JPH08510994A - 黒色腫治療用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ａ）水溶性または水分散性成分と、（ｂ）乳化剤成分と、（ｃ）好適担体媒質中の水不溶性カロチノイド成分との混合物を含む、注射または静脈内投与による黒色腫の治療薬。

Description

【発明の詳細な説明】 黒色腫治療用薬剤 発明の分野 本発明は黒色腫治療用の薬剤および黒色腫の治療法に係る。 発明の背景 黒色腫は一般に皮膚を日光に暴露することにより生じる。色の白い人、特にほ くろのある人でリスクが最も高い。 黒色腫は正常な皮膚細胞であるメラノサイトが変化して起こる。このメラノサ イトは我々が日焼けとして認識する褐色色素であるメラニンを産生する。ほくろ やそばかすはメラノサイトの多い皮膚の部分から生じる。 メラノサイトに対する光の影響は一方向で、光によりメラノサイトが変化し、 異なった増殖や分裂を行い、黒色腫を引き起こすことがある。黒色腫は悪性で、 体の他の部分に広がることがある。拡散しない黒色腫を良性という。 黒色腫は通常、露出された皮膚に生じるが、口や腸のような場所から始まるこ ともある。 黒色腫は大きくなり、体の他の部分に広がり、侵入する前に外科的に切除する 必要がある。黒色腫が内臓に広がると、切除や治療がさらに困難になり、化学療 法や放射線療法が必要となる。 カロチノイド、特にβ−カロチンは乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、頸管癌、 心疾患、心筋梗塞のリスクを低下させ、あざ様変性を遅延させうるとの仮説が立 てられている。この点に関して、哺乳類では、β−カロチンはビタミンＡおよび ビタミンＡアナローグまたはレチノイドに変換されるとの仮説がある（Ｍｏｏｎ ＲＣ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉ ｄｓ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ ａｓ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ、Ｊ Ｎｕｔｒ １１９：１２７−１３４ 、１９８９参照）。このプロビタミンＡ活性および酸化による損傷の予防能によ り 、カロチノイド、特にβ−カロチンが化学予防的研究に興味深いものとなってい る。例えば、細胞内の正常な代謝の副生成物である遊離基を抑えるために特に抗 酸化剤が使用されている。 β−カロチンは赤芽球増殖性プロトポルフィリア（ＥＰＰ）の治療にも使用さ れている。ＥＰＰはポルフィリン化合物の代謝異常を引き起こす遺伝病であり、 日光に曝されると皮膚が急速にひぶくれになる。 カロチノイド組成物をヒトに使用することを考える場合、カロチノイドの性質 が当面の問題となる。 カロチノイドは親油性であり、従って、有用量が水に溶けない。カロチノイド は低密度リポ蛋白として血流により運搬されると考えられている。 カロチノイドを体内に導入する現在の主な方法は経口投与である。しかし、こ の方法では、ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｃａｎａｌでカロチノイドが十分吸収され ず、得られる血中濃度が限定されることから、満足な結果が得られないことが多 い。さらに、血流中または特定の臓器で必要なカロチノイド濃度が得られるのに 非常に時間がかかることがある。また、人によってはカロチノイド、特にβ−カ ロチンの吸収が悪いために、必要な濃度が得られないことがある。β−カロチン 吸収能には約１０倍の個人差がある。５００以上のカロチノイドが単離されてい るが、血流中で認められることが判っているものはこの内の１５種程しかない。 医師は経口投与より注射または静脈点滴で化合物を投与することを必要とする ことが多い。しかし、カロチノイド組成物は本質的に水に不溶であることから、 注射でまたは静脈内に投与することは非常に困難である。この化合物は体内の細 胞が利用できるように水性基剤に分散する必要がある。この点に関して、基剤は 例えば血液またはリンパと相容性でなければならず、この物質は生物学的に無菌 の形態で作製しなければならない。この基剤自体はヒトの細胞に対して毒性であ ってはならない。 今日までに、β−カロチンを可溶化する溶媒、例えばテトラヒドロフラン、ブ タノール、クロロホルム、ヘキサン、ジメチルスルホキシド、エタノールを使用 して、またはリポソームミセル中に入れて、β−カロチンの正常細胞または形質 転換細胞に対する作用を検討するインビトロの研究が多数行われている。これま でのリポソーム製剤は細胞株培養物で毒性が示され、用途が限定されていた（Ｂ ｅｒｔｒａｍ ＪＳ，Ｐｕｎｇ Ａ，Ｃｈｕｒｌｅｙ Ｍ他：Ｄｉｖｅｒｓｅ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ 、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １２：６７１−６７８、１９９１；Ｈａｚｕ ｋａ ＭＢ，Ｐｒａｓａｄ−Ｅｄｗａｒｄｓ Ｊ，Ｎｅｗｍａｎ Ｆ他：Ｂｅｔ ａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｆ ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ ９：１４３−１４９， １９９０；Ｓｃｈｕｌｔｚ ＴＤ，Ｃｈｅｗ ＢＰ，Ｓｅａｍａｎ ＷＲ他：Ｉ ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｉｅｎｏ ｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ、Ｃａｎｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６３：１２５−１３３、１９９２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＪＬ，Ｓｈｋｌａｒ Ｇ ：Ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃ ａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ ａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｊ Ｏｒａｌ Ｍ ａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ ５０：３６７−３７３、１９９２；Ｓｃｈｗａ ｒｔｚ ＪＬ，Ｔａｎａｋａ Ｊ，Ｋｈａｎｄｅｋａｒ Ｖ他：Ｂｅｔａ−Ｃａ ｒｏｔｅｎｅ ａｎｄ／ｏｒ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ａｓ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｓ ｏｆ ａｌＫｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ＳＣＣ−２５ ｈｕｍ ａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ、Ｃａｎｃ Ｃｈｅ ｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２９：２０７−２１３、１９９２；Ｚｈａ ｎｇ Ｌ−Ｘ，Ｃｏｏｎｅｙ ＲＶ，Ｂｅｒｔｒａｍ ＪＳ：Ｃａｒｏｔｅｎｏ ｉｄｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｇａｐ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａ ｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２ ｃｅｌｌｓ： ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔ ｏ ｔｈｅｉｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ａｃｔｉｏ ｎ、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １２：２１０９−２１１４、１９９１；お よびＺｈａｎｇ Ｌ−Ｘ，Ｃｏｏｎｅｙ ＲＶ，Ｂｅｒｔｒａｍ ＪＳ：Ｃａｒ ｏｔｅｎｏｉｄｓ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃｏｎｎｅｘｉｎ ４３ ｇｅｎ ｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｐｒ ｏｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｏｒ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ 、Ｃａｎｃ Ｒｅｓ ５２：５７０７−５７１２、１９９２参照）。これらの溶 媒は毒性作用を有し、この作用は用量依存性であることが知られている。これら の溶媒は静脈内投与用製剤または注射可能な製剤を調製するためには、ヒトの血 液およびリンパに適合性を持たない。 従って、ヒトやその他の動物に受容され、黒色腫の治療に効果を示しうるカロ チノイド組成物を開発する研究が行われた。 発明の説明 本発明の１つの実施態様では、 （ａ）水溶性または水分散性成分と、 （ｂ）乳化剤成分と、 （ｃ）好適な担体媒質中の水不溶性カロチノイド成分と の混合物を含む黒色腫治療用薬剤を提供する。好ましくは、水溶性または水分散 性成分は３０重量％から９０重量％の範囲である。 本発明の別な好適実施態様では、水溶性または水分散性成分は、糖アルコール 、糖、アミノ酸、水、ビタミン、血清または血漿、リンパ、緩衝液およびこれら の物質の組合せおよび重合体ならびに当業界でよく知られている注射可能物質、 例えば無機塩調製物およびデキストロース溶液またはこれらの成分の組合せから 選択される。 より好ましくは、糖アルコールはグリセロールであり、さらに好ましい実施態 様では、グリセロールは３０重量％から９０重量％の範囲である。 本発明の別の好適な形態では、乳化剤成分は０．２重量％から２０重量％、よ り好ましくは１．０重量％から１０重量％である。 本発明のさらに別の好適な実施態様では、乳化剤成分は、グリセリド（好まし くは、植物または動物起源のモノグリセリドおよびジグリセリドを含む）、ポリ グリセロールエステル、レシチンおよび他のリン脂質から選択される。より好ま しくは、グリセリドはグリセリルモノオレートである。 本発明の別の好適形態では、水不溶性カロチノイド成分はβ−カロチンである 。より好ましい形態では、水不溶性カロチノイド成分は、大豆油組成物中の主と して２重量％から５０重量％のβ−カロチンからなる。さらに好ましくは、β− カロチン濃度は主として２０重量％から４０重量％であり、最も好ましくは主と して３０重量％である。 好ましくは、β−カロチンはシス−β−カロチンと全トランス−β−カロチン の混合物である。一般に、β−カロチン中のシス−β−カロチン含量は５０％か ら９０％、より好ましくは７０％から８５％である。さらに好ましくは、β−カ ロチンは主として９−シス−β−カロチンであり、好ましくは６０％から９０％ の範囲である。さらに好ましい実施態様では、組成物中の活性カロチノイド成分 は０．１重量％から１０重量％、より好ましくは１重量％から５重量％である。 本発明のさらに別の好適実施態様では、水不溶性カロチノイド成分を担持する ために使用する担体媒質は、脂肪酸およびトリグリセリド脂質および非鹸化可能 な脂質調製物、オクタデカンを含むある種の好適な石油炭化水素およびこれらの 化合物の組合せからなる群から選択される。 本発明のさらに別な好適形態では、トリグリセリド脂質は、大豆、綿実および ひまわりを含む種油のような植物起源および魚および牛を含む動物起源の脂肪お よび／または油脂からなる群から選択される。より好ましくは、担体媒質は０． １重量％から４０重量％の範囲、より好ましくは１％から２０％の範囲である。 本発明の好適形態では、薬剤は直接血流中または黒色腫に導入するために希釈 し、より好ましくは、希釈溶液は、水性緩衝液、通常の静脈投与用調製物（等張 の食塩溶液または５％デキストロース溶液を含む）、血清およびインビボで細胞 に投与するための上記物質の組合せおよびインビトロで細胞に投与するための細 胞株培養用培地から選択される。 本発明の別の形態では、黒色腫の治療法を提供し、この方法は血流中または黒 色腫に上記治療薬の有効量を直接導入するステップを含む。好ましくは、有効量 は黒色腫細胞と接触する治療薬が０．１−１０．０μｇ／ｍｌ、より好ましくは ０．３−３．０μｇ／ｍｌとなる量である。 さらに好ましくは、治療薬を注射または静脈内投与により直接血流中に導入す る。さらに好ましくは、治療薬を黒色腫の部位に直接注射する。 本明細書で使用する「混合物」という用語はエマルジョン、溶液および結晶性 懸濁液を含む種々の物理的形態を含むものとする。 実施例 以下の実施例は黒色腫の治療におけるカロチノイド組成物の有効性を説明し、 これらの組成物が比較的毒性を持たないことを示す。 第１図は、ヒトの転移性黒色腫および新生児のメラノサイトにおけるＤＮＡ合 成に対する担体の作用を示すグラフである。要約すると、黒色腫細胞株ｃ８１− ４６ａおよびメラノサイトを、大豆油抽出物、テトラヒドロフランおよびジメチ ルスルホキシドとエタノールの３：１混合物と共に７２時間インキュベートした 。各データの点は対照と比較した６ウェルの平均±標準誤差である。 第２図は、ヒトの転移性黒色腫および新生児メラノサイトにおけるＤＮＡ合成 に対するβ−カロチンの作用を示すグラフである。要約すると、メラノサイト株 ：ｃ８３−２ｃ、ｃ８１−４６ｃ、ｃ８１−４６ａ、ｃ８１−６１およびメラノ サイト（ＭＣ）をβ−カロチンと共に７２時間インキュベートした。各データの 点は対照と比較した６ウェルの平均±標準誤差である。希釈剤（ＳＯＹ）濃度＝ ０．０５％。 第３図は、ヒトの転移性黒色腫および新生児メラノサイトの増殖に対するβ− カロチンの作用を示すグラフである。要約すると、メラノサイト株：ｃ８３−２ ｃ、ｃ８１−４６ｃ、ｃ８１−４６ａおよびメラノサイト（ＭＣ）をβ−カロチ ンと共に７２時間インキュベートし、生存率をトリパンブルー排除により評価し た。各データの点は対照と比較した３ウェルの平均士標準誤差である。希釈剤（ ＳＯＹ）濃度＝０．０５％。 第４図は、ヒトの腫瘍細胞株と正常細胞株におけるＤＮＡ合成に対するβ−カ ロチンの作用を示すグラフである。要約すると、Ａ４３１、類表皮癌；ＷｉＤｒ 、結腸線癌；ＷＩ−３８、胎児肺繊維芽細胞およびＬｕ−ＣＳＦ−１、肺線癌を β−カロチンと共に７２時間インキュベートした。各データの点は対照と比較し た６ウェルの平均±標準誤差である。希釈剤（ＳＯＹ）濃度＝０．０５％。 第５図は、ヒトの転移性黒色腫および新生児メラノサイトにおけるＤＮＡ合成 に対する９−シス−β−カロチンの作用を示すグラフである。要約すると、黒色 腫細胞株ｃ８１−４６ａおよびメラノサイトを９−シス−β−カロチンと共に７ ２時間インキュベートした。各データの点は対照と比較した６ウェルの平均±標 準誤差である。希釈剤（ＳＯＹ）濃度＝０．０５％。 第１、２、および４図は、ＤＮＡ合成活性の測定値である「トリチル標識チミ ジン取り込み率」を示す。 本発明に関係して実施した実験の詳細は下記の通りである。 材料 （ａ）細胞培養 メラノサイトの単離および培養に使用した方法はＥｉｓｉｎｇｅｒおよびＭａ ｒｋｏの開発した方法（Ｅｉｓｉｎｇｅｒ Ｍ，Ｍａｒｋｏ Ｏ：Ｓｅｌｅｃｔ ｉｖｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｍｅ ｌａｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏ ｆ ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ、Ｐｒ ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７９：２０１８−２０２２、１９８２参照 ）およびＨａｌａｂａｎおよびＡｌｆａｎｏの方法（Ｈａｌａｂａｎ Ｒ，Ａｌ ｆａｎｏ ＦＤ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂ ｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍ ａｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ２０：４５−４７、１９８ ４参照）を組み合わせたものである。 簡単には、包皮サンプルを新生児から採取し、メラノサイトを単離し、Ｔ−７ ５フラスコに入れた。Ｈａｌａｂａｎが記載（Ｈａｌａｂａｎ Ｒ，Ｇｈｏｓｈ Ｓ，Ｂａｉｒｄ Ａ：ｂＦＧＦ ｉｓ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｎａｔｕ ｒａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｍ ｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｂｉｏ ｌ ２３：４７−５２、１９８７参照）し、Ｋａｔｈが改変（Ｋａｔｈ Ｒ，Ｒ ｏｄｅｃｓｋ Ｕ，Ｍｅｎｓｓｅｎ ＨＤ他：Ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉ ｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ、Ａ ｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９：８６５−８７２、１９８７参照）したように 、一次新生児メラノサイトをＭＣＤＢ１５３培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉ）中で 培養した。ゲネチシン（２５０μｇ／ｍｌ）を培地に２日間添加して、繊維芽細 胞の汚染を抑えた。黒色腫細胞株（ｃ８１−４６ａ、ｃ８１−４６ｃ、ｃ８１− ６１、ｃ８３−２ｃ）を、５％ウシ胎児血清、５％ウシ新生児血清（Ｇｅｍｉｎ ｉ Ｓｃｉ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０ ．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を含むＦ−１０（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉ．） 中で培養した。使用した黒色腫細胞株の継代数は８未満で、メラノサイトについ ては５未満であった。黒色腫細胞株は既に特性化されていた（Ｂｒｅｇｍａｎ ＭＤ，Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍ ａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌ ｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ａｌ、Ｃａｎｃ Ｒｅｓ ４３：１６４２−１６４５、１９８３；Ｔｈｏｍｓｏｎ ＳＰ，Ｍｅ ｙｓｋｅｎｓ ＦＬ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｉｏｐｓｉｅｓ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｕ ｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４３ ：４６０６−４６１３、１９８２；およびＹｏｈｅｍ ＫＨ，Ｓｌｙｍｅｎ Ｄ Ｊ，Ｂｒｅｇｍａｎ ＭＤ他：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｕｔｉｌ ｉｚｉｎｇ ｔｗｏ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ：ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ａｎ ｄ ｓｏｆｔ ａｇａｒ、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃ ５７：６４−６９、１９８７参 照）。多数の他の腫瘍細胞株、すなわち、Ａ−４３１（ヒト類表皮癌）、ＷｉＤ ｒ（ヒト結腸線癌）、Ｗｌ−３８（正常なヒト胎児肺繊維芽細胞）（これらはす べてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎか ら入手した）およびＬｕ−ＣＳＦ−１（ヒト肺線癌）（カリフォルニア大学アー ヴィン校から提供された）もテストした。これらの４つの細胞株はＤＭＥＭ培地 （Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）、５％ウシ胎児血清、５％ウシ新生児血清、ペニシリ ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）中で培 養した。 （ｂ）化学物質 β−カロチンは藻Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａから単離し、全カロチ ノイドの８５−９０％であり、残部の半分はオキシカロチノイド（ルテインおよ びジアキサンチン）からなり、残りの半分はα−カロチンであった。γ−カロチ ンは高圧液体クロマトグラフィーで特性化されるように、通常は検出されない。 大豆油は大豆から単離した。β−カロチンおよび大豆油の結晶性懸濁液を作製し た。この得られた層を次に記載の組成物中に乳化した。次に、加熱または濾過に より滅菌した。細胞株でテストする前に、組成物の各バイアルを、各実験に使用 する新しいバイアルで凍結用バイアル（Ｃｏｓｔａｒ）にサブアリコートした。 全手順を通じて、β−カロチンは直接光から保護した。 入手可能な最高品質のテトラヒドロフランおよびエタノール（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）を使用した。ジメチルスルホキシドはＳｉｇｍａから購入した。 乳化したβ−カロチン組成物の詳細は下記の通りである。 重量％ （ｉ）β−カロチン ２．４％ および （ｉｉ）ＳＯＹ： 大豆油 ６．８％ グリセリルモノオレート ７．２％ グリセロール ６６．７％ 水 １６．９％ 上記組成物は以下の方法で調製できる。大豆油中のβ−カロチンの結晶性懸濁 液を加熱し、グリセリルモノオレートを添加する。高剪断混合し、６０−７０℃ で均質化することにより、この油相をグリセロール−水相に分散させる。一般に 、８０００から１００００ＰＳＩの均質化圧力を使用するが、この圧力は使用す る機械により異なる。次に、得られた生成物を加熱処理により滅菌する。一般に 、熱処理は、分配用パック（３ｍｌの硝子のバイアル）中で１２１℃で１５分間 オートクレーブにかけて実施する。任意に、この期間に生じる可能性のある毒性 を完全に克服するために、抗酸化剤トコフェロール０．３％を添加する。 （ｃ）実験条件 トリチウム標識チミジンのＤＮＡへの取込みは以下の方法で測定した。細胞を ９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に植え付け、集密度５０％まで（２４時間 ）増殖させ、次に、新しい培地のみ、β−カロチンを含む新しい培地、または担 体（担体濃度０．０５％）を含む新しい培地を加え、７２時間インキュベートし た。ＤＮＡ合成は、処理期間の最後の１５時間に培地に［メチル−３Ｈ］−チミ ジン（２．５ｕＣｉ／ｍｌ、２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎ ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を加えて標識することにより測定した。インキュ ベーション後、細胞をＰｈＤ細胞採取装置（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｉｎｃ．）で採取した。取込まれた放射活性を液体シンチレーションカウ ンター（ＬＳ５０００ＴＤ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により 、効率６２．７％で測定した。データは対照と比較したトリチウム標識チミジン の取込みで表わす。各データの点は６ウェルの平均±／標準誤差である。 細胞増殖は次のように測定した。細胞を６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に 植え付け、集密度５０％まで（２４時間）増殖させた。新しい培地および適当な 化合物を加え、次に細胞を７２時間インキュベートした。インキュベーション後 、細胞を０．２５％トリプシンで採取し、洗浄した。細胞をＣｏｕｎｔｅｒ計測 器（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定し、生存率はトリパンブ ルー排除で測定した。各データの点は３ウェルの平均±／標準誤差である。 結果 正常のメラノサイトおよび転移性黒色腫細胞株ｃ８１−４６ａの活性に対する 多数のβ−カロチン担体の作用を測定するために、チミジンの取込みを測定した 。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシドとエタノールの３：１ 混合物（ＤＭＳＯ／ＥＴＯＨ）およびＳＯＹを０．００５％、０．０５％および ０．５％の濃度で細胞と共に７２時間インキュベートした。 第１図に示すように、ＳＯＹは希釈剤濃度に関わらず、黒色腫細胞へのチミジ ンの取込みに影響を与えなかった。ＴＨＦは黒色腫細胞に軽度な影響を与えただ けであったが、ＤＭＳＯ／ＥＴＯＨは最高濃度で４０％まで取込みを低下させた 。 第２図は、正常なメラノサイトおよび４つの転移性黒色腫細胞株に対するＳＯ Ｙ担体中のβ−カロチンの作用を示している。０．１μｇ／ｍｌの濃度では、β −カロチンは黒色腫細胞の増殖に対して軽度な阻害作用を示した。最も感受性が 高いのはｃ８１−６１で、ＤＮＡ合成が２０％低下した。しかし、黒色腫は１． ０μｇ／ｍｌのβ−カロチンに対しては、阻害なしから４０％を超える低下まで 種々の反応を示した。β−カロチン濃度が最高（１０μｇ／ｍｌ）のとき、正常 のメラノサイトと黒色腫の内の２種（ｃ８１−６１、ｃ８１−４６ｃ）は９５％ を超えて阻害された。ｃ８１−４６ａおよびｃ８３−２ｃは２０−２５％が影響 を受けないままであった。 さらに、正常のメラノサイトと４種の転移性黒色腫について生存率をトリパン ブルー排除で測定した（第３図）。１．０μｇ／ｍｌのβ−カロチンは生存率を ２０％低下させたが、１０μｇ／ｍｌでは生存しているメラノサイトは検出され なかった。最高量のβ−カロチンで非常に驚くべき結果が得られ、メラノサイト では生存しているものは検出されなかったが、黒色腫の６０％は影響を受けなか った。 他の型の腫瘍のβ−カロチンに対する反応についても評価した（第４図）。ヒ ト類表皮皮癌細胞株Ａ−４３１は１０μｇ／ｍｌでもβ−カロチンの影響を受け なかった。結腸癌細胞株、正常な肺繊維芽細胞および肺線癌細胞株は非常に弱く 阻害された（１０−２０％）。 第５図は、正常なメラノサイトおよび１種の転移性メラノサイト種細胞株に対 するＳＯＹ中の９−シス−β−カロチンの作用を示している。１．０μｇ／ｍｌ の濃度では、正常なメラノサイトおよびｃ８１−４６ａのいずれも約５０％阻害 された。最高濃度の９−シス−β−カロチン（１０．０μｇ／ｍｌ）では、転移 性メラノサイト種細胞株は９０％阻害されたが、メラノサイトは１．０μｇ／ｍ ｌの場合よりわずかに弱く阻害された。 特定の理論に限定することを望んでいるのではないが、上記説明中に示した混 合物は非常に細かいエマルジョンと思われる。 今日までのインビトロの研究では、種々の化学溶媒をβ−カロチンの担体とし て使用していた。これらの溶媒は単独で細胞毒性作用を有することが判った。上 記の現在の試験は、トリチウム標識したチミジンで測定すると、ＳＯＹは正常な ヒトメラノサイトおよび転移性黒色腫細胞株の増殖に影響を与えなかったことを 明らかにした。しかし、ＴＨＦおよびＤＭＳＯ／ＥＴＯＨ混合物のような溶媒は 濃度依存的にＤＮＡ合成を阻害した。 β−カロチンの新規な担体として、ＳＯＹは反応を干渉する過酷な溶媒担体の 著しい毒性を有することなく、β−カロチンの作用を達成させる。 メラノサイトは一連の化学物質による阻害に感受性のあるヒトの細胞型である ことから選択した。テスト結果は、ＳＯＹはメラノサイトＤＮＡへのトリチウム 標識チミジンの取込みを阻害せず、トリパンブルー排除で測定した細胞生存率も 阻害しないことを示した。 黒色腫は一般的にメラノサイトほど一連の化学物質による阻害に感受性はない が、中等度のβ−カロチンに対してさえもより高い感受性を示した。このことは 黒色腫に対する特異的作用を示していた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）水溶性または水分散性成分と、 （ｂ）乳化剤成分と、 （ｃ）好適担体媒質中の水不溶性カロチノイド成分と の混合物を含む黒色腫の治療薬。 ２．水溶性または水分散性成分が３０重量％から９０重量％の範囲であることを 特徴とする請求項１に記載の治療薬。 ３．水溶性または水分散性成分が、糖アルコール、糖、アミノ酸、水、ビタミン 、血清または血漿、リンパ、緩衝液およびこれらの物質の組合せおよび重合体、 ならびに注射可能物質、例えば無機塩調製物およびデキストロース溶液またはこ れらの成分の組合せから選択される請求項１または２に記載の治療薬。 ４．糖アルコールがグリセロールであることを特徴とする請求項３に記載の治療 薬。 ５．グリセロールが３０重量％から９０重量％の範囲であることを特徴とする請 求項４に記載の治療薬。 ６．乳化剤成分が０．２重量％から２０重量％の範囲であることを特徴とする請 求項１ないし５に記載のいずれか一項に記載の治療薬。 ７．乳化剤成分が１．０重量％から１０重量％の範囲であることを特徴とする請 求項１ないし５のいずれか一項に記載の治療薬。 ８．乳化剤成分をグリセリド（好ましくは、植物または動物起源のモノグリセリ ドおよびジグリセリドを含む）、ポリグリセロールエステル、レシチンおよび他 のリン脂質から選択されることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか一項に 記載の治療薬。 ９．グリセリドがグリセリルモノオレエートであることを特徴とする請求項８に 記載の治療薬。 １０．水不溶性カロチノイド成分が主としてβ−カロチンであることを特徴とす る請求項１ないし９のいずれか一項に記載の治療薬。 １１．水不溶性カロチノイド成分が主として大豆油組成物中の２重量％から５０ 重量％のβ−カロチンであることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか一項 に記載の治療薬。 １２．水不溶性カロチノイド成分が主として大豆油組成物中の２０重量％から４ ０重量％のβ−カロチンであることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか一 項に記載の治療薬。 １３．水不溶性カロチノイド成分が主として大豆油組成物中の３０重量％のβ− カロチンであることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか一項に記載の治療 薬。 １４．β−カロチンがシス−β−カロチンと全トランス−β−カロチンの混合物 であることを特徴とする請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載の治療薬。 １５．β−カロチンのシス−β−カロチン含量が５０％から９０％の範囲である ことを特徴とする請求項１４に記載の治療薬。 １６．β−カロチンのシス−β−カロチン含量が７０％から８５％の範囲である ことを特徴とする請求項１４に記載の治療薬。 １７．シス−β−カロチンが主として９−シス−β−カロチンであることを特徴 とする請求項１４ないし１６のいずれか一項に記載の治療薬。 １８．シス−β−カロチンの９−シス−β−カロチン含量が６０％から９０％で あることを特徴とする請求項１４ないし１６のいずれか一項に記載の治療薬。 １９．組成物中の水不溶性カロチノイド成分が０．１重量％から１０重量％であ ることを特徴とする請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の治療薬。 ２０．水不溶性カロチノイド組成物が１重量％から５重量％の範囲であることを 特徴とする請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の治療薬。 ２１．水不溶性カロチノイド成分を担持するために使用する担体媒質が、脂肪酸 およびトリグリセリド脂質および非鹸化可能な脂質調製物、オクタデカンを含む ある種の好適な石油炭化水素およびこれらの化合物の組合せからなる群から選択 されることを特徴とする請求項１ないし２０のいずれか一項に記載の治療薬。 ２２．トリグリセリド脂質が、大豆、綿実およびひまわりを含む植物油を含む植 物起源および魚および牛を含む動物起源の脂肪および／または油脂からなる群か ら選択されることを特徴とする請求項２１に記載の治療薬。 ２３．担体媒質が０．１重量％から４０重量％の範囲であることを特徴とする請 求項１ないし２２のいずれか一項に記載の治療薬。 ２４．担体媒質が１重量％から２０重量％の範囲であることを特徴とする請求項 １ないし２２のいずれか一項に記載の治療薬。 ２５．血流中または黒色腫に組成物を有効量を直接導入するために薬剤を希釈す ることを特徴とする請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の治療薬。 ２６．薬剤を水性緩衝液、通常の静脈投与用調製物（等張の食塩溶液または５％ デキストロース溶液を含む）、血清または上記物質の組合せで希釈することを特 徴とする請求項２５に記載の治療薬。 ２７．血流中または黒色腫に請求項１ないし２６のいずれか一項に記載の治療薬 の有効量を直接導入するステップを含む黒色腫の治療法。 ２８．黒色腫細胞に接触する治療薬の有効量が０．１−１０．０μｇ／ｍｌであ ることを特徴とする請求項２７に記載の黒色腫の治療法。 ２９．黒色腫細胞に接触する治療薬の有効量が０．１−３．０μｇ／ｍｌである ことを特徴とする請求項２７に記載の黒色腫の治療法。 ３０．注射または静脈内投与により治療薬を血流中に導入することを特徴とする 請求項２７ないし２９のいずれか一項に記載の黒色腫の治療法。 ３１．注射により治療薬を黒色腫の部分に直接導入することを特徴とする請求項 ２７ないし２９のいずれか一項に記載の黒色腫の治療法。