JPH08509373A

JPH08509373A - 組換えウイルスおよび遺伝子療法におけるそれらの使用

Info

Publication number: JPH08509373A
Application number: JP6523940A
Authority: JP
Inventors: ベノワ，パトリク; デネフル，パトリス; ペリコーデ，ミシエル; セグレ，サンドリーヌ; ビニユ，エマニユエル
Original assignee: ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-15
Publication date: 1996-10-08
Also published as: NO954286L; FI955154A7; FR2704556B1; EP0701450B1; ZA942980B; FI955154L; BR9406689A; GR3027660T3; AU6572294A; CA2161679A1; WO1994025073A1; DE69412486T2; FR2704556A1; KR100330142B1; US5866551A; DK0701450T3; USRE38556E1; FI955154A0; ATE169503T1; NO954286D0

Abstract

(57)【要約】挿入遺伝子を含む欠陥組換えウイルス、それらのウイルスを含む薬剤学的組成物、ならびにリポ蛋白質異常症に関連する病状の治療および予防におけるそれらの使用。

Description

【発明の詳細な説明】組換えウイルスおよび遺伝子療法におけるそれらの使用本発明は、所望される遺伝子のインビボでの輸送および発現のための新規の組換えウイルス、それらの調製法、および遺伝子療法におけるそれらの使用に関する。より具体的には本発明は、インビボでのその発現がアポリポ蛋白質の血漿レベルを調節することを可能にさせる挿入遺伝子を含む新規の組換えウイルスに関する。本発明はまた、前記組換えウイルスを含む薬剤学的組成物にも関する。より具体的には本発明は、欠陥組換えウイルス、ならびに心臓血管的および神経的レベルでの重い結果をもたらすために知られるリポ蛋白質異常症に関連する病状の予防もしくは治療のためのそれらの使用に関する。リポ蛋白質異常症は、血液および末梢液中の、コレステロールおよびトリグリセリドのような脂質の輸送の原因となるリポ蛋白質の代謝の疾患である。これらは、特にアテローム性動脈硬化症のような高コレステロール血症もしくは高トリグリセリド血症にそれぞれ関連する主な病状をもたらす。アテローム性動脈硬化症は、大きな動脈（大動脈、冠状動脈、頚動脈）の壁における脂質および他の血液誘導体の沈着（脂質斑もしくは線維脂質斑）による組織学的観点から特定される多原因的複合疾患である。その過程の進行に従って多かれ少なかれ石灰化するこれらの斑が病変に結び付き、そして主にコレステロールエステルを含む脂肪沈着物の動脈内における堆積に関連する可能性がある。これらの斑は、平滑筋の肥厚化、扁平上皮細胞の出現、および線維状組織の蓄積と共に動脈壁の肥大を伴う。粥腫斑は動脈壁上で非常に顕著に盛り上がり、これが最も重度の罹患患者に生じる粥腫、血栓症、もしくは塞栓症による血管閉塞の原因となる狭窄性特性を動脈壁に付与する。従って高コレステロール血症は、梗塞、突然死、心機能代償不全症、および大脳血管偶発症候などのような非常に重篤な心臓血管の病気をもたらす可能性がある。従って、一定の病理学的状況下で血漿コレステロールレベルを減少させるか、あるいは粥腫斑の形成に関与するコレステロールを蓄積させている細胞を排泄させる目的で末梢組織内のコレステロールの流出（コレステロールの逆輸送）を刺激することさえも可能にさせる利用可能な治療法を手にすることが可能であることは特に重要である。コレステロールは、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）および高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）を初めとする様々なリポ蛋白質により血中で運搬される。ＬＤＬは肝臓内で合成され、そして末梢組織にコレステロールを供給することを可能にする。それとは対照的にＨＤＬは末梢組織内のコレステロールを捕捉し、そしてそれを肝臓に輸送し、そこでコレステロールは保存および／または分解される。現在では脂質異常症および特に高コレステロール血症は、コレステロールの生合成（ヒドロキヒメチルグルタリル−コエンザイムＡレダクターゼのインヒビター、スタチン類）、もしくは胆汁コレステロールの捕捉および除去（金属イオン封鎖剤類もしくは樹脂類）のいずれかにおいてか、あるいは別法では分子的見地から解明されるべく残されている作用様式による脂肪分解（ファイブレート類）において作用する化合物により主に治療されている。その結果、この処置において用いられている主な種類の薬物（金属イオン封鎖剤類、ファイブレート類、もしくはスタチン類）全ては粥腫斑の形成の予防的側面についてのみ設計されており、そして実際のところ粥腫の治療について設計されているのではない。粥腫およびその後の冠状動脈の故障のための現在の治療法は待機的であるに過ぎず、それはそれらの治療法がコレステロールのホメオスタシスに作用するのではなく、かつそれらが外科手術的作業（冠状動脈バイパス、脈管形成術）であるためである。本発明は、リポ蛋白質異常症に関連する病状の治療のための新規の治療的研究方法を構成する。本発明は、アポリポ蛋白質の血漿レベルを調節することが可能な遺伝子のインビボでの輸送および発現による遺伝子療法によりリポ蛋白質異常症に関連する病状を治療することの可能性を示すことにより、従来の技術の欠点に対する有利な解決法を提案する。従って本発明は、これらの病状の特異的かつ有効な治療を可能にする単純な手段を提供する。遺伝子療法とは、細胞もしくは冒されている器官内への遺伝子情報の導入により欠損症もしくは異常状態（突然変異および誤った発現など）を矯正することである。この遺伝子情報は、器官から抽出された細胞内にインビトロで導入してその後にこの改変化細胞を体内に再導入するか、あるいは適切な組織内にインビボで直接導入するかのいずれかを行うことができる。この第二の事例においては様々な技術が存在し、それらの技術の内の様々なトランスフェクション技術は、ＤＮＡとＤＥＡＥデキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏｅｔａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、ＤＮＡと核蛋白質との複合体（Ｋａｎｅｄａｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ８４（１９８７）７４１３）、およびリポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）などを必要とする。より最近では、遺伝子の輸送のためのベクターとしてのウイルスの使用がトランスフェクションのこれらの物理学的技術に代わる有望な変法として出現した。この方法に関しては様々なウイルスが所定の細胞性集団に感染するそれらの能力に関してテストされており、それらのウイルスとは具体的にレトロウイルス類（ＲＳＶ、ＨＭＳ、およびＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス類、アデノ関連性ウイルス類、およびアデノウイルス類である。本発明は、アポリポ蛋白質の血漿レベルを調節することが可能な遺伝子をインビボで輸送および発現させることである、リポ蛋白質異常症に関連する病状の治療のための新規の治療的研究方法を構成する。本発明はまた、アデノウイルスがこのような遺伝子の輸送および発現のための特に有効なベクターを構成するということの証明からの成果でもある。具体的には本発明は、ベクターとしての組換えアデノウイルスの使用が、十分に高いレベルのこれらの遺伝子の発現を獲得して所望される治療効果を発揮することを可能にさせるということを示す。従って本発明は、リポ蛋白質異常症による関連する心臓血管的および神経的病状の治療および予防のための新規の研究方法を提供する。従って本発明の第一の主題は、その発現がアポリポ蛋白質のレベルをインビボで調節することを可能にさせる少なくとも一つの挿入遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスである。本発明の主題はまた、リポ蛋白質異常症に関連する病状の治療もしくは予防が予定される薬剤学的組成物の調製のためのこのような欠陥組換えアデノウイルの使用でもある。本発明はより具体的には、アデノウイルスタイプのウイルスが肝臓内のアポリポ蛋白質をコードする遺伝子を輸送および発現可能であり、かつ前記アポリポ蛋白質をそれらが活性を発揮する循環系内に分泌可能であるということの証明に基づいている。後に示される実施例は、アデノウイルスは投与の様式に従って、実質的な期間の間、そして細胞病理学的効果を伴うことなくアポリポ蛋白質ＡＩもしくはアポリポ蛋白質ＡＩＶをコードする遺伝子を効果的に輸送および発現可能であるということを示す。本発明の目的のためには、用語「欠陥アデノウイルス」は、標的細胞内で自律的に複製することが不可能なアデノウイルスを意味する。従って一般的には本発明の構成内で用いられる欠陥アデノウイルスのゲノムは、少なくとも感染細胞内での前記ウイルスの複製に必要な配列を欠損している。これらの領域を除去するか（完全に、もしくは部分的に）、あるいは非機能的にさせるか、あるいは他の配列および特に挿入遺伝子により置換するかのいずれかを行うことができる。それにもかかわらず欠陥ウイルスは、ウイルス粒子の被包化に必要なそれ自体のゲノムの配列を保存することが好ましい。構造および特性が幾分異なる様々な血清型のアデノウイルスが存在する。しかしながら、これらのウイルスはヒト、および特に非免疫抑制化被験体にとっては病原性ではない。これらの血清型の内でもタイプ２もしくはタイプ５アデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）の使用が本発明の構成内では好ましい。Ａｄ５アデノウイルスの場合には、複製に必要な配列はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域である。本発明の目的のためには、アポリポ蛋白質レベルをインビボで調節可能な挿入遺伝子は、アポリポ蛋白質もしくはアポリポ蛋白質タイプの活性を有する蛋白質産物をコードする遺伝子であるか、あるいは標的細胞内でのその発現がアポリポ蛋白質をコードする遺伝子の発現もしくはそれをコードする細胞性ｍＲＮＡの転写を調節することを可能にさせるアンチセンス遺伝子であってもよい。用語「アポリポ蛋白質タイプの活性を有する蛋白質産物」は、アポリポ蛋白質の少なくとも一つの生物学的特性を有するいずれかの突然変異体、断片、もしくはペプチド、ならびにアポリポ蛋白質の天然の変異型を意味する。挿入遺伝子は、ｃＤＮＡの断片もしくは、ゲノムＤＮＡの断片であるか、あるいは例えば一つもしくは複数のイントロンが挿入されているであろうｃＤＮＡからなる融合構築物であることができる。これはまた、合成もしくは半合成配列であることもできる。本発明の目的のための挿入遺伝子の中でもより具体的には、アポリポ蛋白質ＡＩ、ＡＩＶ、もしくはＥの全てもしくは活性部分をコードする遺伝子を挙げることができる。アポリポ蛋白質ＡＩは、２４３アミノ酸からなる蛋白質であり、これは２８，０００ダルトンの分子量を有する２６７残基のプレプロペプチドの形態で合成される。このアポリポ蛋白質はヒトにおいては肝臓および腸内で特異的に合成され、そしてこれはＨＤＬ粒子の主要蛋白質を構成する（蛋白質におけるそれらの量の７０％）。このアポリポ蛋白質は血漿内に豊富に存在する（１．０〜１．２ｇ／１）。このアポリポ蛋白質の生物学的に特徴付けられる最重要活性はレシチン −コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性化であるが、特に細胞性コレステロールの流出の刺激化のような多数の他の活性がそのアポリポ蛋白質に起因するものとみなされている。アポリポ蛋白質ＡＩの生理学的役割はアポリポ蛋白質ＡＩＩにより相殺されるらしく、それはヒトにおいてはこの２つの血漿アポリポ蛋白質の比率（ＡＩＩ／ＡＩ）が冠状動脈疾患の危険性に密接に関連しているためである。アポリポ蛋白質ＡＩは、コレステロールの逆輸送に恐らく関連するであろうアテローム性動脈硬化症に対する耐性において主要な役割を演じており、それは形質転換マウスにおけるこのアポリポ蛋白質の単独発現が、対照マウスと比較して動脈内における脂質沈着の表面領域を４０倍減少することを可能にさせるためである（Ｒｕｂｉｎｅｔａｌ．、１９９３Ｓｃｉｅｎｃｅ、印刷中）。１８６３ｂｐの長さのその遺伝子がクローン化および配列決定されている（Ｓｈａｒｐｅｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２（９）（１９８４）３９１７）。アポリポ蛋白質ＡＩタイプの活性を有する蛋白質産物中でも、特に従来の技術において記載される天然の変異型を挙げることができる（以下の表）。アポリポ蛋白質ＡＩＶ（ａｐｏＡＩＶ）は３７６のアミノ酸からなる蛋白質であり、これは３９６残基の前駆体の形態で腸内で特異的に合成される。この血漿蛋白質は比較的豊富であり（０．１６ｇ／ｌ）、そして４６，０００ダルトンの分子量を有する。このアポリポ蛋白質はリンパ内で分泌されるカイロミクロンの主要構成成分であるが、これは血漿中のリポ蛋白質と非会合性である形態において優勢である特徴的な性質を有する（Ｒ．Ｂ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｔａｌ．、１９８３、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４：５２−５９）。その上、血漿ａｐｏＡＩＶは多形性であるが、この多形性の性質は依然として未知である（Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎｎｅｔａｌ.、１９８２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５０１−５０７）。ａｐｏＡＩＶの生理学的役割は幾分未知のまま残されている。これはインビトロではレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）を活性化することが可能であり（Ｓｔｅｎｍｅｔｚｅｔａｌ．、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２２５８−２２６４）、そしてそれはアポリポ蛋白質ＡＩと同様にウシの動脈内皮細胞上へのＨＤＬ粒子の結合を妨害することが知られている（Ｓａｖｉｏｎｅｔａｌ．、１９８７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５７：４１７１−４１７８）。これらの２つの活性は、ａｐｏＡＩＶがコレステロールの逆輸送の介在物質として作用することが非常に確からしいことを示す。ａｐｏＡＩＶ遺伝子がクローン化されており、そして従来の技術において記載されている（特に国際公開第９２／０５２５３号を参照されたい）。アポリポ蛋白質ＡＩＶタイプの活性を有する蛋白質産物中でも、フランス特許出願公開第９２００８０６号において記載される断片および誘導体を挙げることができる。アポリポ蛋白質Ｅは３１７の残基からなり、その内の１８はシグナルペプチドに相当する。プロペプチドは存在しない。ａｐｏＥ遺伝子がクローン化および配列決定されており（約３６００ｂｐ）、そしてこれは１１６３ｂｐのｍＲＮＡをコードする。ａｐｏＥはＶＬＤＬとＨＤＬ粒子との間で血漿内に分布する。これはＶＬＤＬ蛋白質の約１０〜２０％、およびＨＤＬ蛋白質の約２％に相当する。ＨＤＬ−ＥはＨＤＬの明確なサブクラスを構成する。ａｐｏＥの血漿濃度は約０．０５ｇ／ｌである。ａｐｏＥはシアロ蛋白質の形態で合成され、これはその後に血漿内で脱シアル化される。ａｐｏＥの合成は肝臓により、そして弱くは腸により実施される。しかしながら他のアポリポ蛋白質とは反対に、ａｐｏＥは多数の他の組織内でも合成される（脳、腎臓、副腎、および細網内皮細胞など）。ａｐｏＥは非常に強い親和性でＬＤＬレセプターを認識するが、更にａｐｏＢを認識しない肝細胞上の他のレセプター（ａｐｏＢ／Ｅレセプター）も認識する（カイロミクロン／残りのレセプター）。様々な電気泳動的移動度を基にして多形性が証明されている。従って６つの主要な表現型（Ｅ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／４、Ｅ３／３、Ｅ４／４）が記載されている。白色人種の大集団において実施された研究によると相当する対立遺伝子の頻度は、ε４について１４〜１５％、ε３については７４〜７８％、そしてε２については８〜１２％であった。ε４がより豊富なフィンランド人（２３％）とε２があまり豊富でないフィンランド人（４％）との間には差異が存在する。通常の対立遺伝子はε３である。ε２対立遺伝子は、コレステロールおよびトリグリセリドの増加、黄色腫、ならびに初期のアテローム性動脈硬化症に関連する疾患であるタイプＩＩＩリポ蛋白質異常症（Ｅ２／２表現型）に相当するであろう。ε４対立遺伝子と家族性アルツハイマー症との間の関連性が最近報告されている（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒｅｔａｌ．、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９９（１９９３）１９７７）。より最近ではマウスにおけるａｐｏＥ遺伝子の破壊がアテローム性動脈硬化症に対する感受性亢進過度の出現を示していた（Ｅ．Ｒｕｂｉｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ１９９２）。本発明の目的のためには、用語「挿入遺伝子」は、標的細胞内でのその発現がアポリポ蛋白質をコードする遺伝子の発現もしくはこれをコードする細胞性ｍＲＮＡの転写を調節することを可能にさせるアンチセンス配列をも意味する。このような配列は例えば、標的細胞内で細胞性ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡへと転写され、そしてそのために蛋白質へのそれらｍＲＮＡの翻訳を遮断することができる。本発明の構成内で用いることができるアンチセンス配列の中では、より具体的にはアポリポ蛋白質ＡＩＩの産生のレベルを減少することを可能にさせるいずれかのアンチセンス配列を挙げることができ、これは実施例に詳細に説明されている。一般的には挿入遺伝子は、感染細胞内でのその発現を可能にさせる配列も含む。これらは、これらの配列が感染細胞内で機能することが可能な場合には、前記遺伝子の発現の本質的な原因となる配列であることができる。これらはまた、異なる起源の配列であることもできる（これは他の蛋白質の発現の原因となるか、あるいは合成配列であることもできる）。具体的には、これらは真核生物遺伝子もしくはウイルス遺伝子の配列であることができる。例としては、これらは感染が所望される細胞のゲノム、もしくはウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列、そして特にアデノウイルス遺伝子Ｅ１ＡおよびＭＬＰのプロモーター、プロモーターＣＭＶおよびＬＴＲ−ＲＳＶなどであることができる。その上これらの発現配列を、活性化および調節配列などの添加により改変することができる。その上、挿入遺伝子が発現配列を含まない場合には、この遺伝子をこのような配列の下流で欠陥ウイルスのゲノム内に挿入することができる。その上、挿入遺伝子がアポリポ蛋白質、もしくはアポリポ蛋白質タイプの活性を伴う蛋白質産物をコードする場合には、この遺伝子は一般的に、合成されたポリペプチドを標的細胞の分泌経路内へ向かわせるシグナル配列をコーディング配列の上流に含む。このシグナル配列はアポリポ蛋白質の天然のシグナル配列であることができるが、これはいずれかの他の機能的シグナル配列もしくは人工シグナル配列であることもできる。本発明に従う欠陥組換えアデノウイルスは、アデノウイルスと、中でも挿入が所望される遺伝子を保持するプラスミドとの間の相同組換えにより調製することができる。相同組換えは、前記アデノウイルスとプラスミドとの適切な細胞株内への同時トランスフェクション後に生じる。用いられる細胞株は、（ｉ）前記構成要素により形質転換され、そして（ｉｉ）組換えの危険を回避する目的で好ましくは組み込まれた形態での、欠陥アデノウイルスゲノム部分を補うことが可能な配列を含むべきであることが好ましい。株の例としては、ヒト胎児の腎臓株２９３（Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることができ、これはそのゲノム内に取り込まれているＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左側部分（１２％）を特に含む。その後には増殖させたベクターを回収し、そして通常の分子生物学的技術に従って精製する。本発明は更に、先に記載される欠陥組換えアデノウイルスの一つもしくは複数を含む薬剤学的組成物にも関する。このような組成物は、局所的、経口的、非経口的、経鼻的、静脈内的、筋肉内的、皮下的、もしくは経眼的投与などのために製剤することができる。組成物は注射用製剤について薬剤学的に許容される賦形剤を含むことが好ましい。リポ蛋白質異常症に関連する病状の治療のためのそれらの使用に際し、本発明に従う欠陥組換えアデノウイルスを様々な様式、特に静脈内注射に従って投与することができる。これらを門脈のレベルにおいて注射することが好ましい。注射のために用いられるウイルスの投与剤は様々なパラメーターに従い、特に用いられる投与の様式、関連する病状、発現予定の遺伝子、もしくはそうでなければ所望される治療の期間に従って適用することができる。一般的には本発明に従う組換えアデノウイルスは１０⁴と１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌとの間、そして好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの投与剤の形態に製剤され、投与される。用語ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）はウイルス懸濁液の感染性に相当し、そして適切な細胞培養物の感染、および一般的には４８時間後の感染細胞のプラーク数の測定により決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための技術は刊行物に詳細に記載されている。従って本発明は、具体的には心筋梗塞、狭心症、突然死、心機能代償不全症、脳血管の故障のような心臓血管的症状のドメイン、あるいはａｐｏＥのような所定のアポリポ蛋白質が重要な役割を演じていると思われる神経学的症状（神経的加齢、家族性アルツハイマー症、神経再生）のドメインにおけるリポ蛋白質異常症に関連する病状の治療もしくは予防のための非常に有効な手段を提供する。より一般的にはこの研究方法は、血漿アポリポ蛋白質の遺伝子的もしくは代謝的特性の欠陥を矯正することができる各事例のための非常に有望な治療的方法を提供する。その上この治療法を、ヒト、ならびにヒツジ、ウシ、家畜動物（イヌ、およびネコなど）、ウマ、および魚類などのようないずれかの動物の両方に適用することができる。本発明は、詳細な説明であってかつ非制限としてみなされるべき以下の実施例の助けを借りて一層完璧に記載される。図面の簡単な説明図１：プラスミドｐＸＬ２０９９の構築のための手法。図２：ａｐｏＡＩｃＤＮＡの増幅のための手法。図３：プラスミドｐＸＬ２２３５の構築。図４：プラスミドｐＸＬ２２４４およびｐＸＬ２２６３の概略図。図５：ａｐｏＡＩミニ遺伝子の構築のための手法。図６：プラスミドｐＸＬ２３３６の概略図。図７：プラスミドｐＸＬ２３７５の概略図。図８：ＨＤＬ曲線におけるアデノウイルスＡｐｏＡＩの注射の効果。図９：ＡｐｏＡＩの血漿レベルにおけるＡｐｏＡＩアデノウイルスの注射の効果。図１０：プラスミドｐＸＬ２２３５の概略図。一般的な分子生物学技術プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化セシウム濃度勾配液中のプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、電気穿孔によるＤＮＡ断片の精製、蛋白質のフェノールもしくはフェノール−クロロホルム抽出、生理食塩液中のＤＮＡのエタノールもしくはイソプロパノール沈殿、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中の形質転換などのような分子生物学において通常用いられる方法は当業者に良く知られており、そして刊行物中に広範囲にわたって記載されている［ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ｅｔａｌ．、” ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．ｅｔａｌ．、（ｅｄｓ）、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８７］。ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミド、およびＭ１３シリーズのファージは市販品起源のものである（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。連結反応のためには、ＤＮＡ断片をアガロースもしくはアクリリアミドゲル電気泳動によりそれらのサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてその後に供給元の推奨事項に従ってファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下でインキュベートすることができる。突出性５’端の充填は、供給元の説明事項に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で実施することができる。突出性３’端の破壊は、製造元の推奨事項に従って用いられるファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下で実施される。突出性５’端の破壊はＳ１ヌクレアーゼでの調節的処理により実施される。合成オリゴヌクレオチドによるインビトロでの部位特異的突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実施することができる。いわゆるＰＣＲ技術［ポリメラーゼ触媒化連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）、Ｓａｉｋｉ、Ｒ．Ｋ．ｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；ＭｕｌｌｉｓＫ．Ｂ．ａｎｄＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、製造元の説明事項に従ってＤＮＡサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を用いて実施することができる。ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実施することができる。実施例実施例Ａ：アポリポ蛋白質ＡＩ遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築：先に示すように欠陥組換えアデノウイルスは、アデノウイルスと、中でも挿入が所望される遺伝子を保持するプラスミドとの間の、適切な細胞株内への同時トランスフェクション後の相同組換えにより調製した。Ａ１．ａｐｏＡＩ遺伝子を保持するプラスミドの調製（図１〜４を参照されたい）相同組換えによりヒトのアポリポ蛋白質ＡＩ遺伝子を発現する組換えアデノウイルスを作成するのに用いられるプラスミドは、以下のように構築した。１．プラスミドｐＸＬ２２３６の構築プラスミドｐＸＬ２２３６は特に、ＣＭＶプロモータの調節下のプレプロＡｐｏＡＩをコードするｃＤＮＡ、ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナル、ならびに相同組換えを可能にするアデノウイルス領域を含む。このプラスミドは以下の様式で構築した。ヒトのａｐｏＡＩｃＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を、Ｓ．ＬａｗおよびＢ．ＢｒｅｗｅｒＪｒ．（ＰＮＡＳ８１（１９８４）６６−７０）により記載されるベクターｐＭＤ１４０８からのＰｓｔＩ断片の形態で単離した。この断片をプラスミドＭ１３ｍｐ１９内に挿入した（図１）。その後にこの断片を、５’ 位置内にＨｉｎｄＩＩＩ部位を取り込ませる目的で連続的ＰＣＲにより改変した（図２）。こうして初回のＰＣＲ反応を、先に取得されるプラスミドについてオリゴヌクレオチドＳｑ１８５１（配列番号１）およびＳｑ１８５２（配列番号２）により実施した。このＰＣＲから取得されるＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＳｑ１８４９（配列番号３）、Ｓｑ１８５０（配列番号４）、Ｓｑ１８５１、およびＳｑ１８５２での二回目のＰＣＲで再増幅させた。最終的には三回目のＰＣＲをオリゴヌクレオチドＳｑ１８４９およびＳｑ１８５２で、二回目のＰＣＲの結果を用いて実施した。取得される約４６０ｂｐの断片をプラスミドＰＣＲ１０００（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）内にクローン化させ、そしてこの配列を確認した。得られるプラスミドはプラスミドｐＸＬ２０５０と称する（図１）。ｐＸＬ２０５０からの断片ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＹ１およびｐＸＬ１７７３からのＢｓｔＹ１−ＸｂａＩ（Ｍ１３ｍｐ１８内に挿入されたプラスミドｐＭＤＢ１４０８からのＰｓｔＩ断片）をその後には、予めＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで消化させてあったプラスミドｐＳＶ２ＯＬ１（Ｓｕｂｒａｍａｎｉｅｔａｌ．、ＭＣＢ１（１９９１）８５４）内にクローン化させてプラスミドｐＸＬ２０９９を作成した（図３）。その後にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを保持するＳｐｅＩ−ＫｐｎＩ断片をベクターｐＥＢＶＤｄｙａｄＣＭＶｌａｃｌｎ（ｐ１８９ＣＭＶ、Ｂｉａｒｄｅｔａｌ．、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃｈａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＡｃｔａ１１３０（１９９２）６８）から単離し、そしてその後にベクターｐＲＳＶ−βｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）の対応部位内に挿入した。取得されるプラスミドをｐＸＬ２２３４と表示した。この段階中にコーディング領域ＲＳＶＬＴＲおよびｌａｃＺが除去される。その後にプレプロＡｐｏＩをコードする領域ならびにＳＶ４０ウイルスｍＲＮＡの成熟のためのシグナルを含む平滑末端上のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＸＬ２０９９から単離し、そしてその後にプラスミドｐＸＬ２２３４のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。このようにして取得されたプラスミドをｐＸＬ２２３６と表示した。２．プラスミドｐＸＬ２２３５の構築ｐＸＬ２２３５と表示される第二プラスミドを構築した。このプラスミドは特に、ＣＭＶプロモーターの調節下のプレプロＡｐｏＡＩをコードするｃＤＮＡ、ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナル、ならびに相同組換えを可能にするアデノウイルス領域を含む。このプラスミドは以下の２つの段階、すなわち − 先に同定されるプラスミドｐＸＬ２０９９からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の、同じ酵素で消化させてあるベクターｐＭＴＬ２２（Ｃｈａｍｂｅｒｓｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ６８（１９８８）１３９）内への挿入、ならびにその後の − 先に取得されるプラスミドの酵素ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶでの消化、およびこのように単離されるＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶ断片の、ＥｃｏＲＶで消化させたプラスミドｐＸＬ２２３４内への挿入、である。このようにして取得されるプラスミドをｐＸＬ２２３５と表示した（図３）。３．プラスミドｐＸＬ２２４４の構築プラスミドｐＸＬ２２４４は、ＲＳＶウイルスのＬＴＲプロモーターの調節下のＡｐｏＡＩｃＤＮＡを含む。このプラスミドは、ｐＸＬ２２３９からのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶ断片の、同じ酵素で消化させたベクターｐＬＴＲＲＳＶ −βｇａｌ内への挿入により構築した。プラスミドｐＸＬ２２４４の構造を図４に示す。４．プラスミドｐＸＬ２２６３の構築プラスミドｐＸＬ２２６３は、ＡｐｏＡＩｃＤＮＡからＣＭＶプロモーターを分離するポリリンカーの一部分（ＫｐｎＩ断片）を削除してあるベクターｐＸＬ２２３５から取得される。このプラスミドは以下の２段階で構築した。まずＡｐｏＡＩｃＤＮＡおよびＳＶ４０断片を含むｐＸＬ２０９９からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの同じ部位内にクローン化させてプラスミドｐＸＬ２２４５を作成した。その後にこのプラスミドのＡｐｏＡＩｃＤＮＡを含むＫｐｎＩ断片を、ＫｐｎＩで消化させたベクターｐＸＬ２２３５内に正しい向きで再クローン化させた。プラスミドｐＸＬ２２６３の構造を図４に示す。５．プラスミドｐＸＬ２２３６の構築プラスミドｐＸＬ２２３６は、プロモーターを含むゲノム配列、ａｐｏＡＩ遺伝子の第一エキソンおよび第一イントロンと、ａｐｏＡＩｃＤＮＡ配列の配列との間のハイブリッド構築物を含む。このためには、図５に記載されるハイブリッド配列を、以下に記載するＰＣＲにより構築した。用いられるプライマーは、ＡｐｏＡＩｃＤＮＡの塩基１４〜塩基４４１の配列を増幅するＳｑ３５６１（配列番号５）およびＳｑ３５７１（配列番号６）、ならびに非反復のＡｆｌＩＩＩ部位を含むプロモーターから第二エキソンの始まりまでに広がる断片を増幅するＳｑ３５７０（配列番号７）およびＳｑ３５６２である。そのためプライマーＳｑ３５６１およびＳｑ３５６２に相補的な両方の断片をその後にゲル上で精製し、混合し、そしてプライマーＳｑ３５７１およびＳｑ３５７０での二回目のＰＣＲのための鋳型として用いた。その後にこのハイブリッド断片をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローン化させてプラスミドｐＸＬ２３１４をもたらし、そしてその配列を確認した。ＸｈｏＩで切断し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で充填し、そしてその後にＡｆｌＩＩで再切断したｐＸＬ２３１４からの断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩで切断してあるプラスミドｐＸＬ２０６８内にクローン化させ、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で充填し、そしてＡｆｌＩＩで再切断した。プラスミドｐＸＬ２０６８は、塩基−２２００の方に位置するＫｐｎＩ部位から転写開始部位（塩基＋９３）の後に位置するＫｐｎＩ部位までのＡｐｏＡＩプロモーターを含み、これをＥｃｏＲＩ部位の寸法のプロモーターの５’端を有するプラスミドｐＵＣ１９内にクローン化させ、その後に部位ＸｂａＩおよびＳｓｔＩによりプラスミドｐＳＬ３０１（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）内に再クローン化した。得られるプラスミドをｐＸＬ２３１８と称する。ｐＸＬ２３１８からのＸｂａＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ断片を最終的には既述のプラスミドｐＸＬ２２６３内にクローン化させ、そしてＳｐｅＩ、次いでＢｓｕ３６Ｉで部分的に切断する。得られるプラスミドは最終的にはｐＸＬ２３３６と称され、そしてこの構造を図６に示す。６．プラスミドｐＸＬ２３７５の構築このプラスミドは、後にスプライシングのための３’部位を提供するＯ’Ｇｏｒｍａｎｅｔａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９９１、２５１：１３５１〜１３５５）により記載される合成イントロンの３’の大半にあたる１０７塩基対に連結するスプライシング提供用の５’部位にまで広がるＣＭＶプロモーターの調節下にあるＡｐｏＡＩｃＤＮＡを含む。このプロモーターをプラスミドｐＡＩＣＭＶＩＸＣＡＴ．３（Ｐｈｉｌｉｐｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａr Ｂｉｏｌｏｇｙ、印刷中）からＸｂａＩおよびＣｌａＩ部位により除去し、そしてベクターｐＸＬ２２６３の同じ部位にクローン化させてプラスミドｐＸＬ２３７５を取得する。このプラスミドのマップを図７に示す。Ａ２．インビトロでのａｐｏＡＩの発現Ａ１に記載されるベクターを、株Ｃｏｓ１もしくはＣｏｓ７内での発現によりそれらの機能性についてテストした。このためにはベクターを電気穿孔により、Ｐ．Ｂｅｎｏｉｔｅｔａｌ．、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５０（１９９３）７０７、により記載される方法に従って細胞内に組み込ませた。トランスフェクション後４８時間目に細胞上清を回収し、そしてＥＬＩＳＡテストによりそれらのＡｐｏＡＩ含有量についてテストした。このためにはＩｍｍｕｌｏｎＩＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社）を抗−ＡｐｏＡＩモノローナル抗体（炭酸塩緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９．６）で４℃で一晩インキュベートすることによりコートし、その後にＰＢＳ、ｐＨ７．４中の２％のＢＳＡで一時間３７℃で飽和させた。その後に細胞上清を、場合によってはＰＢＳ２％ＢＳＡで希釈した後に３７℃で１時間インキュベートした。その後に検知用反応を、パーオキシダーゼラベル化抗−ＡｐｏＡＩモノクローナル抗体の混合物での３７℃で１時間のインキュベーションにより実施し、次いで１／５０００に希釈した。パーオキシダーゼ処理した抗体の結合を、最終的には２５０μｌのＴＭＢ（ＫＰＬ）とのインキュベーションにより検知用反応を行わせ、そして６３０ｎｍでプレートを測光した。得られる結果は、全てのテスト事例においてＡｐｏＡＩの発現を検出することができることを示す。Ａ３．組換えアデノウイルスの調製Ａ１において調製されたプラスミドをその後に直線化させ、そして組換えのためにこれを欠陥アデノウイルスベクターと一緒に、アデノウイルスＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１１Ｂ）によりコードされる機能をトランスで提供するヘルパー細胞（株２９３）内に同時トランスフェクトさせた。アデノウイルスＡｄ．ＣＭＶＡｐｏＡＩは、アデノウイルスＡｄ．ＲＳＶβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔｅｔａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ９０（１９９２）６２６）とプラスミドｐＸＬ２２３５との間でのインビボでの相同組換えにより以下の方法に従って取得し、それはつまりその後に酵素ＥａｇＩで直線化させたプラスミドｐＸＬ２２３５、およびＣｌａＩで直線化させたアデノウイルスＡｄ．ＲＳＶβｇａｌとをリン酸カルシウムの存在下で株２９３内に同時トランスフェクトさせて相同組換えを可能にさせることである。そのように作成される組換えアデノウイルスをプレート上での精製により選択する。単離後に、組換えアデノウイルスを２９３細胞株内で増幅させて約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する未精製の組換え欠陥アデノウイルスを含む培養上清を取得する。ウイルス粒子は一般的には、既知の上述に従う塩化セシウム濃度勾配液遠心分離により精製する（特にＧｒａｈａｍｅｔａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６、を参照せよ）。アデノウイルスＡｄ．ＣＭＶＡｐｏＡＩは −８０℃下、２０％のグリセロール中で保存する。同じ方法をプラスミドｐＸＬ２２４４で再現して、組換えアデノウイルスＡｄ．ＲＳＶＡｐｏＡＩを取得する。実施例Ｂ：ａｐｏＡＩ遺伝子のインビボでの輸送および発現このように産生されたウイルスの保存物は、その後にインビボでの感染のために用いる。第一事例では、ウイルスをマウスにおける肝細胞のインビボ感染のために用いる。このためにはウイルス粒子を、例えば門脈を介してＣ５７Ｂ１６マウス内に注射する。注射の様式および発現の特異性は、β−ガラクトシダーゼを発現するウイルスで実施される従来の研究法によりテストした（用いることができる注射技術はＪａｆｆｅｅｔａｌ．、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ、ｖｏｌ．１（１９９２）３２７、によっても記載されている）。ヒトのａｐｏＡＩの血漿発現のレベルはヒトの蛋白質に特異的なモノクローナル抗体の助けを借りるＥＬＩＳＡにより検査し、そして組換え遺伝子の発現の特異性は異なる組織における特異的ヒトオリゴヌクレオチドプローブの助けを借りて確認する（ノザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ）。Ａｄ（ＲＳＶ−ＡｐｏＡＩ）およびＡｄ（ＣＭＶ−ＡｐｏＡＩ）と称されるこれらのウイルスを、尾静脈もしくは後眼窩洞を用いてＣ５７Ｂ１／６マウス内に静脈注射する。これらのウイルスを、マウスＡｐｏＡＩが発現されず、かつＨＤＬコレステロールが非常に低く、このことがヒトＡｐｏＡＩの発現の効果を観察することができるような非常に明快なバックグラウンドを有することを可能にさせるＡｐｏＡＩノックアウトマウス（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎｅｔａｌ．、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７１３４−７１３８）内に注射する。この発現はＥＬＩＳＡにより、ヒト蛋白質に特異的なモノクローナル抗体であってＢｅｔａｒｄｅｔａｌ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８７、２５：８９３−８９９）に従って改変される抗体の助けを借りてテストする。Ｂ１．ＡｐｏＡＩノックアウトマウスにおける発現ウイルスＡｄ（ＣＭＶ−ＡｐｏＡＩ）を最初に、ＡｐｏＡＩノックアウトマウスであってそのためマウスＡｐｏＡＩの発現が欠損しているマウス内に注射する。尾静脈を介する１０⁹ｐｆｕの注射後にはヒトのａｐｏＡＩは、４８時間および９６時間後に血漿内に０．３ｍｇ／ｄの濃度で見いだされる。ＨＤＬ −コレステロール濃度も同じ時間に測定し、このことは注射前の８ｍｇ／ｄｌが４８時間および９６時間目には３０〜３５ｍｇ／ｄｌのレベルで増加することを測定することを可能にする。Ａｄ（ＣＭＶ−ＡｐｏＡＩ）を注射してあるこれらのマウスは、ＨＤＬの主要構成成分がヒトのＡｐｏＡＩになっているヒトＡｐｏＡＩ遺伝子についての形質転換マウス内にも見いだされる多分散性ＨＤＬ集団を有するヒトタイプのＨＤＬに相当するリポ蛋白質特性を証明することを可能にさせる。比較すると、正常マウス内ではサイズにおけるＨＤＬ曲線は単一集団の粒子に相当し、そしてＡｐｏＡＩノックアウトマウスにおいてはこの曲線は対応する領域では平坦であり、かつ異常サイズのＨＤＬ集団が存在する（図８）。Ｂ２．Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける発現１〜５ｍｇ／ｄｌの範晴のヒトＡｐｏＡＩレベルが１０¹⁰ｐｆｕのウイルスＡｄ（ＲＳＶ−ＡｐｏＡＩ）もしくはＡｄ（ＣＭＶ−ＡｐｏＡＩ）を注射したマウスの血漿内に見いだされる。等価レベルが尾静脈もしくは後眼窩洞を介する注射の後に見いだされる。この発現はＣＭＶプロモーターの場合には約１５日間安定であるが、ＲＳＶプロモーターの場合には４週間の程度で持続する（図９）。実施例Ｃ：アポリポ蛋白質ＡＩＩアンチセンス遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築Ｃ１．ａｐｏＡＩＩアンチセンス遺伝子を保持するプラスミドの調製１．プラスミドｐＸＬ２２６４の構築プラスミドｐＸＬ２２６４はヒトのアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩをコードするｃＤＮＡを含む。このプラスミドは以下の様式で構築した。ａｐｏＡ−ＩＩｃＤＮＡに相当するＤＮＡ断片をＨｅｐＧ２細胞からの総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ技術により単離した。ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライマーを用いるポリＡ＋ＲＮＡの逆転写により産生した。その後に一回のＰＣＲを、ａｐｏＡ−ＩＩ配列（Ｃｈａｎｅｔａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）７４５）に特異的なオリゴヌクレオチドＳｑ３３１９およびＳｑ３３２０（配列番号８および９）を用いてこれらのｃＤＮＡについて実施した。取得される４７３ｂｐ断片をプラスミドｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローン化し、そしてその配列を確認した。このｃＤＮＡのコーディング鎖の５’部分はｐＣＲＩＩのＨｉｎｄＩＩＩ部位の横にあり、そして３’部分はＸｈｏＩ部位の横にある。得られるプラスミドをｐＸＬ２２６４と称した。２．プラスミドｐＸＬ２２６７の構築プラスミドｐＸＬ２２６７は、完全なヒトアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩアンチセンス遺伝子をコードするｃＤＮＡ（配列番号１２）を含む。このプラスミドはプラスミドｐＣＲ−ＩＩ（先の１を参照せよ）内へ４７３ｂｐのＰＣＲ断片をクローン化させることにより取得されるクローンの内の一つである。この配列を確認した。Ａ−ＩＩｃＤＮＡは、プラスミドｐＸＬ２２６４により保持されるｃＤＮＡと比較すると反対の向きになっている（コーディング鎖の５’部分がＸｈｏＩ部位の横にあり、そして３’部分がＨｉｎｄＩＩＩ部位に接近している）。３．プラスミドｐＸＬ２２６８の構築プラスミドｐＸＬ２２６８は、その配列が塩基＋１〜＋９５および＋３０７〜＋４７３についてのＡ−ＩＩｃＤＮＡのものに相補的であるヒトアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩの部分的アンチセンス遺伝子をコードするｃＤＮＡ（配列番号１３）を含む。このプラスミドは以下の様式で構築した。２回のＰＣＲをプラスミドｐＸＬ２２６４（センスＡ−ＩＩを保持する）について実施し、１回のものはオリゴヌクレオチドＳｑ３３１９およびＳｑ３３６９を、他方のものはオリゴヌクレオチドＳｑ３３２０およびＳｑ３３６４（配列番号１０）を用いた。これらのＰＣＲから得られる断片は各々９６および１６７ｂｐである。３回目のＰＣＲをこれらの２本の断片の混合物について、オリゴヌクレオチドＳｑ３３１９およびＳｑ３３２０２を用いて実施した。取得される２６３ｐｂ断片をプラスミドｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローン化し、そしてその配列を確認した。Ａ−ＩＩｃＤＮＡのコーディング鎖の５’部分はｐＣＲＩＩのＸｈｏＩ部位の横にある。得られるプラスミドをｐＸＬ２２６８と称した。４．プラスミドｐＸＬ２２６９の構築プラスミドｐＸＬ２２６９は、ＲＳＶウイルスＬＴＲ配列の調節下にヒトアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩ遺伝子のｃＤＮＡを含む真核生物発現ベクターである。このプラスミドは以下の様式で構築し、それはすなわち − ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩでのプラスミドｐＸＬ２２６４の消化、およびその後の − ａｐｏＡ−ＩＩセンスｃＤＮＡを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片の、予め同じ酵素で消化してあるベクターｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内への挿入、である。５．プラスミドｐＸＬ２２７０およびｐＸＬ２２７１の構築プラスミドｐＸＬ２２７０およびｐＸＬ２２７１は、各々ヒトアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩの完全および部分的アンチセンス遺伝子のｃＤＮＡをＣＭＶウイルスプロモーター領域の調節下に含む真核生物発現ベクターである。これらのプラスミドは以下の様式で構築し、それはすなわち − プラスミドｐＸＬ２２６７およびｐＸＬ２２６８のＨｉｎｄ IＩＩ−ＸｈｏＩでの消化、およびその後の、 − ａｐｏ−ＩＩアンチセンスｃＤＮＡを含む各プラスミドからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片の、予め同じ酵素で消化してあるベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内への挿入、である。このようにして取得されるプラスミドを、各々ｐＸＬ２２７０（完全なアンチセンス）およびｐＸＬ２２７１（部分的アンチセンス）と表示した。６．プラスミドｐＸＬ２４０３の構築プラスミドｐＸＬ２４０３は、特にアデノウイルスＭＬＰプロモーターの調節下のヒトアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩをコードするｃＤＮＡ、ポリアデニル化シグナル配列、およびＳＶ４０ウイルス複製起点を含む真核生物発現ベクターである。このプラスミドは以下の様式で構築し、それはすなわち − プラスミドＰｘｌ２２６４のＥｃｏＲＩでの消化、およびその後の − ａｐｏＡ−ＩＩセンスｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の、予めＥｃｏＲＩで直線化させてあるベクターｐＭＴ３（Ｓｗｉｃｋｅｔａｌ．、ＰＮＡＳ８９（１９９２）１８１２）内への挿入、である。センスｃＤＮＡの正しい向きについて選択されたプラスミドをｐＸＬ２４０３と表示した。７．プラスミドｐＸＬ２４０４の構築プラスミドｐＸＬ２４０４は、その配列がヒトアポリポ蛋白質Ａ−ＩＩをコードするｍＲＮＡの全配列に相補的であるメッセンジャーＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含む真核生物発現ベクターである。このプラスミドは、プラスミドｐＸＬ２４０３と同じ技術に従って構築したが、このプラスミドはセンスｃＤＮＡの反対方向について選択された。このようにして取得されたプラスミドをｐＸＬ２４０４と称した。８．プラスミドｐＸＬ２４０５の構築プラスミドｐＸＬ２４０５は、その転写がＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに依存するタイプ２アデノウイルスからのＲＮＡであるＶＡＲＮＡ_IをコードするｃＤＮＡを含む。このプラスミドは以下の様式で構築し、それはすなわち − ＶＡＲＮＡ_Iに相当するＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチドＶＡＣｌａ５’（配列番号１４）およびＶＡＣｌａ３’（配列番号１５）によりタイプ２アデノウイルスからのゲノムＤＮＡからＰＣＲ技術により単離した。取得される２３８ｂｐ断片を精製し、そしてプラスミドｐＣＲ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローン化した。このように取得されたプラスミドをｐＸＬ２４０５と称した。９．プラスミドｐＸＬ２４０６の構築プラスミドｐＸＬ２４０６は、その配列が、ヒトａｐｏＡ−ＩＩをコードするｃＤＮＡの配列＋４４／＋７６に相補的な３３ヌクレオチド配列の位置１０２で挿入により改変されているＶＡＲＮＡ_IをコードするｃＤＮＡ（配列番号２１）を含む。このプラスミドは以下の様式で構築した。２回のＰＣＲをタイプ２アデノウイルスゲノムＤＮＡについて実施し、一回のものはオリゴヌクレオチドＳｑ３８９２（配列番号１６）およびＶＡＣｌａ５’ を用い、そして他のものはオリゴヌクレオチドＶＡＣｌａ３’およびＳｑ３８９３（配列番号１７）を用いた。これらのＰＣＲから取得される断片は各々１６２および１１８ｂｐである。３回目のＰＣＲをこれらの２本の断片の混合物について、それぞれの精製後に、オリゴヌクレオチドＶＡＣｌａ５’およびＶＡＣｌａ３’を用いて実施した。取得される２７１ｂｐ断片をプラスミドｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローン化し、そしてその配列を２５４ｂｐ（配列番号２２）にわたって確認した。得られるプラスミドをｐＸＬ２４０６と称した。１０．プラスミドｐＸＬ２４０７の構築プラスミドｐＸＬ２４０７は、その配列が、ヒトａｐｏＡ−ＩＩをコードするｃＤＮＡの配列＋４４１／＋４７３に相補的な３３ヌクレオチド配列の位置１０２での挿入により改変されるＶａＲＮＡ_IをコードするｃＤＮＡ（配列番号２３）を含む。このプラスミドは以下の様式で構築した。２回のＰＣＲをタイプ２アデノウイルスゲノムＤＮＡについて実施し、一回のものはオリゴヌクレオチドＶＡＣｌａ５’およびＳｑ３８９４（配列番号１８）を、他のものはオリゴヌクレオチドＳｑ３８９５（配列番号１９）およびＶＡＣｌａ３’を用いた。これらのＰＣＲから取得される断片は各々１６２および１１８ｂｐである。３回目のＰＣＲをこれらの２本の断片の混合物について、それぞれの精製後に、オリゴヌクレオチドＶＡＣ１ａ５’およびＶＡＣｌａ３’により実施した。取得される２７１ｂｐ断片をプラスミドｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローン化し、そしてその配列を２５４ｂｐ（配列番号２４）にわたり確認した。取得されるプラスミドをｐＸＬ２４０７と称した。１１．プラスミドｐＸＬ２４０８およびｐＸＬ２４０９の構築プラスミドｐＸＬ２４０８およびｐＸＬ２４０９は、各々ヒトａｐｏＡ−ＩＩをコードするｃＤＮＡの配列＋４４／＋７６および＋４４１／＋４７３に相補的な３３ヌクレオチド配列の挿入により改変されるＶＡＲＮＡ_Iを含む真核生物発現ベクターである。その上これらは、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性をコードする配列を含む。これらのプラスミドは以下の様式で構築し、それはすなわち − プラスミドｐＸＬ２４０５およびｐＸＬ２４０６のＣｌａＩでの消化、ならびにその後の − 改変化ＶＡＲＮＡ_Iを含む各プラスミドからのＣｌａＩ−ＣｌａＩ断片の、予めＣｌａＩで直線化してあるベクターｐＶＶ２内への挿入、である。これらのプラスミドを各々ｐＸＬ２４０８およびｐＸＬ２４０９と表示した。Ｃ２．アンチセンスＲＮＡの機能性アンチセンスＲＮＡを発現するベクター（ｐＸＬ２２７０、ｐＸＬ２２７１、ｐＸＬ２４０４、ｐＸＬ２４０８、ｐＸＬ２４０９）を、 − ＣＯＳ−１細胞内への一時的トランスフェクション後にそれらの発現について、 − ｐＸＬ２４０３との同時トランスフェクション後に同一細胞内での一過性発現によりそれらの機能性について、 − 安定にトランスフェクトされる細胞株２９３の作成によりそれらの機能性について、テストした。１．アンチセンスＲＮＳの発現アンチセンスＲＮＡを発現するベクターを、電気穿孔によりＣＯＳ−１細胞内に組み込ませた。トランスフェクション後４８時間目に、総ＲＮＡをその細胞から抽出した。アンチセンスメッセンジャーＲＮＡの存在をノザンブロット技術により検出した。このためには、総ＤＮＡをホルムアルデヒドの存在下でアガロースゲルにのせ、そしてその後にナイロン膜に移動させた。この膜を³²リンで放射ラベル化してあるプローブとハイブリダイズさせた。改変化ＶＡＲＮＡ_Iの発現については、このプローブは、ＶＡＲＮＡ_IをコードするｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドＳｑ４１１２（配列番号２０）のいずれかであった。完全なアンチセンスＲＮＡの発現については、このプローブは、ヒトａｐｏＡ −ＩＩをコードするｃＤＮＡ、もしくはオリゴヌクレオチドＳｑ３３２０（配列番号９）のいずれかであった。膜のＲＮＡ上へのプローブの結合を、−８０℃でのオートラジオグラフィーの後に検知用反応にかけた。取得される結果は、テストした全ての構築物についてアンチセンス転写物の発現を検出できることを示す。２．アポリポ蛋白質Ａ−ＩＩの発現プラスミドｐＸＬ２４０３をその機能性について、ＣＯＳ−１細胞内での発現によりテストした。このためにはこのプラスミドを電気穿孔により細胞内に取り込ませた。トランスフェクション後２日目に総ＲＮＡをその細胞から抽出し、そしてａｐｏＡ−ＩＩをコードするメッセンジャーＲＮＡの存在をノザンブロット技術により、ヒトａｐｏＡ−ＩＩをコードするｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドＳｑ３３１９（配列番号８）のいずれかである特異的プローブの助けを借りて検出した。一方で、細胞上清を回収し、そしてそれらのａｐｏＡ−ＩＩ含有量についてＥＬＩＳＡテストによりテストした。ＥＬＩＳＡテストのためにはａｐｏＡ−ＩＩに対するモノクローナル抗体（炭酸塩緩衝液、ｐＨ＝９．６中の１０μｇ／ｍｌ）をＩｍｍｕｌｏｎＩＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社）の壁面に、＋４℃で一晩のインキュベーションにより付着させた。この壁をその後にウシ血清アルブミン（ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中で２％に希釈されている）で、３７℃で１時間飽和させた。純粋な、もしくは希釈される（ＰＢＳ−２％ＢＳＡ中での希釈）細胞上清をその壁に沈着させ、そして３７℃で１時間インキュベートした。その後に検知用反応を、（ｉ）その壁を３７℃で１時間、パーオキシダーゼに共有結合的に連結してある抗−ａｐｏＡ−ＩＩモノクローナル抗体の混合物と共にインキュベートし、（ｉｉ）暗所、ＴＢＭ試薬の存在下でインキュベートし、そして（ｉｉｉ）６３０ｎｍの波長で分光光度測定を行うことにより実施した。取得される結果は、アポリポ蛋白質Ａ−ＩＩの発現を検出することができることを示す。３．アンチセンスＲＮＡを安定に発現する細胞株２９３の作成アンチセンスＲＮＡを発現するベクターをトランスフェクション技術によりリン酸カルシウムの存在下で細胞２９３内に組み込ませた。ネオマイシン耐性遺伝子を保持するベクターをベクターｐＸＬ２４０４４と共に組み込ませた。アンチセンスベクターを享受しているクローンの選択を、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）の存在下で細胞を培養することにより実施した。その後にクローンの特徴決定を行い、そしてアンチセンスＲＮＡをコードするｃＤＮＡ（ＰＣＲ）、およびアンチセンス転写（ノザンブロット）の存在について選択した。選択される安定な株ならびに親株２９３を、その後にプラスミドｐＸＬ２４０３によりトランスフェクトさせた。トランスフェクト後４８時間目に細胞上清を回収し、そしてＥＬＩＳＡテスト（先の２を参照されたい）によりそれらのａｐｏＡ−ＩＩ含有量についてテストした。Ｃ３．組換えアデノウイルスの調製Ｃ１において調製されるプラスミドをその後に直線化させ、そして実施例Ａ３に記載される方法に従って、欠陥アデノウイルスベクターと共に組換えのために、アデノウイルスＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１１Ｂ）によりコードされる機能をトランスで供給するヘルパー細胞（株２９３）内に同時トランスフェクトさせた。実施例Ｄ：アポリポ蛋白質Ｅ遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築Ｄ１．プラスミドｐＸＬ２３３５の構築このプラスミドは、ＲＳＶプロモーターの調節下にＡｐｏＩのイソ型３のためのｃＤＮＡを含む。このプラスミドは、プラスミドｐＧＥＭ３のＳｍａＩ部位に含まれるｃＤＮＡをクローニングし、ＥｃｏＲＩ切断により取り出し、Ｔ４ポリメラーゼで充填し、そしてＳａｌＩでの二回目の切断を行い、そしてＣｌａＩで開環されているプラスミドｐＸＬ２２４４内に挿入し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で充填し、そしてＳａｌＩで再度切断することにより構築した（図１０）。Ｄ２．組換えアデノウイルスの調製Ｄ１において調製されるプラスミドｐＸＬ２３３５をその後に直線化し、そして実施例Ａ３に記載される方法に従って欠陥アデノウイルスベクターと共に組換えのために、アデノウイルスＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１１Ｂ）によりコードされる機能をトランスで供給するヘルパー細胞（株２９３）内に同時トランスフェクトさせた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者ペリコーデ，ミシエルフランス国エフ―28150カルビル・レジダンスデユムーラン20 (72)発明者セグレ，サンドリーヌフランス国エフ―78180モンテイグニ―ル ―ブルトヌー・リユシヤルル―リネ13 (72)発明者ビニユ，エマニユエルフランス国エフ―94200イブリ―シユール ―セーヌ・リユジヤン―ル―ガルー60

Claims

【特許請求の範囲】１．インビボでアポリポ蛋白質レベルを調節することが可能な少なくとも一つの挿入遺伝子を含む、欠陥組換えアデノウイルス。２．感染細胞内でのアデノウイルスの複製のために必要なゲノムの領域を欠損することを特徴とする、請求の範囲１に記載のアデノウイルス。３．タイプＡｄ５アデノウイルスであることを特徴とする、請求の範囲２に記載のアデノウイルス。４．アポリポ蛋白質もしくはアポリポ蛋白質タイプの活性を有する蛋白質産物をコードする少なくとも一つの挿入遺伝子を含むことを特徴とする、請求の範囲１〜３の一つに記載のアデノウイルス。５．挿入遺伝子が、アポリポ蛋白質ＡＩ、アポリポ蛋白質ＡＩＶ、アポリポ蛋白質Ｅ、あるいはそれらの天然の突然変異体もしくはそれらの変異型の全てもしくは一部分をコードすることを特徴とする、請求の範囲４に記載のアデノウイルス。６．挿入遺伝子が、アポリポ蛋白質ＡＩ、あるいは好ましくは位置１７３にシステインを有するその変異型をコードすることを特徴とする、請求の範囲５に記載のアデノウイルス。７．標的細胞内での発現が、アポリポ蛋白質をコードする遺伝子の発現もしくはそれをコードする細胞性ｍＲＮＡの転写を調節することを可能にさせる少なくとも一つのアンチセンス遺伝子を含むことを特徴とする、請求の範囲１〜３の一つに記載のアデノウイルス。８．アンチセンス遺伝子がアポリポ蛋白質ＡＩＩの発現のレベルを減少することを可能にさせることを特徴とする、請求の範囲７に記載のアデノウイルス。９．挿入遺伝子が、感染細胞内でのアデノウイルスの発現を可能にする配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１〜８の一つに記載のアデノウイルス。１０．挿入遺伝子が、合成されたポリペプチドを標的細胞の分泌経路内に差し向けるシグナル配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１〜９の一つに記載のアデノウイルス。１１．リポ蛋白質異常症に関連する病状の治療もしくは予防が予定される薬剤学的組成物の調製のための、請求の範囲１〜１０の一つに記載のアデノウイルスの使用。１２．アテローム性動脈硬化症および／または神経学的疾患の治療が予定される薬剤学的組成物の調製のための、請求の範囲１１に記載の使用。１３．請求の範囲１〜１０の一つに記載の欠陥組換えアデノウイルスの一つもしくは複数を含む、薬剤学的組成物。１４．注射用形態であることを特徴とする、請求の範囲１３に記載の薬剤学的組成物。１５．１０⁴および１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌとの間、および好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ ｐｆｕ／ｍｌの欠陥組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする、請求の範囲１３に記載の薬剤学的組成物。