ES2247248T3

ES2247248T3 - Instrumento de administracion de genes movido por gas comprimido.

Info

Publication number: ES2247248T3
Application number: ES02023522T
Authority: ES
Inventors: Dennis E. Mccabe
Original assignee: Powderject Vaccines Inc
Current assignee: Powderject Vaccines Inc
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-20
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2015-01-20
Also published as: DE69529495D1; EP1550713A2; DK1293559T3; RU2134295C1; US5584807A; CN1124460A; CA2158733C; NZ279995A; HK1013804A1; ATE300609T1; DE69529495T2; JP3221683B2; CA2501743C; DE69534348T2; CA2501743A1; JPH08509131A; BR9505691A; DK0690732T3; EP0690732A1; AU674815B2

Abstract

Un cartucho (14) para uso en un instrumento de administración de genes movido por gas comprimido incluyendo, el cartucho (14) un cuerpo con un paso lineal arqueado formado en su interior y un depósito de partículas portadoras (16) recubiertas con material genético depositadas en el paso en el cartucho (14) de manera que las partículas (16) pueden ser desalojadas por una corriente de gas en expansión que pasa a través del paso, pudiendo ser manipulado manualmente el cartucho (14) por un usuario sin que el usuario tenga que tocar las partículas portadoras (16) depositadas en el cartucho.

Description

Instrumento de administración de genes movido por gas comprimido.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de administrar material a células, más en particular a administrar material genético a tejido vivo.

Antecedentes de la invención

En la década pasada, la aceleración por medio de partículas de material, en particular material genético, a células y tejidos vivos ha emergido como una herramienta importante de la biotecnología de plantas y animales. La expresión transitoria y la integración de línea de genes de ADN introducido se han demostrado en microorganismos, plantas, y animales.

A medida que se han elaborado los principios fundamentales de la tecnología, la atención se ha desplazado cada vez más hacia el desarrollo de dispositivos que ofrecen al operador la capacidad de efectuar una serie de transferencias de genes mediadas por partículas secuencialmente en rápida sucesión. Tal dispositivo sería especialmente ventajoso para uso en la inmunización en masa de humanos o animales domésticos con vacunas genéticas.

Una limitación de los actuales dispositivos de transferencia genética mediada por partículas es la forma en que se suministra la muestra. En dichos dispositivos, la muestra se deposita en la superficie de pequeñas partículas densas de un material tal como oro o platino. Las partículas recubiertas se recubren posteriormente sobre una superficie rígida, tal como una placa metálica, o sobre una hoja portadora hecha de un material frágil, tal como mylar. La hoja recubierta es acelerada posteriormente hacia un lugar deseado. Este acercamiento tiene varias ventajas así como algunas desventajas. Las ventajas tienen que ver con el hecho de que una hoja plana genera una dispersión muy uniforme de partículas aceleradas. Una desventaja es que cada placa o hoja portadora recubierta con partículas se prepara individualmente y se puede usar solamente una vez, haciendo de la aceleración de partículas un proceso lento e ineficiente, en particular cuando se contemplan muchas transferencias repetidas de genes. Cada hoja portadora recubierta es relativamente grande y debe ser manejada con cuidado, para evitar el daño o contaminación. A veces también es difícil distinguir el lado recubierto útil de una hoja portadora del lado no recubierto. La colocación inapropiada de la hoja portadora puede reducir la producción y puede dar lugar a desperdicio de muestras.

La distribución o dispersión de la configuración de partículas portadoras puede ser más crítica para algunas aplicaciones, es decir, cuando se desean eventos de línea germinal, que para otras aplicaciones, especialmente cuando solamente se necesita expresión transitoria de los genes introducidos. Cuando se desea un evento infrecuente de transformación de línea germinal, hay que acelerar uniformemente las partículas hacia una zona grande de células o tejidos. Por lo tanto, hasta la fecha se ha considerado deseable distribuir las partículas recubiertas como una monocapa en una superficie relativamente grande antes de acelerarlas hacia un lugar deseado para maximizar el número de células que reciben partículas bajo condiciones exactamente uniformes, y para aumentar por ello la probabilidad de que una célula experimente una transformación de línea germinal. En contraposición, al acelerar partículas a células para inducir expresión transitoria génica en tejidos somáticos tales como la piel, hay una necesidad menos imperiosa de hacer exactamente uniforme la aceleración de las partículas, puesto que la expresión adecuada puede tener lugar incluso con bajas cantidades de células realmente penetradas por partículas. Por lo tanto, son deseables técnicas de distribución de partículas que hasta la fecha han sido indeseables.

Para superar estas y otras limitaciones, lo que se desea es un aparato de administración de genes de alta producción que pueda aceptar una pluralidad de muestras para administración rápida y secuencial a tejidos deseados. Lo que también se desea es una plataforma de almacenamiento y administración de muestras que sea más duradera, y más fácil de preparar, almacenar y manejar que las plataformas existentes.

US-A-4 945 050 describe un dispositivo en el que las partículas son introducidas en el tubo de aceleración mediante una entrada roscada que después se cierra con un tornillo.

Resumen de la invención

La presente invención se define en la reivindicación 1.

Una ventaja de la presente invención es que el aparato acomoda una pluralidad de muestras en vez de la muestra única alojada en los dispositivos actuales.

Una ventaja de la presente invención es que el cartucho se puede preparar con anterioridad al uso y se puede almacenar y manejar con facilidad.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes por la memoria descriptiva siguiente, leída a la luz de los dibujos anexos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una ilustración esquemática de la presente invención.

La figura 2 es una ilustración esquemática de los efectos de variar el ángulo de la boquilla de salida.

La figura 3 es una vista lateral de una primera realización de la presente invención.

La figura 4 es una vista frontal de un soporte de cartucho de muestra de la realización de la figura 3.

La figura 5 es una vista lateral cortada de un cartucho de muestra tubular de la realización de la figura 3.

La figura 6 es un mapa físico del plásmido pWRG1602.

La figura 7 es una vista lateral de otra realización de la presente invención.

La figura 8 es una vista despiezada de la realización de la figura 7.

La figura 9 es una vista en sección transversal de la válvula de la realización de la figura 7.

La figura 10 es una vista en sección transversal del mecanismo accionador de la realización de la figura 7.

La figura 11 es una vista en planta de tamices difusores opcionales para uso con las realizaciones de las figuras 3 y 7.

Descripción detallada de la realización preferida

La presente invención proporciona un aparato y método para la administración secuencial rápida y reproducible de partículas recubiertas con material genético a tejidos y células vivos deseados. En la figura 1 se representa una ilustración esquemática destinada a ilustrar el método de operación general de un dispositivo de transformación genética por aceleración de partículas que opera según el principio de la realización preferida. Las partes del aparato ilustrado en la figura 1 se representan ligeramente despiezadas en algunos lugares a efectos de claridad. Esta ilustración pretende ilustrar el principio operativo básico del instrumento en vez de detalles de su construcción.

Con referencia a la figura 1, en el centro del instrumento se ha colocado un cartucho de partículas portadoras 14. El cartucho de partículas 14 es una estructura cóncava o tubular alargada que tiene un paso hueco cóncavo en su centro. En el interior del cartucho de partículas portadoras se ha dispuesto una pluralidad de partículas portadoras 16. Las partículas portadoras, como se explicará con más detalle a continuación, son pequeñas partículas densas que han sido recubiertas previamente con el material biológico, es decir, ADN o ARN, destinado a introducirse en el organismo deseado. Las partículas también puede estar recubiertas con otros tipos de materiales biológicos tal como péptidos, citoquinas, hormonas, o proteína. Una válvula de gas 18 está situada hacia arriba del cartucho de partículas portadoras y está conectada por un conducto de fluido apropiado 17 al interior del cartucho de partículas portadoras 14. La válvula de gas está conectada, por tubos apropiados indicados en 13, a una fuente de gas comprimido 12. La fuente de gas comprimido 12 puede ser un depósito de gas comprimido comercial convencional, preferiblemente de un gas inerte comprimido tal como helio. Un depósito de gas comprimido es deseable entre la fuente de gas 12 y la válvula 18, pero se ha hallado que el tubo 13 puede funcionar como tal depósito.

A la derecha del cartucho de partículas portadoras hay un orificio 20 que da acceso de fluido al interior de una cámara de aceleración 22 que culmina, a su vez, en una boquilla cónica de salida 24. El paciente, tejido, o células a tratar, designados 19 en la figura 1, están situados en el lado derecho de la ilustración.

En su operación general, la válvula 18 es accionada brevemente para liberar un pulso de gas comprimido mantenido en el depósito formado por el tubo 13. Entre la válvula 18 y la boquilla de salida 24, las partes intermedias forman un paso de aceleración de partículas a través del que el gas en expansión, previamente a presión, crea una corriente de gas que avanza a velocidad significativa. La corriente de gas acelera a través del paso de aceleración de partículas y, cuando pasa por el interior del cartucho de partículas 14, la corriente de gas en aceleración toma las partículas portadoras 16 y las lleva con ella. La corriente de gas en aceleración pasa después a través de la cámara 22 a la boquilla de salida 24. Las partículas salen posteriormente del instrumento y entran en los tejidos del paciente 19 donde las partículas portadoras se alojan en, pero no matan, las células del lugar deseado o paciente.

Para el funcionamiento apropiado del instrumento, como se ilustra en la figura 1, es importante la geometría de la boquilla de salida 24. La razón de dicha importancia se ilustra esquemáticamente en la figura 2, que ilustra, como versiones A, B, y C, tres posibles geometrías diferentes de la boquilla de salida 24, y su efecto en el vuelo de la partícula 16. En la Versión A, la boquilla de salida 24 no se ensancha considerablemente hacia el extremo de salida del aparato. Como resultado, la corriente de gas saliente sale linealmente del extremo de la boquilla de salida 24 y prosigue en un recorrido directamente hacia el lugar deseado 19. Las partículas portadoras, como resultado, continúan en un recorrido relativamente lineal y todas impactan en una zona relativamente estrecha, designada 25 en la figura 2, del paciente 19. Aunque las partículas 16 divergen algo, la divergencia es bastante pequeña e insignificante.

Igualmente, en la Versión B de la figura 2, la boquilla de salida 24 tiene un ángulo excesivamente ancho de ahusamiento cónico hacia el extremo de salida del aparato. También en esta realización, la corriente de gas sale del instrumento bastante linealmente, y las partículas portadoras 16 no se dispersan ampliamente. De nuevo, las partículas impactan en una porción relativamente compacta 25 del paciente 19.

Se produce un fenómeno diferente si, como se ilustra en la Versión C de la figura 2, el ángulo de ahusamiento de la forma cónica de la boquilla de salida es inferior a un ángulo crítico. En este ejemplo, cuando la corriente de gas acelerada pasa a la boquilla de salida, crea, mediante una acción vorticial, un vacío entre la ruta de paso de la corriente de gas y los lados de la boquilla de salida 24. Este vacío hace que la corriente de gas sea expulsada en todas las direcciones perpendiculares a la dirección de avance de la corriente de gas. En otros términos, la dispersión de las corrientes de gas y las partículas es lateral a la dirección de avance de las partículas, que es desde el instrumento y hacia el paciente 19. Así, como se ilustra en la Versión C de la figura 2, la corriente de gas que sale del instrumento se dispersa lateralmente sobre una zona más ancha, dispersando por lo tanto las partículas portadoras 16 transportadas sobre una zona más ancha, y creando una configuración mucho más dispersada de partículas portadoras como se ilustra en la Versión C en la figura 2. El resultado es que las partículas se distribuyen sobre una zona mucho más ancha 25 del organismo deseado que si la boquilla cónica de salida no tuviese dicha forma. Así se evita la administración excesiva de partículas portadoras a cualquier zona pequeña del paciente, y se logra una distribución relativamente ancha y uniforme de las partículas portadoras sin necesidad de distribución mecánica de las partículas o equipo sofisticado de diversión o distribución de gas.

El ángulo exacto de ahusamiento de la boquilla cónica de salida 24 variará de una realización a otra dependiendo de la presión de gas usada y el tamaño de la cámara de aceleración 22. Para un instrumento operado desde un depósito de helio comercial, donde la cámara de aceleración 22 es 1,6 mm (1/16 pulgada) de diámetro, se ha hallado una boquilla de salida que se ahusa de 1,6 mm (1/16 pulgada) a 16,9 mm (2/3 pulgada) sobre una extensión de 8,4 cm (3,3 pulgadas) dispersa satisfactoriamente la configuración de distribución de partícula desde aproximadamente 1,6 mm (1/16 pulgada) a aproximadamente 16,9 mm (2/3 de una pulgada) de diámetro, un aumento de más de 100 veces en la zona sobre que se esparcen las partículas, con una disminución resultante de más de 100 veces de la densidad de distribución de partícula. Para operar efectivamente, la boquilla cónica de salida debe ser de longitud considerablemente más larga (por ejemplo 8,4 cm (3,3 pulgadas)) que en sus diámetros inicial o final (por ejemplo 1,6 mm a 16,9 mm (1/16 a 2/3 pulgada)). Un ahusamiento cónico más ancho que largo no dará lugar a una dispersión apropiada de las partículas. Sin embargo, no es necesario que la boquilla cónica de salida sea suavemente cónica. Por ejemplo, la boquilla de salida puede tener varios pequeños aumentos escalonados de diámetro, en vez de un aumento continuo de diámetro, sin afectar negativamente a su función general.

La fuerza con las que partículas impactan en el lugar deseado 19 y se alojan en él se puede variar variando la presión del gas,. La presión de gas debe ser suficientemente alta para desalojar las partículas recubiertas 16 del cartucho 14, pero no tan alta que dañe el lugar deseado 19. A administrar a piel animal intacta, se ha hallado que una corriente de gas no daña la piel. A presiones de gas más altas, se produce cierto enrojecimiento secundario de la piel a niveles muy tolerables. Las presiones de gas en depósitos comercializados de helio comprimido se han considerado completamente satisfactorias para liberar las partículas 16 y administrar las partículas 16 a células epidérmicas de un animal deseado, tal como un cerdo o ratón. Las presiones más o las presiones más altas pueden operar en algunas situaciones, dependiendo de la densidad de las partículas, la naturaleza de la superficie deseada y la profundidad deseada de penetración de las partículas. La experiencia con piel de cerdo es análoga a la esperada con piel humana, debido a la semejanza mecánica de la piel humana y porcina.

El cartucho de partículas 14 es preferiblemente cóncavo y muy preferiblemente es tubular con partículas depositadas en su superficie interior, dado que dicho cartucho se puede manejar fácilmente sin tocar las partículas portadoras. Aunque son posibles muchas formas y geometrías del cartucho de partículas 14, una versión simple y funcional se basa en usar un segmento corto de tubo de material inerte, tal como Tefzel®. El tubo forma un cilindro con un paso cilíndrico formado a través de su centro. Una ventaja de esta forma tubular es que las partículas portadoras recubiertas con el material biológico no pueden contaminar las paredes del aparato. Una ventaja del material Tefzel® es que es transparente, de manera que los cartuchos cargados pueden ser identificados visualmente. La identificación se realiza por el aspecto del cartucho que será visiblemente de color oro, o tendrá una franja visible de oro. El diámetro interno del cartucho solamente tiene que ser suficientemente grande para que se depositen partículas en él, y para permitir un adecuado flujo de gas a su través a una presión suficientemente alta para desalojar las partículas. Sin embargo, el cartucho 14 no tiene que ser necesariamente tubular, sino que podría ser de cualquier forma cóncava en la que se confine el gas a presión, de tal manera que las partículas desalojadas 16 no se dispersen, sino que más bien se dirijan hacia el lugar deseado por la corriente de gas. A modo de ejemplo, el cartucho 14 podría ser medio tubo en el que las partículas 16 se depositan en el medio tubo y se cubran apretadamente con una superficie plana o no plana del aparato para formar un recorrido semicilíndrico por el que pueda pasar el gas. A lo largo de estas líneas, las geometrías del cartucho de muestra y la cámara circundante formada por una superficie del aparato no son críticas, a condición de que las dos dirijan el flujo de gas del depósito 12 al lugar deseado 19.

Partículas portadoras muy pequeñas 16 hechas de cualquier material biológicamente inerte de alta densidad deberán ser aceptables para uso como las partículas portadoras depositadas en una superficie del cartucho de muestra 14. Las partículas portadoras 16 son de material denso de manera que retengan fácilmente el momento y sean de dimensiones suficientemente pequeñas de manera que sean pequeñas con relación a las células del organismo que pretenden transformar. Se ha hallado que las partículas portadoras de un tamaño de unas pocas micras pueden entrar en células vivas, penetrando en las paredes de sus células, sin afectar de forma excesivamente negativa a la capacidad de sobrevivir de la mayoría de las células vivas. En otros términos, las partículas portadoras pueden entrar en las células vivas sin matarlas, administrando así a la célula el material biológico de las partículas.

El oro es un material óptimo para las partículas 16 dentro de la presente invención puesto que tiene alta densidad, es relativamente inerte a los materiales biológicos y a la oxidación, y se comercializa fácilmente en forma de esferas que tienen un diámetro de 0,2 a 3 micras. Se ha utilizado con éxito partículas de oro esféricas, o perlas, en un rango de tamaño de 1-3 micras así como el oro en polvo microcristalino que tiene un rango de tamaño medido de 0,2 a 3 micras.

También se podría utilizar tungsteno, que tiene una densidad de 19. También sería preferible el iridio, que tiene un valor de densidad de 22, pero el iridio no ha sido utilizado por los solicitantes porque solamente está fácilmente disponible en un polvo relativamente basto. El tungsteno también es probablemente menos deseable en comparación con el oro porque tiende a oxidarse en aire y en presencia de humedad incluso de trazas. Dicha capa de oxidación en las partículas portadoras tiende a unir las partículas produciendo un severo aumento del tamaño medio de partícula cuando las partículas se agregan. Las partículas agrupadas en agregados irregulares son menos deseables para la práctica de la presente invención puesto que tales agregados variarán ampliamente en su masa y tamaño, dificultando así la obtención de resultados replicables regularmente.

En la figura 3 se ilustra una vista lateral de una realización de un aparato de aceleración de partículas 10 construido según la presente invención. El dispositivo mostrado se puede manejar con la mano y es portátil, de manera que pueda ser manejado y movido pronta y fácilmente por el experimentador, técnico o clínico.

Volviendo a los detalles del aparato de la figura 3, el dispositivo incluye un mango 28 que es preferiblemente alargado y puede ser de cualquier forma adecuada o tamaño adaptado para las necesidades y el confort del usuario concreto del aparato. Como se representa en la figura 3, el mango 28 se forma en forma de una empuñadura de pistola para proporcionar al operador un agarre firme y acceso fácil al mecanismo de disparo de válvula 30.

A través del mango 28 pasa un tubo de entrada 32, abierto en ambos extremos y hecho de un material sólido que puede contener gas a las presiones usadas por el dispositivo. Así, se prefiere que el tubo de entrada 32, y todas las demás porciones del aparato (distintas del cartucho de muestra) que contacten la corriente de gas a presión, sean de un material sólido no deformable, tal metal, preferiblemente latón, o un termoplástico de alta densidad o material de resina. El tubo de entrada 32 hace de un depósito, descrito anteriormente, que proporciona almacenamiento liberable para suficiente gas a presión operativa para llevar a cabo una distribución con aceleración de partículas. Las dimensiones del tubo de entrada 32 no son críticas, y se pueden incrementar o disminuir para acomodar suficiente gas a presión. Se puede prever un depósito de gas dedicado separado, si el volumen dentro del tubo de entrada 32 es insuficiente.

En un extremo del tubo de entrada 32 hay un conector 31 que se puede conectar a la fuente externa de gas 12. La fuente de gas puede ser un depósito comercial de un gas comprimido biológica y químicamente inerte. El gas inerte es preferiblemente helio. La presión a la que el gas sale de la fuente de gas es regulada ventajosamente por una válvula reguladora de presión convencional y se visualiza en un manómetro visible por el operador.

En el extremo opuesto del tubo de entrada 32 está conectada una válvula 34, que controla el flujo del gas del tubo de entrada 32 al cuerpo alargado 33 del aparato 10. En la primera realización de la figura 3, la válvula 34 es una válvula de pistón de solenoide accionada eléctricamente por un mecanismo de disparo de válvula 30 en el mango 28. Ventajosamente, los hilos entre la válvula 34 y el mecanismo de disparo 30 están empotrados dentro del mango 28 para mejorar la seguridad y manejabilidad del aparato en la práctica. La invención no se limita al tipo particular de válvula mostrada ni a ningún accionador o mecanismo de disparo concreto. Se conocen muchas combinaciones de válvula y disparador que las personas con conocimientos ordinarios pueden utilizar en lugar de la combinación aquí mostrada, como ilustra la segunda realización descrita a continuación. Muchas combinaciones de válvula y accionador son adecuadas, a condición de que el pistón de válvula y el cuerpo de válvula puedan resistir la presión de la corriente de gas que entra por el tubo de entrada 32.

La salida de fluido de la válvula 34 está en conexión de fluido con un soporte de cartucho 36. En una realización preferida, que facilita la rápida recarga de la muestra, se ha previsto un soporte multicartucho 36. Para maximizar el número de muestras que pueden ser precargadas en un paso único antes de operar el dispositivo, el soporte multicartucho es cilíndrico. Una vista frontal del soporte de cartucho cilíndrico 36 se representa en la figura 4. Múltiples cámaras de cartucho 38, cada una dimensionada para recibir un cartucho de partículas 14, están dispuestas de manera circular a una distancia fija a lo largo de los radios del soporte cilíndrico de manera que una cámara de cartucho 38 se pueda colocar en la corriente de gas durante cada distribución. El soporte 36 gira 360º alrededor de su eje radial. Múltiples retenes 40 en la periferia del soporte de cartucho 36 enganchan un botón para identificar cada posición en la que una cámara 38 está dentro del recorrido del gas. El botón se puede disponer previendo un saliente empujado por muelle 42 a través del cuerpo 33 para enganchar el botón en el soporte de cartucho. El soporte de cartucho 36 podría asumir otras formas, contener más o menos muestras dependiendo de las necesidades del usuario. El soporte de cartucho 36 no tiene que ser cilíndrico como se representa, sino que podría ser una disposición lineal de cartuchos de muestra que se puede mover a posición para recibir la corriente de gas que pasa por la válvula 34.

Una cámara hueca de aceleración de partículas 44 en el cuerpo 33 proporciona un recorrido hacia el lugar deseado para la corriente de gas que transporta partículas. La cámara 44 se ha construido con un diámetro de 1,6 mm (1/16 pulgada), y tiene de 12 a 15 mm de longitud. Si la cámara 44 es demasiado larga, la corriente de gas se ralentiza debido a rozamiento. Como pone de manifiesto la porción cortada de la figura 3, el diámetro de la cámara hueca 44 aumenta en su extremo distal para formar una boquilla de salida 46 que permite una dispersión adecuada de partículas recubiertas arrastradas en el flujo de gas. Al extremo distal de la cámara de aceleración de partículas 44, más allá de la boquilla de salida 46, se ha unido un separador 48 que permite al operador establecer una distancia fija entre el aparato 10 y el lugar deseado. La distancia apropiada se puede determinar y fijar cuando sea necesario, en base a observaciones empíricas del aspecto de las células diana y la extensión de la expresión génica después de la administración. Se ha hallado para piel de mamíferos que un separador de 19 mm a 25 mm (3/4 a 1 pulgada) funciona bien. Se ha hallado que el pulido del interior de la cámara 44 tiene un efecto beneficioso en la operación del dispositivo 10. Esto se puede hacer recubriendo una cuerda o limpiador de tubo con un compuesto de pulido y usándolo para pulir el interior de la cámara 44. Esto reduce la resistencia al arrastre y la interacción con los lados de la cámara 44 y así facilita que las partículas portadoras fluyan hacia el lugar deseado previsto. La boquilla de salida 46 puede estar pulida igualmente. Se ha hallado ventajoso restringir la zona por la que fluye el gas después de la válvula 34, antes de llegar al comienzo de la cámara 44 rellenando el espacio con un separador apropiado, como se ilustra con más detalle con respecto a la realización de la figura 7 a continuación.

Se puede preparar gran número de unos cartuchos de muestra útiles 14, representados en la figura 5, que soportan partículas recubiertas 16, en un solo procedimiento como sigue en varios métodos diferentes. Se han utilizado con éxito dos métodos diferentes.

Según el primer método, se introduce una suspensión de partículas recubiertas con materiales biológicos, preparadas de manera conocida en la técnica, en un tramo de tubo de plástico y las partículas se dejan sedimentar bajo la fuerza de gravedad en la parte inferior de la superficie interior del tubo. Cuando las partículas se han sedimentado, formando una banda de partículas a lo largo de la longitud completa del tubo, se drena el líquido del tubo y el tubo se gira para esparcir las perlas sobre la superficie interior cuando se secan bajo nitrógeno. A continuación se corta el tubo a longitudes apropiadas para la introducción en las cámaras de muestra del aparato de administración. Las personas con conocimientos ordinarios reconocerán que el número de partículas recubiertas disponibles para transferencia se puede variar regulando la concentración de la suspensión de partículas, o regulando el tramo de tubo usado para formar un cartucho. También se reconocerá que se puede preparar cartuchos de muestra útiles en la presente invención de formas distintas a las que acaba de describirse. Las personas con conocimientos ordinarios están familiarizadas con otras formas de fijar soltablemente partículas recubiertas con muestra a una superficie.

Un segundo método usa un ligero efecto adhesivo para fijar las partículas portadoras 16 en el cartucho de partículas 14. Se ha hallado que tal adhesivo ligero contribuye a garantizar que las partículas se aceleren bien manteniéndolas adheridas temporalmente a la superficie interior cóncava del cartucho hasta que la corriente de gas suba a presión plena. Para llevar esto a cabo, se utiliza un aditivo cuando las partículas están suspendidas en alcohol. Los aditivos que sólo son ligeramente adhesivos y que se han usado con éxito son polivinil pirrolidona (PVP), colesterol, glicerina y agua. El colesterol, por ejemplo, se utiliza para una velocidad de 1 mg de colesterol por ml de alcohol en la suspensión. La suspensión de partículas/alcohol es sonicada, para contribuir a la suspensión, y después la suspensión se coloca meramente dentro del cartucho 14 que se coloca en su lado. Las partículas portadoras caen rápidamente de la suspensión a lo largo de un lado de la superficie interior del cartucho. Posteriormente se puede sacar el alcohol y secar el interior del cartucho con una corriente de nitrógeno cuando se gira el tubo.

En las figuras 7 y 8 se representa otra realización de un dispositivo de aceleración de partículas construido según la presente invención. En el dispositivo 110 de las figuras 7 y 8, a los elementos que tienen una función similar o correspondiente a los de la realización de la figura 3 se les han asignados números de referencia similares incrementados en 100. Por ejemplo, el mango 128 y gatillo 130 de la realización de la figura 7 aparecen como el mango 28 y el gatillo 30 de la realización de la figura 3. En el dispositivo 110 de la figura 7, la válvula 134 para liberar el pulso de gas operada por un sistema de accionamiento por fluido está adaptada del solenoide utilizado en la realización antes descrita. La válvula 134 está conectada al gatillo 130 por un conducto de fluido 160.

En la vista despiezada de la figura 8 se pueden ver componentes internos adicionales del dispositivo de la figura 7. Se enrosca un elemento de válvula 151 en el extremo de la caja de la válvula 134. El elemento de válvula incluye un adaptador roscado 152 del que se extiende un eje de empuje empujado por muelle 154 en cuyo extremo está montado un elemento de válvula 156. Un tubo capilar o de purga de helio 158 que tiene un agujero de aproximadamente 50 micras, se extiende a través de la válvula 134 para proporcionar una purga continua de bajo nivel de gas helio mediante el dispositivo 110. Un tubo 160 conecta el lado izquierdo de la válvula 134 con un bloque accionador 162. Dentro del bloque accionador 162 se recibe un gatillo/émbolo 164. Un separador 166 y un adaptador 168 sirven para conectar la válvula 134 con el cuerpo cilíndrico 133. El separador tiene un paso interno de aproximadamente 1/4 pulgada para limitar el volumen al que fluye el gas después de la válvula 134. En el punto en el que el paso de gas entra en el cuerpo 133, se ha previsto un punto de entrada de aproximadamente 0,11 pulgada (2,79 mm) de manera que el gas en expansión se acelere cuando pase por el soporte de cartucho 136. Por lo demás, el cuerpo 133 y el soporte de cartucho 133 son parecidos a los de la realización de la figura 3 a excepción de que el soporte de cartucho 136 está situado en el lado superior del cuerpo 133 en vez del lado inferior.

Los detalles de la válvula 134 se muestran en la figura 9. Un tubo de entrada de gas 132, parecido al tubo de entrada de gas 32 de la primera realización, conecta con la base de la válvula y suministra gas de entrada a presión. El elemento de válvula 156 descansa, cuando la válvula 134 está en su estado normalmente cerrado, contra un asiento de válvula cónico indicado en 170. El agujero del interior de la válvula 134 es un cilindro 172 que encaja cerca, pero no es en contacto estanco a los fluidos, del elemento de válvula 156. Según se ve en la figura 9, la cámara a la izquierda del elemento de válvula 156 es donde el tubo 160 conecta con la válvula 143.

En la figura 10 se representan otros detalles del accionador 162. Extendiéndose horizontalmente al bloque accionador 162 hay un eje 174, que se abre solamente a la parte delantera del bloque accionador 162. Se han formado tres agujeros verticales 176, 178 y 180 que se extienden hacia abajo de la parte superior del bloque accionador y en comunicación de fluido con el eje 174. La parte superior del agujero 176 está dimensionada para recibir el otro extremo del tubo 160 mientras que los ejes 178 y 180 son pequeños y se abren simplemente a la atmósfera ambiente. Un pasador de retención 182 entra en el extremo cerrado del eje 174 para limitar el movimiento del émbolo de disparo 164, y el pasador de retención incluye un muelle para empujar el émbolo a descanso en su posición, como se representa en la figura 10. El émbolo 164 es un eje alargado con dos juntas tóricas que efectúan un cierre hermético contra el interior del eje 174. Una extensión del eje 186 conecta el botón de disparo real en el extremo del émbolo 164 con el eje alargado dentro del eje 174.

En la operación del dispositivo 110, la entrada 131 está conectada al suministro de gas a alta presión, preferiblemente helio. El tubo capilar 158 proporciona un pequeño escape de bajo nivel o purga de helio a través de la válvula 134 y al interior del cuerpo 133, para llevar helio a la boquilla de salida 146. Esto se realiza de manera que el helio sea el gas predominante en la boquilla de salida 146 y entre la boquilla de salida y el lugar deseado incluso antes de que el dispositivo se ponga en funcionamiento. El helio en esta zona proporciona una menor resistencia al arrastre en el flujo de las partículas portadoras y una operación más consistente del dispositivo 110.

El elemento de válvula 156 asienta normalmente en el asiento de válvula 170 como se representa en la figura 9. Todo el interior de la válvula 134 está conectado por el tubo 160 con el agujero vertical 176 en el bloque accionador 162. Mientras el émbolo 164 está en su posición representada en la figura 10, el extremo inferior del agujero 176 está sellado por las juntas tóricas 184 y no se pierde gas por esta ruta. Cuando el usuario presiona el gatillo/émbolo 164, contra la fuerza del muelle en el pasador de retención 182, las juntas tóricas pasan a la izquierda de la base del agujero 176. Esto permite ventear el gas en el agujero 176 a la atmósfera a través del agujero 180. Esta ventilación tiene el efecto de bajar la presión en el lado izquierdo del elemento de válvula 156. Las paredes de la cámara 172 evitan el flujo no restringido de fluido al lado izquierdo de la válvula 134 y por lo tanto la presión en el lado derecho del elemento de válvula 156 es mayor que en el lado izquierdo. El muelle 154 se elige de manera que esta presión diferencial sea suficiente para hacer que el elemento de válvula 156 sea empujado a la izquierda según se ve en la figura 9, y el elemento de válvula 156 se separa del asiento de válvula 170, abriendo el flujo de gas a alta presión a través del cartucho y al cuerpo 133. Esta condición persiste hasta que se libera el gatillo, después de lo que el gatillo/émbolo 164 se vuelve a su posición representada en la figura 10, sellando la parte inferior del agujero 176. Esto permite que vuelva alta presión al lado izquierdo de la válvula 134, y el elemento de válvula 156 vuelve a asentar en el asiento de válvula 170 para cerrar el flujo de gas a través de la válvula 134.

Después de la válvula 134, el dispositivo mantiene una zona relativamente constante para flujo unitario de gas hasta la restricción antes de entrar en el soporte de cartucho. El separador 166 tiene la finalidad de llenar el espacio que queda entre el adaptador 168 y el asiento de válvula 170, a excepción de un agujero central a través del separador 166 de diámetro aproximadamente igual al diámetro del agujero a través del cuerpo 133. La idea es restringir la zona de expansión del gas a un agujero de 6,4 mm (1/4 pulgada) hasta que llegue al orificio de entrada de 2,8 mm (0,11 pulgada) para el soporte de cartucho.

Hay cierta evidencia que indica que un difusor colocado en el extremo de salida del dispositivo 110, el extremo derecho según se ve en la figura 7, contribuirá a la eficiencia de administración de genes. Dos de tales difusores se muestran en la figura 11, indicados en 190 y 191. Cada difusor incluye un anillo anular y un tamiz colocado en el centro 192 y 193 respectivamente suspendido en posición por hilos 194 y 195. El difusor sirve para quitar selectivamente parte de las perlas del centro de la configuración dando lugar a una distribución más uniforme de partículas portadoras en la zona deseada.

El aparato aquí descrito se usa ventajosamente para vacunación en masa de humanos o animales domésticos usando una vacuna genética. Las vacunas genéticas se forman de material genético, generalmente ADN, derivado de un agente patógeno y que después se administra a células vivas de un organismo usando un dispositivo como el aquí mostrado. Una vez en una célula, el material genético se expresa por la maquinaria de trascripción y traducción celular para producir una proteína o péptido que engendra una respuesta inmune en el organismo, haciendo la respuesta inmune que el animal o persona sea resistente a la infección siguiente por el agente del que se originó el material genético. Este aparato también se puede usar para terapia génica por la que se suministran genes que faltan, pero son necesarios, en el organismo. Alternativamente, es posible integrar establemente tal material genético dentro del material genético de un organismo genéticamente deficiente, y al hacerlo, corregir la carencia genética, al menos en algunas células somáticas.

Aunque el aparato así descrito se diseñó por su utilidad para la administración repetida a gran escala de vacunas genéticas, también se puede utilizar de las mismas formas en que los actuales dispositivos de aceleración de partículas se han usado en métodos de administración única, incluyendo, aunque sin limitación, transferencia de material genético a los órganos, tejidos, y células cultivadas de plantas y animales. El dispositivo se ha usado con éxito para administrar genes a los meristemos de plantas vivas para crear plantas transgénicas. Todas las ventajas de este aparato, en particular su portabilidad y fácil manipulación de muestras, se aplican igual de bien cuando el aparato se utiliza para administración monodisparo de un gen por aceleración de partículas. Sin embargo, el principio de la invención también se puede incorporar en una unidad estacionaria no portátil para lograr ventajas sustanciales de velocidad, reproducibilidad y facilidad de uso.

Ejemplo 1. Plásmido

En el plásmido pWRG1602, ilustrado por el mapa de plásmido de la figura 6, el promotor inmediato temprano hCMV dirige la expresión de un gen de hormona del crecimiento humana (hGH). La secuencia de recubrimiento hGH se contiene dentro de un fragmento XbaI-EcoRI de aproximadamente 2,2 kbp, que se obtuvo de plásmido pGH (que se puede adquirir de Nichols Institute). El promotor inmediato temprano hCMV, descrito en 5 EMBO J. 1367-1371 (1986), se contiene dentro de un fragmento AccII de 619 pares base que abarca la región de 522 pares base hacia arriba a 96 pares base hacia abajo del lugar de inicio de trascripción inmediato temprano CMV. El ADN de plásmido se preparó usando técnicas estándar de biología molecular.

2. Preparación de partículas recubiertas de ADN

Posteriormente se recubrieron copias del plásmido pWRG1602 sobre partículas de oro portadoras. Este se hizo mezclando 26 mg de polvo de oro precipitado (0,95 micras de diámetro medio) con 200 \mul de 0,1 M espermidina en 25 \mug de ADN. La relación de ADN a oro era 2,5 \mug de ADN por mg de oro. A continuación se añadió a la mezcla 200 \mul de una solución de cloruro de calcio 2,5 M, con agitación continua, después de lo que la muestra se incubó un período adicional de 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la precipitación del ADN sobre las partículas portadoras. La mezcla se centrifugó durante 3 segundos en una microcentrífuga para concentrar las partículas portadoras con el ADN encima, después de lo que las partículas portadoras se lavaron suavemente con etanol y volvieron a suspender en 3 ml de etanol en un vial coronado. La resuspensión de las partículas portadoras en el etanol fue facilitada por la inmersión del vial en un baño de agua sonicante durante varios segundos.

3. Administración de partículas recubiertas a tejido animal

Se esquilaron bien ratones anestesiados para quitar la mayor parte de la piel del lugar deseado. Las transformaciones se realizaron en este lugar desnudo del animal.

Se cargaron cartuchos de muestra así preparados en el aparato de la presente invención para prueba de laboratorio. En una primera prueba, el gas comprimido se administró a varias presiones para determinar el efecto de la presión de gas en la administración de genes. Para comprobar la efectividad de los procedimientos, 24 horas después del tratamiento, se extrajo y homogeneizó la piel deseada. El nivel de hormona del crecimiento humana (hGH) en cada muestra se cuantificó usando un ensayo comercial basado en ELISA para hGH. La Tabla 1 muestra la cantidad aproximada de hormona del crecimiento humana (hGH) producida por las células transformadas en la epidermis de ratón por lugar de administración.

TABLA 1

Ratón	Presión	Lugar de administración	Cantidad

A	34,5 bar (500 psi)	1	40 ng

		2	22 ng
	48,3 bar (700 psi)	1	59 ng

		2	140 ng
B	34,5 bar (500 psi)	1	40 ng

		2	38 ng
	20,7 bar (300 psi)	1	75 ng

		2	50 ng

En un experimento diseñado para medir la expresión de proteína hGH, se cargó en el aparato otro cartucho de muestra pWRG1602 preparado como se describe y las partículas recubiertas encima se administraron in vivo a un hígado de ratón quirúrgicamente expuesto a 500 psi. Cuando se examinaron el hígado y el suero 254 horas después de la administración, ambos mostraron niveles bajos de hGH, tres y dos veces superiores a los niveles básicos, respectivamente.

Se preparó un conjunto de cartuchos de muestra conteniendo un total de aproximadamente 0,5 miligramos de oro y ADN por cartucho. Estos cartuchos se cargaron en el aparato y se administraron partículas a varias presiones a la epidermis de un cerdo anestesiado. No se realizó pretratamiento de la piel antes de la administración de partículas. Veinticuatro horas después del tratamiento, los parches de piel tratados se extrajeron y analizaron con respecto a hGH usando el ensayo ELISA. A 650 psi, varios lugares mostraron eritema en los lugares de administración. En el lugar que mostró menos eritema, se detectaron 937 ng de hGH. A 800 psi, la mayor parte de los lugares mostró eritema; se detectaron 412 ng de hGH en el lugar que presentaba menos eritema. A 1100 psi, no se detectó hGH en ningún lugar de administración y todos exhibían eritema significativo a esta presión de administración.

Claims

1. Un cartucho (14) para uso en un instrumento de administración de genes movido por gas comprimido incluyendo, el cartucho (14) un cuerpo con un paso lineal arqueado formado en su interior y un depósito de partículas portadoras (16) recubiertas con material genético depositadas en el paso en el cartucho (14) de manera que las partículas (16) pueden ser desalojadas por una corriente de gas en expansión que pasa a través del paso, pudiendo ser manipulado manualmente el cartucho (14) por un usuario sin que el usuario tenga que tocar las partículas portadoras (16) depositadas en el cartucho.

2. Un cartucho según la reivindicación 1, donde el cuerpo es un cuerpo tubular cilíndrico rígido y el paso es un paso cilíndrico.

3. Un cartucho según la reivindicación 1 ó 2, donde las partículas portadoras (16) son partículas de oro.

4. Un cartucho según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, donde las partículas portadoras (16) se depositan en el paso en una configuración lineal alineada con el eje del paso.

5. Un cartucho (14) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en combinación con un soporte de cartucho (36; 136).

6. Una combinación según la reivindicación 5, donde el soporte de cartucho incluye una pluralidad de cámaras de cartucho (38), siendo capaz cada una de recibir y contener un cartucho (14), recibiéndose y conteniéndose dicho cartucho en una de dichas cámaras.

7. Una combinación según la reivindicación 6, habiendo doce cámaras de cartucho (38) dispuestas en el soporte de cartucho.

8. Una combinación según la reivindicación 6 ó 7, donde dicho soporte de cartucho tiene un eje de rotación y dicha pluralidad de cámaras de cartucho (38) están colocadas a la misma distancia de dicho eje de rotación.

9. Una combinación según la reivindicación 8, donde dicha pluralidad de cámaras de cartucho (38) están espaciadas uniformemente una de otra alrededor de dicho eje de rotación.

10. Una combinación según la reivindicación 6 ó 7, donde dicha pluralidad de cámaras de cartucho (38) están en una disposición lineal.

11. Una combinación según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde dicho soporte de cartucho incluye una pluralidad de retenes (40) para enganchar con un botón (42; 142) en dicho instrumento de administración de genes para identificar cada posición en la que una cámara de cartucho (38) está dentro del recorrido del gas.

12. Un instrumento de administración de genes incluyendo el cartucho (14) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Un instrumento de administración de genes incluyendo la combinación de soporte de cartucho (36) y cartucho (14) de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11.

14. Un instrumento de administración de genes según la reivindicación 13, incluyendo además un botón (42; 142) para enganchar con el retén o una pluralidad de retenes (40) en dicho soporte de cartucho (38).

15. Un instrumento de administración de genes según la reivindicación 14, donde dicho botón (42; 142) es empujado por muelle hacia un retén (40).

16. Un instrumento de administración de genes según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, incluyendo además:

un cuerpo (33; 133) que tiene un paso de aceleración de partículas (22; 44; 144) formado en el mismo y abierto en un extremo; y

una válvula (18; 34; 134) adaptada para conectar con una fuente de gas comprimido (12) para admitir selectivamente gas comprimido al paso de aceleración de partículas para hacer una corriente de gas en aceleración;

incluyendo dicho cuerpo una boquilla de salida sustancialmente cónica (24; 46; 146) en el agujero del paso de aceleración de partículas del cuerpo, siendo tal la forma cónica de la boquilla cónica de salida que el cono de la boquilla de salida sea más largo en la dirección de flujo de gas que ancho en la dirección perpendicular al flujo de gas, haciendo la forma cónica, en la práctica, que la corriente de gas que sale del cuerpo se expanda hacia fuera para distribuir las partículas portadoras sobre una zona más ancha que si la boquilla de salida no fuese cónica;

donde dicho soporte de cartucho (36; 136) está colocado de manera que una cámara de cartucho (38) esté en el paso de aceleración de partículas.

17. Un método de hacer un cartucho, teniendo dicho cartucho la construcción expuesta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, incluyendo dicho método:

suspender partículas recubiertas con material genético en un líquido de suspensión;

introducir la suspensión de partículas en un tramo de tubo; y

sacar el líquido de suspensión del tubo dejando las partículas depositadas en el tubo.

18. Un método según la reivindicación 17, donde las partículas pueden sedimentar bajo la fuerza de gravedad en la parte inferior de la superficie interior del tubo antes de dicho paso de extracción.

19. Un método según la reivindicación 17 ó 18, incluyendo además girar el tubo después de dicho paso de introducción para esparcir las partículas sobre la superficie interior del tubo.

20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde dicho paso de extraer el líquido de suspensión incluye drenar el líquido.

21. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, donde dicho paso de extraer el líquido de suspensión incluye secar el interior del tubo con nitrógeno.

22. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, incluyendo además cortar el tramo de tubo a longitudes más cortas apropiadas para la introducción en las cámaras de cartucho (38) de un soporte de cartucho (36).

23. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, donde dicha suspensión de partículas incluye un aditivo adhesivo suave para adherir ligeramente las partículas a la superficie interior del tubo.

24. Un método según la reivindicación 23, donde dicho aditivo se selecciona a partir del grupo que incluye polivinil pirrolidona (PVP), colesterol, glicerina y agua.

25. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, donde dicho líquido de suspensión es alcohol.