JPH08511002A - ポリヌクレオチド架橋剤としての非ヌクレオシドクマリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非ヌクレオシド主鎖部分に結合したクマリン部分を含む光活性の、新規なクマリン誘導体が開示される。得られた分子は、典型的には、核酸ハイブリダイゼーション反応を含む処理に使用されるプローブ中に存在する一種又は数種の相補的ヌクレオシド塩基の置換体としてポリヌクレオシドに導入される時に、光架橋基として使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリヌクレオチド架橋剤としての非ヌクレオシド クマリン誘導体 技術分野 本発明は、相補的な標的核酸配列の架橋に使用するための、自動的なDNA合成 中、合成オリゴヌクレオチドに加えることができる光活性ヌクレオシドアナロー グ（類縁体）に関する。 背景 標的配列の架橋のため、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける架橋プ ローブの使用はヤブサキほかの米国特許第4,826,967号に示されており、化合物 は存在するポリヌクレオチドに（通常付加物形成を通じて）結合するフロクマリ ン（又はプソラーレン）をベースとしており、多くの用途のためには満足しうる 。しかしこの架橋基／付加物は、特に大量には生産することが難しい。サバほか の米国特許第5,082,934号は、介在塩基部分なしに、リボースあるいはデオキシ リボース糖の一位に、フェニル環を介して結合されるクマリン部分を含む光活性 ヌクレオシドアナローグを記載している。得られるヌクレオシドアナローグは、 ハイブリダイゼーションアッセイに使用するプローブに存在する一種又は数種の 相補的ヌクレオシド塩基の代替体として、ポリヌクレオチドに挿入する場合に光 架橋基として使用される。 しかしながら、プローブ生成中の安定性や架橋融通性などの補足的な利点を有 する新しい種類の化合物は、なお望ましい。 本発明の要約 本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ及び治療用途における光架橋 試液として使用される非ヌクレオシドの、安定性のある、光活性の化合物、及び 最終産物を調製するために使用することのできる中間体及び手法、を提供する。 本発明化合物は、クマリン分子又は誘導体のフェニル環をヒドロキシ又はポリ ヒドロキシ炭化水素分子、例えばグリセリン分子の３−０位に架橋することによ り調製されるクマリニル誘導体、を含む。得られる化合物の（ポリ）ヒドロキシ 炭化水素部分はヌクレオシドの糖に対応し、クマリン部分は塩基に対応する。従 って化合物はポリヌクレオチド合成の自動化（又は手動的な）技法を用いて成長 するポリヌクレオチド鎖に挿入することができる。クマリン環系の３位と４位の 間の二重結合は、この非ヌクレオシドアナローグ（プローブ）がハイブリダイゼ ーションアッセイ及び／もしくは治療用途に使用される場合に、相補鎖のヌクレ オシドと共有結合する光活性基である。 大抵の場合、この光活性化合物は下記式： を有し、式中の置換基及び架橋基を以下に、更に詳細に説明する。 （ポリ）ヒドロキシ炭化水素主鎖は、オリゴ糖構造に最大限の融通性と安定性 を付与し、この構造中において、水性及び有機媒体に良好な溶解性を与えるよう に位置している。 特定の実施態様の説明 本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイ及び／もしくは治療用途に使用さ れるオリゴヌクレオチドプローブにおける光活性非ヌクレオシド架橋剤として使 用することができる架橋化合物、を提供する。ハイブリダイゼーションアッセイ では、本発明化合物は、典型的には、一本鎖の標的核酸における特定DNAおよびR NA塩基配列の有無を決定するための、合成DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドの一 部として使用される。より特定すると、本発明は、ハイフリダイゼーションアッ セイにおける二価の光活性架橋化合物として作用する安定した、融通性のある、 （ポリ）ヒドロキシ炭化水素主鎖に結合するクマリン誘導体、を提供する。 本発明化合物は下記一般式を有する： 主鎖部分−結合部分−架橋部分。 本明細書において”部分”とは、記載した機能を行う分子中の一部、を指す。 特定された部分は、通常、二つ又は三つの分子を交又結合させて得られる、別の 分子に由来し、もとの分子の特定しうる残分は、”部分群”と呼ぶ。例えば、プ ソラーレン分子が、例えばメチレン基などの二価の架橋剤でグリセリン分子に結 合する場合、得られる単一の分子は、グリセリンと、メチレンと、プソラーレン 部分群、とから形成される、と記載する。しかし三つの部分が、以下に述べる理 由で三つの、別々の分子から実際に生じたものである必要はない。従って”由来 する”なる言葉は理論的な前駆体及び実際的な前駆体、を指してもよい。 架橋部分は、融合したベンゾピロン構造、例えば（１）クマリン及びその誘導 体；（２）プソラーレン及びその誘導体、例えば８−メトキシプソラーレン又は ５−メトキシプソラーレン（文献にはこのほかに少くとも40の自然界に生じるプ ソラーレンが記載されており、これらは本発明の実施に有用である）；シス−ベ ンゾジピロン 及びその誘導体；（４）トランス−ベンゾジピロン；及び（５）融合クマリン− シノリン環系を含む化合物；を有する分子に由来する。これら分子のすべては、 標的鎖でヌクレオチドと架橋するための正しい配向及び正しい位置に位置する必 要な架橋基（活性二重結合）を含む。これら分子のすべてはクマリン誘導体であ って、すべて基本クマリン（ベンゾピロン）環系を含み、分子の残りは環系をベ ースとしている。 結合部分は、１乃至100、好ましくは１乃至25、より好ましくは１乃至10個の 原子を合計、他の部分と相互に結合するための二つの位置における官能基、を有 する前駆体から通常生成される。この前駆体が反応して結合部分を形成した後は 、クマリン環系と主鎖部分（糖置換体）の間の原子のもっとも短い結合鎖におけ る原子の全数は、一般的には１乃至15、好ましくは１乃至７、より好ましくは１ 乃至３である。そうでない場合、構造のこの部分は大きく変動する。なぜならこ れは、実質的には架橋部分から主鎖部分まで融通性のある結合であるからである 。 結合部分は、もっとも一般的には安定した環状又は非環状部分であって、これ は、一端で架橋分子と、他端で主鎖分子と結合する適当な官能基（通常その末端 ）とを有する分子の反応に由来する。しかし十分な官能基が主鎖及び架橋部分に 存在する場合には、結合部分に対する前駆体は必要ない（即ち主鎖及び架橋部分 は共有結合により結合する）。 上述した特定部分に属する、最終分子の特定部分についての説明はある程度任 意的なものであって、最終産物を生成するために反応した三つの、もとの分子が 存在した、ということを必ずしも意味するものではない。多数のクマリン誘導体 があり、例えば、二つだけの出発物質から（最終）産物を生成するため、主鎖前 駆体上の官能 基と反応することができるクマリン環に結合する、官能化したメチルあるいはメ トキシ基を有するクマリン誘導体がある。しかし得られる構造は一般的には上記 の三つの部分：ポリヌクレオチドの糖主鎖に組み込まれる主鎖分子、通常のヌク レオシドの塩基により占められる空間を占める架橋部分、二つの主要な部分を結 合する原子（即ち結合部分）、を有しているように見える。便宜のため、結合部 分は、結合点における架橋部分の環原子と、糖分子に代る部分の主鎖構造の一部 を明らかに形成する最後の炭素原子であって、通常、架橋部分にもっとも近いヒ ドロキシル基（又はヒドロキシル基の反応産物）をつくる炭素原子、とからなる と考える。 主鎖部分は（ポリヌクレオチドのリボース又はデオキシリボース主鎖に代る機 能を最終的に発揮するためにそう呼ばれる）、異なるsp３−混成炭素原子に結合 する１乃至３個（場合によりそれ以上）のヒドロキシル基を通常有する。この主 鎖部分は通常変ることがなく、そのため、最終的な改変ヌクレオチドにおけるリ ボースあるいはデオキシリボースの置換体としての機能をすることができる。主 鎖部分には、これらに限定されるものではないが、以下が含まれる：（１）線状 炭化水素部分、例えば三炭素グリセリン単位あるいはより長い炭素鎖であって、 通常−OH、−NH₂、−SH、−COOH、ハロゲン酸類、無水酸類からなる群から選ば れる適当な官能基を有するもの、及び（２）三ヒドロシル基あるいは上記（１） のような他の官能基を有する、典型的には、５乃至７員の炭素環構造を有する環 状炭化水素部分。官能基は上記では未反応形態で示されており、多くの実施態様 においては、記載した官能基の誘導体として存在する。上記の反応性官能基（− OH及び−SH以外）は通常中間体の形で存在する。しかし他の官能基と反応した後 では、安定した基となるか、分子の他の部分と共有結合体を形成する。 上記の基本構造に加え、一種又は数種のカップリング部分が主鎖部分と結合し て、存在するか生長するポリヌクレオチド鎖に対する結合の形成を容易にするよ うにしてもよい。カップリング部分は、典型的には、問題の分子がプローブ分子 調製のために使用する中間体である時に、溶液又は固相の核酸合成に使用するヒ ドロキシカップリング及び／もしくは保護基を含む。典型的なカップリング基は フォスフォールアミダイト、フォスフェート、Ｈ−フォスフォネート、フォスフ ォチオエート、メチルフォスフォネート、トリチル、ジメトキシトリチル、モノ メトキシトリチル、及びピクシル基である。非りんカップリング基には、カルバ ミド酸塩類、アミド類、線状及び環状炭化水素基、特にヘテロ原子置換体を有す る分子の残分に結合する基、例えば−COCH₃、−CH₂OH、−CF₃、−NHCH₃、及びPO₂ CH₂CH₃、が含まれる。このような化学を検討するためには、参考迄に掲げる”O ligonucleotide Synthesis，A Practical Approach”，M.J.Gait,英国オクスフ ォードのIRL Press Ltd.，1984、を参照されたい。 本発明の好ましい化合物は下記式： 〔式中、Ｂは（１）２乃至15、好ましくは３乃至10、より好ましくは３乃至６個 の炭素原子を有する線状、有枝鎖状又は環状炭化水素基であって、環状炭化水素 基である場合、５もしくは６員環を含む基を表わすか、または（２）５もしくは ６員環の複素環式芳香環系を表わし、Ｂ（１）及びＢ（２）の両方が式OR₁の１ ，２又は３個 の置換基により置換されており； Ｘは（１）１乃至15、好ましくは２乃至10、より好ましくは３乃至６個の炭素 原子を有する線状、有枝鎖状又は環状炭化水素基、または（２）Ｘ（１）基であ るが炭化水素基の一つの炭素原子が酸素、イオウもしくは窒素原子で置換されて おり、Ｘに結合する式の他の部分の原子相互の間がもっとも短い結合鎖は１乃至 10個の原子であり、ここでＸは、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、アジ ド、カルボキシ、カルボニル、ニトロ、チオ、パーフルオロメチル及びシアノ官 能基からなる群より選ばれた１−３置換体により任意に置換されており； ｎは０，１，２又は３； 夫々のＷはそれぞれ独立して、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、アジ ド、ニトロ、チオ、カルボキシ、カルボニル、パーフルオロメチル、もしくはシ アノ官能基；炭素原子数が10もしくはそれ以下、好ましくは６もしくはそれ以下 、より好ましくは３もしくはそれ以下の未置換ヒドロカルビル基；官能基の１− ３個で置換されているか、１個の炭素原子が酸素、イオウ又は窒素原子で置換さ れているヒドロカルビル基；を表わし； 但し、（１）Ｘ又はＷが置換炭化水素である場合、Ｘ又はＷにおける置換体の 全数はＸ又はＷにおける炭素原子の全数よりも少なく、所定の炭素上の置換体が ハロゲン原素でない場合、１を越えない置換体又はヘテロ原子が所定の炭素に結 合し、かつ（２）すべてのＷ置換体の全炭素原子数は15又はそれ以下、好ましく は10又はそれ以下、より好ましくは６もしくはそれ以下であり； Ｙ及びＺは独立してＨもしくは低級アルキル（炭素原子数は５もしくはそれ以 下、好ましくは３もしくはそれ以下）を表わし；及び Ｒ₁はＨ、またはポリヌクレオチド合成中ヒドロキシ基を保護も しくはカップリングしうるヒドロキシ保護基もしくはヒドロキシカップリング基 、を表わすか、又はＲ₁は上記化合物に結合するヌクレオチドもしくはポリヌク レオチト、を表わす〕を有する。 Ｂ−Ｘ結合を架橋する官能基（例えばエーテルあるいはカルボキシレート）の 酸素原子もしくはその他の非炭素原子（もし存在するとすれば）は、しばしばＢ の前駆体中のヒドロキシル基から生じるが、文脈から違うことが明らかである場 合を除き、この式及び次の式においてＸ架橋剤（種々の基を定義する容易さのた め）の一部である、と考えられる。 一般式Ｉの範囲内で、いくつかの化合物が好ましい。分子のもっとも重要なパ ートは（少くともこれら化合物相互の間の相違に鑑み、また既に知られているこ とに鑑み）、Ｂもしくは主鎖部分である。好ましいＢ部分は下記第一のサブ式の 群： もしくは下記第二のサブ式の群： もしくは下記第三のサブ式の群： 〔式中、Ｓは２又は３； Ｒ_x，Ｒ_y，Ｒ_zはそれぞれ独立してＨもしくはOR₁を表わし； ｍ，ｎ，ｐ，ｑ、及びｒはそれぞれ独立した０もしくは１を表わし； サブ式の一つの水素はＸに対する共有結合により置換され；また 化合物のその他のすべての置換体及び式の定義は、一般式Ｉについて先の定義 と同じである〕に属するものである。 Ｘ基に対する共有結合により置換されるサブ式の水素原子は、通常ヒドロキシ ル基（即ち少くとも一つのOR₁とは、そのような前駆体分子のヒドロキシル基を 表わす）の水素である。しかしこのような選択は合成の都合のみである。なぜな ら生成するＢ−Ｘ結合は（ポリ）ヒドロキシ炭化水素前駆体から容易に調製する ことができ、それらの多くは市販されているからである。他の水素は、望む場合 には記載されている共有結合により置換することができる。合成に使用される実 際の分子は、しばしば、そのヒドロキシル基の一つがたびたび一連の反応により 官能基で置換された（ポリ）ヒドロキシ化合物からなお由来するものである。例 えば、あるヒドロキシル基はハロゲン原子あるいはその他の脱離基により置換す ることができ、残した基は、Ｘ基の前駆体中の電子供与基ととの結合基の形成に 加わる。 Ｂが飽和炭化水素である化合物が好ましいが、不飽和化合物（環式芳香族を含 む）も使用することができる。不飽和化合物（芳香族 を含む）において、−OR₁置換基は直接にはsp2−混成炭素に結合せず、例えば− CR₂OR₁（式中ＲはそれぞれＨ又はアルキル基を表わす）におけるように、介在す るsp3炭素に結合することが好ましい。 Ｂが第三のサブ式を有する式Ｉの化合物は、三つのサブ式の中では好ましく、 特にｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑ＋ｒ＝０，１又は２であるものが好ましい。より好ましくは 、第三のサブ式のこれら化合物は、非環式、飽和、ジ−又はトリ−ヒドロキシ炭 化水素、特に、グリセロールや１，２−又は１，３−ジヒドロヒドロキシアルカ ンであって、３乃至５個の炭素が記載のヒドロキシル基からもっとも遠い位い末 端位置のＸ基に結合しているもの、例えば４，５−ジヒドロキシペンタン、３， ５−ジヒドロキシペンチル、２，４−ジヒドロキシ−２−メチルブチル、３−ヒ ドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル 、などが挙げられる。 既に述べたように好ましいわけではないが、Ｂ部分に存在しうる化合物として 芳香族環系がある。これらは炭化水素及び複素環式の芳香族環系の双方を含む。 これらの化合物のうち、Ｂがベンゼン環あるいはナフタレン環系、特に１，２− ジ（ヒドロキシメチ）−置換芳香族化合物が好ましい。同じ置換基は、Ｂが複素 環式化合物である場合、例えばフラン、ピラン、ピロール、ピラゾール、イミダ ゾール、ピペリジン、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピラジジン、チオフェ ン、アクリジン、インドール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキザ リン、あるいは１，２−ベンゾピラン環系である場合に、好ましい。 好ましくはないが本発明の範囲に入るものとしては、更に、Ｂが架橋炭化水素 環系、例えば二環〔３，１，０〕もしくはヘキサンもしくは〔２，２，１〕ペプ タン環系を含む化合物が挙げられる。こ れらの分子は移動性が低い構造を有し、そのため種々のシス及びトランス置換パ ターンが容易に調製され保持される。例えばFergusonの”Organic Molecular St ructure，”Willard Grant社、ボストン、1975、17−19章、はこの化学及び合成 技法を示す。同様に、Ｂがスピロ又はジスピロ炭化水素環系を含む化合物も、本 発明の範囲に入る。 既に述べたようにＸ結合基は特に限定された構造ではない。なぜなら、主鎖の 残りもしくはポリヌクレオチドの相補鎖のどちらかと相互作用する分子の一部に 存在するものでないからである。しかし、分子のこの部分の好ましい構造があり 、これは二つの可能な配向のＸを表わす以下の構造である： （式中、ＬはＨ、Ｆ、Cl、Ｉ、またはBrを表わし、ｎ＝０、１、または２である ）。 他の好ましい（しかしそれほど好ましくない）化合物は、Ｘが５乃至６員の炭 素を有する環構造又は複素環（一つのＯ，Ｓ又はＮ原子）を含むもの、例えばシ クロペンタン、シクロヘキセン、ジヒドロフラン、ピロールあるいはピリジンで ある。 架橋部分では、Ｙ及びＺは、炭素数が５又はそれ以下、好ましくは３又はそれ 以下であり、アルキル基である場合もっとも好ましくはメチルである。Ｗ，Ｙ及 びＺがすべて水素である化合物が好ましく、例えばＷが、式のフェニル環に融合 したピロン又はフラン環であるような化合物である。これらの化合物は好ましい 化合物であり、これらは、式ＩにおいてＸの右側の式のすべてが、クマリン、プ ソラーレン、シス−ベンゾジピリン、又はトランス−ベンゾジピロンもしくはそ の誘導体を表わすものである。 式Ｉの化合物であって、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドが化合物に結合し ているものは、通常（いつもそうではないが）りん含有結合基を介して接続して いる。好ましいりん含有結合基、及びその他の結合基、について他の部分で論じ られている。このような化合物は本発明の好ましい化合物である。なぜなら本発 明の主要な最終用途であるアッセイや架橋法に直接に使用できるからである。こ れらの化合物は式（Ｎ_m1Ｑ_m4Ｎ_m2）_m3を有し、式中、ｍ１及びｍ２は整数（通常 少くとも14、好ましくは少くとも17、もっとも好ましくは少くとも20）；ｍ３は １乃至10、好ましくは１乃至５の整数、ｍ３は通常（ｍ１＋ｍ２）／10よりも小 さい；Ｎそれぞれは独立に所望ポリヌクレオチド配列のヌクレオチドを表わし； Ｑは通常のポリヌクレオチド配列に組み込まれる本発明のヌクレオチド置換分子 を表わし；ｍ４は１−５、好ましくは１−３である。ハイブリッドを安定にする ヌクレオチドの分断されていない配列がある場合には、ポリヌクレオチド配列中 の少数（通常１又は２）の通常塩基により、２乃至それ以上のＱ部分を相互に分 離してもよい。上記のような配列は分断されていないＱ配列に等しいと考えられ る。分断されない通常のヌクレオチド配列の好ましい長さは、ｍ１及びｍ２につ いての上記定義と同じである。 Ｑはポリヌクレオチドの内部にも、あるいはその末端位置の一つにも存在しう る。内部位置の場合、少くとも二つのＲ₁基が存在して、Ｑ分子が二つの分離し た鎖に結合するようにしなければならない；Ｑが末端位置に挿入される場合には 、一つだけのＲ₁が必要であるが他のＲ₁が両方の場合に存在していてもよい。 これらの式において、ｍ３が１より大きいポリヌクレオチド配列 についてＮ_m1Ｑ_m4Ｎ_m2が相互に異なっていてもよい；即ち多数のＱ部分が分子の 長さに沿って存在していてもよいが、但し上述の残るパラメータについては一致 していなければならない。 好ましいポリヌクレオチドの一つの基は分断されない通常塩基の長い配列を有 し、１−５個のＱ部分（好ましくは１−３個のＱ部分）が分子の一端又は両端に 存在する。記載したようにＱ部分は分断されていないか、あるいはいくつかの通 常のヌクレオチドで分断されていてもよい。プローブの中央の複数のＱ部分（分 断されているか分断されていない）も好ましい実施態様を表わし、これは架橋Ｑ 単位のいずれかの側に対する比較的長い、分断されていない配列を有する。 すべての好ましい実施態様において、対応する標的ヌクレオチドに対して相補 的である、少くとも一つの分断されていないヌクレオチド配列がある。この分断 されていない配列はハイブリダイゼーションプロセスにおいて安定性を付与し、 それにより標的の適切な認識が生じる。安定性及び選択性に至るファクターは、 本ハイブリダイゼーションプロセスにおいても、他のプロセスの場合と同じであ る。Ｑ部分が続く相補ヌクレオチドの分断されない配列は、この点で非相補的通 常塩基が続く標的ヌクレオチドの分断されない配列異ならない。かくして本発明 の架橋部分を含むポリヌクレオチドの安定性は、核酸ハイブリダイゼーションに おける標準的な考察から容易に予測しうる。 二つのＲ₁基がＢ部分にあり、両方が異なるヒドロキシルカップリングあるい はヒドロキシル保護基を表わす化合物も好ましいものである。なぜならこのよう な化合物は架橋ポリヌクレオチドの合成にすぐに使用できるからである。これら の保護及び活性基も、本明細書の他の部分で述べられている。 本発明化合物の、別の、特に好ましい基は下記式IIを有するものであり、その 多くは式Ｉの範囲に入り、好ましい化合物の態様として挙げられているものであ る： 〔式中 ｎ₁は０乃至10（好ましくは０乃至５、より好ましくは１乃至３）； ｎ₂は０乃至５（好ましくは０乃至２、より好ましくは０又は１）； ｎ₃は０乃至５（好ましくは０乃至２、より好ましくは０又は１）； 夫々のＷは独立して、15までの原子を含む少量の安定した置換基（特に低級ヒ ドロカルビル基、ハロゲン、ニトロ、チオ、シアノ、カルボニル、カルボキシ、 ヒドロキシ、アミノ、アミド、又はポリフルオロアルキル基；または１個もしく は数個のヘテロ原子、即ち水中、25℃で炭素と安定した共有結合を形成する炭素 又は水素以外の原子、を含むヒドロカルビル置換基）を表わし； Ｙ及びＺは、それぞれ独立してＨ又は低級アルキル基を表わし； Ｘは、（ａ）１乃至10の炭素原子と、（ｂ）Ｏ，Ｓ及びＮからなる群より選ば れる０乃至10、好ましくは０乃至２のヘテロ原子を含む有機基であって、Ｘは、 結合される式の他の原子の間がもっとも短い１乃至10の原子の結合鎖を含むもの であり； Ｒ₂はＨ又はOR₁；及び Ｒ₁は、Ｈまたは自動的なポリヌクレオチド合成中、ヒドロキシ ル基をカップリングするか保護しうる基（前者は主鎖部分の末端ヒドロキシルの みに位置することが好ましい）である〕。あるいはＲ₁は、フォスフォジエステ ル結合により化合物に結合されるヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。好 ましいカップリング基は、フォスファイト、フォスフォアミダイト、フォスフェ ート、Ｈ−フォスフォネート、フォスフォロチオエート、フォスフロジチオエー ト、メチルフォスフォネートなどの基を含むりんであってもよい。非りんカップ リング基とはカルバメート類及びアミド類が含まれる。低級炭化水素基には、Ｃ₁ −Ｃ₆アルケニル及びアルケニル基、またＣ₃−Ｃ₆環式基、また好ましくはＣ₁ −Ｃ₄アルキル及びアルケニル基、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピ ル、ブチル、イソ−ブチル、sec−ブチル及びtert−ブチルが含まれる。ヘテロ 原子置換基を有する典型的なヒドロカルビル基には−COCH₃、−CH₂OH、−CF₃、 −NHC₃、−CO₂CH₂CH₃及び−CON(CH₃)₂、が含まれる。 本発明化合物は、例えばハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブと して使用される光活性ポリヌクレオチドの調製のための中間体、あるいはその成 分として、有用なものである。本発明のの意図は一種又は数種のこれら化合物が 最終的にポリヌクレオチドの一部と形成することであるから、分子の一部を形成 する主鎖部分は、グリセリル、あるいは大抵の場合異なるポリヒドロキシル炭化 水素分子から由来する。グリセリルあるいは他のポリヒドロキシル炭化水素分子 は、分子中の隣接するヌクレオチドの３′及び／もしくは５′ビドロキシル基と 典型的にはフォスフォジエステル型結合により、いずれかの位置で、核酸の主鎖 に組み込まれ、架橋部分は、通常はそのような組み込みの前に主鎖部分に結合さ れる。 本発明化合物の架橋部分はクマリンそれ自体から、あるいはある 数の置換クマリンから由来するものであってもよい。架橋部分前駆体のグリセリ ンあるいはその他の主鎖部分が結合する位置における有機官能基は、典型的には 最終産物における主鎖部分に架橋部分を結合させるために使用される。最終産物 はしばしば別の合成ルートにより調製することができるから、どのような所定最 終産物もいくつかの前駆体をもつ可能性がある。結合部分は、別個の分子から生 じるか、架橋部分前駆体と主鎖部分前駆体との反応部分により生成されうる。 結合位置以外の部分ではクマリン（又はその他の）環系は未置換であるか置換 される。フェニル環上の典型的な置換基は、有機化合物中の芳香族環に通常見ら れる小さい安定した置換基である。置換基は所望に従ってクマリンの励起波長を 変えるように選択される。３位及び４位の置換基であって典型的には非極性であ るものがもっともしばしば使われる炭化水素置換基であり、メチル置換基がもっ とも一般的である。置換基の位置は変わってもよいが、もっともよくみられるの は４，６及び８位である。 ある好ましい実施態様では、クマリン部分前駆体は、主鎖部分前駆体と反応す る前には下記式： 〔式中、Ｙ，Ｚ，ｎ₂，Ｍ及びＷは先の定義通りであり； Ｘ₁は、Ｘ結合部分の全部又は一部の前駆体である。Ｘ₁は結合部分の前駆体上 の有機官能基と反応して、共有結合をする。典型的な反応性官能基には、ヒドロ キシ、アミン、ハロゲン、チオ、カル ボニル、カルボキシエステル、カルボキシアミド、シリコン、及びビニル基が含 まれる〕を有する。これら前駆体は標準的な有機合成法によりクマリンそれ自体 から、あるいは多くの市販されているクマリン誘導体から合成することができる 。 ある好ましい実施態様では、グリセロール主鎖部分前駆体は下記式： 〔式中、Ｒ₁，Ｒ₂，ｎ₁及びｎ₃は先の定義の通りであり； Ｘ₂は、Ｘ結合部分の全部又は一部の前駆体である〕を有する。 Ｘ₂は、クマリン部分上の有機官能基と反応して、最終結合Ｘ部分に共有結合 をつくる。Ｘ₂は典型的には、反応性官能基及び求核又は求電子置換又は付加を しうる求核及び求電子基のうちから選ばれる。 特定の官能基の例としては、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲン、チオ、カルボニ ル、カルボキシエステル、カルボキシアミド、ビニル及びシリコーン類があげら れる。この前駆体は標準的な有機合成法により（ポリ）ヒドロキシ炭化水素、例 えばグリセリン、市販の１，２−又は１，３−ジヒドロキシアルカン誘導体、あ るいは所定のヒドロキシル基の位置に保護ヒドロキシル基を有するような化合物 、から合成される。ポリヌクレオチド合成に使用する塩基に本発明主鎖部分の構 造に類似する構造を有する部分を結合させることについての説明は、Misiura，K .，Durrant，I.，Evans，M.R.，及びGait，M.J.，によるNucleic Acids Res．（ 1990），18，4345-4354参照。 本発明化合物は、本明細書に概要を説明したようにして標準的な有機化学合成 法により調製できる。例えば、市販の出発物質をベースにした典型的な合成法は 、以下の反応経路に示される。 試薬 （ａ）水素化ナトリウム（ＮａＨ）／CH₃−O−CH₂CH₂−O−CH₃ （ｂ）７−ブロモメチルクマリン （ｃ）HCl（aq.）、THF（テトラヒドロフラン） （ｄ）DMTrCl（４，４’−塩化ジメトキシトリチル）ピリジン （ｅ）ClPN(ipr)₂OCH₂CH₂CN、CH₃CH₂N(ipr)₂、CH₂Cl₂ 実施例１ ７−クマリニルメチルソルケタール １２０ｇのエチレングリコールジメチルエーテルに、ソルケタール（２．６４ ｇ、２０．０ｍｍｏｌｅ）と水素化ナトリウム（０．８８ｇ、２２．０ｍｍｏｌ ｅ、６０％鉱物油溶液）を加えた。生じた懸濁液に７−ブロモメチルクマリンを 、７分間かけて少量ずつ加えた。１０分後、１．５ｍｌの氷酢酸を加えて反応を 止めた。次に、固形物を遠心分離によって懸濁液から分離した。次に、溶液を固 形物となるまで濃縮した。次に、固形物を、溶離液としてクロロホルム／酢酸エ チル ９７：３を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物 を含む画分をTLCで同定して合わせ、減圧下で白色の固形物となるまで濃縮した 。収量は６３０ｍｇであった；融点は７５−８０℃であった。CHCl₃／酢酸エチ ル ９：１で、Ｒｆ＝０．５５。実施例２ １−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−０−（７−クマリニルメチル ）グリセロール ７−クマリニルメチルソルケタール（８００ｍｇ、２．７４ｍｍｏｌｅ）を、 テトラヒドロフラン（１２ｍｌ）及び塩酸（６ｍｌ） 中に、２０分間溶解させた。次に溶液を無水エタノール（２ｘ５ｍｌ）との共蒸 発により乾燥させて油とした。生じた溶液を２５ｍｌの飽和炭酸ナトリウムで洗 浄した後、３ｘ２５ｍｌのジエチルエーテルで抽出した。溶液は、減圧下で、油 となるまで濃縮した。油は、ピリジン（２ｘ５ｍｌ）との共蒸発により乾燥し、 乾燥生成物とした。液体にピリジン（３０ｍｌ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ ピリジン（２５ｍｇ）、及びトリエチルアミン（２００μｌ）を加えた。生じた 溶液に４、４’−塩化ジメトキシトリチル（１０００ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌｅ ）を加えた。反応混合物を２時間撹拌した。３７．５ｍｌの水を加えて反応を止 め、生じた溶液を２ｘ１８０ｍｌのジエチルエーテルで抽出した。合わせたエー テル抽出物を減圧下で濃縮し、１５ｍｌの塩化メチレンに溶解して、溶出溶媒と してアセトン／ヘキサン ４：６を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより 精製した。Ｒｆ＝０．５の画分を集め、生成物（７７０ｍｇ、収率５５％）が得 られるまで蒸発乾固した。実施例３ １−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−０−（７−クマリニルメチル ）−２−０（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエチル）フォスファ イト １−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−０−（７−クマリニルメチ ル）グリセロール（１．２０ｇ、２．１８ｍｍｏｌｅ）を２ｘ６．５ｍｌの混合 溶液（ピリジン ５ｍｌと塩化メチレン１．５ｍｌ）と共に、２回、蒸発させた 。乾燥反応物に塩化メチレン（４．６ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（１ ．８７ｍｌ、８．５９ｍｍｏｌｅ）を加えた。懸濁液を澄んだ溶液になるまで撹 拌した。次に、２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロフォス ファイト（０．６２ｍｌ、３．２４ｍｍｏｌｅを溶液 に加えた。生じた溶液を６５分間撹拌し、次に３０μｇの無水メタノールを加え て反応を止めた。次に反応混合物を、４５ｍｌの酢酸エチルと２．２ｍｌのトリ エチルアミンで希釈し、１０％の炭酸ナトリウム水溶液（２ｘ３０ｍｌ）、飽和 炭酸ナトリウム（２ｘ３０ｍｌ）、飽和塩化ナトリウム（２ｘ３０ｍｌ）で抽出 した。有機層を減圧下で濃縮した。生じた生成物を溶媒系（塩化メチレン／ジエ チルエーテル／トリエチルアミン ９０：７．５：１）を用いたシリカゲルクロ マトグラフィーで精製した。Ｒｆ＝０．７３の画分を集めた。溶液は減圧下で固 形物となるまで濃縮した。収量は、１．０６ｇ（１．４１ｍｍｏｌｅ、６４％） であった。実施例４ 非ヌクレオシドクマリン機能を含むオリゴデオキシヌクレオチドの調製 上記の実施例３で調製した試薬を用い、ＤＮＡ合成のβ−シアノエチルフォス フォアミダイト法により、１６型ヒト乳頭腫ウイルスのセグメントと同一で、Ｅ ６遺伝子の３９７から４１７のヌクレオチドからなり、その２０番目の塩基（ア デニン）が３−（７−クマリニルメチル）グリセロールで置換されたオリゴヌク レオチドを調製した。 合成後、３ｍｌ ３０％ＮＨ₄ＯＨを用い、室温において１．５時間かけてオ リゴヌクレオチドを固相担体から開裂させた。次に、アンモニア溶液を５５℃で １．５時間加温した。冷却後、ＮＨ₄ＯＨを減圧下で除いた。未精製のオリゴヌ クレオチドは逆相高速液体クロマトグラフィーで均質に精製した。 オリゴヌクレオチドを、０．７５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（２０μＬ）中で、 相補的な５’−³²Ｐ標識標的オリゴヌクレオチド（プローブ／標的＝１０：１の モル比）と、４０℃で１時間ハイブリダ イズさせた。この時、溶液に波長３０２ｎｍの光を１０分間照射した。照射を受 けた混合物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動試験により、放射能標識標的 に関して達成された光化学的な架橋のレベルは、８０％であったことが示された 。サバ等の米国特許第5,082,934号で記載されたヌクレオシドのクマリン誘導体 の一つを含む類縁オリゴヌクレオチドを用いた対照実験を同時に行った。これら の試薬を用いて得られた光架橋の効率は６０％であった。従って、本発明の化合 物は、２０％高い効率（１／３大きな相対効率）で光化学的な架橋を受けた。実施例５ 前記の実施例１、２及び３に示されたと同様の反応に従って、以下の構造をも つ生成物も同様にして合成することができた。 この化合物は、また、非ヌクレオチドプソラーレン誘導体を含むオリゴデオキシ ヌクレオチドの調製にも有用であろう。 本発明について、以上で全て説明されたが、当該技術分野において通常の知識 を有する者には、添付請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、多く の改変および変更を行うことができることは明らかである。 本明細書で述べた全ての文献及び特許出願は、個々の文献又は特 許出願が別個に特定される程度に特定して、参考として加入されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シーン，ダグラス ワイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94025, メンロ パーク，カレッジ アベニュ 701

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記式： 〔式中、 Ｂは（１）２乃至１０の炭素原子を有する線状、有枝鎖状又は環状炭化水素基 であって、環状である場合、５もしくは６員環を含む基を表わし、又は（２）５ もしくは６員環の複素環式芳香族環系を表わし、Ｂ（１）又はＢ（２）は式ＯＲ₁ の１、２又は３個の基により置換されており、Ｒ₁はＨもしくは、ポリヌクレオ チドの合成中ヒドロキシ基を保護もしくはカップリングしうるヒドロキシ保護も しくはヒドロキシカップリング基を表わすか、又はＯＲ₁は前記式の残りに結合 するヌクレオチド又はポリヌクレオチドを表わし； Ｘは、（１）１乃至１０個の炭素原子を有する線状、有枝鎖状又は環状炭化水 素基、又は（２）Ｘ（１）基であるが炭化水素基の一つの炭素原子が酸素、イオ ウもしくは窒素原子で置換されており、式の他の部分のＸに結合した原子間にあ る、Ｘ中の原子の最も短い結合鎖は１乃至１０個の原子であり、ここでＸは、ヒ ドロキシ、ハロゲン、アミノ、アミド、アジド、カルボキシ、カルボニル、パー フルオロメチル及びシアノ官能基からなる群より選ばれた１−３個の置換基によ り任意に置換されており； ｎは０、１、２又は３； 各々のＷはそれぞれ独立して、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、 アミド、アジド、ニトロ、チオ、カルボキシ、カルボニル、パーフルオロメチル 、もしくはシアノ官能基；炭素原子数が１０もしくはそれ以下の未置換ヒドロカ ルビル基、もしくは官能基の１−３個で置換されているか、１個の炭素原子が酸 素、イオウもしくは窒素原子で置換されているヒドロカルビル基、を表わし； 但し、（１）Ｘ又はＷが置換炭化水素である場合、Ｘ又はＷにおける置換基の 全数はＸ又はＷにおける炭素原子の全数よりも少なく、所定の炭素上の置換体が ハロゲン元素でない場合、１を越えない置換基又はヘテロ原子が所定の炭素に結 合し、かつ（２）すべてのＷ置換基の全炭素原子数は１５又はそれ以下、であり ； Ｙ及びＺは独立してＨもしくは低級アルキルを表わす〕で表わされる化合物。 ２．どちらかの配向性をもつＸが： ，Ｃｌ，Ｉ又はＢｒ，ｎ＝０、１又は２である）である請求の範囲第１項記載の 化合物。 ３．Ｘが５又は６員環、又は１個のＯ、Ｓ又はＮ原子を含む５又は６員環のヘ テロ環を有する環状構造である請求の範囲第１項記載の化合物。 ４．Ｗが、シンノリン環系又は前記式のフェニル環に融合したピロン又はフラ ン環である請求の範囲第１項記載の化合物。 ５．Ｘの右の、前記式のすべてがクマリン、クマローシンノリン、プソラーレ ン、シス−ベンゾジピリン、又はトランス−ベンゾジピロン又はその誘導体を表 す請求の範囲第４項記載の化合物。 ６．Ｘがクマリン部分の７位に共有結合している請求の範囲第１項記載の化合 物。 ７．Ｂが、下記第一のサブ式の群： 下記第二のサブ式の群： 下記第三のサブ式の群： 〔式中 ｓは２又は３； Ｒ_x，Ｒ_y，Ｒ_x，はそれぞれ独立してＨ又はＯＲ₁を表わし； ｍ，ｎ，ｐ．ｑ及びｒはそれぞれ独立して０又は１を表わし； 前記サブ式の１個の水素は前記Ｘ基に対する共有結合により置換され； すべての他の置換基及び前記化合物の前記式の定義は先に定義し た通りである〕で表わされる請求の範囲第１項記載の化合物。 ８． Ｂが飽和している請求の範囲第７項記載の化合物。 ９．Ｂが前記第三のサブ式を有する請求の範囲第７項記載の化合物。 １０．ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑ＋ｒが０，１又は２である請求の範囲第９項記載の化合 物。 １１．前記第三のサブ式が非環式、飽和の、ジ−又はトリ−ヒドロキシ炭化水 素である請求の範囲第５項記載の化合物。 １２．前記第三のサブ式がグリセリンを表す請求の範囲第１１項記載の化合物 。 １３．前記ヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、りん含有結合基により前記 化合物と結合している請求の範囲第１項記載の化合物。 １４．前記りん含有基がフォスフェート基である請求の範囲第１３項記載の化 合物。 １５．Ｂがベンゼン又はナフタレン環系を含む請求の範囲第１項記載の化合物 。 １６．Ｂが架橋炭化水素環系を含む請求の範囲第１項記載の化合物。 １７．Ｂが二環［３、１、０］もしくはヘキサンもしくは［２、２、１］ヘプ タン環系を含む請求の範囲第１６項記載の化合物。 １８．Ｂがスピロ又はジスピロ炭化水素環系を含む請求の範囲第１項記載の化 合物。 １９．少なくとも一個のＲ₁がトリチル、ピキシル、ジメトキシトリチル、モ ノメトキシトリチル、フォスファイト、フォスフォアミダイト、フォスフェート 、Ｈ−フォスフォネート、フォスフォロチオネート、メチルフォスフォネート、 フォスフォジチオエート又 はフォスフォトリエステル基である請求の範囲第１項記載の化合物。 ２０．Ｂがフラン、ピラン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、ピペリジ ン、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピラジジン、チオフェン、アクリジン、 インドール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、及び１、２ −ベンゾピラン環系からなる群より選ばれるヘテロ環系を有する請求の範囲第１ 項記載の化合物。