JPH08509363A - 融合プロトコルを使用することにより発生セリンの産出増加を得る方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は当該技術において知られている融合プロトコルにより元のセリンをそれ自体により処理することにより特徴付けられる発生哺乳類セリンの高い生成物発現を得るための方法に関する。蛋白質生成物の産出は哺乳類の組織培養中で行われ、そして生成物は治療蛋白質または人間使用に向けられる他の分子であることが可能である。とくに本発明は安定した高い発生セリンを得るための細胞融合方法の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 融合プロトコルを使用することにより発生セリンの産出増加を得る方法 技術分野 本発明は当該技術において知られている融合プロトコルにより元のセリンをそ れ自体により処理することにより特徴付けられる発生哺乳類セリンの高い生成物 発現を得るための方法に関する。蛋白質生成物の産出は哺乳類の組織培養中で行 われ、そして生成物は治療蛋白質または人間使用に向けられる他の分子であるこ とが可能である。とくに本発明は安定した高い発生セリンを得るための細胞融合 方法の使用に関する。 関連技術の説明 異質組織の哺乳類細胞中の蛋白質の発現は通常当業者に良く知られた、以下の ３つの方法の１つにおいて行われている。 １）哺乳類細胞中の蛋白質の発現に必要な要素を含有するベクターまたはウイ ルスを適切な細胞内に導入させることができる。 ２）一定の蛋白質を発現する１次セリンを連続セリンに変換させることができ る。 ３）リンパ球のごとき１次セリンが非生成セリンを融合させることができそし てその結果として生じるハイブリツドを望まれる蛋白質の発現のために選択させ ること ができる。 さらに上記１〜３から引き出された細胞を培養することにより、関心のある蛋 白質を培養媒体または細胞それら自体から得ることができる。 最後の技術３は最も普通のものでありそしてハイブリドーマ細胞による単一細 胞に由来する細胞である抗体の産出に使用されている。ハイブリツドセリンは通 常２つの異なる融解親からの染色体または遺伝子の存在により特徴付けられてお り、融合混合物から親細胞を除去しかつ融解された細胞の出現および生成を認め るために或る種の選択手順を必要とする。 蛋白質産出を高める方法としての細胞融合はチエンサイナー氏等著のバイオテ クノロジー、第８巻、１９９０年、第８５８頁乃至第８６２頁に記載されている 。著者は肝臓細胞とトランスフエクシヨン（細胞感染）されたベーロ細胞との間 で標準的なハイブリツドを産出した。安定したハイブリツドが増加された量の望 まれる生成物を産出した。 種々の細胞融合プロトコルが当該技術において良く知られている。ポリエチレ ングリコール（ＰＥＧ）、プロトプラストまたは仙台ウイルスの使用を例として 記載することができ、ここでは参考として１９７９年、アカデミツク出版、酵素 学における方法、第ＬＶＩＩＩ巻、ウイリアム・ビー・ジヤコビー氏およびイラ ・エイチ・パスタン氏による細胞培養を示す。電気融合は同様に使用 され得る他の方法であり、ここでは参考として１９８９年、ストツクマン出版、 カール・エー・ケー・ボールベツク氏およびインガー・ハーゲン氏による、研究 手引、「ハイブリドーマ技術における電子操作」および１９９２年、アカデミツ ク出版、チヤン氏等による「エレクトロポレーシヨンおよび電気融合に対するガ イド」を示す。例えば、使用される細胞、時間、温度等の量の変化により、各研 究室はしばしばその固有のプロトコルを有している。 手短に、上記従来技術は融合細胞、２つの親細胞の組み合わせである特定の細 胞の特定の生成物の産出を得かつ増加する手段として、２つの異なる細胞の標準 的な細胞融合の使用を開示している。 本発明は蛋白質生成セリンの確立において使用され得る方法に関するものであ り、本方法はセリンの望まれる生成物の産出を増加する。 本方法は細胞融合に似ているけれども標準的な細胞融合ではなくそして得られ るセリンは驚いたことには、長期間にわたつて安定している。 発明の概要 本発明は、当該技術において知られた、融合プロトコルにより元の細胞をそれ 自体と融合することにより生成セリンの高い生成物発現を得る方法に関する。本 発明に適する細胞融合プロトコルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または電 気融合、プロトプラストまたは仙台 ウイルスを利用する方法である。細胞は支那ハムスター卵巣（ＣＨＯ）派生セリ ン、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）またはコス（アフリカン・グリーン・モン キー派生セリン）または他の普通に使用される哺乳類セリンにさせることができ る。 生成物は好ましくは十分な長さの因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩの欠失派生物ま たは他の方法で変形された因子ＶＩＩＩであるが、他の治療的に活性の蛋白質ま たは分子であつても良い。 結果として生じるセリンは元のセリンと同一または非常に似た染色体およびＤ ＮＡ含量を有することができる。 細胞融合プロトコルは好ましくは選択プロトコルの存在なしに実施させること ができるが、選択プロトコルを使用することもできる。融合プロトコルはすでに 融合された細胞で実施され得る。 本発明は哺乳類セリンの生産性を増加するために細胞融合プロトコルの使用に 関するものである。 本発明の好適な態様はヒト組み換え因子ＶＩＩＩ生成セリンの生産性を増加す るための方法の使用である。因子ＶＩＩＩ：Ｃの増加の範囲は２倍、１０倍、同 様に２０倍までにすることができる。本方法は多数のセリンに適用し得るが、と くに十分な長さの因子ＶＩＩＩを生成するＣＨＯ（支那ハムスター卵巣）、欠失 変形例または他の方法で変形された因子ＶＩＩＩに適用し得る。 本発明は細胞融合条件下で、従来のハイブリツドでは ない高い生成および安定したセリンを得ることができることを示す。 好適な実施例の説明 材料および方法 組み換え因子ＶＩＩＩは因子ＶＩＩＩＳＱ．（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）と呼ばれる ヒト因子ＶＩＩＩの欠失変形例用のｃＤＮＡ符合化によりトランスフエクシヨン されたＣＨＯＤＧ４４ＮＹ細胞中で生成された（国際特許出願公開第ＷＯ９１／ ０９１２２号公報および国際特許出願公開第ＷＯ９２／１６５５７号公報参照） 。以下の細胞融合プロトコルが使用された。すなわち細胞は所有者の血清なしの 媒体中で培養された。２０〜８０×１０⁶の細胞が洗浄され、ペレツト化されそ してＰＥＧ４．０００の５０％（媒体中）溶液がペレツトに小滴状で添加された 。１分後ＰＥＧ−細胞混合物が培養媒体を添加することにより徐々に希釈された 。希釈された混合物は徐々に遠心され、新たな媒体が添加されかつさらに血清な しの媒体中で培養された。選択的な媒体は使用されずそして１つの型の細胞のみ が使用された。 細胞の融合は染色体計数および流れ血球計算により監視された。 因子ＶＩＩＩ：Ｃ活性の測定のために、成長媒体が産出媒体に交換されそして ＶＩＩＩ：Ｃはそれが表中に示された日数の上清（媒体変化なし）中に蓄積され たとき測定した。因子ＶＩＩＩ活性（ＶＩＩＩ：Ｃ）は種々の 時点後発色体基板（クロモジエニツクス・ミユルンダール）により測定された。 例１ この例は融合後１週間のｒ−ＶＩＩＩＳＱ発現を示す。元のｒ−ＶＩＩＩＳＱ 生成セリン“ＡＤＬＡ”は、材料および方法（表１のＡＤＬＡＰＦＴおよびＰＥ Ｇ１〜５）により上述されたごとくかつまた細胞が融合するのを阻止するために 副融合下で細胞をプラスチツクに付着して保持するとき（表１のＡＤＬＡＰＴ） に、標準融合条件下でＰＥＧ４０００により処理された。ＡＤＬＡ対照標準はＰ ＥＧ処理しなかつた。細胞は融合に成長させられかつ因子ＶＩＩＩ：Ｃに関して 試験された。 結果 「標準」融合条件により処理された細胞は融合処理後 １日ないし３日で対照標準値の平均４５７％，１４０％および１５３％として発 現した。副融合条件によりＰＥＧ処理された細胞は処理後１日で単に高められた ＶＴＩＩ：Ｃ活性（ＡＤＬＡＰＴ）を発現した。表はまた個々の実験間にかなり の差異がありかつ発現が、融合後、１日で直ちに最も高いことを示す。 例２ 選択されなかつた、ＰＥＧ処理の個体群の安定性を試験するために上記セリン の１つ（ＰＥＧ−４）がさらに２ケ月間選択的な圧力なしに２次培養されかつ次 いで因子ＶＩＩＩ活性に関して再評価された。これらの細胞はさらにｒＶＩＩＩ ＳＱの高い量を発現した。 結果 非選択条件下に保持された、溶融後６２日から６８日の発現は対照標準値の２ ９４％ないし１８９２％の間であつた。 例３ 既にＰＥＧ融合のセリン（ＰＥＧ４）が再びそれ自体とＰＥＧ融合され、そし てさらに選択的な圧力なしに１ ０日間２次培養された。 結果 二度の「融合処理細胞」が単一融合細胞に比してｒ−ＶＩＩＩＳＱの同様によ り高いレベルを発現した。かくしてＰＥＧ処理は繰り返して実施され得る。 例４ セリンＰＦＴはさらにプロピジウムヨー化物着色後の蛍光による染色体計数お よびＤＮＡ含量により検査された。表４は２つの異なる場合についての融合後の 培養中の１０〜２０日後の染色体分析の結果を示す。これらの時点において上述 されたような増加された発現が存在した。すべてのセリンは２０の形式上の染色 体数を示す。検査されたすべての細胞はサブ４倍性の染色体数により異常型の中 期板の存在を示した。しかしながら融合細胞を対照標準セリンに比較する差異は なかつた。これはさらにプロピジウムヨー化物着色および細胞の増殖中の幾つか の場合についてのＤＮＡ含量蛍光分析の分析により研究された。 結果 ＰＥＧ処理された細胞は融合されない対照標準セリンに比較して高いＤＮＡ含 量を持たなかった。これらの分析は、高い発現レベルが長時間の非選択細胞培養 後安定していたという事実とともに、高い産出細胞が標準の細胞融合方法の結果 でなかつたことを示す。 検討 細胞融合は公知の方法である。けれども、ここで示された例は標準の細胞融合 に関する代表ではない。第１にＰＥＧ処理細胞はより多くのＤＮＡまたは染色体 を含有せずかつ第２に個体群を２次培養することに伴われる選択的な工程が無い 。そのうえ、１０^-4〜１０^-5の規則的な融合回数は増加された生産性の長時間の 持続の説明として細胞融合に関して低い方にある。ともに取られたこれらの結果 はＰＥＧ処理による細胞融合が細胞の発現能力の安定した変化を誘起することを 示す。このようにこの方法は種々の細胞および種々の病原体に適用可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）元の細胞を融合プロトコルによりそれ自体と融合させることを特徴とする 発生セリンの高い生成物発現を得る方法。 ２）融合プロトコルにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることを特徴 とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ３）融合プロトコルに電気融合、プロトプラストまたは仙台ウイルスを用いる ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ４）細胞が支那ハムスター卵巣（ＣＨＯ）派生セリンであることを特徴とする 請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５）細胞がベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）またはコスまたは蛋白質製造に普 通に使用される他の哺乳類セリンであることを特徴とする請求の範囲第１項ない し第３項のいずれか１項に記載の方法。 ６）生成物が治療的に活性の蛋白質または分子であることを特徴とする請求の 範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の方法。 ７）生成物が十分な長さの因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩの欠失派生物または他 の方法で変形された因子ＶＩＩＩであることを特徴とする請求の範囲第６項に記 載の方法。 ８）結果として生じるセリンが元のセリンと同一また は非常に似た染色体およびＤＮＡ含量を有することを特徴とする請求の範囲第１ 項ないし第７項のいずれか１項に記載の方法。 ９）細胞融合プロトコルを選択プロトコルの存在なしに実施させることを特徴 とする請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１項に記載の方法。 １０）選択プロトコルを使用することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第 ８項のいずれか１項に記載の方法。 １１）融合プロトコルをすでに融合させた細胞で実施させることを特徴とする 請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１項に記載の方法。 １２）蛋白質または他の分子の産出において融合プロトコルにより元の細胞を それ自体により融合することにより得られたセリンまたは細胞の使用。 １３）前記セリンが染色体を有しかつＤＮＡ含量が元のセリンと同一または非 常に似ていることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のセリンの使用。