JPH08509131A - ガス駆動型遺伝子搬入装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遺伝物質で被覆された粒子（16）をターゲットに加速注入するためのガス駆動型装置（10）であって、サンプルカートリッジ（14）の表面から該粒子を分離し、かつ該粒子を該装置（10）を介して該ターゲットに向けて搬送するのに十分に高い圧力で放出可能にガスを収容するリザーバ（12）を含む。該装置（10）を離れた場合に、該粒子（16）は、実質的に円錐形の出口ノズル（24）を通るガス流に同伴され、該出口ノズルは該粒子の分布パターンを著しく拡げる。該装置の使用法および該サンプルカートリッジ（14）の調製法をも記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 ガス駆動型遺伝子搬入装置 発明の分野 本発明は、細胞内に物質を搬入する分野に関し、より詳細には生きた組織に遺 伝物質を運び込むことに関するものである。 発明の背景 過去十年において、生きた細胞および組織に、物質特に遺伝物質を粒子−媒介 加速注入することが、植物および動物のバイオテクノロジーにおける重要な道具 として出現した。導入されたDNAの一次的発現および生殖系列への組み込みが、 微生物、植物および動物において明らかになってきた。 この技術の基礎が打ち立てられるにつれて、作業者に迅速な継続性をもって、 周期的に一連の粒子-媒介遺伝子搬入を実施する能力をもたらす装置の開発が、 ますます注目を集めるようになってきた。このような装置は、ヒトおよび家畜を 遺伝的ワクチンで大規模に免疫化する際に利用するのに特に有利である。 既存の粒子−媒介遺伝子搬入装置の限界の一つは、サンプルを与える形状にあ る。このような装置の全てにおいて、該サンプルは小さな、高密度の物質、例え は金またはプラチナの粒子表面に堆積される。この被覆粒子自体を、次に剛性の 表面、例えば金属板、またはマイラー等の脆い物質の担体シート上に被覆する。 この被覆シートを、次いでターゲットに向けて加速する。この方法は幾つかの利 点および幾つかの欠点を有する。該利点は平坦なシートが加速された粒子の極め て均一な拡がりを与えるという事実に関連している。また、その欠点の一つは、 各粒子で被覆したプレートまたは担体シートが別々に調製され、かつ一回だけ使 用されることであり、これは、特に多数回の反復的遺伝子搬入を想定している場 合に、粒子の加速を時間のかかるものとし、また効率の悪い方法としている。各 被覆担体シートは比較的大きく、また損傷または汚染を防止するために注意して 取り扱う必要がある。また、往々にして、担体シートの有用な被覆側と非−被覆 側とを識別することが困難でもある。該担体シートの不適当な配置は処理量を減 じ、かつサンプルの浪費をもたらす。 担体粒子の分布または展開パターンが、幾つかの用途において、即ち生殖系列 の獲得が望まれる場合には、他の用途、特に該組み込み遺伝子の一次的発現のみ が必要とされる場合よりも、より一層臨界的条件となる。稀な生殖系列形質転換 事象が望まれる場合、細胞または組織の大きな面積に対して粒子を均一に加速す る必要がある。従って、これまで該被覆粒子をターゲットに向けて加速する前に 、比較的大きな表面上に単層として該被覆粒子を分布させて、正確に均一な条件 下で該粒子を受け取る細胞の数を最小化し、かつ結果として１個の細胞が生殖系 形質転換を受ける可能性を高めることが望ましいと考えられてきた。これとは対 照的に、細胞内に粒子を加速注入して体細胞組織、例えば皮膚に一時的な遺伝子 発現を誘発する場合には、該粒子を正確に均一に加速することはあまり必要とさ れない。というのは、十分な発現が、実際に粒子が侵入した少数の細胞によって も起こるからである。従って、これまでは望ましくなかった粒子搬入（delivery ）技術が、今や望ましいものとなった。 上記のおよび他の限界を克服するために望ましいものは、例えば組織中に迅速 にかつ周期的に、複数のサンプルを注入することを可能とする高い処理量の遺伝 子搬入装置である。同様に望ましいものは、既存のプラットホームよりも、より 永続性のある、より簡単に調製でき、保存できかつ取り扱えるサンプル保存かつ 放出用プラットホームである。 発明の概要 本発明は、大雑把にいえば、加速通路を形成した本体を含む、圧縮ガス源によ って駆動するように設計された遺伝子搬入装置に関する。バルブによって該圧縮 ガスを該加速通路に送る。この本体には、カートリッジチャンバーが、生物物質 で被覆した担体粒子を含む粒子カートリッジを受け取るように配置されている。 該バルブによって解放されたガス流が該加速通路を急速に通過して、該カートリ ッジから該担体粒子を受け取るであろう。該本体から該加速通路の出口端部にお いて、円錐形にテーパーの付された出口ノズルには、該担体粒子が該装置を離れ る際に、該粒子の分布を外に向かって拡げるようにテーパーが付されている。 本発明の目的の一つは、一貫性のあるかつ反復的様式で、組織または細胞中に 遺伝物質を搬入する装置を提供することにある。 加圧不活性ガスの噴出によって、該装置から該粒子を追い出し、かつ該粒子が 組織または細胞中に入るのに十分な力で、これらを運搬することが本発明の特徴 の一つである。 該装置が、既存の装置のように単一のサンプルを収容するのではなく、複数の サンプルを収容できることが、本発明の利点の一つである。 該装置によって搬入されるサンプルは、使用前に調製でき、また容易に保存並 びに取り扱えることも、本発明の利点の一つである。 本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の明細書の記載を、添付図に照ら して読むことによって明らかとなろう。 図面の簡単な説明 第１図は、本発明を模式的に示した図である。 第２図は、出口ノズルの角度を変えた効果を、模式的に示す図である。 第３図は、本発明の第一の態様の側面図である。 第４図は、第３図に示した態様のサンプルカートリッジホルダーの正面図であ る。 第５図は、第３図に示した態様の管状サンプルカートリッジの一部切除した側 面図である。 第６図は、プラスミドpWRG1602の物理的地図である。 第７図は、本発明のもう一つの態様の側面図である。 第８図は、第７図に示した態様の分解図である。 第９図は、第７図に示した態様のバルブの断面図である。 第10図は、第７図に示した態様のアクチュエータ機構の断面図である。 第11図は、第３図および第７図に示した態様で使用する随意のディフューザー スクリーンの平面図である。 好ましい態様の詳細な説明 本発明は、遺伝物質で被覆された粒子を、迅速に再現性よく周期的に、生きた ターゲット組織および細胞中に搬入する装置および方法を提供する。第１図は、 ここに記載する好ましい態様の原理に基いて作動する、粒子加速による遺伝的形 質転換装置の操作の一般的方法を例示するための模式的な図である。第１図に示 した本発明の装置の部材は、明確化のために幾つかの部分においては、幾分分解 された状態で示されている。この図は、該装置の構成の詳細というよりも、寧ろ その基本的動作原理を示すものである。 第１図を参照すると、該装置の中心部には担体粒子カートリッジ14が位置して いる。この粒子カートリッジ14は長い凹型または管状の構造をもち、これはその 中心に凹型の中空通路を有している。該担体粒子カートリッジの内部には、複数 の担体粒子16が配置されている。この担体粒子は、以下に更に詳細に論じられる ように、小さな高密度の粒子であり、ターゲット生物中に挿入しようとする生体 物質、即ちDNAまたはRNAで予め被覆されている。該粒子は、更に他の型の生体物 質、例えばペプチド、サイトカイン、ホルモンまたはタンパク質で被覆されてい てもよい。ガスバルブ18が、該担体粒子カートリッジの上流側に位置し、かつ適 当な流体用導管17によって、該担体粒子カートリッジ14の内側に接続されている 。このガスバルブは、13で示された適当な管手段によって、圧縮ガス源12に接続 されている。この圧縮ガス源12は、公知の市販の圧縮ガスタンク、好ましくはヘ リウム等の不活性な圧縮ガスのタンクであり得る。圧縮ガスのリザーバは、該ガ ス源12と該バルブ18との間にあることが望ましいが、該管手段13がこのようなリ ザーバとして機能できることが分かっている。 該担体粒子カートリッジの右側には、オリフィス20があり、これは加速チャン バー22の内部での流体の取り出し口を与え、該チャンバー22は円錐形の出口ノズ ル24で終端している。第１図において参照番号19で示された処置すべき患者、組 織または細胞は、図の右側に配置される。 該装置の一般的な動作において、該バルブ18をしばらく動作させて、管13によ って形成されるリザーバ中に保持された圧縮ガスのパルスを放出する。該バルブ 18と該出口ノズル24との間で、その中間部分が粒子加速通路を形成し、以前圧縮 されていた該膨脹ガスがかなりの速度で該通路を移動するガス流を生成する。こ のガス流は該粒子加速通路を介して加速され、該粒子カートリッジ14の内部を通 過するにつれて、該加速ガス流は該担体粒子を受け取り、そこに同伴する。この 加速ガス流は、次に該チャンバー22を介して該出口ノズル24に達する。次いで、 該粒子は該装置から該患者19の組織上およびその内部に達し、そこで該担体粒子 は該ターゲットまたは患者の細胞内に止まるが、これを殺すことはない。 第１図に示した如く、本発明の装置の適当な動作にとって重要なことは、該出 口ノズル24の幾何形状である。その重要性の理由は、第２図に模式的に示されて おり、第２図はバージョンＡ、ＢおよびＣとして、該出口ノズル24の可能な３種 の幾何形状および該粒子16の飛行に及ぼすその効果を示している。バージョンＡ において、該出口ノズル24は、該装置の出口端部に向かって大幅に拡がってはい ない。結果として、これを出てゆくガス流は該出口ノズル24の端部から直線的に 進み、直接該ターゲット19に向かう通路を進む。結果として、該担体粒子は比較 的線形の流路を維持し、患者19の、第２図に参照番号25で示した比較的狭い領域 に衝突する。粒子16は幾分分散するが、その分散は全く僅かであってあまり重要 でない。 同様に、第２図のバージョンＢでは、該出口ノズル24は、該装置の出口端部に 向かうかなり広い角度の円錐形のテーパーを有する。この態様においても、該ガ ス流はかなり線形で該装置を出、該担体粒子はそれ程広く分散しない。また、該 粒子は患者19の比較的コンパクトな部分25に衝突する。 第２図のバージョンＣに示したように、該出口ノズルの円錐形のテーパーの角 度が臨界角未満である場合には、違った現象が起こる。この例においては、該加 速されたガス流が該出口ノズルを通過するにつれて、渦流作用によって、該ガス 流の通路と、該出口ノズル24の側部との間に真空部を生成する。この真空は、該 ガス流の移動方向に直交するあらゆる方向に外方向に、該ガス流を引っ張る。換 言すれば、該ガス流および該粒子の分散は該粒子の移動方向に対して横方向であ り、該装置から該患者にまで分散する。かくして、第２図のバージョンＣに示し た如く、該装置を出てゆく該ガス流は幅広い領域に渡り横方向に分散され、その 結果該ガス流に同伴される該担体粒子16は広い領域に渡り分散され、第２図のバ ージョンＣに示したように、担体粒子のより一層広い分散パターンを生成する。 その結果として、該粒子は、該円錐形の出口ノズルがこのような形状にない場合 に予想されるよりも、該ターゲット生物のより広い領域25に渡り分配される。従 って、該患者の任意の小領域に対する担体粒子の過剰−投与が回避され、かつ該 粒子を機械的に分布させる必要なしに、あるいはガスの分散または分布装置を使 用することなしに、該担体粒子の比較的広い均一な分布が達成される。 該円錐形の出口ノズル24のテーパーの正確な角度は、使用するガス圧および該 加速チャンバー22のサイズに依存して、態様毎に変動するであろう。市販のヘリ ウムタンクを使用して稼働する装置に対しては、該加速チャンバー22が径1/16イ ンチを有し、出口ノズルがスパン3.3インチに渡り1/16インチ〜2/3インチのテー パーが付されたものが、粒子を、径約1/16インチ〜約2/3インチの分布パターン で拡がるのに十分であり、該粒子が拡がる領域を100倍まで増大することにより 、該粒子分布の密度は100倍に減じられる。効果的に作業するために、該円錐形 の出口ノズルは、その初期または最終的な径（例えば、1/16〜2/3インチ）より も、その長さを著しく大きくする必要がある。長いというよりも幅広い円錐形テ ーパーは該粒子の適切な分散を与えないであろう。しかしながら、該円錐形の出 口ノズルは滑らかな円錐である必要はない。例えば、該出口ノズルは、その全体 としての機能に悪影響をあたえることなく、幾つかの小さな階段状に増大する径 をもつことができる。 該ガスの圧を変えることにより、粒子を該ターゲット19に衝突させ、その内部 に止まらせる力を変えることができる。該ガス圧は該カートリッジ14から該被覆 粒子16を分離するのに十分であるが、該ターゲット19に損傷を与える程に高いも のであってはならない。完全な動物の皮膚に搬入する場合、ガス流は該皮膚に対 して有害であってはならない。幾らかの高いガス圧において、僅かな皮膚の赤変 を正に許容し得る程度に生ずる。市販品として入手可能な圧縮ヘリウムタンクの ガス圧は、該粒子16を分離し、かつターゲット動物、例えばブタまたはマウスの 表皮細胞中に該粒子16を搬入するのに完全に満足であることが分かった。ある状 況下では、該粒子の密度、該ターゲット表面の性質および粒子侵入の所定の深さ に依存して、より低い圧力またはより高い圧力を使用できる。ブタの皮膚を使用 した実験は、ヒトおよびブタの皮膚の機械的類似性の故に、ヒトの皮膚で見られ た結果と類似している。 該粒子カートリッジ14は、好ましくは凹型であり、最も好ましくは内部表面に 堆積した粒子を有する管状のものである。というのは、このようなカートリッジ が該担体粒子に触れることなく、容易に取り扱えるからである。多くの粒子カー トリッジ14の形状および幾何が可能であるが、単純かつ機能的なものは、テフゼ ル（Tefzel:登録商標）等の不活性材料の短い管状のセグメントの使用に基くも のである。該管状のものは、その中心を通して形成された円筒状の通路を有する 円筒を形成する。この管状型の利点は、該生体物質で被覆された該担体粒子が該 装置の壁を汚染し得ないことである。該テフゼル材料の利点は、これが透明であ ることにあり、従って担持したカートリッジを肉眼的に同定可能なことにある。 肉眼視可能な金色の色合いまたは肉眼視可能な金色の縞をもつその外観によって 、この同定が可能となる。該カートリッジの内径は、その内部に粒子の堆積を可 能とし、かつ該粒子を分離するのに十分に高い圧で、十分なガス流を確保するの に十分な大きさであればよい。しかしながら、該カートリッジ14は必ずしも管状 でなくてもよいが、加圧ガスを閉じ込め、分離された粒子16を分散しないが寧ろ 該ガス流によって該ターゲットに向けられるような、任意の凹型の形状のもので あり得る。その例として、該カートリッジ14は、管の半分に該粒子16を堆積し、 かつ該装置の平坦なまたは平坦でない面によってしっかりと覆い、ガスを通すこ とのできる半−円筒状の通路を形成するような半−管状体であり得る。これに基 いて、該サンプルカートリッジおよび該装置の表面によって形成される回りのチ ャンバーの幾何形状は、これら２つが一緒に該ガス流を該リザーバ12から該ター ゲット19に導く限り、何等限定されない。 あらゆる高密度の生物学的に不活性な物質で作られた極めて小さな担体粒子16 が、該サンプルカートリッジ14の表面に堆積される担体粒子として使用可能であ るはずである。この担体粒子16は高密度物質製であって、これらは容易にその運 動量を維持し、かつ十分に小さなサイズであって、形質転換しようとする生物の 細胞に比して小さなものである。数ミクロンのサイズの担体粒子は、該生きた細 胞の細胞壁を透過させることによって、該生きた細胞の殆どの生存能力に不当に 悪影響を与えることなく、該細胞内に入ることが可能である。換言すれば、該担 体粒子は生きた細胞を殺すことなく、その内部に入ることができ、かくして該粒 子上の生体物質を該細胞内に搬入できる。 本発明において、金が該粒子16の最適の材料である。というのは、これは高密 度を有し、生体物質および酸化両者に対して比較的不活性であり、また0.2〜３ μｍの範囲内の径をもつ球状粒子として容易に市販品として入手できるからであ る。測定された寸法範囲0.2〜３μｍを有する微晶質粉末として金が市販されて いるので、１〜３μの範囲のサイズの金球状粒子またはビーズが首尾良く使用で きる。 密度19のタングステンも利用可能である。密度22を有するイリジウムも好まし いが、本出願人はこれを使用しなかった。というのは、比較的粗い粉末としての み容易に入手できるにすぎないからである。タングステンも、金と比較して恐ら くあまり望ましくないものである。というのは、これが空気中でかつ痕跡程度の 水分の存在下で酸化される傾向があるからである。該担体粒子上のこのような酸 化層は粒子を一緒に結合する傾向をもち、該粒子が相互に凝集するにつれて、平 均粒径を著しく増大させるからである。不規則な凝集状態で凝集した粒子は、本 発明の実施にとってあまり望ましくない。なんとなれば、このような凝集はその 質量およびサイズを広範囲に変動せしめ、かくして規則的に反復性のある結果を 得ることを困難にするからである。 第３図には、本発明に従って構築した粒子加速装置10の一態様の側面図を示す ものである。図示したこの装置は手動型かつ持ち運び可能であり、従って容易か つ簡単に操作でき、実験者、専門技術者または臨床医によって稼働できるもので あり得る。 第３図の装置の詳細を説明すると、この装置は好ましくは長く、かつこの装置 の特定の利用者の要求に合った、また該利用者の快適性に合った任意の適当な形 状並びにサイズのものであり得るハンドル28を含む。第３図に示した如く、この ハンドル28は拳銃のグリップの形状に形成されていて、操作者にしっかりした握 りを与え、かつ容易にバルブトリガ機構30を利用できるようにしている。 送入管32が該ハンドル28を貫いて通されており、その両端部は開放状態にあっ て、本装置で使用する加圧下にあるガスを収容できるように固体物質で形成され ている。かくして、該加圧ガス流と接触する該送入管32および該装置の他の全て の部分（サンプルカートリッジ以外）を、非−変形性の固体物質、例えば金属好 ましくは真鍮または高密度熱可塑性または樹脂材料で形成することが好ましい。 この送入管32は上記のようなリザーバとして機能し、作動圧下で粒子加速搬入を 達成するのに十分なガスの放出が可能な貯蔵部を与える。該送入管32の寸法に制 限はなく、加圧下で十分なガスを収容するべく高くしあるいは低くすることがで きる。この送入管32内の容積が不十分である場合には、別の専用のガスリザーバ を設けることも可能である。 該送入管32内の一端部には、コネクタ31が接続され、該コネクタは外部のガス 源12に接続可能である。このガス源は生物学的および化学的に不活性な圧縮ガス を含む市販のタンクであり得る。該不活性ガスは、好ましくはヘリウムである。 該ガス源を出るガスの圧を、有利には公知の圧力制御バルブによって調節し、か つ作業者がみることのできるゲージ上に表示する。 該送入管32内の反対側の端部には、バルブ34が接続されており、これは該送入 管32から該装置10の長い本体33への該ガスの流れを制御する。第３図の第一の態 様において、このバルブ34は、該ハンドル28上のバルブトリガ機構30によって操 作される電気的に動作するソレノイドピストンバルブである。有利には、該ハン ドル28内の該バルブ34と該バルブトリガ機構30との間にワイヤを埋め込み、使用 の際の該装置の安全性および操作性を改善する。本発明は、ここに示された特定 の型のバルブ、あるいは任意の特定のアクチュエータまたはトリガ機構に限定さ れない。多くのバルブとトリガとの組み合わせが公知であり、以下に記載する第 二の態様によって例示されるように、当業者はここに記載した該組み合わせを該 公知のものと交換することができる。バルブとアクチュエータとの多くの組み合 わせが、該バルブピストンおよびバルブ本体が、該送入管32から入ってくる該ガ ス流の圧に耐え得る限り、何れも本発明において使用するのに適している。 該バルブ34の流体出口はカートリッジホルダー36と流体接続状態にある。容易 に迅速なサンプルの再充填を可能とする好ましい態様においては、マルチ−カー トリッジホルダー36を備えている。この装置を作動する前に、単一の工程で予め 充填することのできるサンプル数を最大にするためには、該マルチ−カートリッ ジホルダーは円筒状のものである。該円筒状カートリッジホルダー36の正面図を 第４図に示した。複数のカートリッジチャンバー38（その各々は１個の粒子カー トリッジ14を収容するサイズをもつ）が、該円筒状ホルダーの半径に沿って一定 の距離で円形に配列されていて、一個のカートリッジチャンバー38は各搬入の際 に該ガス流中に位置できるようになっている。該ホルダー36はその半径方向の軸 の回りを360°回転する。該カートリッジホルダー36の周辺上に複数の戻り止め4 0が、チャンバー38が該ガス通路内にある各ピストンを同定するためのコブと嵌 合している。このコブは該本体33を貫くバネで偏らせた突起42を、該カートリッ ジホルダー上に該コブを嵌合するように設けることにより与えることができる。 該カートリッジホルダー36は、利用者の必要に応じて、より多くのまたより少数 のサンプルを収容する他の形状であってもよい。該カートリッジホルダー36は図 示したような円筒状である必要はないが、バルブ34を通過する該ガス流を受け取 るために、ピストン内に移動させることのできるサンプルカートリッジの線形配 列であってもよい。 該本体33内の中空粒子加速チャンバー44は粒子を同伴する該ガス流を該ターゲ ットに送る通路を与える。このチャンバー44は、径1/16インチ、および長さ12〜 15mmをもつように構成されている。該チャンバー44が長過ぎると、該ガス流は摩 擦のために減速される。第３図の切除した部分から明らかな如く、該中空チャン バー44の径はその遠位端部において大きく、該ガス流に同伴された被覆粒子の十 分な分散を可能とする出口ノズル46を形成している。該出口ノズル46を越えて該 粒子加速チャンバー44の遠位端部には、作業者が該装置10と該ターゲットとの間 に一定の距離を設定することを可能とする、スペーサ48が取付けられている。こ の適当な距離は、ターゲット細胞の外観および搬入後の遺伝子発現の程度を実験 的に観測することにより、必要に応じて決定しかつ設定することができる。哺乳 類の皮膚については、3/4〜１インチのスペーサが良好に機能することが分かっ ている。該チャンバー44の内部を研磨することは、該装置10の動作に有益な効果 をもたらす。これは、紐またはパイプクリーナーを研磨化合物で被覆し、これを 該チャンバー44の内部の研磨に使用することによって達成できる。この処理は該 チャンバー44の側部との相互作用および抵抗を減じ、かくして該担体粒子が該目 的のターゲットに向かって流動するのを容易にする。該出口ノズル46も同様に研 磨することができる。以下の第７図に示す態様に関連してより詳細に記載される ように、該バルブ34の背後の該チャンバー44の開始点に達する前に、該ガスの流 動する領域を、適当なスペーサによって該空間を満たすことによって制限するこ とが有利であることが分かった。 第５図に示したような、被覆粒子16を担持する多数の有用なサンプルカートリ ッジ14が、多数の異なる方法に従って、単一の手順で調製できる。２つの異なる 方法が首尾良く利用できた。 第一の方法では、当分野で公知の方法で調製した、生体物質で被覆した粒子の 懸濁液をプラスチック管のある長さに渡り導入し、該粒子を重力の作用によって 該管の内部表面の底部に沈降させる。該粒子が沈降したら、該管の全長に沿った 粒子のリボンを形成し、該液を該管から排液し、該管を回転させて、該ビーズを 窒素雰囲気下で乾燥しつつ、該管の内部表面に該ビーズを展開させる。次いで、 該管を、該放出装置の該サンプルチャンバーに挿入するのに適した長さに切断す る。当業者は、形質転換に利用できる被覆粒子の数が該粒子懸濁液の濃度を調節 することにより、あるいはカートリッジを形成するのに使用する管の長さを調節 することにより変え得ることを認識するであろう。また、本発明において有用な サンプルカートリッジがここに記載した方法以外の方法で調製できることも認識 するであろう。当業者は、サンプル−被覆粒子を分離可能に表面に固定する他の 方法に精通している。 第二の方法は、該粒子カートリッジ14に該担体粒子16を固定するのに、弱い接 着効果を利用する。このような弱い接着性は、該ガス流が完全な圧力に達するま で、該カートリッジの内部凹型表面に一時的に該粒子を付着状態に維持すること によって、該粒子の十分な加速を達成するのに役立つことが分かっている。これ を実現するには、該粒子をアルコールに懸濁する際に添加物を使用する。ほんの 僅かに接着性であり、かつ首尾良く利用されてきた添加物はポリビニルピロリド ン（PVP）、コレステロール、グリセリンおよび水である。例えば、コレステロ ールは該懸濁液中において、アルコール１mｌ当たりコレステロール１mgの割合 で使 用される。この粒子／アルコール懸濁液を超音波処理して、懸濁を助け、次いで この懸濁液を、その側に配置された該カートリッジ14の内部に単に入れるだけで よい。該担体粒子は迅速に、該カートリッジ内部表面の一方の側に沿って懸濁液 から分離してくる。次いでアルコールを除去し、該管を回転しつつ、窒素気流に よって該カートリッジを乾燥する。 第７および８図には、本発明に従って組み立てた粒子加速装置のもう一つの態 様を示した。第７および８図の装置110において、第３図に示した態様における 要素と同一のまたは対応する機能をもつ要素には、100を加えた同様な参照番号 を与えた。例えば、第７図のハンドル128およびトリガ130は第３図の態様のハン ドル28およびトリガ30と同様である。第７図の装置110において、ガスパルスを 放出するためのバルブ134は、上記態様で使用した該ソレノイドを改造した流体 作動システムによって作動する。このバルブ134は流体導管160によって該トリガ 130と接続している。 第８図の分解図では、第７図に示された装置の付随的な内部要素が見えるよう になっている。バルブ部材151は該バルブ134のハウジングの端部にねじ込まれて いる。このバルブ部材はねじ切りした取付け部材152を含み、該取付け部材から バネをもつ偏りシャフト154が伸び、その端部にはバルブ部材156が搭載されてい る。約50μの開口をもつ毛管またはヘリウム放出管158が、該バルブ134を横切っ て伸びて、該装置110に連続的に低−流量でヘリウムガスを放出する。管160が、 アクチュエータブロック162と共に、該バルブ134の左側に接続している。トリガ ／プランジャー164が該アクチュエータブロック162の内側に嵌め込まれている。 スペーサ166および取付け部材168は該バルブ134と該円筒状本体133とを接続する ように機能する。このスペーサは内部通路をもち、該通路は約1/4インチであっ て、該バルブ134背後のガスの流入する容積を制限している。該ガス通路が該本 体133に入る点において、約0.11インチの流入点が与えられ、該膨脹ガスは該カ ートリッジホルダー136を通過するにつれて加速されるであろう。該本体133およ び該カートリッジホルダー136は、これ以外は第３図に示された態様におけるも のと同様であるが、該カートリッジホルダー136は該本体133の底側というよりも 上側に位置している。 該バルブ134の詳細は第９図に示されている。該第一の態様のガス送入管32と 類似するガス送入管132は該バルブのベースに接続し、加圧ガスの導入を可能と する該バルブ部材156は、該バルブ134が正常な閉じた状態にある場合には、170 で示された円錐形にテーパーを付されたバルブシートに対して休止状態にある。 該バルブ134の内部の孔は、該バルブ部材156と、気密接続ではないが、密に嵌合 されたシリンダー172である。第９図に見られるように、該バルブ部材156の左側 のチャンバーにおいて、該管160は該バルブ143と接続している。 第10図には、該アクチュエータ162の更なる詳細を示した。シャフト174が該ア クチュエータブロック162内に水平に伸びており、該アクチュエータブロック162 の前方に対してのみ開放状態にある。３つの垂直な孔176、178、180が、該アク チュエータブロックの上部から下方に伸びるように形成され、該シャフト174と の流体接続状態にある。該孔176の上部の寸法は、該管160の他の端部を受け入れ るようになっており、一方で該シャフト178および180は小さく、かつ単に周囲大 気に対して開放状態にある。拘束ピン182は該シャフト174の閉じた端部内に伸び 、トリガプランジャー164の運動を制限し、かつ該拘束ピンは、第10図に示した 如く、該プランジャーを偏らせて、その位置に休止させるバネを含む。該プラン ジャー164はその上に２つのO-リングをもった長いシャフトであり、該シャフト1 74の内部を封止する。シャフトの延長部186は、該プランジャー164の端部におけ る実際のトリガボタンを該シャフト174の内部に接続する。 該装置110の動作において、該入口131は高圧ガス、好ましくはヘリウムの供給 源に接続されている。該毛管158は小さな低流量での漏れまたは該バルブ134を横 切り、かつ該本体133の内部へのヘリウムの放出を与えて、該出口ノズル146にヘ リウムを溢れさせる。これを実施すると、該装置を作動する前においてさえ、ヘ リウムが該出口ノズル146および該出口ノズルと該ターゲットとの間における支 配的なガスとなる。この領域におけるヘリウムは、該担体粒子の流れおよびより 一貫した該装置110の動作に対して低い抵抗を及ぼす。 該バルブ部材156は、第９図に示したように、通常該バルブシート170に対して 当接されている。該バルブ134の内部全体は、該アクチュエータブロック162内で 、該管160によって該垂直孔176に接続されている。該プランジャー164が 第10図に示したように、その所定の位置にある限り、該孔176の下方端部は該O- リング184によって封止されており、かつ如何なるガスもこの通路から失われる ことはない。該拘束ピン182上のバネの力に抗して該トリガ／プランジャー164を 利用者が押した場合、該O-リングは該孔176のベースの左側による。これは、該 孔176内のガスが該孔180を介して大気中に排出することを可能とする。この排気 は該バルブ部材156の左側における圧力を低下する効果を有する。該チャンバー1 72の壁は制限されていない流体流を該バルブ部材156の左側に制限し、結果とし て該バルブ部材156の右側の圧力が左側の圧力よりも大きくなる。該バネ154は、 この圧力差が、第９図に示したように、該バルブ部材156を強制的に左側にシフ トさせるのに十分な値となるように選択され、また該バルブ部材156は該バルブ シート170から離れ、該カートリッジを介する高圧ガスの流れを解放して、該本 体133に送る。この状態を、該トリガが解放されるまで持続し、その後該トリガ ／プランジャー164は第10図に示す所定の位置に戻り、孔176の底部を封止する。 これにより、高圧状態が該バルブ134の左側に戻り、かつ該バルブ部材156は該バ ルブシート170に対する当接状態に戻り、かくして該バルブ134を介するガスの流 れを閉じる。 該バルブ134の背後で、該装置は該カートリッジ担体を入れる前の拘束状態ま で、ガス流動装置に対して比較的一定の面積を維持する。該スペーサ166は、該 取付け部材168と該バルブシート170との間に残される空間を満たすためのもので あるが、該スペーサ166を貫通する中央の孔の径は、ほぼ該本体133を貫く孔の径 と等しい。この概念は、該ガスが膨脹する領域を、該カートリッジホルダーの0. 11インチの入口に達するまで、1/4インチの孔に制限することである。 第７図に示したように、右端部において、該装置110の出口端部に位置するデ ィフューザが遺伝子搬入の効率を高めるであろうことを示すある証拠がある。こ のようなディフューザ２個が第11図に図示され、190および191によって示されて いる。各ディフューザは環状リングおよびそれぞれ所定の位置にワイヤー194お よび195によって吊り下げられた中央部に位置するスクリーン192および193を含 む。このディフューザは該パターンの中心から該ビーズの一部を選択的に分離し 、該ターゲット領域における担体粒子のより均一な分布を得るように作用す る。 本明細書に記載する装置は、遺伝子ワクチンを使用した、ヒトまたは家畜の大 規模ワクチン接種で使用するのに有利である。遺伝子ワクチンは、遺伝物質、通 常はDNAで作られ、病原性薬物を由来とし、次いでここに記載した如き装置を使 用して生物の生きた細胞内に搬入される。生物体内での免疫応答を生ずるタンパ ク質またはペプチドを生成する細胞転写および翻訳機器によって、一旦細胞内で 該遺伝物質が発現されれば、該免疫応答は、該遺伝物質の起源である該薬物によ る後の感染に対して、動物またはヒトを耐性にする。本発明の装置は、また生物 に欠乏しているが該生物によって必要とされる遺伝子の搬入が行われる、遺伝子 治療に対しても使用できる。また、遺伝子欠損の生物の遺伝物質内にこのような 遺伝物質を安定に組み込むことも可能であり、その実施によって、少なくとも幾 つかの体細胞中の該遺伝子欠損を修復することが可能となる。 本明細書に記載した装置は、遺伝子ワクチンの大規模な反復的搬入において使 用するように設計されているが、既存の粒子加速装置が単一回の搬入で使用され ているのと同様にして、例えば遺伝物質の器官、組織および植物並びに動物の培 養細胞に移す（これらに限定されない）のに使用することも可能である。本発明 の装置は、形質転換植物を形成するために、生きた植物の分裂組織中に遺伝子を 搬入するのに上首尾で利用できた。本発明の装置の利点の全て、特にその持ち運 び性およびサンプル取扱いの容易性は、粒子加速による遺伝子の単一回の搬入の ために使用する場合にも、同様に首尾よく適用できる。しかしながら、本発明の 原理は持ち運び不能な設置型の装置に組み込んで、迅速性、再現性および利用の 容易性における実質的な利点を達成することができる。 実施例 １．プラスミド 第５図のプラスミド地図に示されているように、プラスミドpWRG1602において は、該hCMV即時型プロモータは、ヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子の発現を導く 。このhGHコート配列（coatings equence）は約2.2kbpのXbal-EcoRIフラグメン ト内に含まれており、該フラグメント自体はプラスミドpGH（ニコルインスティ チュ ート（Nichols Institute）から入手できる）から得られた。５EMBO J.，1986， pp．1367-1371に記載されているこのhCMV即時型プロモータは619塩基対をもつAc cIIフラグメント内に含まれており、該フラグメントは該CMV即時型転写開始サイ トの上流側の522塩基対から下流側の96塩基対までの領域を包含している。プラ スミドDNAは標準的な分子生物学的技術を利用して調製した。 ２．DNA被覆粒子の調製 次いで、プラスミドpWRG1602のコピーを金担体粒子上に被覆した。この被覆は 26mgの沈殿金粒子粉末（平均粒径0.95μ）と、25μgのDNA中の200μlの0.1Mスペ ルミジンとを混合することにより行った。DNA対金の比は金１mg当たりDNA2.5μg とした。次いで、連続的に攪拌しつつ200μlの2.5M塩化カルシウム溶液を該混合 物に添加し、その後該サンプルを室温にて更に10分間インキュベートして、該担 体粒子上に該DNAを沈殿させた。該混合物を小型遠心機内で３秒間遠心処理して 、該DNAを担持する該担体粒子を濃縮し、次いで該担体粒子を穏やかにエタノー ルで洗浄し、キャップ付きバイアル中で３mlのエタノール中に再懸濁させた。エ タノール中に該担体粒子を含む該再懸濁を、数秒間、超音波照射した水浴中で該 バイアルを浸漬することにより補助した。 ３．動物細胞中への被覆粒子の搬入 麻酔したマウスを、そのターゲット部位から殆どの毛を除去すべく、厳密に毛 を刈り取った。該動物のこの脱毛した部位に形質転換を誘起させた。 このようにして調製したサンプルカートリッジを、実験室テスト用の本発明の 装置に搭載した。最初のテストにおいては、圧縮ガスを種々の圧力の下で放出し て、遺伝子放出に及ぼすガス圧の効果を決定した。この処置の有効性をアッセイ するために、該処置の24時間後に、該ターゲット皮膚を取り出してホモジナイズ した。各サンプル中のヒト成長ホルモン（hGH）の濃度は、hGHに関する市販のEL ISA-を基礎とするアッセイを利用して定量した。第１表の結果は、搬入部位当た りのマウスの表皮における形質転換された細胞によって生産されたヒト成長ホル モン（hGH）のおよその量を示している。 hGHタンパク質発現を測定するために工夫した実験において、上記のようにし て調製したもう一つのpWRG1602サンプルカートリッジを該装置に搭載し、被覆し た該粒子を、500psiにて、外科的に露出させたマウス肝臓内にインビボで搬入し た。該搬入後24時間後に該肝臓および血清を検査したところ、両者はそれぞれバ ックグラウンド濃度の３および２倍の低いhGH濃度を示した。 カートリッジ当たり全体で約0.5mgの金およびDNAを含有する一組のサンプルカ ートリッジを調製した。これらのカートリッジを該装置に搭載し、麻酔したブタ の表皮に、種々の圧力の下で粒子を搬入した。粒子の搬入前に、皮膚の予備処理 は何等行わなかった。処理の24時間後に、処理した皮膚パッチを取り出し、該EL ISAアッセイを利用してhGHにつきアッセイした。650psiにおいて、数個の部位は 、該搬入部位に紅斑を示した。最小の紅斑を示した一つの部位においては、937n gのhGHが検出された。800psiにおいては、多くの部位が紅斑を示し、最小の紅斑 を示した部位において、412ngのhGHが検出された。1100psiにおいては何れの部 位においてもhGHは検出されず、この搬入圧力下では全てのサンプルが著しい紅 斑を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．圧縮ガス源と接続するのに適した、遺伝子搬入装置であって、 内部に形成された粒子加速通路を有し、かつ一端部において解放されている本 体と、 該圧縮ガス源に接続するのに適しており、選択的に圧縮ガスを該粒子加速通路 に通すように接続されて、加速ガス流を形成するバルブと、 堆積により遺伝物質で被覆された担体粒子を有する粒子カートリッジを内部に 受け取るのに適した形状をもつカートリッジチャンバーと、ここで該チャンバー は該本体内の該粒子加速通路内に配置されて、該粒子加速通路を膨脹しつつ通る 該ガス流は該粒子カートリッジ近傍を通過し、該カートリッジから該担体粒子を 受け取りかつ加速する、 該本体の該粒子加速通路の開口における実質的に円錐形の出口ノズルとを含み 、該円錐形出口ノズルの円錐形形状は、該出口ノズルの錐体がガス流に対して直 交方向において幅が広いというよりも、該ガス流の方向に長いものであり、該円 錐形状は、該本体を出る該ガス流を外方向に拡げて、該出口ノズルが円錐形でな い場合に予想されるよりも広い領域に渡り該担体粒子の分布を生ぜしめる、こと を特徴とする上記遺伝子放出装置。 ２．カートリッジホルダーを有し、該ホルダーはその中に形成された多数のカー トリッジチャンバーを有し、該カートリッジホルダーは該本体に移動可能に取り 付けられて、該カートリッジチャンバーの任意の一つを該粒子加速通路に配置す ることができることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の装置。 ３．該カートリッジホルダーがシリンダーであり、該シリンダーが該本体に対し て回転して、別のカートリッジチャンバーを該粒子加速通路に配置する、請求の 範囲第２項に記載の装置。 ４．該カートリッジホルダーを、該カートリッジチャンバーの一つが回転されて いる、該粒子加速通路内にある、複数の位置の各々における所定の位置に固定す るためのレジストレーション機構を有する請求の範囲第３項に記載の装置。 ５．該カートリッジチャンバーの背後の該粒子加速通路内にオリフィスを有し、 該オリフィスが該粒子カートリッジの内部の凹型部の寸法よりも狭くて、該粒子 カートリッジから該担体粒子を受け取った後に、該ガス流による該粒子の加速を 容易にする、請求の範囲第１項に記載の装置。 ６．該出口ノズルの端部において該装置に取り付けられたスペーサを有し、該装 置を処理すべき組織または生きた生物から所定の距離離す、請求の範囲第１項に 記載の装置。 ７．該圧縮ガスがヘリウムである、請求の範囲第１項に記載の装置。 ８．該カートリッジチャンバーが円筒形であり、かつ該カートリッジが管状であ り、該担体粒子が該カートリッジの内部に堆積されている、請求の範囲第１項に 記載の装置。 ９．該加速通路が平滑となるまで研磨されている、請求の範囲第１項に記載の装 置。 10．該バルブを横切って伸びるように設けられたヘリウム放出管を有していて、 該装置の作動前に、該出口ノズルに残留ヘリウムを導入する、請求の範囲第１項 に記載の装置。 11．製造物品としての、圧縮ガス−駆動型遺伝子搬入装置で使用するためのカー トリッジであって、内部に形成されたアーチ形の線形通路を有する凹型の剛性本 体と、該カートリッジ内の該通路中の、堆積によって遺伝物質で被覆された担体 粒子の堆積物とを含み、該粒子は、該通路を通る膨脹するガス流によって分離で き、該カートリッジは、その上に堆積された該担体粒子に触れることなしに、使 用者が手動で操作できるものであることを特徴とする、上記カートリッジ。 12．該カートリッジが、その中心部を貫いて伸びるように形成された円筒状の通 路をもつ、管状形状のものである、請求の範囲第11項に記載のカートリッジ。 13．該担体粒子が金粒子である、請求の範囲第11項に記載のカートリッジ。 14．該担体粒子が、該通路の軸と整合する線形のパターンで、該通路内に堆積さ れている、請求の範囲第11項に記載のカートリッジ。 15．製造物品としての、圧縮ガス−駆動型遺伝子搬入装置で使用するためのカー トリッジであって、内部を貫いて形成された円筒形の通路を有する円筒形の剛性 管状本体と、該カートリッジ内の該通路中の、堆積によって遺伝物質で被覆され た担体粒子の堆積物とを含み、該粒子は該通路を通る膨脹するガス流によって分 離でき、該カートリッジは、その上に堆積された該担体粒子に触れることなく、 使用者が手動で操作できるものであることを特徴とする、上記カートリッジ。 16．ターゲット生物に遺伝物質を搬入する方法であって、 内部に形成された粒子加速通路を有する遺伝子搬入装置を、制御可能なバルブ を介して圧縮ガス源に接続する工程、 適当な形状の粒子カートリッジを、該遺伝子搬入装置の該粒子加速通路内に適 当に形成されたカートリッジチャンバー内に配置する工程、ここで該粒子カート リッジは、予め該生物の細胞のサイズに対して小さな生物学的に不活性な担体粒 子を該カートリッジの内部の凹型の表面に担持しており、該担体粒子は該遺伝物 質のコピーで被覆されている、 該粒子加速通路が該ターゲット生物を向くように、該遺伝子搬入装置を該ター ゲット生物と隣接して配置する工程、 該遺伝子搬入装置の該粒子加速通路内におよびこれを通して圧縮ガスの流動を 可能とするバルブを作動させて、発生するガス流が該粒子カートリッジから該担 体粒子を受け取り、かつ該担体粒子を該ターゲット生物に向けて同伴する条件下 で、該粒子加速通路内に該ガス流を発生させる工程、および 該遺伝子搬入装置上の円錐形にテーパーの付された出口ノズルによって、該ガ ス流が該装置を出ていく際に、該ガス流を加速する工程、ここで該出口ノズルは 一般に該ガス流の流動方向に対して直交するガス流を拡げるように作用して、該 粒子は該ターゲット生物に衝突する際に拡がる、 を含むことを特徴とする、上記方法。 17．担体粒子を液体中に懸濁し、該懸濁液を該カートリッジ内に入れ、該懸濁液 から該液体を蒸発させることにより、該担体粒子を該カートリッジ内部の凹型の 表面に配置する、請求の範囲第16項に記載の方法。 18．更に、該懸濁液に穏やかな接着剤を添加して、該担体粒子を回カートリッジ の内部表面に僅かに接着させる、請求の範囲第17項に記載の方法。 19．上記配置工程が該装置上に該ターゲット生物に対するスペーサを配置するこ とにより実施する、請求の範囲第16項に記載の方法。 20．該圧縮ガスがヘリウムである、請求の範囲第16項に記載の方法。 21．該粒子カートリッジを該カートリッジチャンバー内に配置する工程を、内部 に形成された多数のカートリッジチャンバーを有するカートリッジホルダーに、 複数の粒子カートリッジを配置し、次いで該カートリッジホルダーを該装置内に 配置して、該装置の多数回に渡る操作を可能とすることにより実施する、請求の 範囲第16項に記載の方法。