS ID NR:6, SEKVENS ID NR:7, SEKVENS ID NR:8, eller SEKVENS ID NR:9.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1: Nukleotidsekvensen av polymerasekjedereaksjon-(PCR) primere anvendt for å klone et fragment av S. avermitilis El-alfa BCKDH-genet. Den deduserte aminosyresekvensen som er kodet av hvert oligonukleotid er vist ovenfor den korresponderende DNA-sekvensen. Piler indikerer amplifiseringsretning. Figur IA er en høyrevendt primer, og figur IB er en venstrevendt primer. Figur 2: Forgrenet alfa-ketosyredehydrogenase-sekvens-sammenligning. Oppstilling av de deduserte

aminosyresekvensene for Streptomyces avermitilis (Sa) PCR-klonet CD503-genomisk fragment, Bacillus stearothermophilus (Bs), Pseudomonas putida (Pp) og Homo sapiens (Hs). Vertikale merker markerer aminosyreenheter. Lokalisering av sekvenser korresponderende med høyrevendte og venstrevendte PCR-primere anvendt for kloning er indikert (hhv. topp venstre og høyre).

Figur 3: Genomisk restriksjonskart, lokalisering og subkloner for Streptomyces avermitilis bkd-genklusteret. Den svarte boksen nedenfor kartet indikerer lokaliseringen og orienteringen av det initielle El-alfa-spesifikke S. avermitilis CD503 genomiske fragmentet klonet ved å anvende PCR. Genomiske subkloner (derivater av pGEM-3Z) er indikert.

Lokaliseringen og organiseringen av bkd-strukturelle gener som koder for El-alfa (Ela), El-beta (Elb) og E2 BCKDH-subenheter er også indikert. Polaritet av identifiserte åpne leserammer (markert ved bokser) er fra venstre mot høyre. Forkortelser: B, BamHI; E, EcoRI; K, Kpnl; Bg, Bgl II og S, SphI.

Figur 4A, 4B, 4C, 4D, 4E og 4F: Nukleotidsekvens og deduserte translasjonsprodukter fra 2,728-bp S. avermitilis-genomisk DNA-fragment omfattende El-alfa-, E2-beta- og E2-(delvis) bkd-åpne leserammer (ORF'er). El-alfa ORF strekker seg fra posisjon 403 til 1548 i sekvensen, El-beta ORF strekker seg fra posisjon 1622-2626 og E2 ORF starter ved posisjon 2626. Nukleotider er nummerert på toppen av sekvens1injene. Stoppkodonene er indikert med en stjerne (<*>). Sannsynlig

Shine-Dalgarno ribosombindingssetesekvenser er understreket. BamHI-restriksjonsgjenkjenningssekvenser er innrammet. Figur 5: Nukleotidsekvens og deduserte translasjonsprodukter fra 0,8 kb Bglll-SphI S. avermitilis genomisk DNA-fragment (pCD539) omfattende en del av E2 bkd-ORF.1 251 bp, startende fra Bglll-setet (innrammet), ble sekvensert. Nukleotider er nummerert på toppen av sekvenslinjene. Figur 6: Nukleotidsekvensen i polymerasekjedereaksjon (PCR) mutagene (høyre) og universelle (venstre) primere anvendt for å konstruere pT7-derivater for heterolog ekspresjon av S. avermitilis bkd-genene i E. coli. PCR-primere ble anvendt for å innføre et Ndel-restriksjonssete ved translasjons-startkodonet til El-alfa eller El-beta S.. avermitilis bkd ORFer (hhv. primer-par 55:31 og 56:30). Den deduserte aminosyresekvensen som kodes av hver mutagene oligodeoksynukleotid er vist over de korresponderende DNA-sekvensene. Restriksjonsgjenkjenningssekvensene er indikert.

Piler indikerer retningen på amplifisering. Figur 6A er høyrevendte mutagene primere, og figur 6B er venstrevendte mutagene primere.

De nye prosedyrene for å klone S. avermitilis bkd-genene og bestemmelsen av den primære strukturen til genene som koder for S. avermitilis BCKDH-multienzymkomplekset er beskrevet nedenfor. Først ble to PCR-primere, kalt "høyrevendt" og "venstrevendt" (figur 1), designet ut fra konserverte regioner identifisert fra en multippel sammenligning av deduserte El-alfa BCKDH-peptidsekvenser fra ulike arter, tilgjengelige i litteraturen. Et PCR-produkt, omtrent 0,2 kb langt, ble detektert ved amplifisering av S. avermitilis genomisk DNA ved å anvende både høyrevendte og venstrevendte primere. Dette PCR-ampiifiserte DNA-fragmentet ble deretter klonet i E. coli-vektoren pGEM-3Z for å produsere rekombinant plasmid pCD503. Deretter ble plasmid pCD503 transformert i E. coli DH5-alfa kompetente celler. En transformant ble betegnet som stamme CD503. DNA-sekvensering av klonet DNA-fragment CD503 viste eksistensen av en åpen leseramme med et dedusert peptid som har høy homologi til El-alfa. BCKDH-subenhet (figur 2). Klonet CD503 genomisk DNA-fragment ble så anvendt som probe for å undersøke et S. avermitilis kromosomalt bibliotek ved koloni-hybridisering. Fire kosmid-kloner ble identifisert, kalt CD518, CD519, CD520 og CD521. Restriksjons- og Southernblott-analyser viste at de fire klonene bar overlappende genomiske fragmenter. DNA-sekvensering av "nøstede" delesjoner fra sub-klonede genomiske DNA-fragmenter (som fullstendig beskrevet i eksempel #8) demonstrerte at sekvens CD503 er en del av et komplett bkd-genkluster. Klonede S. avermitilis bkd-gener omfatter en region av kromosomet på omtrent 15 kilobaser i lengde (figur 3). DNA-sekvensanalyse viste tilstedeværelse av antatte transkripsjonspromotersekvenser og bkd-strukturelle gener, arrangert i et kluster som følger: promotersekvens, El-alfa, El-beta og E2 åpne leserammer (figurene 4 og 5).

Til slutt ble det komplette S. avermitilis bkd-genklusteret klonet nedstrøms for den sterke Escherichia coli T7-promoteren for ekspresjon i en E. coli-vert. På lignende måte ble El-alfa og El-beta åpne leserammer (ORF^er) også klonet enten separat eller sammen nedstrøms for T7-promoteren, og hver konstruksjon ble testet for ekspresjon. Nye PCR-mutagene primere, anvendt for å innføre unike Ndel-restriksjonsseter ved ATG translasjons-starten i El-alfa og El-beta ORF^ene, er fullstendig beskrevet i eksempel #9 (se også figur 6). Den doble plasmid T7-ekspresjonsystem-undersøkelsen demonstrerte at minst to åpne leserammer fra det CD503-avledede S. avermitilis bkd-genklusteret (El-alfa og El-beta) er fullt translaterbare når uttrykt i E. coli. I tillegg bekreftet enzymatiske tester for å analysere spesifikt El-komponenten av BCKDH-komplekset, entydig at to av de rekombinante E. coli-klonene, hvor en bærer hele bkd-genklusteret og den andre bærer El-alfa og El-beta 0RF"ene sammen, inneholdt El BCKDH-spesifikk enzym-aktivitet (tabell 1).

Vi beskriver isolering av bkd-genene fra avermektin-produserende Streptomyces avermitilis. Det store Streptomyces-genomet (ca. IO<4> kb) er mer enn det dobbelte av det til Escherichia coli. Streptomycetes-genomet er sammensatt av DNA med et ekstremt høyt guanosin pluss cytosin- (G+C) innhold (gjennomsnittlig opp til 73%, med noen regioner > 90%), nært opptil den øvre grensen observert i naturen. Disse distinkte karakteristikkene gjør det nødvendig med utvikling av streptomycetes-spesifikke rekombinante DNA-teknikker. Eksempler på slike forsøk kan bli funnet i US patentsøknad nr. 08/048,719, innlevert 16. April, 1993 og US patentsøknad nr. 08/032,925, innlevert 18. Mars, 1993). Disse søknadene er tatt med her i sin helhet ved referanse.

Andre teknikker som er spesielt optimalisert for foreliggende oppfinnelse, så som PCR-ampiifisering av genomisk DNA, produksjon av "nøstede" delesjoner, DNA-sekvensering og heterolog ekspresjon av S. avermitilis bkd-genene i E. coli er beskrevet detaljert i eksempel-avsnittet.

En fullstendig beskrivelse av de eksperimentelle trinnene involvert i kloningen av S. avermitilis bkd-genene, og de opnådde resultatene, følger: (a) Identifikasjon av konserverte regioner i El- alfa BCKDH-peptidsubenheten som kan fungere som kandidat- seter for binding av PCR- primere.

Fire El-alfa BCKDH-peptidsekvenser fra menneske (Fisher et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:3448-3453), rotte (Zhang et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch et al., 1988, Eur. J. Biochem., 176:311-317) og Bacillus stearothermophilus (Perham et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191:337-346) ble sammenlignet for å identifisere konserverte regioner som kan fungere som kandidat-sekvenser for å designe korresponderende PCR-primere. Computer-analyse for å identifisere regioner av El-alfa-subenheten som er høyt konservert i både prokaryote og eukaryote BCKDH-komplekser ble utført ved å anvende LineUp og Pretty-programmene fra GCG-sekvens-analyse programpakke (Madison, WI). Flere oppstillin-ger av de fire Elalfa BCKDH-peptidene viste flere regioner med utvidet homologi (se Wexler, I.D. et al., 1991, FEBS Letters, 282:209-213). Tiamin-pyrofosfatbindingsmotivet (Perham et al., 1989, FEBS Letters, 255:77-82) lokalisert mellom human El-alfa aminosyrer 182-229, og en region omfattende fosforyleringssetene 1 og 2, omspennende aminosyrer 245-289 var bemerkelsesverdig konservert i alle fire analyserte El-alfa BCKDH-peptidene. Tilstede var også en tidligere beskrevet region med høy homologi, lokalisert mellom aminosyrene 291-307. Denne regionen ser ut til å være unik for alfa-ketosyredehydrogenaser som har både alfa- og beta-subenheter, og er ikke homolog med noen sekvens i E. coli PDC El eller El-komponentene fra E. coli og gjær alfa-ketoglutaratdehydro-genasekompleksene, som er dimere sammensatt av ett enkelt El-polypeptid. Av de ovenfor nevnte grunner er den siste regionen med homologi foreslått å spille en rolle i en subenhet-interaksjon (Patel et al., 1991, FEBS Letters, 282:209-213). Konserverte regioner valgt for PCR-primer-design koder for aminosyre-enhetene 192 til 200, og 370-376 fra human El-alfa BCKDH-proteinet. (b) Design av nye oligonukleotider avledet fra El- alfa BCKDH-konserverte regioner som skal bli anvendt som PCR- primere.

Som tidligere beskrevet ble to konserverte regioner av El-al.fa BCKDH-subenheten valgt fra fler-sammenligningsanaly-sen. Den høyrevendte PCR-primeren (figur 1) ble designet fra en region som dekker aminosyrene 192-200 fra human El-alfa BCKDH-subenheten, hvilken ble anvendt som en representativ modell for en El-alfa BCKDH-subenhet. Disse aminosyrene er lokalisert innen tiamin-pyrofosfatbindingsmotivet. Den venstrevendte PCR-primeren (figur 1) ble designet fra en region som dekker aminosyrene 370-376 fra El-alfa BCKDH-sub-' enheten. Denne siste aminosyresekvensen er lokalisert nær den C-terminale enden i peptidet. Streptomyces gen-kodonbruk ble anvendt (F. Wright og M. J. Bibb, 1992, Gene, 113:55-65). Ved 5'-enden av hver primer er det en restriksjonsenzym-gjen-kj enningssekvens (EcoRI i den høyrevendte primeren og Xbal i den venstrevendte primeren) for å forenkle kloningen av PCR-produktene. Den komplette sekvensen for den høyrevendte PCR-primeren er:

5'- GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3'.

Den komplette sekvensen for den venstrevendte PCR-primeren er:

51 - TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3'.

Sekvenser som ikke er homologe med El-alfa bkd-genene, og inkorporert i primerene for kloningsformål, er understreket (se også figur 1). (c) PCR- amplifisering av S. avermitilis genomiske DNA- fragmenter. S. avermitilis genomisk DNA ble enzymatisk amplifisert ved å anvende reaksjonsbetingelser egnet for DNA med et høyt GC-innhold, noe som tillater effektiv og spesifikk amplifisering av streptomycetes DNA (se eksempel 2). PCR ble utført ved å anvende primer-kombinasjdnen beskrevet ovenfor (høyrevendt primer, 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3<1 >og venstrevendt primer, 5<1->TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3<1>). Amplifiseringsproduktene ble størrelsesfraksjonert ved agarosegelelektroforese. Under PCR-betingelsene beskrevet ovenfor ble et enkelt DNA-bånd (omtrent 250 bp. langt) detektert når denne primerkombinasjonen anvendes. (d) Kloning av amplifisert genomisk DNA- fragment i Escherichia coli- kloningsvektor og påfølgende transformering i E. coli-vert.

Som nevnt tidligere ble et EcoRI-restriksjonssete innført i den høyrevendte PCR-primeren for enklere kloning, og et Xbal-restriksjonsete var tilstede i 5'-enden av den venstrevendte primeren. Forsøk på å klone 0,25 kb PCR-fragmentet ved å anvende en ligeringsprosedyre hvor både innskudd og kloningsvektor var kuttet med EcoRI og Xbal var imidlertid ikke vellykket. En alternativ fremgangsmåte for å klone 0,25 kb PCR-fragmentet, som involverer anvendelse av Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I for å produsere rette ender i PCR-fragmentet, ble derfor prøvet. En enkelt rekombinant klon ble oppnådd etter å ha satt inn det rett-endede fragmentet i en rett-ehdet, Smal-linearisert E. coli vektor (pGEM-3Z[f+]), for å produsere rekombinant plasmid pCD503. pCD503 ble deretter innført i E. coli DH5-alfa kompetente celler ved transformasjon. Den valgte transformanten ble betegnet som stamme CD503. Bekreftende restriksjonsanalyse viste at plasmid pCD503, isolert fra E. coli stamme CD503, virkelig inneholdt 0,25 kb S. avermitilis-innskuddet. (e) Subkloning av det 0, 25 kb PCR- amplifiserte DNA- innskuddet i bakteriofag M13, DNA- sekvensering av klonet fragment og identifisering av bkd- spesifikke sekvenser.

0,25 kb innskuddet som er tilstede i plasmid pCD503 ble subklonet i bakteriofag M13. For å utføre dette ble innskuddet først frigjort fra E. coli-vektoren ved fordøying av pCD503med EcoRI og Pstl, to restriksjonserizymer hvis gjenkjenningsseter er tilstede i fler-kloningssetet til pGEM-vektoren ved begge sider av det klonede innskuddet. Det spesifikke fragmentet ble så klonet både i EcoRI-behandlet, Pstl-behandlet M13 mpl8 og mpl9 vektorer. Kloning i begge vektorer sikrer muligheten for å produsere enkelttrådet DNA av begge trådene, fra DNA-innskuddet for sekvensering. En klon inneholdende det spesifikke innskuddet, valgt fra mpl8 tranfeksjons-forsøket ble. betegnet stamme CD505. En annen klon som også inneholder det spesifikke innskuddet, men valgt fra mpl9 transfeksjons-forsøket, ble betegnet CD506. DNA-sekvensering ble utført ved dideoksynukleotidkjedetermineringsmetoden, med enkelttrådet DNA-templat og TaqTrack-settet (Promega). For alle tilfellene ble begge trådene av DNA, en anskaffet fra klon CD505 og den komplementære tråden anskaffet fra klon CD506, sekvensert. Kodon-preferanseanalyse (GCG sekvensanalyse programvarepakke, Madison, WI) av DNA-sekvenseringsdata oppnådd fra klonene CD505 og CD506 viste eksistensen av en åpen leseramme som har den rette kodonbruken for et streptomycetes gen.

Den antatte åpne leserammen ble deretter translatert til en aminosekvens ved å anvende Seq and Translate- programmene til IntelliGenetics Suite programvare (IntelliGenetics Inc., Mountain View, California). Databaselikhetssøk mot forespør-sel-peptidsekvensen ble til slutt kjørt ved å anvende FASTDB-programraet til IntelliGenetics programvare. Alle database-søk, enten DNA-baser (GenBank og EMBL) eller protein databaser (PIR og Swiss-Prot), viste entydig at sekvensen oppnådd fra klon CD503 var meget homolog med, men ny og distinkt fra alle andre El-alfa BCKDH-peptider oppført i databasene, av både prokaryot og eukaryot opprinnelse. En multippel sammenligning av El-alfa BCKDH-peptidsekvenser fra menneske, rotte, Pseudomonas putida, og Bacillus stearothermophilus, og inklu-sive den nye Streptomyces avermitilis El-alfa BCKDH CD503-peptidsekvensen er vist i figur 2. Fra disse data kan det bli konkludert at det 250 bp S. avermitilis genomisk PCR-produktet klonet i E. coli-r stamme CD503 virkelig representerte et nytt El-alfa bkd-genfragment. (f) Kloning av hele S. avermitilis bkd- genklusteret, restriksjons- og Southern blott- analyser og konstruksjon av kromosomalt kart.

Et ca. 0,25 kb langt BamHI/EcoRI DNA-fragment fra pCD503, som bærer El-alfa bkd-spesifikk S. avermitilis DNA-sekvens ble anvendt som en radioaktivt merket probe for å undersøke et S. avermitilis genomisk DNA kosmid-bibliotek ved koloni-hybridisering. Fire kloner (CD518, CD519, CD520 og CD521) ble identifisert og gjenvunnet. Restriksjons- og Southern blott-hybridiseringsanalyser viste at de fire klonene inneholdt overlappende sekvenser som stammet fra den samme kromosomale regionen. Den samme proben ble anvendt ved høy stringens mot Southern blott av fordøyd kromosomalt DNA fra S. avermitilis ATCC 31272. Den sist nevnte analysen bekreftet identiteten av klonene gjenvunnet fra det genomiske bibliote-ket. Et restriksjonskart over den genomiske regionen som omfatter S. avermitilis CD503-sekvensen er vist i figur 3. (g) Subkloning av genomiske DNA- fragmenter avledet fra klonene CD518 og CD521, og DNA- sekvensering av S. avermitilis kromosomal region som bærer bkd- genklusteret ( genklyngen).

Genomiske fragmenter (1-2 kb lange) som dekker hele CD503 bkd-regionen fra S. avermitilis-kromosomet ble subklonet fra DNA-bibliotek-klonene CD521 og CD518 i E. coli-vektor pGEM-3Z.

En liste med subklonene konstruert under dette arbeidet, omfattende en kort beskrivelse av hvert plasmid, følger: 1: Plasmid pCD528 omfatter et 7 kb BamHI-fragment, subklonet fra pCD518; 2: Plasmid pCD545 omfatter et 2,3 kb Sphl-fragment, subklonet fra pCD528; 3: Plasmid pCD550 omfatter et 6 kb SphI-fragment, subklonet fra pCD521; 4: -Plasmid pCD559 omfatter et 7 kb BamHI-fragment, subklonet fra pCD521; 5: Plasmid pCD574 omfatter et 4,2 kb SphI-Bglll-fragment, subklonet fra pCD550; og 6: Plasmid pCD577 omfatter et omtrent 10,4 kb innskudd. Dette innskuddet omfatter 2 nabostilte genomiske fragmenter satt tilbake sammen: et 4,2 kb Sphl/Bglll-fragment, subklonet fra pCD550, og et 6,2 kb BglII/BamHI-fragment, subklonet fra pCD559. Plasmid restriksjons-kartlegging, Southern hybridisering og PCR-analyser bekreftet identiteten til hver subklon. Sanger kjedetermineringsmetoden ble anvendt for bestemmelse av nukleotidsekvensen. For dette formålet ble S. avermitilis genomiske fragmenter deretter subklonet i M13mpl8 og M13mpl9 bakteriofager, for å bestemme sekvensen til begge DNA-trådene. Flere DNA-restriksjonsfragmenter ble isolert fra de pGEM-avledede kloner nevnt ovenfor og ligert i M13mpl8 og M13mpl9, og de følgende rekombinante fagene resulterte: CD535: 0,4 kb S. avermitilis DNA-fragment klonet ved PCR ved å anvende pCD528 DNA som templat, spesifikk primer 29-PCR-EX (51-A AGAATTCTCGAGCTGGCCCACAAGGCCGTCGGCTAC-31) og universell primer 31-PCR-BP (se eksempel #9 og figur 6). Amplifisert fragment ble kuttet med EcoRI og Pstl, og klonet i EcoRI/Pstl-linearisert M13mpl8 DNA.

CD536: Samme DNA-fragment som beskrevet ovenfor, klonet i M13mpl9 DNA.

CD537: 1,15 kb Sali DNA-fragment som bærer sekvensen CD503, subklonet fra pCD528 til M13mpl8.

CD538: 1,15 kb Sali pCD528 DNA-fragment (lokalisert oppstrøms for 1,15 kb Sali-fragmentet beskrevet ovenfor) klonet i M13mpl8.

CD539: 1,15 kb BamHI/Bglll DNA-fragment, subklonet fra pCD550 til M13mpl8.

CD540: Samme DNA-fragment som beskrevet ovenfor, klonet i motsatt orientering i M13mpl9 DNA.

CD541: 0,35 kb Sall/BamHI DNA-fragment, subklonet fra pCD528 til M13mpl8.

CD542: 0,35 kb Sall/BamHI DNA-fragment, subklonet fra pCD528 til M13mpl9.

CD553: 0,8 kb BamHI/Bglll DNA-fragment, subklonet fra pCD550 til M13mpl8.

CD554: 1,1 kb BamHI DNA-fragment, subklonet fra pCD550 til M13mpl8.

CD555: Samme DNA-fragment som beskrevet ovenfor, klonet i motsatt orientering i M13mpl8.

CD558: 0,8 kb BamHI/HindiII DNA-fragment, subklonet fra pCD553 til M13mpl9.

CD561: 1,15 kb Sali DNA-fragment, subklonet fra pCD537 til M13mpl8 (omvendt orientering av den tilstede i konstruksjon CD537).

CD565: 1,15 kb Sali DNA-fragment, subklonet fra pCD537 til M13mpl9.

CD566: 1,15 kb Sali DNA-fragment, subklonet fra pCD537 til M13mpl9 (omvendt orientering av den tilstede i konstruksjon CD565).

CD567: 1,15 kb Sali DNA-fragment, subklonet fra pCD538 til M13mpl9.

CD582: 0,8 kb BamHI/Bglll DNA-fragment, subklonet fra pCD550 til M13mpl8 (omvendt orientering av den tilstede i CD553).

S. avermitilis genomisk innskudd båret av disse klonene ble deretter forkortet ved behandling med eksonuklease III, for å gi en serie subkloner ("nøstede delesjoner", se eksempel #8) . (h) Computer- analyse av DNA- sekvenserings- data oppnådd fra klonede DNA- fragmenter og identifisering av S. avermitilis El-alfa-, El- beta- og E2- bkd åpne leserammer.

Nukleotidsekvensen av den 2,7 kb S. avermitilis genomiske regionen som omfatter bkd-genene er vist i figur 4. Glidende basesammensetningsanalyse av den 2,7 kb genomiske regionen omfattende S. avermitilis El-alfa-, El-beta- og E2-bkd (ufull-stendig) bkd-åpne leserammer (ORF) ble utført ved å anvende "DNA Inspector" programpakken. Denne analysen ga en profil av det løpende gjennomsnittet av G+C-innholdet ved å anvende en strekklengde på 30 baser, og en forskyvningsverdi på 20. Totalt G+C-innhold korresponderende med denne regionen av S. avermitilis kromosomet var 72%. Et lavt G+C-område (G+C-innhold omkring 50%), noe som er en indikasjon på en promoter-region, ble lokalisert rett oppstrøms for de bkd-åpne lese-rammene.

G+C-innholdet som en funksjon av kodon-posisjon ble også. analysert. Åpne leserammer ble detektert ved å anvende pro-grammet "CodonPreference" (Genetics Computer Group, Madison, WI) med en Streptomyces kodonbruk-tabell for 64 gener (F. Wright og M.J. Bibb, 1992, Gene, 113:55-56). CodonPreference-programmet er en rammespesifikk gen-finner som prøver å gjenkjenne protein-kodende sekvenser i kraft av deres likhet med en kodon-frekvenstabell, eller ved deres sammensetning (vanligvis GC) i den tredje posisjonen av hvert kodon. ORFer er vist som bokser nedenfor plottet for deres respektive leserammer. Alle start- (ATG) og stoppkodoner ble også detektert (vertikale linjer). Sjeldne kodoner som er funnet i hver leseramme ble markert nedenfor hver ORF-plott. G+C-innholdet ble kalkulert ved å anvende et glidende vindu på 25 kodoner, slik at en forsinkelse på omkring 25 kodoner var forventet før den fulle virkningen av en proteinkodende region ble observert. Tre profiler ble oppnådd, som følger: 1, første posisjon i triplett; 2, andre posisjon i triplett; 3, tredje posisjon i triplett. Som et resultat av denne analysen ble tre bkd-0RF'er lokalisert, svarende til følgende BCKDH-subenheter: El-alfa, El-beta, E2 (Figurene 4 og 5). (i) Design av nye oligonukleotider som skal bli anvendt som primere for PCR- basert, sete- dirigert mutagenese.

Linker- eller PCR-basert, sete-dirigert mutagenese ble anvendt for å innføre et Ndel-restriksjonssete ved ATG-translasjonssetet til El-alfa og El-beta ORF"ene. Følgende nye oligonukleotider ble designet (se også eksempel #9 og figur 6):

Venstrevendte universale ( vektor) primere:

Høyrevendte mutagene primere:

(j) Sete- dirigert mutagenese avpå S. avermitilis bkd- gener for å danne nytt Ndel- restriksjonssete oppstrøms for en åpen leseramme.

Ekspresjonsplasmider ble avledet fra plasmid pT7-7 (se S. Tabor, 1990. I Current Protocols in Molecular Biology, s. 16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) som bærer El-alfa, El-beta, El-alfa pluss El-beta ORF'er eller det komplette S. avermitilis bkd-genklusteret. Ndel-restriksjons-seter ble dannet ved PCR-basert, setedirigert mutagenese. Fem ekspresjonsplasmider ble konstruert for dette studiet som følger: Plasmid pCD670: Derivat av pT7-7 som bærer S. avermitilis El-alfa bkd-åpen leseramme (ORF1). Et Ndel-restriksjonssete omspennende ATG-startkodonet ble innført i S. avermitilis El-alfa bkd-genet ved amplifisering, og samtidig mutagenese, ved å anvende den PCR-mutagene primeren 55-PCR (se eksempel #9 og figur 6).

Plasmid pCD666: Derivat av pT7-7 som bærer S. avermitilis El-beta bkd-åpen leseramme (0RF2). Et Ndel-restriksjonssete omspennende ATG-startkodonet ble innført i S. avermitilis El-beta bkd-genet ved amplifisering, og samtidig mutagenese, ved å anvende den PCR-mutagene primeren 56-PCR (se eksempel #9 og figur 6). For å oppnå optimal ekspresjon av denne ORF ble den tredje posisjonen i kodon 7 endret fra C til G for å produsere et kodonsynonym som ligner E. coli-kodonbruken. El-beta peptidsekvensen ble ikke påvirket av denne endringen.

Plasmid pCD736: Derivat av pT7-7 som bærer sammen både El-alfa (0RF1) og El-beta (0RF2) ORF'ene under kontroll av T7-proraoteren.

Plasmid pCD705: Lignende pCD736, men som har 3'-halvdelen av El-beta ORF lokalisert i den gale orienteringen. Denne konstruksjonen ble anvendt som en negativ kontroll ved ekspresjons-eksperimenter.

Plasmid pCD685: Derivat av pT7-7 som bærer det komplette S. avermitilis bkd-genklusteret.

(k) Ekspresjon av S. avermitilis bkd- åpne leserammer i E. coli ved å anvende det T7 doble plasmid- ekspresjons- systemet.

Ekspresjon av S. avermitilis bkd-genene i E. coli ble oppnådd.ved å anvende det T7 RNA-polymerase/promoter doble-plasmid-systemet i all hovedsak som beskrevet av S. Tabor (1990. I Current Protocols in Molecular Biology, s. 16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York).

Derivater av E. coli C600 (pGP-1) inneholdende de ulike pT7-7-konstruksjonene ble analysert. Natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) ble anvendt for å over-våke ekspresjonen av S. avermitilis 0RF'er i E. coli-verten etter varmeinduksjon. SDS-PAGE-analyse på protein-profil etter induksjon viste overekspresjon av induserte peptider som har en størrelse lignende den forventede verdien (som dedusert fra den korresponderende cDNA-sekvensen) for El-alfa og El-beta ORF^ene, som følger:

(1) Deteksjon av El S. avermitilis BCKDH- aktivitet ved spesifikk test på råekstrakt fra rekombinant E. coli- klon

Tabell 1 nedenfor (eksempel 11) oppsummerer disse resultatene. El-spesifikke BCKDH-tester utført på råekstrakter fra E. coli-celler som bærer pCD736 viste signifikant El-aktivitet etter induksjon av T7-promoteren. En lignende kultur som bærer en konstruksjon med en del av innskuddet plassert i gal orientering (pCD705) viste bakgrunnsnivå av aktivitet.

I tillegg indikerte enzymatiske tester at råekstrakter fra E. coli-stammen inneholdende plasmid pCD685 også hadde en betydelig El BCKDH-aktivitet (>10 ganger bakgrunnsnivå). En ikke-indusert kultur av denne klonen ble også analysert, og viste basalnivå av aktivitet på 2 ganger over bakgrunnsnivå. Det siste resultatet er forventet siden T7-systemet er kjent for å tillate et lavt nivå av konstitutiv ekspresjon av klonede gener, også under ikke-induserende betingelser.

Det klonede Streptomyces avermitilis bkd-genklusteret er nyttig for forbedring av produksjon av naturlig avermektin ved å øke kopitallet for disse genene, eller ved å optimalisere deres ekspresjon i produksjonsstammer. En mulig fremgangsmåte for å oppnå effektiv ekspresjon av klonede bkd-genene involverer innsetting av disse genene i en multikopi E. coli/ Streptomycetes pendel-vektor (f.eks plasmid pCD262, Denoya C.D., 1993, "Novel Bacterial Plasmids Shuttle Vectors for Streptomycetes and Escherichia coli", US-patentsøknad nr. 08/032,925, innlevert 18. Mars, 1993), slik at genene blir transkribert fra en sterk promoter. Denne prosedyren vil sikre effektiv transkripsjon av genene. I tillegg kan visse strategier bli tenkt ut for å garantere effektiv ekspresjon. Disse omfatter (a) promoterstyrke; (b) stabiliteten av mRNAet; (c) tilstedeværelse eller fravær av regulatoriske faktorer; (d) induserbarhet og (e) setedirigert mutagenese for å forbedre ribosom-gjenkjennings- og translasjons-initierings-signaler. Ekspresjon av bkd-genene kan også bli optimalisert ved å erstatte villtypepromoteren og regulatoriske regioner med ulike promotere ved generstatningsteknikker. Det er mange eksempler i litteraturen på nyttige promotere som kan benyttes for å optimalisere ekspresjonen av nye S. avermitilis bkd-gener beskrevet her, f.eks den sterke ermE-promoteren (Hopwood et al., 1985, "Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich, U.K.) og tiostrepton-induserbar tipA-promoteren (Murakami et al., 1989. J. Bacteriol, 171:1459-1466). I tillegg vil inaktivering av bkd-genene, og samtidig fravær av BCKDH-aktivitet, ved delesjon eller sete-dirigert mutagenese ved å anvende generstatningsteknikker, utvikle forbedrede, irreversibelt blokkerte bkd Streptomyces avermitilis-stammer som er nyttige for produksjon av nye avermektiner.

EKSEMPLER

Følgende er detaljerte eksempler på de eksperimentelle prosedyrene som er anvendt for å klone og analysere bkd-genene fra S. avermitilis, hvilket også er illustrert i de vedlagte figurene. Ytterligere detaljer om standardteknikker, som er velkjent for fagfolk innen molekylær biologi, og betegnelsen av de spesielle enzymene som er anvendt, er f. eks beskrevet i laboratorie-manualen "Molecular Cloning" av Maniatis et al., (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Eksempel 1

Preparering av S. avermitilis genomisk DNA

S. avermitilis ATCC 31272 mycelium ble dyrket som et konfluent lag på YPD-2 agar-medium i 7 dager ved 29°C. Mediet omfattet:

Autoklavert i 15 minutter ved 121°C.

Dyrket mycelium ble deretter anvendt for å inokulere 30 ml AS-7-medium (se Hafner et al., 1988, Europeisk Patentsøknad #88300353,5, publikasjon # 0 284176) i en 300 ml avbøyd kolbe, som ble holdt med risting (230 rpm) ved 29°C i 24 timer. Mediet omfattet:

Omtrent 0,3 ml av kulturen ovenfor ble anvendt for å inokulere en annen avbøyd 300 ml kolbe som inneholder 30 ml av modifisert flytende gjær ekstrakt-Malt ekstrakt- (YEME) medium (Bibb, M.J., Freeman, R.F. og D.A Hopwood, 1977, Mol. Gen.

Genetics, 154:155-166). Modifisert YEME-medium inneholder pr. liter:

Kulturer ble dyrket i 48- 72 timer ved 29°C. Mycelium ble gjenvunnet ved sentrifugering, og genomisk DNA ble preparert ved å følge protokollen "Isolation of Streptomyces Total DNA by Cesium Chloride Gradient Centrifugation: Procedure 2", som finnes i læreboken "Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual", The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985, forfattet av Dr. D.A. Hopwood et al. DNA-pelleter ble resuspendert i 3 ml TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM

EDTA).

Eksempel 2

Polymerasekjedereaksjon S. avermitilis genomisk DNA-amplifisering

S. avermitilis genomisk DNA ble enzymatisk amplifisert ved å anvende Perkin-Elmer Cetus-thermal cycler. PCR-reaksjonen ble utført med Taq-polymerase (Perkin-Elmer Cetus) og buffer anskaffet fra leverandøren, i nærvær av 200 uM dNTP, 15% glycerol, 0,5 uM av hver primer, 50 ng templat-DNA (i dette tilfellet S. avermitilis genomisk DNA) og 2,5 enheter enzym i et endelig volum på 100 ul i 30 sykluser. Termo-profilen i den første syklusen var: 95°C i 3 minutter

(denaturerings-trinn), 55°C i 2 min. (feste-trinnet) og 72°C i 2 min (ekstensjons-trinnet). De etterfølgende 29 syklene hadde en lignende termoprofil, bortsett fra at denaturerings-trinnet ble forkortet til 1,5 min. DNA-primere ble anskaffet fra Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Den høyrevendte primeren (figur 1) var 5'-GAATTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3', og den venstrevendte primeren (figur 1) var 5'-TCTAGACCGCAGGTGGTCCGGCATCTC-3<1>. Amplifiseringsproduktene ble størrelsesfraksjonert ved agarosegelelektroforese. PCR-prøven ble elektroforert i en horisontal 1,5% agarosegel i lXTBE-buffer (90 mM Tris-HCL, pH 8,5, 90 mM bor-syre, 2,5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 1,5 timer ved 100 V, som beskrevet av Maniatis et al. De separerte PCR DNA-produktene ble lokalisert i gelen ved farging med etidiumbromid, og visualisering av flourescerende bånd med 365 nm ultrafiolett lys. Under PCR-betingelsene beskrevet ovenfor ble et enkelt DNA-bånd (omtrent 250 basepar langt) detektert når denne primerkombinasjonen ble anvendt.

Eksempel 3

Kloning av et 0, 25 kb PCR- amplifisert S. avermitilis genomisk DNA- fragment i E. coli- vektor, og påfølgende transformering i E. coli- vert.

A. Gjenvinning av 0, 25 kb PCR- produktet

Som nevnt ovenfor ble 0,25 kb DNA-fragmentet amplifisert ved PCR ved å benytte S. avermitilis genomisk DNA som templat, og den høyrevendte pluss venstrevendte primerkombinasjonen. Som vist i figur 1 har den høyrevendte primeren et EcoRI-gjenkjenningssete lokalisert i 5'-enden, og den venstrevendte primeren har et Xbal-gjenkjenningssete ved 5'-enden. Forsøk på å klone 0,25 kb PCR-fragmentet ved å anvende en ligeringsprosedyre hvor både innskudd og vektor blir kuttet med EcoRI og Xbal var imidlertid ikke vellykket. En alternativ fremgangsmåte for å klone 0,25 kb PCR-fragmentet, som involverer anvendelse av Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I for å produsere rette ender i PCR-produktet, ble derfor utført. Etter amplifisering (som beskrevet i eksempel 2) ble omtrent 80 ul av PCR-reaksjonen ekstrahert to ganger med fenol-kloroform, ekstrahert to ganger med eter og PCR DNA-produktet ble deretter etanol-felt som tidligere beskrevet. DNA ble resuspendert i 18,5 ul H20. 2,5 ul 10 x Nick-translasjons-buffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 M magnesiumsulfat (MgS04) , 1 mM ditiotreitol, 500 pg/ml bovint serum albumin) (Maniatis et al., 1989) og 20 enheter av Klenow-fragmentet av E. coli DNA polymerase I (Boehringer Mannheim Biochemicals) ble deretter tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 5 minutter. 1 ul 2 mM dNTP (2 mM hver av de fire dNTPene) ble så tilsatt, og reaksjonen ble inkubert videre ved romtemperatur i 15 minutter. Reparasjons-reaksjonen ble stoppet ved. å tilsette 1 ul 0,5 M EDTA, pH 8,0, og hele reaksjonsblandingen ble appli-sert på en 1,5% agarosegel og elektroforert. 0,25 kb DNA-fragmentet ble visualisert som beskrevet tidligere, og gjenvunnet ved elektroeluering som følger: 0,25 kb DNA-båndet ble fjernet med et skapellblad, og DNAet gjenvunnet fra agarose-gelen ved elektroeluering i 35 minutter ved 80 V i en V-formet brønn fylt med 10 M ammoniumacetat ved å anvende en enveis-elektroeluator (International Biotechnology Inc., New Haven, CT). DNAet ble så utfelt med etanol, pelletert og tilslutt oppløst i 20 pl DNA-buffer (10 mM Tris-HCl, 4 mM natriumklorid (NaCl), 0,1 mM EDTA; pH 7,5).

B. Smal- fordøying og defosforylering av plasmidvektor PGEM- 3Z

Omtrent lyg av plasmidet pGEM-3Zf(+) (Promega Corp., Madison, WI) og 2 enheter med restriksjonsenzymet Smal (alle restriksjonsenzymer ble anskaffet fra Boehringer Mannheim Biochemicals) ble inkubert i testbufferen spesifisert fra leverandøren, ved 25°C i 3,5 timer, i et totalt reaksjonsvolum på 40 mikroliter (pl) for å produsere lineær rett-endede molekyler. Smal-linearisert-vektor ble så defosforylert ved å anvende kalvetarm-alkalisk fosfatase (CIAP) (anskaffet fra Promega Corp., Madison, WI) ved å følge instruksjonene gitt av leverandøren. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 35 min. ved 37°C, og DNAet ble så ekstrahert to ganger med et likt volum fenol-kloroform, to ganger med et likt volum eter og tilslutt ble DNAet utfelt ved å tilsette 2 volumdeler absolutt etanol.

Presipitert DNA ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 10,000XG i 10 minutter, og tørket under vakuum. Den endelige pelleten ble oppløst i 20 ul DNA-buffer.

C. Ligering for å produsere pCD503

Omtrent 9 ul Klenow-behandlet 0,25 kb PCR DNA-produkt, og omtrent 1 ul Smal-linearisert, CIAP-defosforylert, rett-endet pGEM-3Zf(+) ble inkubert natten over med 1 enhet ligase (New England BioLabs, IC, Beverly, MA) under betingelsene angitt av leverandøren ved 14°C i et totalt reaksjonsvolum på 20 yl. Reaksjonen ble terminert ved å sette testmikrorøret på is, og 15 yl av reaksjonsblandingen ble så anvendt for å transformere kompetente E. coli JM109-celler ved å følge standard prosedyre, som beskrevet av Maniatis et al., 1989. Mange ampicillin-resistente transformanter ble gjenvunnet. Plasmidvektor pGEM-3Zf(+) inneholder et DNA-segment avledet fra lac-operonet fra Escherichia coli som koder for det aminoterminale fragmentet

av beta-galaktosidase (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. og J. Messing, 1985, Gene, 33:103). Dette fragmentet, hvis syntese kan induseres ved isopropyltio-beta-D-galaktosid (IPTG), har evnen til inter-allelisk (alfa) komplementasjon med en defekt form av beta-galaktosidase som er kodet av verten. E. coli-celler som er eksponert for induser-IPTG syntetiserer begge fragmentene av enzymet, og danner blå kolonier når de utstrykes på media som inneholder det kromogene substratet 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-galaktosid (X-gal). Innsetting av fremmed DNA i flerkloningssetet til plasmidet vil inaktivere det aminoterminale fragmentet av beta-galaktosidase, og ødelegger alfa-komplementasjon. Bakterier som bærer rekombinante plasmider gir derfor opphav til hvite kolonier. En rekke hvite kolonier ble gjenvunnet fra dette transformasjons-eksperimentet. Disse koloniene skal inneholde plasmidet pCD503. Dette ble bekreftet ved å velge en koloni, betegnet som CD503, og videre analyse. En enkelt bakterie-. koloni av E. coli-stammen CD503 ble inokulert i Luria-Bertani

(LB)-flytende medium inneholdende 50 pg/ml ampicillin ved å følge standard mikrobiologiske prosedyrer. LB-mediet omfattet:

Bacto-tryptone 10 gram

Bacto gjær-ekstrakt 5 gram

NaCl 10 gram

pH justert til 7,0 med 5 N natriumhydroksyd (NaOH)

Totalt volum på løsningen justeres til IL

Sterilisert ved autoklavering i 20 min. ved 121°C.

Kulturen ble inkubert ved 35°C natten over. Den følgende morgenen ble bakteriecellene høstet ved sentrifugering ved 10,000 rpm i 5 minutter ved 4°C. Plasmidvektor ble isolert fra nylig høstede Escherichia coli CD503-celler ved å anvende en modifisering av metoden til Birnboim og Doly (Nucleic Acids Res., 1979, 7:1513), som beskrevet av Denoya et al., 1985, Microbios Lett., 29:87. Det isolerte plasmid-DNA ble tilslutt oppløst i DNA-buffer (10 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; pH 7,5) for å produsere en konsentrasjon på omtrent 1 pg pCD503 pr. 10 pl buffer. Bekreftende restriksjonsanalyse, ved å anvende restriksjonsenzymene EcoRI og Pstl viste, som forventet, at pCD503 bar 0,25 kb DNA-innskuddet.

Eksempel 4

Preparering av radioaktivt merket DNA- og RNA- prober

A. Preparering av ensrettet merket dobbeltrådete DNA-prober

Dobbelttrådete DNA-prober ble preparert ved nick-translasjon (se Maniatis et al., 1989 for en generell beskrivelse av denne teknikken). Først ble et spesifikt DNA-fragment som bærer målsekvensen, preparert ved egnet restriksjons-fordøying og rensing ved elektroeluering i all hovedsak som beskrevet i eksempel 1. Omtrent 1 pg DNA ble merket i hvert tilfelle ved å anvende [alfa-<32>P]dCTP (deoksycytidin 5'-trifosfat, tetra(trietylammonium)salt, [alfa<32>P]-) anskaffet fra NEN-Dupont og BRL Nick-translasjonssystemet anskaffet fra BRL Life Technologies, Inc, ved å anvende instruksjonene angitt av leverandøren. En typisk reaksjon bler utført i et volum på 50 ul. Etter tilsetning av 5 ul stoppbuffer (som beskrevet i den BRL-anbefalte prosedyren) ble merket DNA separert fra uinkorporerte nukleotider ved å anvende Stratagene Push-kolon-ne og følge instruksjonsmanualen angitt av leverandøren. 32P-merket DNA med en spesifikk aktivitet godt over IO<8> cpm/ug ble rutinemessig oppnådd ved å følge disse prosedyrene.

B. Preparering av merkede enkelttrådete RNA- prober

<32>P-merkede RNA-prober ble preparert ved in vitro-transkripsjon ved å anvende Riboprobe Gemini .transkripsjons-systemet (Promega). Renset fragment av mål-DNA ble klonet i transkripsjonsvektoren pGEM-3Z ved å anvende standard prosedyrer. Preparering av templat plasmid-DNA for in vitro transkripsjons-reaksjoner ble utført som beskrevet i eksempel 3, men omfatter et polyetylenglykol- (PEG) presipiteringstrinn for selektivt å fjerne små nukleotider, som kan forurense disse preparatene, som følger: Etter etanol-fellingstrinnet ble pelleten resuspendert i 520 ul vann. 100 ul 5M NaCl og 620 ul 13% PEG (MV 6,000-8,000) ble så tilsatt. Etter blanding blir røret inkubert på is i 1 time, og DNAet ble pelletert ved 4°C ved 10,000 x G i 15 min. Pelleten ble vasket en gang med 500 ul 80% kald etanol og resuspendert som vanlig.

Omtrent 1 ug templat plasmid-DNA ble linearisert ved å anvende enten SacI- eller Hindlll-restriksjonsenzymer, og deretter in vitro-transkribert ved å anvende hhv. SP6 eller T7-bakteriofag DNA-avhengig RNA-polymerase. Cytidin-5<1->trifosfat-tetra(trietylammonium)salt, [alfa-<32>P] (CTP) anskaffet fra NEN-Dupont ble anvendt i denne reaksjonen. Reaksjons-betingelsene ble som anbefalt av leverandøren. Etter inkubering blir reaksjonsblandingen behandlet med én enhet RQl-DNase (Promega) for å degradere DNA-templatet, ekstrahert to ganger med fenol-kloroform og så etanol-presipitert ved å følge standard prosedyrer. Pelleten bler tørket og resuspendert i 20 ul RNase-fritt vann (Promega). En liten alikvot av merket RNA-transkript ble analysert ved polyakrylamid-agarosegelelektroforese som beskrevet av Denoya et al., 1987, J. Bacteriol., 169:3857-3860. Under betingelsene gitt her ble merkede full-lengde transkripter oppnådd rutinemessig.

Eksempel 5

Analyse av S. avermitilis genomisk DNA ved Southern hybridisering

Omtrent 10 ug renset S. avermitilis genomisk DNA ble fordøyd med 2 enheter av restriksjonsenzymet BamHI ved 37°C i minst to timer. Etter kuttingen ble DNA-fragmentene separert

ved elektroforese gjennom en 1% agarosegel (se eksempel IA), og ble overført natten over til en nylon-membran (pore-stør-relse 0,45 pm) (Schleicher og Schuell Nytran membraner) ved å benytte kapilær-overføringsmetoden (Southern, E. M., 1975, J. Mol. Biol., 98:503). Den neste dagen ble nylonmembranen pakket inn i plastikkomslag, og DNA-siden på hver membran ble eksponert for en kilde for ultrafiolett bestråling (302 nm) for å fiksere DNAet til membranen. Hybridisering av radioaktivt merket RNA- eller DNA-prober med DNAet som er immobili-sert på nylonmembraner ble utført ved å følge protokollen beskrevet av Maniatis et al. (1989). Prehybridisering og hybridisering ble utført ved 42°C. Hybridiseringsløsning en inneholdt: 6 x SSC (lx: 0,15 M natriumklorid (NaCl), 15 mM natrium citrat, pH 7,0), 10 x Denhardts reagens (lx: 0,02% ficoll, 0,02% polyvinylpyrolidon, 0,02% bovint serum albumin), 1% SDS (natrium dodecyl sulfat), 100 pg/ml denaturert, fragmentert laksesperm DNA, 100 pg/ml E. coli tRNA og 50% formamid (Fluka). Etter hybridisering natten over ble membranene vasket som følger: to vasker med lxSSC, 0,1% SDS ved romtemperatur i 15 minutter og to vasker med 0,lxSSC, 0,1% SDS ved 42°C i 15 minutter. I noen eksperimenter ble hybridiser-ingen utført ved 65°C i fravær av formamid, og SSPE (lx: 0,18 M NaCl, 10 mM natriumf osf at (NaP04) , pH 7,7, 1 mM EDTA) ble

anvendt istedenfor SSC. Til slutt ble membranene eksponert for røntgenfilm for å oppnå et autoradiografisk bilde.

Eksempel 6

Kloning av 0, 25 kb CD503 S. avermitilis genomisk fragmentet i bakteriofag M13 og DNA- sekvensering

0,25 kb CD503 S. avermitilis DNA-fragmentet ble klonet i bakteriofagene M13mpl8 og M13mpl9 for fremstilling av enkelttrådet rekombinant DNA som skal bli anvendt som templater i Sangers dideoksy-sekvenseringsmetode (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5467). Omtrent 2 pg plasmid pCD503, preparert ved å følge miniprepp-prosedyren beskrevet tidligere, ble kuttet med restriksjonsenzymene EcoRI og Pstl for å frigjøre det 0,25 kb S. avermitilis genomiske innskuddet. Restriksjonsanalyser viste tidligere at pCD503 kuttet med EcoRI eller med Pstl alene var lineær. Denne analysen demonstrerte at 0,25 kb innskuddet ikke inneholdt noen EcoRI- eller Pstl-gjenkjenningsseter. Den fordøyde blandingen ble elektroforert i en 1,2% agarosegel, og 0,25 kb fragmentet ble elektroeluert og presipitert som beskrevet tidligere. I tillegg ble omtrent 1 pg hver av renset dobbelttrådet replikative former (RF) av M13mpl8 og M13mpl9 DNA dobbeltkuttet med EcoRI og Pstl, defosforylert med kalvetarm alkalisk fosfatase (CIAP) (anskaffet fra Promega Corp., Madison, WI) og til slutt ligert med 0,25 kb DNA-fragmentet som beskrevet tidligere. Rensede RF M13 kloningsvektorer ble anskaffet fra New England Biolabs. Ligeringsblandinger ble anvendt for å transfektere kompetente E. coli JM109-celler. En enkelt hvit plaque fra mpl8 transfeksjonen, og en enkelt fra mpl9 transfeksjonen ble valgt, fagen dyrket og enkelttrådet DNA preparert som beskrevet (Maniatis et al., 1989). DNA-sekvensering av hvert enkelttrådet DNA-templat ble utført ved å anvende den Ml3-spesifikke -4 0 sekvenseringsprimeren (New England Biolabs, katalog # 1212), deoksyadenosin-5<1->

[alf a-tio] trifosfat, [35S] (NEN-Dupont) og TaqTrack sekvenserings-settet (Promega), ved å følge instruksjonene

gitt av leverandøren (Promega). DNA-sekvenseringsdata for pCD503 S. avermitilis genomiske fragmentet er vist i figur 4..

Eksempel 7

Kloning av hele bkd S. avermitilis genklusteret, og konstruksjon av kromosomalt kart

Omtrent 5 pg renset pCD503 ble dobbelt-kuttet ved å anvende både BamHI- og EcoRI-restriksjonsenzymer, DNA-fragmenter ble separert ved elektroforese i en 1,2% agarosegel, et omtrent 0,25 kb langt DNA-fragment som bærer en sekvens som er spesifikk for S. avermitilis bkd El-alfa genet ble gjenvunnet ved elektroeluering og merket ved nick-translasjon i all hovedsak som beskrevet tidligere. [<32>P]-merket DNA-fragmentet ble så anvendt som en probe for å undersøke et S. avermitilis genomisk kosmidbibliotek. En detaljert beskrivelse av frem-stillingen av genomiske biblioteker generelt finnes i Molecular Cloning A Laboratory Manual, av Maniatis et al., (1989). En fullstendig beskrivelse av streptomycetes kromosomal bibliotek- fremstilling er presentert i Genetic Manipulation of Streptomyces -A Laboratory Manual av Hopwood et al., (1985). En beskrivelse av kosmid-vektor finnes i "Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA Cloning" av Denoya C. D., US Patent-søknad nummer 08/048,719, innlevert 16. April, 1993. Fire kloner ble identifisert etter undersøkelse av mer enn 2200 rekombinante bibliotek-kloner. De fire hybridiserende klonene

(opptegnet som E. coli-klonene CD518, CD519, CD520 og CD521)

ble dyrket i LB-medium med selektivt trykk med ampicillin. Plasmid ble preparert fra hver kultur som beskrevet tidligere.

Restriksjons- og Southern blott analyser viste at de fire klonene var beslektet, med overlappende kromosomale regioner.

Et S. avermitilis genomisk restriksjonskart, som dekker hele den kromosomale regionen omfattende sekvensen CD503, ble oppnådd ved standard prosedyrer, og er presentert i figur 3.

Eksempel 8

Generering av nøstede sett av delesjonsmutanter for å dirigere DNA- sekvensering av S. avermitilis kromosomal region som bærer bkd- genklyngen.

Nøstede sett med delesjonsmutanter som mangler progressivt fler nukleotider fra en ende, eller den andre, av S. avermitilis bkd-mål-DNA, ble oppnådd ved å anvende eksonuklease III ved å følge prosedyrene i all hovedsak lignende de beskrevet av Henikoff, S., (1987, Methods Enzymol., 155:156). For å skape ensrettede delesjonsmutanter ble dobbelttrådet DNA, fra hver rekombinant bakteriofag M13 replikativ form av DNA, kuttet med to restriksjonsenzymer, hvor begge har seter for spaltning mellom en ende av mål-DNA og primerbindingssetet. Restriksjonsenzymet som spaltet nærmest målsekvensen skapte en rett, eller en tilbaketrukket 3'-ende; det andre enzymet dannet en overhengende 3'-ende. Eksonuklease III katalyserer den trinnvise fjerningen av 5'-mononukleotider fra en tilbaketrukket eller rett 3'-hydroksyl-ende av dobbelttrådet DNA. Overhengende 3'-ender er imidlertid fullstendig resistente for enzymaktiviteten. Derfor blir bare en ende av det resulterende lineære DNAet mottagelig for eksonuklease III, og fordøyingen fortsatte i én retning, vekk fra spaltningssetet i mål-DNA-sekvensen.

Som et eksempel følger beskrivelse av prepareringen av pCD565 nøstede delesjoner. Plasmid pCD565 er et M13mpl9 RF-derivat som bærer et 1,15 kb Sall-fragment som inneholder en del av El-alfa S. avermitilis bkd-åpen leseramme. Plasmid pCD565 ble renset ved likevektsentrifugering i cesiumklorid-og etidiumbromidgradienter som beskrevet av Maniatis et al

(1989). Eksonuklease III kan initiere fordøying fra enkelt-tråd-brudd, slik at det er viktig å anvende en preparering som inneholder mindre enn 10% relakserte sirkulære molekyler. Omtrent 10 ug av plasmid pCD565 (se avsnitt "Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen") ble dobbelkuttet med restriksjonsenzymene SacI og Xbal ved 37°C i fire timer, og deretter fenol-kloroform- og eter-ekstrahert og etanolpresipitert som beskrevet tidligere. Pelleten ble resuspendert i 60 ul eksonuklease III reaksjonsbuffer (10 X eksonuklease III buffer: 0,66 M Tris-HCl, pH 8,0, 66 mM magnesiumklorid (MgCl2) . DNA-oppløsningen ble så inkubert ved 37°C ved tilstedeværelse av 300 enheter eksonuklease III (Ambion Inc.), og 2,5 ul alikvoter ble fjernet med 30 sekunders intervaller. Prøver ble så inkubert med Sl-nuklease, og alikvoter av hver prøve ble analysert ved agarosegelelektroforese. Prøver inneholdende DNA-f ragment er med den ønskede lengden ble samlet., DNA ble reparert ved å anvende Klenow fragmentet av DNA polymerase I, ligert natten over og transfektert i kompetente E. coli JM109-celler. Innskuddets størrelse i gjenvunnede kloner ble analysert ved EcoRI/Hindlll kutting og agarosegel-elektroforese. Fem kloner ble valgt for sekvensering: 565-D19 (1,1 kb), 565-D7 (0,88 kb), 565-d24 (0,77 kb), 565-D1 (0,51 kb) og 565-D16 (0,36 kb). Enkelttrådet DNA ble preparert fra hver av disse klonene, og sekvensert som beskrevet tidligere.

Eksempel 9

Konstruksjon av plasmidene pCD670, pCD666, pCD736 og pCD685 som skal bli anvendt ved ekspresjonen av S. avermitilis bkd- genene i E. coli

Ekspresjon av S. avermitilis bkd-genene i E. coli ble . oppnådd ved å anvende det T7 RNA polymerase/promoter doble-plasmid-systemet i all hovedsak som beskrevet av S. Tabor (1990. I Current Protocols in Molecular Biology, s.16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York).

A. Konstruksjon av pCD670 som bærer S. avermitilis El-alfa bkd- ORF: Et Ndel-restriksjonssete som spenner over ATG-startkodonet ble innført i S. avermitilis bkd El-alfa-genet ved å anvende en PCR-basert prosedyre. Templatet for PCR var plasmid pCD528, et pGEM-3Z-derivat som bærer et 7 kb S. avermitilis genomisk fragment omfattende den aminoterminale halvdelen av El-alfa ORF. To oligonukleotider ble anvendt som primere i PCR-reaksjonen (se fig. 6): 1. Venstrevendt universal (vektor) primer 31-PCR-BP (51 -AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3') som 1igger nedstrøms for Hindlll-setet i pGEM-3Z MCS (posisjon 91-114). Ved 5'-enden av denne primeren er to A og to restriksjonsseter (BamHI og Pstl) for å forenkle kloning av PCR-produktene. 2. Mutagen primer 55-PCR (5'-AAGAGATCTCATATGACGGTCAT-GGAGCAGCGG-3'). Ved 5'-enden av denne primeren er to A, en G og to restriksjonsseter (Bgl II og Ndel). Ndel-setet overlapper ATG-initieringskodonet i den El-alfa åpne leserammen.

Polymerasekjedereaksjon ble utført som beskrevet tidligere. Reaksjonsprodukter ble analysert ved elektroforese i en 0,8% agarosegel. Et PCR-amplifisert DNA-fragment med den korrekte størrelsen (omtrent 1,1 kb langt) ble elektroeluert, kuttet med restriksjonsenzymene Ndel og BamHI og subklonet i Ndel/BamHI-linearisert plasmid pT7-7 for å gi plasmidet pCD663 etter ligering og transformering i E. coli DH5-alfa-celler. Omtrent 1 ug plasmid pCD663 (preparert fra E. coli-stamme CD663 ved å anvende en plasmid-miniprepp-prosedyre) ble linearisert med BamHI, defosforylert og tilslutt ligert ved tilstedeværelse av omtrent 0,5 pg elektroeluert, renset 1,1 kb BamHI-fragmentet isolert fra en BamHI-kutting av plasmid pCD550, for å oppnå plasmid pCD670. Den korrekte orienteringen av 1,1 kb BamHI-fragmentet i den siste konstruksjonen ble bestemt ved å kartlegge Sal I-setene som er til stede i innskuddet. Til slutt ble plasmid pCD670 innført i E. coli stamme CD600 som bærer plasmidet pGPl-2 (plasmidet inneholder T7 RNA polymerase-genet) (se Tabor, 1990). En transformant ble valgt for videre arbeid, og oppført som stamme CD676.

B. Konstruksjon av pCD666 som bærer S. avermitilis El-beta bkd- ORF: Et Ndel-restriksjonssete omspennende ATG-startkodonet ble innført i S. avermitilis bkd El-beta-genet ved å anvende en PCR-basert prosedyre. Templatet for PCR var plasmid pCD574, et pGEM-3Z-derivat som bærer et 4,5 kb S. avermitilis genomisk innskudd omfattende El-beta ORFen. To oligonukleotider ble anvendt som primere i PCR-reaksjonen (se også fig. 6): 1. Venstrevendt universal ( vektor) primer 30- PCR- BP: (5<1->AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3') som 1igger oppstrøms for EcoRI-setet i pGEM-3Z MCS (posisjon 2689-2712).

Ved 5'-enden av denne primeren er det to A'er og to restriksjonsseter (BamHI og Pstl) for å forenkle kloningen av PCR-produktene. 2. Høyrevendt mutagen primer 56- PCR: (5'-AAGAGATCTCATATGACCACCGTTGCCCTGAAG-3'). Ved 5'-enden av denne primeren er det to A, en G og to restriksjonsseter (Bgl II og Ndel) . Ndel-setet overlapper ATG-initieringskodoiiet i El-beta åpen leseramme.

Polymerasekjedereaksjonen ble utført som beskrevet tidligere. Reaksjonsprodukter blir analysert ved elektroforese i en 0,8% agarosegel. Et PCR-amplifisert DNA-fragment med den korrekte størrelsen (omtrent 1,9 kb langt) ble elektroeluert, kuttet med restriksjonsenzymene Ndel og EcoRI og subklonet i Ndel/EcoRI-linearisert plasmid pT7-7, for å gi plasmidet pCD666 etter ligering og transformering i E. coli DH5-alfa-celler. Tilslutt ble plasmid pCD666 innført i E. coli stamme C600 som bærer plasmidet pGPl-2 (plasmidet inneholdende T7 RNA polymerase-genet) (se Tabor, 1990). En transformant ble valgt for videre arbeid, og oppført som stamme CD673. C. Konstruksjon av pCD736 som bærer S. avermitilis El-alfa og El- beta bkd- ORFer: Omtrent 2 ug av plasmid pCD670 ble linearisert ved partiell BamHI-fordøying. For å oppnå lineær form av plasmid pCD670 ble alikvoter av BamHI-fordøyingen tatt ved følgende tidspunkter: 1, 3, 5, 10 og 20 minutter. Alikvoter ble kjørt gjennom en 0,8% agarosegel. Den lineære formen (ca. 4,3 kb lang) ble gjenvunnet ved elektroeluering, og defosforylert ved å anvende CIAP (som beskrevet tidligere). Halvparten av den defosforylerte, lineære formen av plasmid pCD670 ble så ligert med et 0,8 kb BamHI/Bgl II-fragment isolert fra plasmid pCD577. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere kompetente E. coli DH5-alfa-celler. Ti kloner ble gjenvunnet og analysert ved restriksjonsanalyse på plasmid-DNA som er preparert ved miniprepp-prosedyren. En klon, oppført som stamme CD736, inneholdt det korrekt sammensatte plasmid pCD736. Til slutt ble plasmid pCD736 innført i E. coli-stamme C600 som bærer plasmid pGPl-2. En transformant ble valgt for videre arbeid, og er oppført som stamme CD737. En annen klon, oppført som stamme CD705, inneholdt plasmid pCD705, som bar 0,8 kb BamHI/Bgl II-fragmentet i gal orientering. Konstruksjon pCD705 ble anvendt som en negativ kontroll i ekspresjons-eksperimentene. D. Konstruksjon av pCD685 som bærer S. avermitilis bkd-genklyngen: Den resterende halvdelen av defosforylert, lineær form av plasmid pCD670 oppnådd, som beskrevet ovenfor, ved partiell fordøying med restriksjonsenzymet BamHI, ble ligert til et 7 kb BamHI-fragment isolert fra plasmid pCD577. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere kompetente E. coli DH5-alfa-celler. Mange kloner ble gjenvunnet, og 16 av dem ble valgt for videre analyser. Plasmid DNA ble ekstrahert og analysert ved restriksjonsanalyse. En klon, betegnet som stamme CD685, inneholdt det korrekt sammensatte plasmidet (pCD685). Til slutt ble plasmid pCD685 innført i E. coli-stamme C600 som bærer plasmid pGPl-2. En transformant ble valgt for videre arbeid, og.er oppført som stamme CD687.

Eksempel 10

Ekspresjon av S. avermitilis bkd- genene i Escherichia coli ved å anvende T7 dobbelt- plasmidsystem

Derivater av E. coli C600 (pGP-1) som inneholder ulike pT7-7 konstruksjoner (stammene CD676, CD673, CD737 og CD687) ble dyrket i 5 ml LB-medium som inneholder både kanamycin (60 jig/ml) og ampicillin (60 ug/ml) natten over ved 30°C. Over-natt-kulturene ble så fortynnet 1:40 (0,25:10,00 ml) i en rør-kultur (25 x 150 mm) som inneholder frisk LB/ampicillin/ kanamycinmedium, og dyrket i en riste-lufte-maskin ved 30 °C for å måle optisk tetthet (OD590) til ca. 0,4. Genet for T7 RNA polymerase ble indusert ved å øke temperaturen til 42°C i 30 minutter, som på sin side induserte genet (genene) som er under kontroll av T7-promoteren (som beskrevet av S. Tabor, 1990) . Til slutt ble temperaturen senket til 37°C, og cellene dyrket i ytterligere 90 minutter med risting. Ikke-induserte kontroll-kulturer ble holdt ved 30°C hele tiden. Proteiner ble analysert ved natrium-dodecyl-sulfat (SDS) polyakrylamid-gelelektroforese som beskrevet av C. D. Denoya et al., 1986,

J. Bacteriol., 168:1133-1141. Enzymatisk aktivitet ble analysert som beskrevet i eksempel 11.

Eksempel 11

Bestemmelse av El S. avermitilis BCKDH- aktivitet i råekstrakter fra rekombinante E. coli- stammer

A. Celle- lysat fremstilling

Celler (avledet fra 8 ml kulturer) ble oppsamlet ved sentrifugering (5 min. ved 5,000 rpm, 3,000 x g, ved å anvende en Sorvall SS-34 rotor som er nedkjølt til 4°C) , og resuspendert i 5 ml "brudd-buffer" (0,05 M kaliumfosfatbuffer, pH 7,0, som inneholder 3% Triton X-100, 15% glycerol, 3 mM ditiotreitol, 1 mg/ml kalkun eggehvite trypsin-inhibitor, 5 mM EDTA og 0,04 mM TPP [tiamin-pyrofosfat]). Resuspenderte celler ble overført til en fransk presse, og cellene ble sprengt ved passasje ved 5,000 x psi. En 1,5 ml alikvot av det franske pressatet ble så overført til et mikrosentrifugerør, og renset ved 30 sekunders sentrifugering ved 14,000 rpm. Alikvoter på 100 ul av hver supernatant ble anvendt pr. enzymtest. Proteinkon-sentrasjonen ble bestemt ved å anvende Bio-Rad proteintest (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) som er basert på Bradford farge-bindingsprosedyren (Bradford, M., Anal. Biochem., 72:248, 1976).

B. Test for El- komponenten av S. avermitilis forgrenet alfa- ketosyredehydrogenase- ( BCKDH) komplekset

BCKDH El-aktivitet ble bestemt ved en modifisert versjon av den radiokjemiske testen beskrevet tidligere (Chuang, D. T., 1988, Methods Enzymol., 166:146-154; og Hafner, E. W., et al., 1991, J. Antibiotics, 44:349). Til bunnen av en 15 ml glass-scintillasjonskrukke ble det tilsatt: 0,148 ml 0,25 M kaliumfosfatbuffer, pH 6,5; 0,002 ml 0,1 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, dinatrium-salt); 0,004 ml 0,1 M MgCl2; 0,02 ml 3,7 mM tiaminpyrofosfat (TPP); 0,02 ml 37 mM NaAs02; 0,01 ml 37 mM 2,6-diklorfenolindofenol (natriumsalt, Sigma D-1878); 0,008 ml alf a-[1-14C] ketoisocaproat lageroppløsning (fremstilt som beskrevet nedenfor); 0,058 ml vann og 0,1 ml renset celle-fritt ekstrakt. Krukkeåpningen ble med en gang dekket med Whatman 4CHR-papir (Whatman katalognummer 3004614) som er impregnert med Solvable (en vevs- og geloppløser anskaffet fra NEN-Dupont). Et plastikklokk ble så festet godt på krukken, både lokket og den øvre halvdelen av krukken ble pakket med parafilm og inkubert med forsiktig risting i 2 timer ved 3 0°C. Da inkuberingen var ferdig ble filterpapiret overført til en 7 ml glass-scintillasjonskrukke som inneholder 4 ml "Ready Safe"

(Beckman) flytende scintillasjonscocktail for å bestemme radioaktivitet. Alf a-[1-14C] ketoisokaproat lageroppløsning ble fremstilt ved å blande 5,6 ul 20 mM alfa-ketoisokaproat (natriumsalt, Sigma K-0629), 50ul (alfa-[1-<14>C]ketoisokaproat (55 mCi/mmol, 50uCi/ml, Amersham) og nok vann til et sluttvolum på 1 ml. Den spesifikke aktiviteten av El-komponenten av forgrenet alfa-ketosyredehydrogenase er pikomol karbondioksid utviklet pr. minutt pr. milligram protein, som vist i tabell 1 nedenfor.

BESKRIVELSE AV SEKVENS ID

SEKVENS ID NR:1 representerer DNA-sekvensen som koder for El-alfa subenheten av S. avermitilis BCKDH. Denne sekvensen er også avbildet i figur 4, som basene 403-1548.

SEKVENS ID NR:2 representerer DNA-sekvensen som koder for El-beta subenheten av S. avermitilis BCKDH. Denne sekvensen er også avbildet i figur 4, som basene 1622-2626.

SEKVENS ID NR:3 representerer DNA-sekvensen som starter den åpne leserammen som koder for den aminoterminale regionen av E2 subenheten av S. avermitilis BCKDH. Denne sekvensen er også avbildet i figur 4, som basene 2626-2727.

SEKVENS ID NR:4 er en DNA-sekvensen som representerer basene 3-251 av pCD539. Dette er en del av den interne sekvensen av genet som koder for E2 subenheten av S. avermitilis BCKDH. Denne sekvensen er også avbildet i figur 5.

SEKVENS ID NR:5 representerer de 2728 baseparene fra S. avermitilis genomisk DNA-fragment som er avbildet i figur 4, og inneholder åpne leserammer for El-alfa, El-beta og E2 (delvis) subenhetene fra S. avermitilis BCKDH.

SEKVENS ID NR:6 representerer aminosyresekvensen til El-alfa subenheten av S. avermitilis BCKDH. Denne aminosyresekvensen er kodet av DNA-sekvensen i SEKVENS ID NR:1.

SEKVENS ID NR:7 representerer aminosyresekvensen til El-beta subenheten av S. avermitilis BCKDH. Denne aminosyresekvensen er kodet av DNA-sekvensen i SEKVENS ID NR:2.

SEKVENS ID NR:8 representerer aminosyresekvensen til den aminoterminale regionen av E2 subenheten av S. avermitilis BCKDH. Denne aminosyresekvensen er kodet av DNA-sekvensen i

SEKVENS ID NR:3.

SEKVENS ID NR:9 representerer aminosyresekvensen som kodes av DNA-sekvensen representert av basene 3-251 i pCD539 (SEKVENS ID NR:4). Denne aminosyresekvensen representerer et internt peptid-fragment av E2 subenheten av S. avermitilis

BCKDH.

Claims (12)

1. Isolert DNA-segment som koder for forgrenet alfa-ketosyredehydrogenasekomplekset fra en organisme tilhørende slekten Streptomyces, karakterisert ved at nevnte DNA-segment omfatter DNA-sekvensen i SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID NR:4, eller SEKVENS ID NR:5 eller en allelisk variasjon av slike sekvenser.

2. Isolert DNA-segment ifølge krav 1, karakterisert ved at det koder for Streptomyces avermitilis forgrenet alfa-ketosyredehydrogenasekompleks.

3. Isolert DNA-segment ifølge krav 1, karakterisert ved at det videre omfatter en DNA-region som regulerer ekspresjonen av nevnte forgrenede alfa-ketosyredehydrogenasekompleks.

4. Isolert DNA-segment ifølge krav 2, karakterisert ved at det videre omfatter en DNA-region som regulerer ekspresjonen av nevnte forgrenede alfa-ketosyredehydrogenasekompleks.

5. Rekombinant DNA, karakterisert ved at det omfatter et DNA-segment ifølge krav 1.

6. Vertscelle, karakterisert ved at den har fått innført rekombinant DNA ifølge krav 5.

7. Plasmid, karakterisert ved at det omfatter rekombinant DNA ifølge krav 5.

8. DNA-segment karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av pCD528, pCD545, pCD550, pCD559, pCD574 og pCD577 idet nevnte DNA-segment har det genomiske restriksjonskartet vist i figur 3.

9. Vertscelle, karakterisert ved at den har fått innført et DNA-segment ifølge krav 8.

10. DNA-segment ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en DNA-region som regulerer transkripsjonen eller translasjonen av DNA-sekvensen i SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID NR:4, eller SEKVENS ID NR:5 eller en allelisk variasjon av slike sekvenser.

11. DNA-segment ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som er en undergruppe av DNA-sekvensen i SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID NR:4, eller SEKVENS ID NR:5, eller en allelisk variasjon derav, og som kan hybridisere under stringente betngelser til henholdsvis SEKVENS ID NR:1, SEKVENS ID NR:2, SEKVENS ID NR:3, SEKVENS ID NR:4, eller SEKVENS ID NR:5, eller en allelisk variasjon derav, når det anvendes som probe, eller amplifisere hele eller deler av slike sekvenser når det anvendes som polymerasekjedereaksjonsprimer.

12. Vesentlig renset polypeptid, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen i SEKVENS ID NR:6, SEKVENS ID NR:7, SEKVENS ID NR:8, eller SEKVENS ID NR:9.