JPH08509806A

JPH08509806A - 方法およびアッセイ

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Publication number: JPH08509806A
Application number: JP6520827A
Authority: JP
Inventors: ソーリユム，ニルス・オーラヴ; ブロツスター，フランク; ホーム，ポール・アンドレ; ゴツグスター，ゲアイル・オーラヴ
Original assignee: ニユコメド・フアルマ・アクシエセルカペト
Priority date: 1993-03-24
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 1996-10-15
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: ATE154847T1; GB9306053D0; EP0694168B2; WO1994022018A1; JP3422491B2; AU6262794A; DE69403961T2; NO953770L; DE69403961T3; DE69403961D1; AU691489B2; NO953770D0; FI954499A0; ES2103582T5; FI113206B; US5811250A; DK0694168T4; CA2158363A1; FI954499L; EP0694168A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、人間または人間以外の対象の体液検体中の血小板由来マイクロベジクルの存在および／または濃度を評価することより成る前記対象の止血障害の診断方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】方法およびアッセイ本発明は、血漿など液状検体中の血小板由来マイクロベジクルの検出および／または測定、およびこの測定の止血障害診断への使用に関する。血小板は血液の正常成分であり、また止血過程に活発に関与していることが知られている。例えば傷害を受けた血管の内皮下層との相互作用を通して、血小板が凝集して原発性止血栓を形成することがある。この過程には、更に、通常、血小板による止血に関与する様々な因子の生成が伴う。血小板の活性化はそれらの止血反応触媒作用を大きく高め、そして特に活性化血小板はVa因子の濃度および活性の増加を示す（Ｖａ因子は、その前駆体であるプロトロンビンからトロンビンを生成するいわゆるプロトロンビナーゼ複合体の一成分である）。更に、血小板は活性化されるとそれらの原形質膜からマイクロベジクル（マイクロパーティクルとも呼ばれる）を発することが見出されている。この現象はSandbergら（Biochem.，J．203：303-311(1982)）により最初に記述された。更なる研究の後、現在では血小板マイクロベジクルは原形質膜の切り取り（pi nching off）または出芽により形成されるものと信じられている。マイクロベジクルは血小板糖タンパク質Ｉｂ、IIｂおよびIIIａおよび細胞骨格タンパク質フィラミン、タリンおよびミオシンを含有している。形成されたマイクロベジクルは50〜800nmの直径を有する。マイクロベジクルおよび血小板はいずれも止血反応を触媒でき、そしてそれぞれが凝血促進活性と抗凝血活性の両方を示す。マイクロベジクルの形成はプロトロンビナーゼ複合体の生成と連関しているものと仮定されているが（Sims et al.，J．Biol．Chem．264：17049-17057(1989)）、比活性が血小板由来のマイクロベジクルまたは血小板のいずれかに制限されているということは実証されていない。血小板の活性化およびマイクロベジクルの形成は、多くの様々な因子、例えばトロンビン、コラーゲン、イオノホア、カルパインおよび補体タンパク質複合体、例えばＣ５ｂ〜９、により誘導され得る。血小板の弱い活性化剤、例えばADP 、エピネフリンおよび血小板活性化因子はほんの低レベルのマイクロベジクル形成を生起するに過ぎない。血小板濃縮液の貯蔵に伴ってマイクロベジクルの濃度増加が実証されている（Bode et al.，Blood 77：887-895(1991)；Solberg et a l.，Thromb．Res．48：559-565(1987)）。更に、コラーゲンおよび／またはトロンビンにより活性化された血小板より成るサンプルの撹拌がマイクロベジクル形成を高めることも示されている。血管の病気または障害の発現を引き起こすまたは反映する上での止血形成は広く認められていて、いくつかの止血因子がかかる病気および障害のマーカーとしての適合性について調べられている。すなわち、トロンボプラスチンが関与するプロトロンビン時間試験または内因性血漿凝固に対する活性化剤が関与する活性化部分トロンビン時間試験を病気の監視または検出に用いることができる。またフィブリノーゲン、抗トロンビンIII、プロティンＣ、プロティンＳ、VIII因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、フィブリンモノマーおよびフィブリノーゲン分解生成物の試験も用いられる。血漿止血因子の測定に代る選択肢として止血中に生じる細胞活性化の度合を監視する試みもなされている。この点に関し血小板の活性化が研究されている。何故ならば、（前述の如く）血小板は止血における重要な関与物質であり、また動脈血栓の発現およびアテローム性硬化症の過程において主たる役割を演じていると考えられるからである。従来の研究は、分泌されたタンパク質の量を測定することにより血小板活性化を監視することに傾倒してきた。すなわち、血小板４因子（PF-4）、β−トロンボグロブリン（β-TG）およびトロンボスポンジンを測定するためのアッセイが研究されている（Lane et al.，Thromb．Haemostas.（シュツットガルト）52(2) pp.183-187(1984)）。しかしながら、これらのタンパク質はいずれもルーチン監視に適さないものであった。トロンボスポンジンは血小板に対し非特異的であることがわかり、またβ-TGおよびPF-4についての研究からそれらの血中半減期が短すぎて、バックグラウンドレベルに対して検体濃度を区別する上で問題となることが分った。更に、β-TGレベルは腎不全患者では上昇することがわかり、またPF-4レベルはヘパリン（これは血栓性障害の患者の治療に広く用いられている）の存在により影響された。現在、血小板により形成されるマイクロベジクルは血小板活性化を正確に指示し従って止血系全体の活性を反映することは認められている。Georgら（J．Clin ．Invest．78：340-348(1986)）は、心肺バイパス手術後に血小板表面および血小板由来マイクロベジクル上に現われる糖タンパク質の変化を監視した。マイクロベジクル数の増加が認められ、そしてこれはかかる手術中に経験されるせん断応力によるものであると仮定された。しかしながら、マイクロベジクル濃度の監視が止血障害の良好なインジケーターであるとの、またかかる状態の診断方法のベースとなり得るとの示唆はなかった。今般、血小板由来マイクロベジクルの存在または濃度の評価を止血障害診断法として使用できることを見出した。「止血障害」という用語は血液凝固カスケードメカニズムのいかなる異常をも包含し、特に血栓形成の可能性を高めるまたは損傷後の血液凝固能を低下させる障害、例えばすべての形のDIC（播種性血管内血液凝固）およびアテローム硬化症を包含する。従って止血障害の診断は、血栓塞栓症および／または心血管系疾病の検出および／または監視を可能にする。この用語は二次現象（例えば癌の結果としての）である止血障害をも包含する。従って本発明は、人間または人間以外の対象の体液検体中の血小板由来マイクロベジクルの存在および／または濃度を評価することより成る前記対象の止血障害の診断方法を提供する。本発明の診断方法は、慣用手段により患者から採取された体液（例えば血液）検体を用いて試験管内で行われる。更に、血小板由来マイクロベジクルの存在または濃度を評価するための簡単なアッセイも必要とされている。マイクロベジクルをフィルター上に捕捉して簡便な測定を可能にするのが特に有利であることがわかった。すなわち、本発明は、液体検体中の血小板マイクロベジクルの定性的および／または定量的測定のためのアッセイであって、（a）（i）まず検体を濾過してマイクロベジクルを保持残留物として保持し、次いで該マイクロベジクルに対し特異的なマーカーを前記保持残留物に適用し、あるいは（ii）所望によりまず前記マイクロベジクルに対し特異的なマーカーを添加し次いでその検体を濾過し、そして標識されたマイクロベジクルを保持残留物として保持し；（b）所望によりそのフィルターを洗浄し；そして（c）保持されたマーカーの存在または量を測定することより成るアッセイも提供する。液状検体は血小板を含むべきでなく、また好ましくは止血タンパク質を生産できる他の細胞、例えば内皮細胞または単球を含むべきでない。従って段階（a）に先立って液状検体を濾過しまたは遠心分離して本質的に無細胞の検体を生成させることが考えられる。液状検体中の大部分の細胞を除去する一方はるかに小さいマイクロベジクルを懸濁状態のまま維持させるには、100nm以上、例えば１μm 以上の細孔径を有するフィルターが適している。検体中の細胞を遠心分離により除去する場合、2,000〜20,000×ｇで15〜30分、例えば11,000×ｇで15分のｇ− 力が適しており、また既に概説したアッセイ手順の段階（a）に必要な本質的に細胞不含の検体を生成させるのに用いることができる。他の等価の方法を用いて細胞を除去しそして必要な本質的に細胞不含の液状検体を得ることもできる。段階（a）において、使用されるフィルターは血小板マイクロベジクルを保持するのに十分小さい細孔径を有するべきであり、そして800nm以下、好ましくは2 00nm以下の細孔径が適している。濾過の作用により、マイクロベジクルはフィルター上に不動化されるが、それらは次いでマーカーと接触させてもよく、あるいは該マイクロベジクルが既に標識されている場合には直接評価することができる。適切なマーカーには、血小板由来マイクロベジクルの有する表面エピトープに特異的な抗体が包含される。本発明による好ましい抗体マーカーは、GPIIｂ−II Iａ複合体および／または個々の糖タンパク質GPIIｂおよびGPIIIａを含む糖タンパク質を認識する。マイクロベジクル上にみられる他の血小板特異的糖タンパク質にはGPＩｂ−GPIX、GPＩａ−IIａおよびGPIIIｂが含まれる。マイクロベジクルに結合する抗体をそれ自体標識してもよく、あるいはまた、第２抗体、例えば、適用された第１抗体、例えばマウスモノクローナル抗体に特異的に結合する標識された抗−マウス免疫グロブリンを用いてもよい。モノクローナル抗体が好ましい。段階（a）（ii）におけるように、液状検体にマーカーを添加するのが好ましい。マーカーは、段階（a）（i）に従って、マーカーをフィルターに直接適用するかまたはフィルターをマーカーの溶液中に浸漬することにより、フィルターに不動化されたマイクロベジクルと接触させることができる。使用される標識は、信号を発することのできる任意の成分、例えば酵素、発色団、発蛍光団、放射性同位元素、着色粒子、色素、コロイド状金属などであってよい。好ましくは、過剰マーカーをフィルター洗浄により除去してから、マーカーの存在または量の測定を行う。付加的に、段階（a）（i）において、検体の適用後に、そしてマーカーの添加前にフィルターを洗浄してもよい。それら洗浄段階には水または緩衝液が適している。使用されるマーカーが酵素である場合には、段階（c）は、触媒されるべき反応への基質転化を含んでよい。しかしながら、使用されるマーカーまたは標識は、直ちに評価を行えるように、直ちに視認できるのが好ましい。検体中のマイクロベジクル濃度は、次いでフィルター上に保持されたマーカーレベルから算出できる。この値は次いで臨床医により患者の止血障害の診断に用いることができる。定量的測定を可能にするアッセイが好ましい。クエン酸塩、EDTAまたはヘパリンなどの血液凝固防止剤で処理された血小板不含血漿が本発明によるアッセイの検体として用いるのに適している。もちろん、クエン酸加血漿は必要に応じて使用前に希釈してもよい。更に、マイクロベジクル含有フィルターはタンパク含量または、より好ましくは、燐脂質含量について分析することもできる。本発明の好ましい一態様においては、ニトロセルロース膜またはナイロン膜、例えばHybond N（Amersham Internationalから販売されている）またはMagna Ny lon（MSIから販売されている）がフィルターとして用いられる。100nmの細孔径が便利である。吸収剤パッド例えばセルロースブロッティング紙、はフィルムを通しての液状検体通過を高めるために膜の片側に置き、そして液体非透性のシートまたはフレームを膜の他方の側に置くのが有利である。液状検体およびアッセイ液を膜に正確に適用できるように、非透過性のシートまたはフレームに、例えば直径５mmの丸穴を設ける。（所望により緩衝液で予め希釈された）マイクロベジクル含有細胞不含水性溶液の既知量、例えば10〜500μｌを膜に適用してその下の吸収剤パッド中に通す。マーカーとしての金ゾルコロイドに接合させた抗GP IIｂ−IIIａ抗体の、例えば10〜500μｌの水性溶液を適用しそして膜を通過させる。次にその膜を２×200μｌアリコートの適当な洗液、例えばTris HCl緩衝液（pH7.0）で洗浄してから、その膜上に不動化された金ゾルの量を、通常は肉眼でカラースケールと比較することにより、あるいはレフレクトメーター（reflectometer）により評価する。本発明はまた、マイクロベジクルを血小板不含液状検体から保持するためのフィルターおよび血小板由来マイクロベジクルを選択的に標識するマーカーより成る試薬、および所望により緩衝洗浄溶液より成る、本発明のアッセイを行うためのキットも提供する。本発明は更に、人間または人間以外の、好ましくは哺乳類の、動物の体から採取された所望により希釈された本質的に細胞不含の血漿検体を前述のアッセイに付すことにより、血中を循環する血小板由来マイクロベジクルの存在または濃度の評価方法を提供する。以下の実施例は、例示のためだけに示したものである：特に断らない限り、すべての割合は容量基準である。実施例では様々な緩衝溶液を言及するのに次の略号を用いる： TS−緩衝液：0.01モル／ｌ Tris-HCl−緩衝液（pH7.4）／0.154mol／ｌ NaCl TTG−緩衝液：TS−緩衝液添加１％Triton X-100 TBS−緩衝液：0.02モル／ｌ Tris-HCl−緩衝液（pH7.5）／0.5モル／ｌ NaCl TTBS−緩衝液：TBS−緩衝液添加0.05％Tween20実施例１血小板マイクロベジクルの調製および収集血液を緩衝クエン酸ナトリウム水溶液に集め（１：９）そして320×ｇで15分間遠心分離した。高血小板血漿（PRP）含有上清をプラスチック管に移しそして更に10分間11,000×ｇで遠心分離した。得られた上清は血小板不含であり、そしてマイクロベジクルを含有する。それらマイクロベジクルを集めるために、2.8mlの上清をシリンジに取りつけたMillex-VV 0.10μmフィルター（Millipore Products Division，ベッドフォード(Bedford)，マサチューセッツ州，米国）を通して濾過した。そのフィルターをTS−緩衝液中で十分に洗浄した。フィルター上に残留するマイクロベジクルはフィルター全体を反応段階を通して処理することによって更に分析することができた。あるいは前記ベジクルは150μlのTTG−緩衝液に可溶化した。実施例２ TTG−緩衝液に可溶化したマイクロベジクルからの物質試料を「ホスホリピッドエンザイマティック（Phospholipid enzymatique）」キット（BioMorieux，フランス）を用いて燐脂質について定量測定した。その方法は、Takayama et al. ，Clin．Chim．Acta．79，p.93-98に基づいている。実施例３総タンパク質の測定実施例１に記載の如く濾過されそしてTTG−緩衝液中に可溶化されたマイクロベジクルからの物質サンプルを、Bradford，Anal．Biochem．1976，72，248-54 の方法に基づいて、BioRad Dye−結合アッセイ（BioRad，リッチモンド，米国）により測定した。実施例４マイクロベジクルの免疫化学的測定のための高速テストクエン酸加血液検体を320×ｇで15分間遠心分離した後その上清を11,000×ｇで10分間遠心分離した。それら血小板マイクロベジクルを含有する上清に、血小板表面膜のGPIIｂ−IIIａ−複合体のCd41ｂ（GPII ｂ）中のエピトープに対するモノクローナル抗体SC22を添加した。その抗体はIm munotech S.A.，ルミニー（Luminy）、マルセーユ、フランスから入手した。その抗体は１：1500の希釈比で添加した。20℃で１分間インキュベーション後、2. 8mlの混合物を実施例１に記載の如く濾過した。その時点でマウスモノクローナル抗体を有するマイクロベジクルがフィルター上に捕捉された。それらフィルターをTTBS−緩衝液中で、次いでTBS−緩衝液中で十分洗浄した。TBS−緩衝液中で１：3000希釈されたアルカリ性ホスファターゼに接合されたヤギ−抗−マウスTg G F(ab)（Jackson Immuno Research Laboratories，米国）を各フィルターを通して流した。この時点でその接合体はマイクロベジクル中のGPIIｂ−IIIａ−複合体に結合された抗体に結合された。それらフィルターを0.5mg／mlNitroblueテトラゾリウム、0.25mg／ml５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート−ｐ−トルイジンおよび0.1mol／lNaHCO₃−緩衝剤（pH9.8）を含む溶液に、フィルター表面に測定可能な色形成が生じるのに十分な時間浸漬した。Ｄ−ダイマーおよび／または可溶性フィブリン試験（エタノールゲル化試験）陽性の患者を前記方法を用いて検査した。コントロールとして病気の臨床的徴候がなく、かつＤ−ダイマーおよび可溶性フィブリン試験陰性の明らかに健常な人を選定した。フィルター上に得られた色はレフレクドメーター（例えば英国特許第9213733. 0および9213737.1に開示されているような、NycoCard Reader）により測定した。反射率値は次の通りであった：患者検体は正常血漿検体およびコントロール緩衝液よりも実質的に高い値を示すことがわかる。実施例５血栓塞栓症患者からの物質の検査ルーチンの検査室分析試験においてＤ−ダイマーおよび／または可溶性フィブリンにより確認された血栓塞栓症患者、および明らかに健常の人を年令に従ってグループ分けした。採血し遠心分離し、そして実施例１に記載の如くフィルター上に血小板マイクロベジクルを集めた（それぞれ実施例２〜４に記載された）特異的抗体を用いた高速免疫アッセイを用いて総燐脂質、総タンパク質およびGPII ｂ−IIIａの分析を行った。免疫化学的検査において、検体を置換する緩衝液だけを用いて得られた色をコントロールとして用い数値から差引いた。マイクロベジクルの内標準に1.0という任意値を与え、そして個々の実験を行った際に、免疫化学的方法を用いて得られたすべての結果をこの標準を用いて得られた結果に関係づけた。結果は表１に示され、そして総タンパク質は患者と健常人との間で相当に重なりあうことを示している。しかしながら、GPIIｂ−IIIａの量は、患者と健常人との間に明確な差のあることを実証した。すなわち、この分析方法は血液検体中の血小板マイクロベジクルを検出するための診断ツールの構築に最も適している。総タンパク質レベルの変動性は、マイクロベジクル中のタンパク質含量の変動性による可能性がある。調製過程を通してベジクルが破砕される程度をコントロールすることは困難かもしれず、従ってベジクルからの可溶性タンパク質のもれの変動性が結果に見られる変動性の原因となっている可能性がある。実施例６ DIC患者からの物質の検査フィブリン分解生成物（FDP）および可溶性フィブリン（陽性エタノールゲル化試験）での試験が陽性であることから判定された播種性血管内血液凝固（DIC ）患者を前記実施例に記載の方法を用いて検査した。患者の年令は24〜72才であった。DIC患者のうち10人は大手術を受けており、６人は子癇前症を有し、３人は敗血症を有し、そして３人は前骨髄性白血病を有した。コントロール（ｎ＝30 ）は年令および性別をマッチさせた健常給血者から構成した。DIC患者は採血時に抗凝血剤療法を受けなかった。前述の実施例に記載の方法を用いてGPIIｂ−IIIａ（例えばGPIIｂ抗原）、燐脂質および総タンパク質を試験したところ次の結果が得られた：これらの結果は、GPIIｂ−IIIａおよび燐脂質の測定は患者をコントロールの間に高有意差があるのに対し、総タンパク質については有意差は相当に低いことを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年２月２４日【補正内容】クエン酸塩、EDTAまたはヘパリンなどの血液凝固防止剤で処理された血小板不含血漿が本発明によるアッセイの検体として用いるのに適している。もちろん、クエン酸加血漿は必要に応じて使用前に希釈してもよい。更に、マイクロベジクル含有フィルターはタンパク含量または、より好ましくは、燐脂質含量について分析することもできる。本発明の好ましい一態様においては、ニトロセルロース膜またはィルターとして用いられる。100nmの細孔径が便利である。吸収剤パッド例えばセルロースブロッティング紙、はフィルムを通しての液状検体通過を高めるために膜の片側に置き、そして液体非透性のシートまたはフレームを膜の他方の側に置くのが有利である。液状検体およびアッセイ液を膜に正確に適用できるように、非透過性のシートまたはフレームに、例えば直径５mmの丸穴を設ける。（所望により緩衝液で予め希釈された）マイクロベジクル含有細胞不含水性溶液の既知量、例えば10〜500μlを膜に適用してその下の吸収剤パッド中に通す。マーカーとしての金ゾルコロイドに接合させた抗GPIIｂ−IIIａ抗体の、例えば10〜500μ lの水性溶液を適用しそして膜を通過させる。次にその膜を２×200μｌアリコートの適当な洗液、例えばTris HCl緩衝液（pH7.0）で洗浄してから、その膜上に不動化された金ゾルの量を、通常は肉眼でカラースケールと比較することにより、あるいはレフレクトメーター（reflectometer）により評価する。実施例１血小板マイクロベジクルの調製および収集血液を緩衝クエン酸ナトリウム水溶液に集め（１：９）そして320×ｇで15分間遠心分離した。高血小板血漿（PRP）含有上清をプラスチック管に移しそして更に10分間11,000×ｇで遠心分離した。得られた上清は血小板不含であり、そしてマイクロベジクルを含有する。それらマイクロベジクルを集めるために、2.8m lの上清をシリンジ Division，ベッドフォード（Bedford），マサチューセッツ州，米国）を通して濾過した。そのフィルターをTS−緩衝液中で十分に洗浄した。フィルター上に残留するマイクロベジクルはフィルター全体を反応段階を通して処理することによって更に分析することができた。あるいは前記ベジクルは150μlのTTG−緩衝液に可溶化した。実施例２ TTG−緩衝液に可溶化したマイクロベジクルからの物質試料を「ホスホリピッドエンザイマティック（Phospholipid enzymatique）」キット（BioMorieux，フランス）を用いて燐脂質について定量測定した。その方法は、Takayama et al. ，Clin．Chim．Acta．79，p.93-98に基づいている。実施例３総タンパク質の測定実施例１に記載の如く濾過されそしてTTG−緩衝液中に可溶化されたマイクロベジクルからの物質サンプルを、Bradford，Anal.Biochem．1976，72，248-54の方法に基づいて、BioRad Dye−結合アッセイ（BioRad，リッチモンド，米国）により測定した。フィルター上に得られた色はレフレクドメーター（例えば英国特許第9213733. 0および9213737.1に開示されているような、NycoCard 患者検体は正常血漿検体およびコントロール緩衝液よりも実質的に高い値を示すことがわかる。実施例５血栓塞栓症患者からの物質の検査ルーチンの検査室分析試験においてＤ−ダイマーおよび／または可溶性フィブリンにより確認された血栓塞栓症患者、および明らかに健常の人を年令に従ってグループ分けした。採血し遠心分離し、そして実施例１に記載の如くフィルター上に血小板マイクロベジクルを集めた（それぞれ実施例２〜４に記載された）特異的抗体を用いた高速免疫アッセイを用いて総燐脂質、総タンパク質およびGPII ｂ−IIIａの分析を行った。免疫化学的検査において、検体を置換する緩衝液だけを用いて得られた色をコントロールとして用い数値から差引いた。マイクロベジクルの内標準に1.0という任意値を与え、そして個々の実験を行った際に、免疫化学的方法を用いて得られたすべての結果をこの標準を用いて得られた結果に関係づけた。請求の範囲１．人間または人間以外の対象の体液検体中の血小板由来マイクロベジクルの存在および／または濃度を評価することより成る前記対象の止血障害の診断方法。２．完全な細胞からマイクロベジクルを分離し、該マイクロベジクルを固体支持体上に不動化し、そして不動化されたマイクロベジクルの存在または濃度を評価する段階を含む請求項１記載の方法。３．マイクロベジクルが遠心分離または濾過により完全な細胞から分離される請求項２記載の方法。４．マイクロベジクルが200nm以上の細孔径のフィルターを通して濾過することにより完全な細胞から分離される請求項２記載の方法。５．フィルターが１μm以上の細孔径を有する請求項４記載の方法。６．マイクロベジクルが800nm以下の細孔径のフィルター上に不動化される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。７．フィルターが200nm以下の細孔径を有する請求項６記載の方法。８．マイクロベジクルの存在および／または濃度が、抗体を特異的マイクロベジクル表面エピトープに結合させそしてこのようにして結合した抗体のレベルを評価することにより評価される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．表面エピトープが糖タンパク質上にある請求項８記載の方法。 10．表面糖タンパク質がGPIIｂ−IIIａである請求項９記載の方法。 11．抗体が直接的または間接的に検出され得る標識を有する請求項８〜10のいずれかに記載の方法。 12．標識がその抗体に直接的または間接的に検出され得る付加的な標識された成分を結合させることにより、または酵素を担持する抗体に基質を添加することにより、間接的に検出される請求項11記載の方法。 13．特異的マイクロベジクル表面エピトープに対する抗体を不動化に先立ち結合させる請求項１〜12のいずれかに記載の方法。 14．マイクロベジクルの濃度がそれらの燐脂質含量により評価される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 15．固体支持体が所望により段階間で洗浄される請求項２〜14のいずれかに記載の方法。 16．少くとも次の構成分、すなわち a）マイクロベジクルを血小板不含液状検体から保持するためのフィルター、 b）血小板由来マイクロベジクルを選択的に標識するマーカーより成る試薬を含んで成る請求項１〜15のいずれかに記載の方法を行うためのキット。 17．キットが付加的に緩衝洗浄溶液を含む請求項16記載のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ホーム，ポール・アンドレノールウエー国 0456 オスロ．ローヴイセンベルグガーテン４アー (72)発明者ゴツグスター，ゲアイル・オーラヴノールウエー国 0491 オスロ．アーリルツヴインゲン16

Claims

【特許請求の範囲】１．人間または人間以外の対象の体液検体中の血小板由来マイクロベジクルの存在および／または濃度を評価することより成る前記対象の止血障害の診断方法。２．完全な細胞からマイクロベジクルを分離し、該マイクロベジクルを固体支持体上に不動化し、そして不動化されたマイクロベジクルの存在または濃度を評価する段階を含む請求項１記載の方法。３．マイクロベジクルが遠心分離または濾過により完全な細胞から分離される請求項２記載の方法。４．マイクロベジクルが100nm以上、好ましくは１μm以上の細孔径のフィルターを通して濾過することにより完全な細胞から分離される請求項２記載の方法。５．マイクロベジクルが800nm以下、好ましくは200nm以下の細孔径のフィルター上に不動化される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．マイクロベジクルの存在および／または濃度が、抗体を特異的マイクロベジクル表面エピトープに結合させそしてこのようにして結合した抗体のレベルを評価することにより評価される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。７．表面エピトープが糖タンパク質上にある請求項６記載の方法。８．表面糖タンパク質がGPIIｂ−IIIａである請求項７記載の方法。９．抗体が直接的または間接的に検出され得る標識を有する請求項６〜８のいずれかに記載の方法。 10．標識がその抗体に直接的または間接的に方向づけられ得る付加的な標識された成分を結合させることにより、または酵素を担持する抗体に基質を添加することにより、間接的に検出される請求項９記載の方法。 11．特異的マイクロベジクル表面エピトープに対する抗体を不動化に先立ち結合させる請求項１〜10のいずれかに記載の方法。 12．マイクロベジクルの濃度がそれらの燐脂質含量により評価される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 13．固体支持体が所望により段階間で洗浄される請求項２〜12のいずれかに記載の方法。 14．少くとも次の構成分、すなわち a）マイクロベジクルを血小板不含液状検体から保持するためのフィルター、 b）血小板由来マイクロベジクルを選択的に標識するマーカーより成る試薬を含んで成る請求項１〜13のいずれかに記載の方法を行うためのキット。 15．キットが付加的に緩衝洗浄溶液を含む請求項14記載のキット。