PT684992E - Metodo para aumentar o rendimento de uma linha celular produtora atraves de um protocolo de fusao - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE UMA UNHA CELULAR PRODUTORA ATRAVÉS DE UM PROTOCOLO DE FUSÃO"
A Âmbito da invenção A presente invenção diz respeito a um método para obtenção de uma elevada expressão de produto numa linha de células de mamíferos produtora caracterizada por se tratar a linha de células original com ela própria de acordo com um protocolo de fusão, conhecido na técnica. A produção de produtos proteicos é realizada em culturas de tecidos de mamíferos, e o produto pode ser proteínas terapêuticas ou outras moléculas para uso humano. Esta invenção diz respeito em particular ao uso de métodos de fusão células para obter uma linha de células estável altamente produtora.
Descrição de técnicas relacionadas. A expressão de proteínas em células mamíferas heterologas é normalmente realizada de um dos seguintes três modos, bem conhecidos pelos técnicos nesta área. 1. Um vector ou vírus contendo os elementos necessários para a expressão de proteínas em células mamíferas pode ser introduzida numa célula apropriada. 2. Uma linha de células primária exprimindo uma certa proteína pode ser transformada numa linha de células continua. 3. Uma linha de células primária, tal como um linfócito pode ser fundida com uma linha de células não produtora e o híbrido resultante pode ser seleccionado para exprimir a proteína desejada.
Por posterior cultivo dos derivados celulares conseguidos dos modos 1-3 acima pode ser obtida a proteína de interesse a partir do meio de cultura ou das próprias células. A última técnica 3 é a mais comum e é utilizada para a produção de anticorpos monoclonais por células de hibridoma. As linhas de células híbridas são normalmente caracterizadas pela presença de cromossomas ou genes da fusão de dois progenitores diferentes e requer alguma espécie de procedimento de selecção de modo a eliminar as células parentais da mistura de fusão e permitindo a emergência e crescimento das células fundidas. A fusão de células como um método para aumentar a produção de proteínas tem sido descrito por Chenciner e outros em Bio/Technology volume 8, 1990:858-862. Os autores produziram híbridos clássicos entre uma célula do fígado e uma célula Vero transfectada. Os híbridos estáveis produziram um aumento na quantidade de produto desejado. O pedido de patente dos Estados Unidos n° 4 659 663 descreve um método para o isolamento dos produtos da fusão celular que são produzidos pela fusão de duas populações de células. A prática de isolar produtos de fusão das células baseia-se num sistema de selecção toxina - anti-toxina (ver coluna 4).
No exemplo 3 do pedido de patente dos Estados Unidos n° 4 659 663 este sistema de selecção toxina - anti-toxina é testado através da capacidade de complementar deficiências genéticas causando Xeroderma pigmentosum. Um grupo de controlo usado neste exemplo são fusões de células da mesma linha de células. Não existe nenhum depoimento que diga respeito à capacidade dos produtos de fusão para influenciarem a expressão numa linha de células produtora.
Diferentes protocolos de fusão de células são bem conhecidos na técnica. O uso de polietileno glicol (PEG), protoplasto ou Sendaivirus podem ser mencionados como 3 exemplos e é aqui feita referência à cultura de células por William B. Jakoby e Ira H. Pastan, “Methods in Enzymology” volume LVIII, Academic Press, 1979. A electrofusão é outro método que também pode ser utilizado e é aqui feita referência ao “Electromanipulation in hybridoma technology, Laboratory manual” por Cari A. K. Borrbaeck e Inger Hagen, Stockman Press, Í989 e “Guide to Electroporation and Electrofusion” por Chang e outros, Academic Press, 1992. Devido às variações de, por exemplo, a quantidade de células utilizadas, tempo, temperatura, etc., cada laboratório tem com frequência o seu próprio protocolo.
Resumindo, as técnicas anteriores acima descritas dizem respeito à utilização da fusão celular clássica de duas células diferentes, como meio para obter e aumentar a produção de um produto em particular numa determinada célula que é uma célula de fusão, uma combinação de duas células progenitoras.
Descobrimos agora um método que pode ser usado no estabelecimento de uma linha de células produtoras de proteína. O método aumentará a produção do produto desejado da linha de células.
Apesar do método se assemelhar a uma fusão celular não é uma fusão celular clássica e as linhas de células obtidas são, para nossa grande surpresa, estáveis durante um período de tempo prolongado.
Sumário da invenção. A presente invenção diz respeito a um método de obtenção de uma maior expressão de produto numa linha de células produtora através da fusão da célula original com ela própria de acordo com um protocolo de fusão, conhecido na técnica.
Os protocolos de fusão de células aceitáveis para a presente invenção são métodos utilizando o polietileno glicol (PEG) ou electrofusão, protoplasto ou Sendaivirus. A célula pode ser um derivado da linha de células do Ovário da Hamster Chinesa (CHO),
Rim do Hamster Bebé (BHK) ou Cos (um derivado da linha de células do macaco verde africano) ou qualquer outra linha de células de mamíferos vulgarmente utilizadas. O produto é prèferencialmente factor VIII, de comprimento completo, derivados do factor VIII por apagamento ou por outro lado factor VIII modificado mas também pode ser outra proteína ou molécula terapêuticamente activa.
As linhas de células resultantes podem ter um cromossoma e conteúdo de ADN idênticos ou muito semelhantes à linha de células original. O protocolo de fusão de células é preferencialmente realizado sem a presença de um protocolo de selecção, mas os protocolos de selecção podem ser usados. O protocolo de fusão pode ser realizado em células já fundidas. A invenção também diz respeito à utilização de uma linha de células ou célula que foi obtida pela fusão de uma célula original com ela própria de acordo com protocolo de fusão na produção de uma proteína ou outra molécula e preferencialmente uma linha de células na qual as linhas de células têm um cromossoma e um conteúdo em ADN similar à linha de células original. A presente invenção compreende assim a utilização de um protocolo de fusão de células para aumentar a produtividade de uma linha de células dos mamíferos.
Um aspecto preferido da presente invenção é a utilização do método para aumentar a produtividade das linhas de células produtoras do factor VIII recombinante humano. A extensão do aumento do factor VIII: C pode ser o dobro, dez vezes e até vinte vezes. O método é aplicável a muitas linhas dé células mas em particular às células CHO (Ovário da Hamster Chinesa) produtoras de um factor VIII com o comprimento completo, variantes de apagamento ou por outro lado factor VIII modificado. 5
Esta invenção mostra que sob as condições reivindicadas de fusão células, se pode obter linhas de células altamente produtoras e estáveis que não são híbridos clássicos.
Descrição da forma de realização preferida.
Materiais e Métodos. O factor VIII recombinante foi produzido em células CHO DG44 NY transfectadas com ADNc codificado para uma variante de apagamento do factor VIII humano chamado factor VIII SQ. (r-VIII SQ) (ver patente mundial n. 0 91\09122 e patente mundial n° 92/16557). Foi utilizado o seguinte protocolo de fusão de células: as células são cultivadas num meio apropriado livre de soro. Foram lavadas 20-80x106 células, precipitadas e uma solução a 50 % (em meio) de PEG 4 000 foi adicionada gota a gota ao precipitado. Após um minuto a mistura de células - PEG foi suavemente diluída através da adição do meio de cultura. A mistura diluída foi suavemente centrifugada, foi adicionado um novo meio e posteriormente cultivado num meio livre de soro. Não foi utilizado nenhum meio selectivo e só foi utilizado um tipo de células. A fusão de células foi monitorizada por contagem cromossómica e fluxo citométrico.
Para medição da actividade do factor VIII: C o meio de crescimento foi alterado para um meio de produção e o factor VIII: C foi medido tal como se acumulou no sobrenadante/(sem alterações do meio) para o numero de dias indicado nas tabelas. A actividade do Factor VIII (VIII:C) é medida pelo substracto cromogénico (Chromogenix Molndal) após vários pontos no tempo.
Exemplo 1
Este exemplo (tabela 1) ilustra a expressão do r-VIII SQ uma semana após a fusão. A linha de células original produtora de r-VIII SQ “ADLA” foi tratada com PEG 4000 sob condições de fusão padrão, como descrito acima sob o titulo de Materiais e Métodos, (ADLA PFT e PEG 1-5 na tabela 1) e também quando se mantêm as células aderidas ao plástico sob sub-confluência com o objectivo de prevenir que elas se fundam (ADLA 6
1 U PT na tabela 1). 0 controlo ADL não teve tratamento com PEG. As células cresceram para confluência e foi testado o Factor VIII:C.
Tabela 1. Expressão das células tratadas com PEG comparadas com as células controlo (ADLA)
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 ADLA Controlo 100% 100% 100% 100% ’ ADLA PT 340% 104% 123% 90% ADLA PFT 1880% 273% 268% 184% PEG 1 173% 97% 92% Não testado PEG 2 236% 138% 152% Não testado PEG 3 134% 129% 147% Não testado PEG 4 200% 120% 159% Não testado PEG 5 91% 85% 98% Não testado Média por fundidos 457% 140% 153% Não testado
Resultados
As células tratadas sob condições de fusão padrão expressas como uma média de 457%, 140% e 153% dos valores de controlo do dia um ao dia três após o tratamento de fusão.
As células tratadas com PEG sob condições sub-confluentes. expressaram apenas um aumento na actividade de VIII :C (ADLA PT) um dia após o tratamento. A tabela também mostra que há consideráveis diferenças entre experiências individuais e essa expressão é imediatamente superior, um dia, após a fusão.
Exemplo 2.
Para testar a estabilidade de uma população tratada com PEG, não seleccionada das linhas de células (PEG 4) acima foi posteriormente sub-cultivada sem qualquer pressão selectiva por um período de 2 meses e foi então reavaliada a actividade para o Factor VIII. Estas células ainda expressavam uma maior quantidade de rVIII SQ.
Tabela 2. Estabilidade da capacidade da expressão aumentada de células tratadas com PEG. Expressão de VIII:C comparada com controlo após 60 dias em cultura.
Dia 61 Dia 62 Dia 63 Dia 64 Dia 65 Dia 66 Dia 67 Dia 68 Controlo 100% 100% 100% 100% 100% n. t. n. t. 100% PEG 4 100% 907% 1892% 1541% 1187% n. t. n. t. 294%
Resultados A expressão do dia 62 ao 68 após a fusão, mantida sob condições não selectivas, foi entre 294% e 1892% dos valores de controlo.
Exemplo 3
As linhas de células já fundidas com PEG (PEG 4) foram de novo fundidas por PEG com elas próprias, e posteriormente sub-cultivadas por 10 dias sem qualquer pressão selectiva.
Tabela 3. Expressão de VIII:C após re-tratamento com PEG de células tratadas com PEG (PEG 4) comparada com células de controlo não tratadas.
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Controlo 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% PEGx2 100% 1933% 1884% 1799% n. t. n. t. 490%
Resultados
As células tratadas duas vezes por fusão expressaram níveis ainda mais altos de r-VIII SQ comparado com as células fundidas uma só vez. Assim o tratamento com PEG pode ser realizado repetidamente.
Exemplo 4 A linha de células PFT foi posteriormente examinada por contagem cromossómica e conteúdo de ADN por fluorescência após coloração com iodeto de propidium. A tabela 4 mostra os resultados da análise cromóssomica após 10-20 dias de cultura após a fusão em duas ocasiões diferentes. Nestas alturas estava presente uma expressão aumentada como descrito acima. Todas as linhas de células mostraram um cromossoma modal com 8
u
o número 20. Todas as células examinadas mostraram a presença de placas de metafase aberrantes com números de cromossomas sub-tetraploides. Não houve no entanto diferenças comparando as células fundidas com a linha de células de controlo. Isto foi posteriormente estudado por coloração com iodeto de propidium e analisado por análise de fluorescência do conteúdo de ADN em várias ocasiões durante a propagação das células.
Tabela 4. Análise dos cromossomas. Nenhuma das metafases com o numero de cromossomas indicado nas células tratadas com PEG e no controlo.
Crom N.° 18 19 20 21 22 24 32 34 36 37 38 39 controlo 6 8 4 1 1 ADLA PFT 1 2 2 7 3 1 2 1 1 ADLA PFT 2 1 3 11 2 1 1 1
Resultados
As células tratadas com PEG não tinham um conteúdo em ADN superior comparado com as linhas de células de controlo não fundidas. Esta análise, em conjunto com o facto dos níveis de elevada expressão serem estáveis após um longo período de tempo em cultura de células não selectivas indica que células altamente produtoras não eram o resultado de um processo de fusão celular clássico.
Discussão A fusão celular é um processo bem conhecido. Os exemplos aqui apresentados não são, sem dúvida, típicos da fusão de células clássica. Primeiramente as células tratadas com PEG não continham nem mais ADN nem mais cromossomas e em segundo lugar não houve passos selectivos envolvidos numa sub-cultura da população. Além disso, as frequências da fusão regular de 10"4-!O'5 são demasiado baixas para fusão celular como explicação de uma persistência a longo termo do aumento de produtividade. Tomados em conjunto estes resultados indicam que a fusão celular com tratamento de PEG induz uma alteração estável na capacidade da expressão das células. Assim sendo, este método é aplicável a diferentes células e diferentes agentes.
Lisboa, 2 1 JUL 2000 <dc< L. !&_
Dr. Américo da Silva Carvalho
Agente Clicld :i-;· ftEjvheÍaJí .'.iduslrial R. CísSs, £01-3'£·CíC-Os 1 LISBOA Teiefs. ;·. /51339 - 213854613
Claims (9)
1 1
REINVINDI CAÇÕES 1. Um método para a obtenção de uma maior expressão de produto numa linha de células produtora compreendendo fusões de células da mesma origem com um agente de fusão para formar células fundidas que produzem um produto
2. O método de acordo com a reivindicação 1 em que o agente de fusão é polietileno glicol (PEG).
3. O método de acordo com a reivindicação 1 em que a fusão é alcançada pelo uso de electrofusão, protoplastos ou Sendaivirus.
4. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 nas quais as células são células do Ovário da Hamster Chinesa ou linhas de células derivadas do Ovário da Hamster Chinesa (CHO).
5. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que as células são células de Rim de Hamster Bebé (BHK) ou células Cos.
6. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, no qual o produto é uma proteína ou molécula terapêuticamente activa.
7. O método de acordo com a reivindicação 6 no qual o produto é o factor VIII com o comprimento completo ou um derivado de apagamento do factor VIII, tal como rVIII SQ.
8. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, no qual a linha de células resultante tem um conteúdo cromossómico e de ADN idêntico ou muito semelhante à linha de células original.
9. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, no qual a fusão de células é realizada em células já fundidas. Lisboa, ^ ^ JUL 2000
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