JPH09503861A

JPH09503861A - 患者の急性心筋梗塞症の検出

Info

Publication number: JPH09503861A
Application number: JP7510882A
Authority: JP
Inventors: ヘンドリックス、ジェームズ・ビー; メタ、ジャーハー・エル
Original assignee: リサーチ・コーポレイション・テクノロジーズ、インコーポレイテッド
Priority date: 1993-09-30
Filing date: 1994-09-28
Publication date: 1997-04-15
Anticipated expiration: 2015-12-11
Also published as: CA2173159C; WO1995009559A3; JP3115604B2; EP0721585A1; AU7845894A; CA2173159A1; WO1995009559A2; US5503982A

Abstract

(57)【要約】患者の急性心筋梗塞症を検出ための方法および手段を提供する。本発明の方法には患者の末梢血液を採取し、単球血小板結合体（ＭＰ−Ｃ）の量を定量して単球血小板結合体の有意に増加しているか否かを判断する。定量は、スライドグラス上の単球血小板結合体を顕微鏡下で直接計数するか、見かけ上の細胞の体積の増加を測定する装置によるか、フローサイトメトリーによるか、または電気抵抗パルスサイジングまたは散乱光によって行えばよい。ＡＭＩを検出するための診断用テストキットもまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】患者の急性心筋梗塞症の検出急性心筋梗塞症（ＡＭＩ）は米国において依然として死亡および障害の原因のうちの主流を成している。ＡＭＩの早期診断は、適当な治療および分類を決定するのに非常に重要である。さまざまな血清酵素の活性の上昇を測定するアッセイは、ＡＭＩの診断に重要な役割を果たす。しかしながら、急性狭心痛には診断が困難であるという問題がある、というのも解剖を行った結果から多くの心筋梗塞が検知されずに進行することが指摘されている（リーら、アン・イント・メド（ Ann.Int.Med.）１０５：２２１−２３３，１９８６）。急性心筋虚血（不安定狭心症およびＡＭＩ）の病体生理学的な基本は過去１０年間にわたって明らかにされてきた。急性心筋虚血は一般に、アテローム性動脈硬化症患者の冠動脈の閉塞性血栓に起因すると考えられている。冠血管の血流の一時的あるいは間欠的な減少による短時間の虚血からは心筋層は回復するが、冠動脈血流量の減少が永続的であり長期間続いた場合には、急性心筋梗塞症が発症すると考えられる（メタら、ＪＡＣＣ１５：７２７−７２９，１９９０）。現在、不安定急性狭心症（ＵＡＰ）およびＡＭＩの両方は、血管内皮細胞の破壊、内皮細胞破壊部位における血小板の活性化およびフィブリンおよび他の細胞性物質の取り込みによる血栓の肥大という、同様の病態示すと考えられている。不安定急性狭心症の患者の血栓は不安定であり、心筋の壊死を起こす患者では血栓が安定し、固くなるようである。血小板は止血および動脈血栓の生成において中心的役割を示す。動脈血栓は主に凝集した血小板から生成されているが、その他に顆粒球も多く含む（例えばレバインら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション５７：９５５−９６３、１９７６）。単球と血小板の両方は虚血の後の心筋に対するダメージに寄与していることが知られている（エントマンら、ＦＡＳＥＢジャーナル５：２５２９−２５３７、１９９１；フォルツら、サーキュレイション５４：３６５−３７０、１９７６；イーらジェイ・サーズ・レス(J．Surg．Res.)４０：４９９−５０３，１９８６）。冠動脈内皮細胞のダメージと血小板の活性化は冠動脈閉塞に起因する病態生理であると考えられている。活性化された血小板は、トロンボキサンＡ₂およびセロトニンのごとき強い痙攣誘発物質および血小板凝集物質を放出し、これらが動脈閉塞部位から離れた血栓もしくはその下流の両方において血管収縮性の影響を及ぼす（メタ、Ｊ．ＪＡＣＣ１５：７２７−７２９、１９９０）。血小板の活性化はまた、表面へα−顆粒外部膜タンパク質−１４０（ＧＭＰ− １４０）の発現を伴う。これはＣＤ６２と名付けられており、血小板活性化依存性顆粒外部膜タンパク質（ＰＡＤＧＥＭ）もしくはＰ−セレクチンとして知られている。ＧＭＰ−１４０は血小板の多形核白血球（ＰＭＮ）および単球への接着を媒介する（ラーセンら、セル、５９：３０５，１９８９）。近年、血小板−白血球接着を正確に定量するフローサイトメトリー法が開発された。このアッセイは血小板が結合している白血球の割合および細胞当たりに結合している白血球の相対数を正確に測定することができる（リンダーら、７８：１７６０−１７６９、１９９１）。このアッセイを用いて、リンダーらは心肺バイパス手術（ＣＰＢ）による血小板の活性化が、単球とＰＭＮへの血小板の接着を伴うことを示した（リンダーら、ブラッド、７９：１２０１−１２０５）。ＡＭＩは世界保健機構によって臨床的に定義づけられている（急性心筋梗塞症の診断のためのＷＨＯ基準；ジェノバ：心血管疾患会議、１９８１年）。ＷＨＯの基準に基づけば、以下に示すいずれかの２つの基準がＡＭＩの診断に用いられる：（ａ）局所的な狭心痛み、（ｂ）ＥＣＧにおける新たなＱ波、および（ｃ）ピーク酵素（ＣＫ，ＳＣＯＴまたはＬＤＨ）が正常値の上限の２倍以上であること。しかしながら、新たなＱ波の存在は稀である。Ｑ波放出の異常はＡＭＩ後約４から８時間に認められる。ＡＭＩの診断は一般に狭心痛およびＥＣＧにおける非特徴的変化に基づいてなされる。局所狭心痛は左腕下および左手に広がり、指の打診痛覚を伴う胸の痛みである。サイトゾルのイソ酵素であるＣＫ−ＭＢは、臨床研究においてのＡＭＩの診断に用いられる標準である。血清酵素であるクレアチニンキナーゼ（ＣＫ）は二つのサブユニットを有し、両者はアミノ酸配列および組織特異性が異なる。ＣＫ− ＭＢは最初は心筋細胞のみ存在すると考えられていたが、より感受性の高いアッセイによって正常骨格筋にもその存在が少量ではあるが確認されている。ＣＫ− ＭＢの増加が非心筋由来、例えば外科手術や外傷によっても起こり得るが、かかる要因なしに生じるＣＫ−ＭＢの増加は高い確率で心筋虚血と結び付いている（リーら、アン・イント・メド、１０５：２２１−２２３、１９８６）。旧来のＣＫ−ＭＢアッセイには最初および約１２時間および約２４時間後の連続的サンプリングが必要である（サクセナら、アーチ・ファトール・ラブ・メド１１７：１８０−１８３）。血栓溶解治療は梗塞発生から４から６時間以内に開始しなくてはならないため、この方法は救急医にとって診断のジレンマを伴うものである。単回ＣＫ−ＭＢ測定の感受性は低い（３４％）ので、一回の試験ではＡＭＩの危険性を除くのに用いることはできない。さらに、血栓溶解治療を開始する前にＣＫ−ＭＢの結果を得るのでは遅すぎる。旧来の２４時間ＣＫ−ＭＢサンプリングを、６時間でできる２、３の非常に早い測定に代えることが示唆されている（アップルら、クリン・ケム（Clin.Chem.３７：９０９、１９９１）が、症状の発現時間と血清ＣＫ−ＭＢの発現が臨床的に有意となる時間の間隔は２.８から１５.１時間の間で変化する（アーウィンら、アーク・インターン・メド１４０：３２９−３３４、１９８０）。したがって、実際はＡＭＩの患者であっても、症状発生後の比較的早い時期に測定したＣＫ −ＭＢレベルがネガティブである場合もある。ＣＫ−ＭＢに代わる迅速な、そして感受性の高いアッセイへの要望が高まっている。多くの代わりとなるアッセイが報告されており、例えばＣＫ異性体（プエロら、クリン・ケム３５：１４５２−１４５５、１９８９）、ミオグロブリン（ドレクセルら、アム・ハート・ジェイ(Am.Heart J.)１０５：６４２−６５０、１９８３）およびトロポニン（troponin）イソ酵素（カトゥースら、ジェイ・モル・セル・カルディオール２１：１３４９−１３５３、１９８９）を用いる方法がある。これらのアッセイはまた心筋ダメージの血清マーカーの出現に基づくものでもある。ＣＫ−ＭＢアッセイと同様、これらのアッセイは確実に読み取るためには開始時および約２４時間後に行わなくてはならない。加えて、アッセイの結果は少なくとも１時間のターンアラウンンド時間を有する。ＵＡＰおよびＡＭＩに必要とされる処置方法は非常に異なっているため、ＡＭＩの早期診断は救急室における手当における重要な到達目標でもある。血栓溶解治療は、心筋梗塞の４から６時間以内に始める場合にはＡＭＩに有効な治療法である。これはＵＡＰには有効ではない。さらに、血栓溶解治療は危険な副作用、例えば出血を伴う場合がある。ＷＨＯ基準が非特異的であり、一時的な心筋の虚血か心筋の壊死かの判断ができないことは明らかである。我々の研究により急性心筋壊死の疑いで入院した患者のうちの、たった３０％しかその後にＡＭＩと診断されていないことが明らかとなった(例えばプエロら、サーキュレーション、８２：７５９−７６４(１９９０))。加えて、ＡＭＩが絡む死亡のうちの５０％以上は冠動脈虚血の発症後最初２時間以内に起こっている（アップル、F.S.,A.J.C.P.９７：２１７−２１６、１９９０）。この短い時間枠ではＡＭＩのＣＫ−ＭＢアッセイによる診断に依存できないことは確かである。最後に、医師が心筋梗塞の診断を誤ることは非常に多いという発見（リーら、アン・イント・メド、１０５：２２１−２３３）は、当業者の現在の状況がいまだに非常に不十分な状態であるということを強調するものである。したがって、虚血性心疾患を示唆する症状を示す患者のうちからＡＭＩ患者を同定するための迅速で正確な方法に対する要求は強いものとなっている。本発明は急性心筋梗塞を出現時または少なくともその症状の発現時において診断することを容易にする方法および手段を提供する。本発明は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の直後には、循環レベルの単球血小板結合体の有意な上昇が認められるという発見に基づくものである。本明細書および請求の範囲において「単球−血小板結合体」もしくは「ＭＰ−Ｃ」という語は１個または複数個の血小板が付着した単球を意味する。発現から２４及び４８時間後の間、血小板−単球結合体はベースラインに戻る。したがって、本発明の方法はこの時間の間に行わなくてはならない。驚くべきことに、血小板−単球結合体のレベルは安定または不安定狭心症の患者において、または重篤な外傷もしくは感染の後には上昇しない。すなわち、本発明によれば、ＡＭＩを他の症状から区別することができ、患者に対して適当な治療を行うことができる。詳しくは、本発明は患者の急性心筋梗塞の発生の検出方法であって、患者の血液試料を採取し、該試料から単球−血小板結合体を定量する方法に関する。加えて、本発明は患者の急性心筋梗塞診断用テストキットであって、単球−血小板結合体の定量のための手段を含むものを提供する。さらに、本発明は患者の急性心筋梗塞診断用テストキットであって、白血球に対する特異性を有し、レポーター分子へ結合している第１の抗体および血小板に対して特異性を有し、レポーター分子へ結合している第２の抗体を含有している容器と、先に定量しておいた固定化剤と抗凝固剤を含有する減圧栓を有するバイアルとを装着するよう区分されているものを提供する。さらに、本発明は患者の急性心筋梗塞診断用テストキットであって、単球−血小板結合体を直接計数するものを提供するが、この態様のキットには血液試料を集めるための固定化剤および抗凝血剤を含有する真空栓をした試験管を含む。さらに、本発明は患者の急性心筋梗塞診断用テストキットであって、ａ）血液試料を集めるための固定化剤と抗凝固剤を含有する減圧栓を有するチューブ、ｂ）白血球および血小板に対する、標識した抗体類、およびｃ）レポーター分子検出系を含むものを提供する。さらに、本発明は患者の急性心筋梗塞診断用テストキットであって、ａ）血液試料を集めるための固定化剤と抗凝固剤を含有する減圧栓を有するチューブ、ｂ）ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４５抗体およびビオチン化抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＣＤ４１ａ）抗体；およびｃ）ＰＥ−アビジンを含むものを提供する。本発明は患者の末梢血を採取し、単球−血小板結合体（ＭＰ−Ｃ）のレベルを定量することを含む方法により達成される。本発明の方法によって、通常は循環単球の約５％が１または複数の血小板と結合体を形成していることを測定した。５％のＭＰ−Ｃレベルに対して有意に高いＭＰ−Ｃレベル、例えば平均から２標準偏差離れている場合をＡＭＩの発生のシグナルとし得る。約１０％またはそれ以上のＭＰ−Ｃレベルの場合が、ＡＭＩの指標となると考えられる。ＭＰ−Ｃの定量は従来から知られているどのような方法を用いてもよい。例えば、ＭＰ−Ｃの定量を顕微鏡下で接着細胞を数えるマニュアル法で行うことも可能である。ＭＰ−Ｃレベルはまた、フローサイトメーターによって測定してもよい。単球に接着する血小板により細胞の比体積が変わるため、単球−血小板結合体を電気抵抗パルスサイジング法（クールターサイジング：細胞計測装置）を用いるかまたは単色光散乱を用いて、例えばセルカウンターによって、測定してもよい。本発明にはまた、ＭＰ−Ｃの検出および定量のために必要な器具および試薬を提供する数多くの様々なＡＭＩ診断キットも含まれる。診断用キットを使用するに当たって用いられる方法は単球−血小板結合体を検出および定量するための従来の方法である。白血球および血小板用の抗体、例えば抗-ＣＤ４５および抗-ＣＤ４１ａで標識した固定血液試料についてのフローサイトメトリーまたは単球集団中の相対体積変化の測定のような更に最近の方法論も種々のＡＭＩ診断キットを用いて検討されている。本発明の開示により、患者をＡＭＩとして診断することができまたは除外することができるので、ＡＭＩを安定型および不安定型の狭心症、強度の外傷または感染のような他の症状と区別することができる。ＡＭＩとしては除外されるかまたはＡＭＩとして診断されてしまえば、適当な処置を施すことが可能である。第１図は、ひとりの代表的ＡＭＩ患者からの投与直後のフローサイトメトリーヒストグラムデータである。単球-血小板結合体の百分率が表示されている。第１図ｂはストレプトキナーゼ投与後２時間の時点での同じ患者からのフローサイトメトリーヒストグラムデータである。第１図ｃは同じ患者からの４日後のフローサイトメトリーヒストグラムデータである。第２図は白血球に関する前方散乱光（寸法パラメータ（Ｙ軸））対側方散乱光（複雑性パラメータ（Ｘ軸））のプロットであり、リンパ球（Ｌ）、単球（Ｍ）および顆粒体（ＰＭＮ）の間で明瞭な輪郭が形成されることが示されている。第３図ａは、非特異的な免疫染色用としてコントロールに使用される同型のコントロール抗体からの蛍光を示すヒストグラムである。これは陽性血小板のしきい値を決定するために用いられる。第３図ｂは、投与の結果、ＡＭＩ患者から収集した血液の単球領域にゲートをかけたＣＤ４１ａ（抗-ＧＰIIｂ／IIIａ）の蛍光を示すヒストグラムである。コントロールの蛍光の最大方向（ｃｈａｎｎｅｌ）よりも強い蛍光を示す陽性血小板の百分率が記録される。第４図は経皮的冠動脈圧腔拡張術（ＰＣＴＡ）の前後に於ける単球-血小板結合体の百分率を示すグラフである。第５図は虚血性心疾患（安定型および不安定型の可逆的虚血狭心症およびＡＭＩ）のある患者のｃＩＣＡＭ−１の水準を示すグラフである。第６図は経皮的冠動脈圧腔拡張術前後の患者のｃＩＣＡＭ−１水準のグラフである。本発明によれば、ＡＭＩを暗示する兆候のある患者は、単球-血小板結合体水準を測定するためにその血液が採取される。ＡＭＩの存在は患者の末梢の血液試料中のＭＰ−Ｃの水準をＡＭＩに関連する場合のＭＰ−Ｃの既知水準と比較して決定される。血小板に結合しＡＭＩに関連する単球の水準は一般的には５０％台である。コントロールの血液試料中の血小板に結合した単球の百分率は大略ほんの５％に過ぎないから、５％を越える有意のＭＰ−Ｃ水準、例えばコントロールの平均値からの標準偏差の２倍のＭＰ−Ｃ水準であれば、それはＡＭＩの存在を示していよう。１０％またはそれ以上の水準はＡＭＩインデックスと考えられよう。ＭＰ−Ｃ結合体の水準が測定されれば、適切な処置を合理的に決定することができる。本発明によれば、ＡＭＩの臨床的な兆候を有する患者から単球-血小板結合体の数値が読み取られる。ＡＭＩの初期の兆候としては、左腕から指の刺痛感覚をともなう左手までに広がる狭心痛が含まれる。また本発明によれば、例えば半意識的または無意識的な患者にＡＭＩの可能性がある場合は常に単球-血小板結合体の数値が読み取られる。好ましい実施態様では、血液試料は一般には腕から静脈穿刺によって採取される。血液は固定液と抗凝血剤の入った試験管に集められる。固定液と抗凝血剤の組み合わせは通常臨床実験室で用いられるもののどれを用いてもよい。使用することのできる固定液の例は緩衝液処理した１０％のホルマリン／ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはパラホルムアルデヒドである。使用することのできる抗凝血剤はクエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、ヘパリンおよびヘパリン様化合物である。固定液および抗凝血剤は静脈穿刺による血小板の活性化の結果として生じるかもしれない疑似単球-血小板結合体の形成を防止するのに役立つ。もうひとつの実施態様では、採血試験管には、パラホルムアルデヒドの最終濃度が１〜５％の間になるように、リン酸塩により緩衝した塩溶液中に２％のパラホルムアルデヒドと３.８％のクエン酸ナトリウムが含まれている。試料は６時間以上固定液中に留まらせてはいけない。１０分もあれば固定時間として十分である。ＭＰ−Ｃを直接人が計数する場合は、数滴の固定した血液をスライドガラスに載せ、標準の方法で染色し、カバーガラスをかぶせる。単球-血小板結合体の数は少なくとも２００個の単球を計数し、次いで１個またはそれ以上の血小板が結合した単球の百分率を報告することにより決定される。この方法はフローサイトメトリーまたは細胞寸法測定装置、例えばセルカウンターが使用できない場合に用いられる。単球-血小板結合体を測定するもうひとつの方法は細胞表面積当たりの体積の変化を検出することである。本発明のこの実施態様ではＭＰ−Ｃと一致した体積を有する細胞固着物の百分率が記録される。ＭＰ−Ｃの相対数が通常の範囲から外れるとＡＭＩが示唆される。ＭＰ−Ｃを読み取るもうひとつの好ましい実施態様はフローサイトメトリーアッセイによるものである。白血球を対象とした飽和濃度の抗体および血小板を対象とした飽和濃度の抗体を適当な同型のコントロール試薬とともに用いる。白血球を対象とした抗体の例としてＣＤ１３、ＣＤ１４、およびＣＤ４５が含まれる。血小板を対象とした抗体の例としてはＣＤ４１ａ、ＣＤ４１ｂおよびＣＤ４２ａが含まれる。適切な標識を付けた同型コントロールの例としては同じ動物からであるが、無関係の抗原に対して調製されたＩｇＧ１抗体類が挙げられる。好ましい実施態様で用いられる抗体は「レポータ分子」に結合する。本発明の明細書およびクレームで用いる「レポータ分子」という言葉は、その化学的特性により、抗原に結合した抗体を検出することができる分析同定の可能なシグナルを発する分子のことを言う。検出は定性的であっても、定量的であってもよい。一般的なレポータ分子は酵素類、蛍光体類、または放射性ヌクレオチド含有分子である。本発明の好ましい実施態様では、パラホルムアルデヒド固定血液の少量試料を２個の別の試験管に入れ、等張性塩緩衝液で２回洗浄する。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合した飽和濃度の抗-ＣＤ４５を両方の試験管に加える。ビオチン付加抗-ＧＰIIｂ／IIIａ（ＣＤ４１ａ）をひとつの試験管に添加し、他方には適当に標識した同型のコントロールを加えた。適当に標識した同型のコントロールの例としては同じ動物からであるが、無関係の抗原に対して調製されたＩｇＧ１抗体類が挙げられる。次ぎに試験管は４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、そしてフローサイトメトリーによる分析用として、ＰＢＳのような等張性緩衝液２００μｌ中に再分散する。別の実施態様では、本発明はまたＡＭＩ検出用の診断キットを目的としている。キットには患者の血液試料中に存在する単球-血小板を検出し定量する装置と試薬が含まれる。フローサイトメトリーまたは細胞カウンターとともに使用されるキットは白血球に対する特異性を有する抗体を含むことができるようにした第１の容器を受け入れるように区分されている。第２の容器は血小板に特異性を有しまたレポーター分子に結合した抗体を含むように適合化される。予備測定した固定液および抗凝血剤を含む減圧栓付きのガラスびんも用意されている。フローサイトメトリーとともに使用するための好ましい診断試験キットはＦＩＴＣを結合した抗-ＣＤ４５およびビオチン付加抗-ＧＰIIｂ／IIIａ（ＣＤ４１ａ）を含むように適合化した第１の容器およびアビジン結合したフィコエリトリン標識（ＰＥアビジン）を含むように適合化した第２の容器を受け入れるように区分される。予備測定した固定液および抗凝血剤を含む減圧栓付きガラス容器も用意される。本発明は更に以下の実施例によって説明するが、実施例は発明の範囲を限定するものではない。実施例１冠動脈ダメージおよびＡＭＩの指標としての単球−血小板結合体全血中の血小板が結合した白血球のサブセットの割合をフローサイトメトリー法により調べた。２８人の冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者から採取した４１の血液試料と４つのコントロール血液を得た。７ｍｌの血液をバキュテーナー(Vactainer )内へ採取した。試料はすぐに２％パラホルムアルデヒド、３.８％クエン酸ナトリウムのＰＢＳ溶液で固定化し、パラホルムアルデヒドの終濃度が１％であるフローサイトメトリー用溶液を調製した。フローサイトメトリーはリンダーらの方法の変法を用いて行った。パラホルムアルデヒドで固定化した各末梢血液の１００μｌをそれぞれ２本の試験管へ投入し、ＰＢＳで２回洗浄した。飽和濃度のＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４（ベクトン−デッキンソン・イムノサイトメトリー・システムス、カリホルニア州サンホセ）を両方の試験管へ添加した。ビオチン化抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＣＤ４１ａ；エーエムエーシー、インコーポレイテッド、メリーランド州ウエストブロック）を一方の試験管へ投入し、ビオチン化抗ＩｇＧ１（同型コントロール）をもう一方へ投入した。試験管を１５分間４℃にてインキュベートし、その後ＰＢＳにて洗浄、再懸濁した。次いで試料に飽和濃度のファイコエリスリン−アビジン（ＰＥ −アビジン）（ベクトン・ディッキンソン）を加えて４℃で１５分間インキュベートし、２００μｌのＰＢＳで洗浄および再懸濁してフローサイトメトリー分析に用いた。試料はファックスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）フローサイトメーター（ベクトン −ディッキンソン）で分析し、リストモードでデータを蓄積した。この装置のＦＬ１（ＦＩＴＣ蛍光）に対する閾値設定した。この調節はＣＤ４５−ＦＩＴＣの信号（全血細胞）を識別する最低レベルを定めるものであり、装置は設定した閾値を越えない信号を検知しなくなる。この操作は試料中に存在し、測定しなくてもよい赤血球の影響を除くための簡便な方法である。前方および側方散乱光の組み合わせを用い、単球およびＰＭＮの領域を電子ゲートをかけるために定めることができる（図２）。ゲートをかけた領域内に含まれるものを、ＣＤ４１−ＰＥが存在している（「赤色蛍光」）として分析する。同型コントロール抗体を含む試験管を血小板陽性蛍光（ＣＤ４１ａ−ＰＥ）の閾値（９８％の信号が閾値以下である）を設定するのに用いた。血小板陽性結合体の存在は単球およびＰＭＮポピュレーションとして記録される（図３）。予備研究により、このフローサイトメトリーアッセイは１個のみの血小板が結合している白血球を検出できることが分かっている（リンダーら、ブラッド７８：１７３０−１７３７、１９９１）。フローサイトメトリーアッセイを用いて血小板が結合している白血球サブセットの全血中の割合を調べた。血液を２８人の冠動脈疾患の患者およびコントロールの８人から採取して調べた。表１に示したように、単球−血小板結合体(Ｍ− ＰＣ)はＡＭＩの初期段階においてコントロールに対し、数倍の増加が認められた(ｐ＜０.０５)。Ｍ−ＰＣの下図はＡＭＩ後４８時間以内にベースラインまで戻った。安定型または不安定狭心症の患者ではＭ−ＰＣの上昇が認められなかった。不安定狭心症（ＵＡＰ）に起因する症状および病理はＡＭＩのものと類似しているにもかかわらず、ＵＡＰの患者においてＭ−ＰＣレベルが正常範囲であることは特記すべきことである。ＵＡＰは通常、重篤度が増すか、または頻度が増えたか、またはその両方である狭心痛のパターンの変化によって検出される。これらの２つの病態の唯一の相違は、ＡＭＩにおいては血栓が永続性であるのに対し、ＵＡＰにおいては血栓が自発的に消滅することのみである。ＵＡＰとＡＭＩのＭ−ＰＣのデータは、比較的高度の血小板活性化がＡＭＩでは生じており、ＵＡＰでは末梢血中では検出できない一過性の活性化のみが生じるということを示している。図１はフローサイトメトリーにより解析した、典型的なＡＭＩ患者のヒストグラムデータである。Ｍ−ＰＣの数は救急室への到着時に高く（Ａ）、そしてストレプトキナーゼ投与２時間後にも高い（Ｂ）、しかしながら、この値は４日後にはベースラインに戻っていた（Ｃ）。ヒストグラムは単球フラクションを囲い込んで作成し、ＣＤ４１ａ（血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）の蛍光を分析した。カーソルの位置は同型のコントロールの分析により定めた。ＣＤ４陽性群の割合は、少なくとも１個の血小板が結合している単球の割合を示す。（リンダーら、ブラッド７８：１７３０−１７３７、１９９１）。ＡＭＩ患者におけるＭ−ＰＣの顕著な増加は、血小板および単球活性化の強さが他の虚血性心疾患の患者のものよりはるかに大きいことを示す。実施例２経皮的冠動脈内腔拡張術（ＰＣＴＡ）における単球−血小板レベルの研究冠動脈内皮細胞のダメージと血小板の活性化の間の関係を調べるため、５人の患者の経皮的冠動脈内腔拡張術（ＰＣＴＡ）の前および１０分後のＭ−ＰＣの割合をフローサイトメトリーにて実施例１と同様にして測定した。図４に示したように、ＰＣＴＡ直後の単球−血小板結合体の割合に有意な増加が認められた（ｐ＜０.０５）。ＰＴＣＡ前のＭ−ＰＣ値は正常範囲（５.６±１.６９）であった。ＰＴＣＡの１０分後にはしかしながら、１７.２±５.３４％のＭ−ＰＣが検出された。Ｍ−ＰＣはＰＴＣＡの１時間後にはベースラインまで戻っていた（表１）。ＰＴＣＡ後のＭ−ＰＣ結合体の末梢血中の相対数は、ＡＭＩの患者に認められたレベルより低かった。これらの所見は、内皮細胞の傷害、血小板の活性化およびＭ−ＰＣの形成の程度は、バルーンに誘導された血管の傷害後に生じる場合の方が、ＡＭＩへ結び付く自然発生の冠動脈血栓症の場合より低いことを示唆する。これらのデータから、末梢静脈血中のＭ−ＰＣレベルをＡＭＩの早期発見のために用い得ること、およびＭ−ＰＣレベルがベースラインを越えて増加する場合、冠動脈内皮細胞のダメージがあること、および血小板が活性化されていることが予測できる。Ｍ−ＰＣレベルが不安定狭心症において高くないという事実は、内皮細胞のダメージの程度および危険度もしくは血栓の安定性を特に考慮しなくてはならないということを示唆する。Ｍ−ＰＣ結合体は末梢血中、ＡＭＩ後およそ２４時間乃至４８時間、およびＰＣＴＡ後およそ１時間持続する。ＰＣＴＡを受けた患者におけるＭ−ＰＣレベルの僅かな一時的上昇は、血小板 −白血球活性化の程度がＡＭＩにおける場合の程度と同一ではないことを示唆する。Ｍ−ＰＣは従って、ＡＭＩの診断のための重要な道具であり、さらに冠動脈内皮細胞の血管の傷害および血小板活性化のインデックスとなることが判明した。実施例３冠動脈内皮細胞のダメージおよびＡＭＩの指標としての循環ＩＣＡＭ−１数多くの動物実験において、好中球が心筋虚血性疾患および心筋梗塞において重要な役割を担っていることが分かっている。初期症状の検出において、この好中球が診断および治療の標的となり得ることを予測して、白血球−内皮細胞接着を媒介する細胞内接着分子（ＩＣＡＭ−１）を用いた研究を行った。ＩＣＡＭ−１が閉塞／再循環の後に内皮細胞上で産生されることが示唆されている。接着分子の発散は、接着を調節、制御するための強力な方法であるので、血清内にて循環している接着分子は冠動脈内皮細胞のダメージおよびＡＭＩの早期標識となり得ると考えられる。８７人の虚血性心臓疾患患者からの血清および１６人からのコントロール血清中の、循環ＩＣＡＭ−１（ｃＩＣＡＭ−１）の存在の有無を酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって調べた。アッセイは市販品の説明書に従って行った。コントロールに対するｃＩＣＡＭ−１のレベルの有意な増加が安定型狭心症の患者（Ｎ＝３０；ｐ＜０.０５）、不安定狭心症の患者（Ｎ＝３９；ｐ＜０.０５）およびＡＭＩの患者（Ｎ−１８；ｐ＜０.０５）において認められた（図５）。これらの結果はｃＩＣＡＭ−１がＡＭＩの標識としては有用でないことを示す。ｃＩＣＡＭ−１と冠動脈内皮細胞のダメージとの相関関係を、経皮的冠動脈内腔拡張術(ＰＴＣＡ)の前および１０分後の患者のｃＩＣＡＭ−１レベルを調べることによって調べた。虚血性心臓疾患において認められるｃＩＣＡＭ−１レベルの増加が、直接冠動脈の内皮細胞のダメージと結び付いているならば、ＰＴＣＡによってｃＩＣＡＭ−１のベースレベルからの増加が誘導されるはずである。しかしながら、ｃＩＣＡＭ−１レベルの有意な増加はＰＴＣＡの後には認められなかった(図６)。これらのデータは、虚血性心臓疾患における虚血性内皮細胞におけるｃＩＣＡＭ−１レベルの増加が活性化の定常状態であることを示唆する。実施例４スライドグラス上の試料を顕微鏡で見てマニュアルで計数する、単球−血小板結合体レベルの測定方法パラホルムアルデヒドにて固定化した血液試料から血液のスメアを調製した。血液試料の小滴を顕微鏡用スライド上に乗せ、乾燥させ、メタノールで固定化した。このスライドグラスをライトの染色液または他のタイプのロマノフスキー染色にて染色し、カバーグラスをかけた。少なくとも２００個の単球が形態的に同定でき、１または複数の血小板が付着している単球を記録した。ＭＰ−Ｃレベルが約１０％またはそれ以上の場合をＡＭＩの指標として用いる。実施例５電気抵抗パルスサイジングまたは散乱光による単球−血小板結合体レベルの測定最初の７ｍｌの固定化血液試料から分取した少量の試料をセルカウンター、例えば通常のフローサイトメーターまたは電子サイジング機能を有するフローサイトメーターへ導いた。装置は細胞の接着割合を同定するようプログラムされており、これはＭＰ−Ｃに相応する。１０％またはそれ以上のＭＰ−ＣレベルをＡＭＩの指標として用いた。実施例６ＡＭＩ診断のためのフローサイトメトリーを用いる診断テストキットＭＰ−Ｃレベルをフローサイトメトリーアッセイを利用して測定するテストキットには、先に量を測定しておいたパラホルムアルデヒドとクエン酸ナトリウムを含有する減圧栓つきバイアルを含む。ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４５およびビオチン付加抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＣＤ４１ａ）を他のバイアルもしくは試験管へ入れたもの、アビジン結合ファイコエリスリン標識を他のバイアルもしくは試験管へ入れたものも含む。陽性ＡＭＩ血液試料および陰性ＡＭＩ血液試料も同時に提供する。試験は実施例１の手法に従って行う。実施例７見かけ上の単球細胞体積の増加を検出するための、診断テストキットＭＰ−Ｃレベルを測定する第３のテストキットには、減圧栓つき試験管に固定液および抗凝固剤を予め測定された量含有するものを含む。陽性ＡＭＩ血液試料および陰性ＡＭＩ血液試料もまたキットに含まれる。上述の実施例は本発明の説明のためのものであり、本発明の範囲を定めるものではないことが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/49 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/49 Ｘ 33/53 0276−2Ｊ 33/53 Ｋ 0276−2ＪＬ 0276−2ＪＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．患者から血液試料を採取し、該試料内の単球−血小板結合体を定量することを含む、患者の急性心筋梗塞症の検出方法。２．該定量を、スライドガラス上の試料を顕微鏡で観察して単球−血小板結合体の数をマニュアルで計測することによって行う、第１項記載の検出方法。３．該定量を、フローサイトメトリーにより行う、第１項記載の検出方法。４．該定量を、セルカウンターを用いて行う、第１項記載の検出方法。５．該定量を、電気抵抗パルスサイジング様式のセルカウンターを用いて行う、第１項記載の検出方法。６．該定量を、散乱光様式のセルカウンターを用いて行う、第１項記載の検出方法。７．単球−血小板結合体定量のための手段を含む、患者の急性心筋梗塞症の検出のための診断用テストキット。８．白血球細胞に対する特異性を有し、レポーター分子が結合している第１抗体と、血小板に対する特異性を有し、レポーター分子が結合している第２抗体を含有するための容器を収め、そして予め計量した固定液および抗凝固剤を含有する減圧栓付バイアルを収めるよう、区分分けされている、患者における急性心筋梗塞発生の検出のための診断用テストキット。９．固定液および抗凝固剤を含有する減圧栓付きの血液試料採取用試験管を有する、単球−血小板結合体の数を直接計数することによって患者における急性心筋梗塞発生の検出をするための、診断用テストキット。１０．ａ）固定液および抗凝固剤を含有する減圧栓付きの血液試料採取用試験管、ｂ）白血球細胞および血小板に対する標識した抗体、ｃ）レポーター分子検出系を有する、患者における急性心筋梗塞発生の検出をするための、診断用テストキット。１１．ａ）固定液および抗凝固剤を含有する減圧栓付きの血液試料採取用試験管、ｂ）ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４５およびビオチン化抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＣＤ４１ａ）：および、ｃ）ＰＥ−アビジンを含有する、患者における急性心筋梗塞発生の検出をするための、診断用テストキット。１２．さらにａ）ＡＭＩ陽性血液試料；およびｂ）ＡＭＩ陰性血液試料を有する、第１１項記載のテストキット。１３．さらに、ａ）血液試料を２％パラホルムアルデヒドおよび３.８％のクエン酸ナトリウム内で即座に固定化する、ｂ）固定化血液試料をＦＩＴＣ−抗−Ｃ４５およびビオチン化抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩ（ＣＤ４１ａ）と共にインキュベートする、ｃ）血液試料を飽和濃度のＰＥ−アビジンにてインキュベートする、ｄ）反応させた血液試料を洗浄し、再懸濁する；およびｅ）単球−血小板結合体を定量する工程を含む、第１項記載の方法。１４．工程ｅ）がフローサイトメトリーにより行われる、第１３項記載の方法。１５．工程ｅ）が見かけの細胞体積を測定する装置によって行われる、第１３項記載の方法。１６．工程ｅ）がクールター・カウンターを用いて行われる、第１３項記載の方法。１７．工程ｅ）がテクニコンＨ１を用いて行われる、第１３項記載の方法。１８．工程ｅ）がテクニコンＨ２を用いて行われる、第１３項記載の方法。