JPH08511172A - 血管障害の遺伝子治療に用いるためのｄｎａ発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＤＮＡ発現ベクターに関する。このＤＮＡ発現ベクターは、真核細胞中で前記ＤＮＡ配列の発現を引き起こす真核生物性調節要素も含んでいる。本発明は、さらに、血管疾患の治療及び予防用としてのこの発現ベクターの用途にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 血管障害の遺伝子治療に用いるためのＤＮＡ発現ベクター 本発明は、高血圧、動脈硬化、狭窄、再狭窄のような血管障害の遺伝子治療の ためのＤＮＡ発現ベクターの用途に関する。 経皮経管冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）は、危険な冠状血管狭窄（冠状動脈狭窄 症）をカテーテルによって機械的に拡張させて血管を再び開放させる、診療所に おいて広く用いられている方法として理解されている。今日まで、ＰＴＣＡのア キレス鍵となっているのは再狭窄である。この障害は、治療を受けた全患者の１ ２〜４３％において、ＰＴＣＡの成功後数週間から数ヶ月後に発生している（La nge，R.A．et al.，Southwestern Internal Medicine Conference：再狭窄：冠 状動脈形成術のアキレス腱、Am．J．Med．Sci.，265-274，1993）。その結果、 改めてＰＴＣＡを行うか或いはバイパス手術が必要となる。 最新の分析においても、再狭窄の精確なメカニズムは解明されていない。しか しながら、重要なのは、初期の機械的伸張刺激であり、ここでは、内皮細胞の破 壊とは別に、繊維素と血小板の同時沈着のある動脈硬化壁領域に裂傷が発生する 。血小板の方は、平滑血管筋系の成長阻害因子を隠蔽する、血管狭窄性かつ増殖 穴進性の代謝産物を放出する。その結果が、筋中膜の過形成、即ち再狭窄である 。 過去の臨床研究において、再狭窄の治療に関する様々な戦略が検討された。薬 学療法に関しては、抗血栓剤（アスピリン、ヘパリン）、鎮痙剤（ニフェジピン 、ジルタゼム）又は抗増殖剤（コルヒ チン）の使用、或いは脂質レベル降下療法のいずれも、再狭窄の発生に対して有 利な影響を及ぼさなかった。組織の損傷を最小限にするための新しいカテーテル の開発（レーザー血管形成術、アテローム切除術カテーテル）も、再狭窄の予防 に対して何らの成功ももたらさなかった。 現在のところ、再狭窄のための療法は存在していない。その理由は恐らく、医 薬品の全身的適用後における有効血中レベルが低すぎて、局部的に治療上有効と なり得ないためであろう。 一酸化窒素（ＮＯ）は、ほ乳類の細胞において、酵素ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ ）の仲介を通じてアミノ酸Ｌ−アルギニンから形成される。ＮＯは、数多くの生 理学的及び病態生理学的作用を媒介する、人体内の重要なメッセンジャー物質及 び／又はシグナル分子である。中枢神経系においては、ＮＯは、恐らく統合能、 即ち記憶機能の調節に関与している。胃腸管内では、ぜん動に関与するものと考 えられている。マクロファージによって形成されたＮＯは、バクテリア及び寄生 虫を殺すことができる。心臓循環系の内部においては、ＮＯは、内皮細胞から形 成され、そこで２つの重要な機能を果す。血管の管腔側の方向では、血小板の凝 集を阻害し、それと共に血管内壁の抗トロンボゲン形成特性の一因ともなってい る。管腔の反対側では、ＮＯは、平滑筋系を弛緩させて、長期的な増殖阻害作用 を及ぼしている。例えば血管内皮の損傷による、内皮ＮＯの消失は、全身の高血 圧を導き、恐らく動脈硬化症の発生に関連している。それに加え、ＮＯの機能に とって重要なことは、その生物学的半減期が１秒に満たないという点である。そ れと共に、ＮＯは、形 成された場所に至近の細胞にしか到達できない。即ち、ＮＯの効果は局部的に限 定されているのである。 少なくとも３種類の異なるＮＯＳアイソザイムがＮＯＳファミリーに属してい る。即ち、内皮酵素（ｅＮＯＳ）、脳酵素（ｂＮＯＳ）及び誘導性酵素（ｉＮＯ Ｓ）である。これら３種のアイソザイム全てがこれまでに単離されており、その 一次構造、即ちアミノ酸配列は解明され、コーディング遺伝子セグメントも特徴 づけされている。これらのＮＯＳ間の基本的な差異は、それらの分子量、そして とりわけ発現の調節と酵素活性にある。従って、ｅＮＯＳとｂＮＯＳはその活性 を通じて、また、ｉＮＯＳは主として発現を通じて調節されている。 ＮＯＳ酵素の特徴付けのために以下のことが説明される： ｅＮＯＳ： この酵素は１３３kDaの分子量を有し、遊離Ｃａ⁺⁺濃度に依存す るカルモジュリン結合部位を有しており、９０％以上が膜結合型として存在して いる。 ｂＮＯＳ： 脳酵素は、サブユニット当たり１６０kDaの分子量を有するホモ ダイマーであり、１０％未満が膜結合型として存在する。ｅＮＯＳ同様に、カル モジュリン結合は遊離Ｃａ⁺⁺に依存する。即ち、両方の酵素は共に、例えばレセ プターにより媒介されるＣａ⁺⁺の流入の結果として、細胞内Ｃａ⁺⁺濃度が上昇し た場合にのみ活性となる。 ｉＮＯＳ： 誘導性ＮＯＳも同様に、サブユニット当たり１３０kDaの分子量 を有するホモダイマーである。他のアイソザイムとの基本的な差異は、ｉＮＯＳ の活性がカルモジュリンに依存せず、 従って細胞カルシウムに依存しないという点にある。ｉＮＯＳに関するＬ−アル ギニンについての代謝回転率は、ｅＮＯＳ及びｂＮＯＳによるものよりもおよそ １０〜１００倍高いことから、ｉＮＯＳは「高算出量（ハイ・アウトプット）」 ＮＯＳとも呼ばれる。基礎条件下において、ｉＮＯＳは、通常は検出不可能であ る。しかしながら、炎症媒介物質及び内毒素を通した免疫学的活性化の後に強く 発現される。 本発明の目的は、特に高血圧又は動脈硬化、狭窄又は再狭窄のような血管障害 の遺伝子治療に適した発現ベクターを利用可能にすることにある。 この目的は、一酸化窒素シンターゼの生物学的活性を発現するタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列を含み、かつ真核生物性調節要素を含むＤＮＡ発現ベクター であって、このＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された又はこれに感染した 血管が、この血管の狭窄もしくは再狭窄の抑制のため及び／又は平滑血管筋系の 増殖阻害のために治療上許容可能な量で組換え一酸化窒素シンターゼを発現する 発現ベクターによって解決される。 前記発現ベクターは、本発明に従うと、特に高血圧、動脈硬化又は狭窄のよう な血管障害の治療のため、とりわけ経皮経管冠状動脈形成術後の冠状血管の再狭 窄症の治療のための方法に使用される。 さらに、医薬組成物も利用可能である。 本発明者は、驚くべきことに、ここで記載するＤＮＡ発現ベクターによりトラ ンスフェクションされた血管における組換え一酸化 窒素シンターゼの発現が、血管狭窄及び経皮経管冠状動脈形成術後の再狭窄の、 治療上適切な抑制を導くということを発見した。 本発明は、ｉＮＯＳ、ｂＮＯＳ又はｅＮＯＳ、好ましくはｉＮＯＳ活性をコー ドする、ほ乳類、好ましくはマウス又はヒトから得られるＤＮＡ配列、好ましく はｃＤＮＡ配列に関する。好ましくはｉＮＯＳのｃＤＮＡが使用されるが、それ は、それがより高い比活性を有しており、さらにＣａ非依存性でもあるからであ る。従って、酵素活性は調節の影響とは独立している。 ＤＮＡ発現ベクターには、バクテリア内での複製を可能にする配列要素、真核 細胞内での前記ベクターの複製を可能にする配列要素、好ましくはＳＶ４０複製 配列要素、ポリアデニル化シグナル、及び１つ以上の介在配列（イントロン）が 含まれることが可能である。 調節要素には、真核生物ウイルス、好ましくはサイトメガロウイルス又はアデ ノウイルスからのプロモーター及び／又はエンハンサー領域、さらに好ましくは サイトメガロウイルスタンパク質合成前（immediate early）ポリペプチド遺伝 子のプロモーター・エンハンサーが含まれることが可能である。 さらに、本発明は、高血圧及び動脈硬化並びに血管の狭窄又は再狭窄のような ヒトの血管障害の治療及び予防に関する。本発明は、特に、血管を、上述のＤＮ Ａ発現ベクターと接触させ、このベクターでトランスフェクションし、又はこれ に感染させる、経皮経管冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の環状血管の再狭窄の治 療及び予防の方法に関する。 ＤＮＡ発現ベクターによる血管のトランスフェクション又は感染は、当業者に とって周知の標準的方法によって起こすことが可能であり、ここで記述されてい るトランスフェクション技術に制限されるわけではない。 さらに、本発明は、上述の血管障害の治療及び予防のための該ＤＮＡ発現ベク ターを含む医薬組成物にも関する。この医薬組成物は、ＤＮＡ発現ベクターに加 えて、医薬的に許容できる担体、安定剤又は緩衝剤を含むことができる。以下の 図は、本発明を説明するのに役立つ。 図１： マウスの誘導性ＮＯシンターゼのヌクレオチド及びアミノ酸配列（ク ローニングされたｃＤＮＡから演繹されたハツカネズミ（Mus musculus）／ほ乳 類、Genbank受入番号第Ｍ９２６４９号）。 図２： ヒトのニューロンＮＯシンターゼのヌクレオチド及びアミノ酸配列（ クローニングされたｃＤＮＡから演繹されたホモ・サピエンス（Homo sapiens） ／ほ乳類、Genbank受入番号第Ｌ０２８８１号）。 図３： ウシの内皮ＮＯシンターゼのヌクレオチド及びアミノ酸配列（クロー ニングされたＤＮＡから演繹されたボス・タウラス（Bos taurus）／ほ乳類、Ge nbank受入番号第Ｍ９５６７４号）。 図４ａ： プラスミドｐＳＰ６５ｈ−ＣＭＶから、さらにプラスミドｐＳＣＭ Ｖを構築するために分離された、ＣＭＶプロモーターを含む２．１７KbのＰｖｕ Ｉ−ＰｖｕIIフラグメント。 図４ｂ： プラスミドｐＳＣＴ ＧＡＬ Ｘ−５５６から、さら にプラスミドｐＣＭＶを構築するために分離された、β−グロビン遺伝子及びＳ Ｖ４０複製起点の２．８０Kbの３′領域を含むＰｖｕＩ−ＰｖｕIIフラグメント 。 図４ｃ： プラスミドｐＳＣＭＶ。 図４ｄ： 図１に従ったＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩフラグメントを含む３．９７K bのｉＮＯＳ。 図４ｅ： プラスミドｐＳＣＭＶ−ｉＮＯＳ。 以下の例により、本発明を、これらに制限することなく、より詳細に説明する 。 例１ Ｉ． 発現ベクターの要素 発現プラスミドｐＳＣＭＶ−ｉＮＯＳは、プラスミドｐＳＯ６５に基づいてク ローニングされた（Promega Biotech）。これは下記の機能要素を含んでいる。 − ヒトサイトメガロウイルスのタンパク質合成前ポリペプチドのプロモーター ／エンハンサー（Pos.２１６−８０９／Genbank受入番号第Ｋ０３１０４号） − マウスの誘導性ＮＯシンターゼのｃＤＮＡ（Pos.１２７−４１１０／Genban k受入番号第Ｍ９２６４９号） − イントロン２、エキソン３及びポリアデニル化シグナルを含むウサギのβ− グロビン遺伝子のゲノミック配列（Pos.９０５−２０８０）（Ｐｏｓ．９０５− １８２７は第Ｊ００６５９号という受入番号でGenbankに保管されている。） − ＳＶ４０ウイルスの複製起点（環状ＳＶ４０地図のPos. ５１７６−１３０又はPos.１３０〔ＳＶ４０初期地図〕／Genbank受入番号第Ｖ ０１３８０号）。 II． 発現ベクターの製造 ＣＭＶプロモーター／エンハンサーは、平滑末端を有するプラスミドｐＳＰ６ ５のＳｍａＩ部位に挿入されたＤＮＡフラグメントとして存在していた（ｐＳＰ ６５ｈ−ＣＭＶ１）。このプラスミドから、ＣＭＶプロモーターを担持するＰｖ ｕＩ−ＰｖｕIIフラグメントを分離した（図４ａ）。 β−グロビン遺伝子の３′領域及びＳＶ４０複製起点を担持するＰｖｕＩ−Ｐ ｖｕIIフラグメント（図４ｂ）を、プラスミドｐＳＣＴ ＧＡＬ．Ｘ−５５６か ら分離した（図４ｂ参照）。このフラグメントを、ｐＳＰ６５ｈ−ＣＭＶ１から のＰｖｕＩ−ＰｖｕIIフラグメントと連結した。結果として得られたプラスミド （ｐＳＣＭＶ、図４ｃ）に、以下の変更を行った。 − ＣｌａＩリンカーの同時挿入を伴う、ＨｉｎｄIIIとＰｖｕIIの間のベクタ ー配列の欠失。これにより、出発切断部位ＨｉｎｄIIIとＰｖｕIIは失われた。 − ＸｈｏＩ切断部位の、ＰｖｕＩ切断部位への変換。 得られたベクターを、ｐＳＣＭＶ２と呼ぶ。 ｉＮＯＳ ｃＤＮＡを、ＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩフラグメントとしてＸｂａＩ −ＳａｌＩで消化されたベクターｐＳＣＭＶ２中にクローニングした（図４ｄ） 。 さらに、５′突出末端を、ＸｂａＩ消化の後の充填によって平滑末端へと変換 した。３′末端において、ｃＤＮＡを、ニワトリから のβ−グロビン遺伝子のイントロン及びポリアデニル化シグナルと融合させた。 構築物の機能性を、まずＣＯＳ細胞のトランスフェクションによって、そしてそ の後、酵素活性の検出によって確認した。結果として得られたプラスミドｐＳＣ ＭＶ−ｉＮＯＳ（図４ｅ）を、トランスフェクシヨン実験に利用した。ＣＭＶプ ロモーターは、ｉＮＯＳ遺伝子の構成的発現を付与する。産生された酵素の活性 は、Ｃａ非依存性である。 III． ＤＮＡリポソーム複合体の製造 センダイ（Sendai）ウイルスの培養は、標準的な方法に従い、（胚発生１０〜 １２日目の）ニワトリ受精卵の漿尿膜液中で行った（Nakanishi M.，Uchida T. ，Sugawa H.，Ishiura M.，Okada Y.，Exp．Cell Res．159，399-409）。 フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン及びコレステロールをテト ラヒドロフラン中に溶解し、４．８：１：２のモル比で混合して、窒素下で蒸発 させた。１０mgの乾燥脂質を、渦流（ボルテックス）によって２００μｌのｐＳ ＣＭＶ−ｉＮＯＳ〔ＢＳＳ（１４０mM ＮａＣｌ、５．４mM ＫＣｌ及び１０mM トリス−ＨＣｌ、pH７．６９）中に溶解したもの〕中に懸濁させた（濃度１μ ｇ/μｌ）。得られたリポソームを、軽く振とうしながら３７℃で３時間、４ml のセンダイウイルス（Ｚ株）（１６０００血球凝集単位（ＨＡＵ）/ml）と共に インキュベートし、その後２０秒間、超音波浴内で音波処理した。使用前にウイ ルスを紫外線（１１J/m²×ｓ）を用いて不活化した。得られた懸濁液を２つのシ ョ糖勾配（ＢＳＳ中のショ糖６０％ １ml、４０％ １ml、３０ ％ ８ml）上に載せ、ＳＷ４０ローター（Beckman Instruments）中で３０，０ ００rpmで３時間、遠心分離した。上層の２mlを収集し、トランスフェクション 実験用として用いた。 IV． トランスフェクションプロトコール インビボでの内皮損傷後における平滑血管筋系の増殖に対するｉＮＯＳの局部 的過剰発現の影響を調べるために、確立されているClowes AW，Reidy MA及びClo wes MM（Lab．Invest．49，327-333，1983）の再狭窄ラットモデルを使用した。 頚部領域において、総頚動脈、並びに総頚動脈が外頚動脈及び内頚動脈に枝分か れする吻側に位置する分岐を準備した。外頚動脈を分岐から約１cm吻側の所で永 久的に結紮し、内頚動脈を血管鉗子によって一次的に結紮した。外頚動脈は、分 岐から約０．５cm吻側の所で切開により開いた。フォガーティ２Ｆ塞栓切除術カ テーテルを、この開口部を通して総頚動脈内に誘導し、膨張させたこのカテーテ ルを３回通過させることによって総頚動脈の内皮を除去した。 「治療群」に対しては、以下の方法を用いた。カテーテルを取り除いた後、分 岐から１．５〜２cm尾側の所で、血管鉗子を用いて露出した血管を閉鎖した。外 頚動脈の開口部から、血管内にポリエチレンカテーテルを組み込んだ。このカテ ーテルを通して、総頚動脈の分離された区域内に、ＤＮＡリポソーム複合体を含 む５０〜１００μｌの溶液を、１５〜２０分以内で注入した。トランスフェクシ ョンの間、血管のこの区域がリポソーム溶液からの圧力に耐えられるように注意 を払った。トランスフェクションカテーテルを取り除いた後、外頚動脈を、血管 切開部に対して尾側で永久的に結紮 し、その後、総頚動脈及び内頚動脈を通じての血液流を、血管鉗子の除去によっ て再度確保した。 Ｖ． 血管の形態学的分析 総頚動脈トランスフェクション後の様々な時点において（２１日目迄）、血管 内の形態学的変化についてラットを検査した。血管を、ＰＢＳ（１４０mM Ｎａ Ｃｌ、１０mM リン酸ナトリウム、pH７．５）中の３％パラホルムアルデヒドで の灌流によって固定し、切片にした。増殖の程度を、対照処理を受けた血管と比 較した。治療を受けた動物において最高６０％の狭窄形成減少が立証された。こ の研究は、この動物モデルにおいて、局部的な遺伝子の過剰発現が、治療的に適 切な血管狭窄の抑制という結果をもたらすことを初めて示し、かつ平滑血管筋系 の増殖阻害に対するＮＯの特別な役割を明らかにしている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/00 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/00 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の生物学的活性を有するタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列及び真核生物性調節要素を含み、前記真核生物性調節要素が 真核細胞において前記ＤＮＡ配列の発現という結果をもたらすことを特徴とする ＤＮＡ発現ベクター。 ２．一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の生物学的活性を有するタンパク質をコ ードするｃＤＮＡ配列及び真核生物性調節要素を含み、前記真核生物性調節要素 が真核細胞において前記ＤＮＡ配列の発現という結果をもたらすことを特徴とす るＤＮＡ発現ベクター。 ３．前記ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列がほ乳類から由来する、請求の範囲第１項又 は２項に記載のＤＮＡ発現ベクター。 ４．前記ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列がヒトＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を構成する、 請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ発現ベクター。 ５．ｃＤＮＡが、図１、図２又は図３に記載の一酸化窒素シンターゼのヌクレ オチド配列を含むか、或いは図１、図２又は図３に記載の一酸化窒素シンターゼ のアミノ酸配列をコードする、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項又は複 数項に記載のＤＮＡ発現ベクター。 ６．前記真核生物性調節要素が真核生物性ウイルスから由来する、請求の範囲 第１項〜第５項のいずれか１項又は複数項に記載のＤＮＡ発現ベクター。 ７．前記真核生物性調節要素が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期遺伝 子のプロモーター及び／又はエンハンサーか ら由来する、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のＤＮＡ発現ベク ター。 ８．前記ＤＮＡ発現ベクターが、図４ｅに記載のｐＳＣＭＶ−ｉＮＯＳを表す 、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ発現ベクター。 ９．前記真核生物性調節要素が、アデノウイルスプロモーター及び／又はエン ハンサー要素から由来する、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項又は複数 項に記載のＤＮＡ発現ベクター。 10．請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項又は複数項に記載のＤＮＡ発現 ベクター及び医薬的に許容可能な担体を含むことを特徴とする医薬。 11．血管障害、高血圧或いは動脈硬化、血管の狭窄又は再狭窄の治療又は予防 のための、請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項又は複数項に記載のＤＮＡ 発現ベクター及び／又は請求の範囲第１０項に記載の医薬。 12．再狭窄が、経皮経管冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の冠状血管の再狭窄で ある、請求の範囲第１１項に記載の医薬。