JPH08511173A

JPH08511173A - バイオリアクターのための培養培地添加物

Info

Publication number: JPH08511173A
Application number: JP7525645A
Authority: JP
Inventors: ゴッフェ，ランダル・エイ
Original assignee: ユニシン・テクノロジーズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1994-04-01
Filing date: 1994-07-26
Publication date: 1996-11-26
Also published as: EP0711339A1; AU7371394A; WO1995027040A1; NO954854L; WO1995027041A1; NO954854D0; CA2163618A1; AU6766994A

Abstract

(57)【要約】安定化されたヘモグロビンまたは過フッ素酸化学乳濁液を含む中空繊維バイオリアクター培養培地が記載される。培養培地は酸素の需要と利用を仲介する。新規な中空繊維および撹拌タンク細胞培養システムの配置、装置および方法が可能となるようにバイオリアクターの効率が促進される。

Description

【発明の詳細な説明】バイオリアクターのための培養培地添加物本出願は、１９９４年４月１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９４／０３６１３の継続出願である。発明の分野本発明は、改良された細胞培養培地および中空繊維バイオリアクターの操作におけるそのような培地の使用に関する。発明の背景中空繊維バイオリアクターは通常ケース内に配置された中空繊維束を含む。細胞はケース内の管腔外空間（extracapillary space）で培養される。栄養培養培地は中空繊維の管腔を通して循環される。従来の技術は、酸素利用、バイオリアクター効率および生産物のグリコシル化レベルを同時に高めるような培養培地の修飾に関する情報を本質的に欠いていた。発明の概要本発明は、酸素需要および利用の媒介に有効であり、中空繊維バイオリアクターの効率を改善させる血液代替物等の酸素キャリアー添加物を含む細胞培養培地を提供する。好ましい添加物は、１ｇあたり少なくとも０.００１ｍＭの遊離酸素を培地に提供する。本発明の一つの態様は、酸素供給器（oxygenator）における酸素の取り込みだけでなく、バイオリアクターの管腔内循環ループにおける酸素放出および二酸化炭素取り込みをも高めるのに有効な血液代替物を有する細胞培養培地を含む。本発明のこの態様により、培地ｐＨの二酸化炭素制御の必要性が制限される。この態様の利点は、適当なコンフルエント状態に到達すると同時に、二酸化炭素−空気混合物の使用によるｐＨ制御が消滅し、空気または純粋な酸素が取って変わることができることである。この態様のさらなる利点は、管腔内空間（intracapil Iary space）を再循環している比較的低濃度の血液代替物によって、生産性が向上し、細胞の生存率が高まることである。本発明の第二の態様は、長時間にわたる中空繊維細胞培養操作のうちの初期段階（接種物増大期（the inoculum expansion phase））にのみ、血液代替物を培地添加物として使用することを内含する。本発明のこの態様は、生存している細胞が迅速に増大して早くコンフルエント状態に到達するように剌激する。適当なコンフルエント状態に到達すると、このような添加物は培地から除去され、細胞の複製速度が減少し、続いて代謝生産期が起こる。本発明のこの態様の利点は、本発明の酸素キャリアー培地添加物の使用によって得られた蛋白質のグリコシル化レベルが高まり一定となること、そして前記グリコシル化レベルは細胞培養物の代謝特性（即ち、低いＬＰＲ／ＧＵＲ率）と相関することである。本発明の他の態様は、撹拌型タンクの細胞培養システムを、管腔内（即ち、管腔の（lumenal））空間を再循環している本発明の酸素キャリアー培地添加物と共に、中空繊維膜ベース酸素化システムを含むように適応させることである。撹拌型タンク中の培地は、充分な撹拌と本発明の管腔内（ＩＣ）培地から供給される酸素の均等な分布を保証する手段を伴い、中空繊維バイオリアクター中の拡張された管腔外空間（ＥＳＣ）と同等の効果をもたらす。図面の簡単な説明図１は、本発明の培地添加物を継続使用した場合の時間経過に伴う細胞生産率をミリグラムデ示した曲線である。図２は、本発明の培地添加物を短時間使用した場合の時間経過に伴う細胞生産率をミリグラムデ示した曲線である。図３は、実施例１の実施に使用された市販されているバイオリアクターシステムの概略図である。図４は、市販用の安定化されたウシヘモグロビン（ＥＲ１）（０.１％Ｗ／Ｖ）のグルコース取り込み率（ＧＵＲ）における影響を示す。図５は、市販用の安定化されたウシヘモグロビン（ＥＲ１）（０.１％Ｗ／Ｖ）の、乳酸生産率（ＬＰＲ）のグルコース取り込み率（ＧＵＲ）に対する割合における影響を示す。図６は、安定化されたウシヘモグロビン（ＥＲ１）（０.１％Ｗ／Ｖ）の蓄積ＩｇＧ₁生産における影響を示す。図７は、ＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ／ＢＲ１１０／ＯＸＹ−１中の３Ｃ１１ハイブリドーマによる抗体の生産におけるＥＲ−１濃度の影響を示す。図８は、培養物中の３Ｃ１１ハイブリドーマの代謝特性（即ち、ＬＰＲ／ＧＵＲ率）におけるＥＲ−１濃度の影響を示す。図９は、３Ｃ１１ハイブリドーマのＩｇＧ１生産を高めるための、（０.１％における）種々の培地添加物の相対的な能力を示す。図１０は、種々の培地添加物に対するＬＰＲ／ＧＵＲ率を示す。図１１は、０.１％ＥＲ−１を細胞増大期に様々な異なる継続時間使用した場合に抗体生産に与える効果を示す。図１２は、抗体生産におけるＥＲ−１の効果のスケールアップしたものを示す。図１３は、大型中空繊維バイオリアクターシステムにおいてＥＲ−１の使用が抗体生産および細胞生存率の両方に与える正の影響を示す。図１４は、通常の培地システムとＥＲ−１を含む大規模の中空繊維バイオリアクターシステムとにおけるＩｇＧ₁生産率を比較したものである。図１５は、細胞をＥＲ−１から隔離する膜のＩｇＧ₁生産における効果を示す。図１６は、細胞をＥＲ−１から隔離する膜を使用した場合と使用しない場合の細胞の代謝特性（ＬＰＲ／ＧＵＲ）を比較したものである。図１７は、種々の異なる濃度のウシヘモグロビン（Ｈ２６２５）を用いた定常培養中の３Ｃ１１細胞の生存曲線を含む。図１８は、種々の異なる濃度のＥＲ−１を用いた定常培養中の３Ｃ１１細胞の生存曲線を含む。図１９は、種々の異なる濃度のＦｏｒｍｕｌａ−１を用いた定常培養中の３Ｃ１１細胞の生存曲線を含む。図２０は、種々の異なる濃度のＰＦＣを用いた定常培養中の３Ｃ１１細胞の生存曲線を含む。図２１は、増長期に５日間ＥＲ−１を使用した場会のｒＣＨＯ細胞によるデコリンの累積生産を、ＲＧＤペプチドでコートしたバイオリアクター繊維の場合および非コートコントロールと比較して示したものである。図２２は、種々のｒＣＨＯ細胞上清サンプルに関し、デコリン標準との比較グリコシル化パターンを示したものである。図２３は、本発明を撹拌タンク細胞培養システムへの応用する態様を示す概観図である。本発明の詳細な説明天然のヘモグロビンは、酸素のキャリアーであるにもかかわらず赤血球外では不安定である。ヘモグロビンの分解産物は酸素のキャリアーとして有効でなく、かつ腎臓に対して有害である。本発明は、メテモグロビン（methemoglobin）等の実質的な分解産物を実質的に含まない（例えば、１０重量％以下）種々の安定化されたヘモグロビン、並びにヒト血液代替物として有用であることが知られている過フッ素酸化学乳濁液を細胞培養栄養培地添加物として使用することを内含する。本発明で有用な安定化されたヘモグロビンおよび過フッ素酸化学乳濁液は、以下に挙げる会社から示した商品名または商標で購入可能である。本発明は、０.００００１から５.０％、好ましくは０.００１から０.５％Ｗ／Ｖの安定化されたヘモグロビンまたは過フッ素酸化学乳濁液を含む細胞培養培地を提供する。特に好ましい培養培地は、０.００００１から０.１％（Ｗ／Ｖ）の範囲の安定化されたヘモグロビンまたは過フッ素酸化学乳濁液を含む。図１および２が示すように、本発明の培地添加物は継続して、または短期間だけ、即ち接種物の増大期にのみ好ましい濃度範囲の最大濃度で使用することができる。継続して使用した場合、細胞、即ち生体分子とウイウス粒子の双方が比較的多量に迅速に生産される。血液代替物の好ましい濃度範囲の最高濃度における最適な実行を行った場合、生存期間は短いかもしれない。最適な実行を恒常的に長時間保つためには、適用する添加物の濃度は驚くべきほど低いことがわかった（例えば、ＥＲ−１に関しては０．００００１％）。（好ましい濃度範囲の最大濃度、例えば０.１％ＥＲ−１における）本発明の添加物を含む培地の短期間の使用は、接種物増大期中の細胞接種物の迅速な増大を可能にする。この後、代謝生産期にはそのような添加物が存在しなくても、長期間最適の生体分子生産が行われる。中空繊維バイオリアクター培養培地中における各血液代替物の最適濃度は、（ｉ）酸素の結合および放出効率、（ii）安定化の程度、（iii）培地粘度における濃度の影響、（iv）相対的細胞毒性、および（ｖ）酸素分圧を含む種々の因子によって影響される。実施例１ 3C11ハイブリドーマ（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC ）寄託番号HB8511）を用いた、30日間の細胞培養実験を記述する。この細胞培養の回収において重要な生産物は、放射免疫拡散分析（RID）により定量される、マウスのモノクローナル抗体IgG₁である。実行１は、図３にしめすような、商業的に入手可能な、ＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ^TM小型バイオリアクターシステムを、ＵｎｉＳｙｎＯＸＹ−１酸素供給器（1.0 ft²，0.2 μｍ孔径のポリエチレン繊維）を備えたＵｎｉＳｙｎ（ユニシンテクノロジー（有）、14272フランクリンアベニュー、ツスチン、カリフォルニア、92680）BR 110バイオリアクターカートリッジ（1.5ft²セルロース中空繊維）と共に用いた。このシステムは、一定の温度（37℃）を保つためオーブンのなかに設置された。バイオリリーステクノロジー（有）（Biorel ease Technologies Inc.，セーレム、ニューハンプシャー）より購入した、0.1 ％（w/v）Ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎ^TM（ウシのヘモグロビンER-1の安定化型）が以下に述べる細胞培養培地に加えられた。この培地は、バイオリアクターおよび酸素化システムの双方のカートリッジのファイバー内腔を通して再循環され、培地貯蔵器に戻された。培地の流路は、図３において矢印で示されている。あらかじめ混合されたCO₂および空気を、約75mL（std）/分の流速で、培地再循環のループの流れとは逆方向に、OXY-1の管腔外空間（ECS）に流した。培地のpH、はCO₂ と空気の流速を、それぞれ調節することにより、7.0から7.4の範囲に制御された。参照として、実行２では、ＵｎｉＳｙｎＯＸＹ−１酸素供給器を備えた同様のＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ^TM ＢＲ１１０小型バイオリアクターを、細胞培養培地へのウシのヘモグロビン添加をおこなわずに使用した。実行２のシステムは、一定の温度（37℃）を保つため、オーブンの中で組み立てられた。あらかじめ混合された空気およびCO₂を、OXY-1酸素供給器のECSを通して、約70m L（std）/分の流速で、培地の再循環ループの流れと逆方向に、流した。pHを7.0 から7.4の間に制御するため、CO₂の空気に対する比率は、２個のガス流量計のバルブを用いて調節した。実行３では、ＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ^TM ＢＲ１１０小型バイオリアクターを、ＯＸＹ−１酸素供給器の代わりに拡散による酸素の物質移動のためのシリコンチューブと共に用いた。このバイオリアクターは、一定の温度（ 37℃）を保つため、CO₂インキュベーターのなかに設置された。培地の定常pH（7 .0-7.4の間）は、CO₂インキュベーター内を、ＣＯ₂を７％、空気を９３％の比に設定することにより確立した。培地条件：実行１− 管腔内空間（Intracapillary space，ＩＣＳ）−５％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン＋ 1.03ｇＥＲ１をＤＭＥＭ（Duibecco's Modified Eagle's高グルコース（4.5g/L ）基本培地 1000mL中に加えたもの。ＥＣＳ−20% FBS＋4mM グルタミン＋１００Ｋユニットペニシリン/100m g ストレプトマイシンをDMEM 1000mL中に加えたもの。実行２及び３− ＩＣＳ−５％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋１００ｋユニットペニシリン／１００mg ストレプトマイシンをDMEM 1000mL中に加えたもの。ＥＣＳ−実行１に用いたものと同一。５×10⁸個の3C11細胞を含む接種物（生存率89%）を、18ゲージの針をつけた、２本の滅菌された10mLのシリンジを用いて、BR110 バイオリアクターのECSに注入した。片方のシリンジは、5mLのECS培地と細胞を含む。他方は空で、接種中に置換された培地を集めるのに用いられた。実行２と３は共に、4.5×10⁸個の3C11 （生存率97%）を、上述した方法により、ECSに注入した。ＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ^TMバイオリアクターシステムのための、細胞培養の日常の保守に関する標準的な操作方法が、３つの全ての実行期間中を通して行われた。細胞培養システムの工程パラメーターは、グルコースの取り込み、乳酸の生成、NH₃の生成および、モノクローナル抗体（MAb）の生成をモニターするように、設定された。BR 110 バイオリアクターのICSから採取された、グルコース、乳酸とNH₃は、コダックＥｋｔｃｈｅｍ分析器を用いて分析された。BR 110 バイオリアクターのECSからのMAbの回収は、全実行期間を通じ、毎回10mL、週３回の頻度で行われた。BR 110のICSに用いられた培地は、培地中のグルコース濃度が1.5g/L以下に落ちるか、または、乳酸濃度が20mMより高くなったとき、新しい培地と入れ換えられた。中空繊維バイオリアクター中の時間に対しての細胞の増殖を直接予測することはできないので、グルコースの取り込み率（GUR）および乳酸の生産率（LPR）が、物質代謝の指紋として用いることができる。この方法は妥当なものと思われる。なぜなら、特定のGURは細胞の対数増殖期において一般的に一定であるように見えるからである。したがって、同一操作条件下に於ける、実験（実行１）における参照実験（実行２及び３）と比較してのより高いGU Rは、細胞の成長および／または生産性の増加の表示として用いることができよう。図４に、三つの実験実行の全てで得られたGURをしめす。バッチ操作のため、G URは、培地の入れ替えごとに、周期的に変わるように見受けられる。実行１のGU Rは、最初の15日間において、他の二つの実行に比べ、有意に高いようである。比較的高い溶解酸素濃度（ヘモグロビンの再循環による）が、より多くのグルコースを利用する機会を、細胞に与えている。計測はされなかったが、（ヘモグロビンにより）バイオリアクターからCO₂を運び去り、酸素供給器（即ち、ガス交換器）へ戻す事が、同時に起こっていると仮定される。細胞培養実験を始めて15日後、実行１に於ける細胞量は、非常に大きくなり、 ECSの取り出し口から、回収することもサンプルを取ることも困難になった。 LPRのGURに対する比は、細胞培養液の相対的通気状況を反映している。図４で、実行２及び実行３に比べ、実行１において最低の比率を示している。このデータは、酸素の供給を改善することにより乳酸の生成が効果的に減少する事、即ち、グルコースがより効率よくCO₂と水に代謝されることを示している。図５は、三回の実行について蓄積された抗体の生成量の差を示している。0.1% （w/v）のウシヘモグロビンをBR 110/OXY-1システムに添加することにより、ほぼ２倍のIgG₁生成の増加が達成された（即ち、実行１と実行２の比較）。同様の結論が、実行１と実行３の比較でも導かれる。また、図３は、15日後には、詰まり過ぎた細胞が死に始めるため、抗体の生産性が目覚ましく低下する事を示している。この結論は、図３の実行１の15日から30日目のGURを調べることにより裏づけられる。実施例２この実施例では、3C11ハイブリドーマ細胞の増殖が記述される。培地上清中の IgG₁抗体生成物は、放射免疫拡散分析（RID）によって測定された。 OXY-1酸素化システムを備えたＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ^TM BR 11 0バイオリアクターシステムは、細胞を培養するため、実施例１及び図３に記述した様式により組み立てられた。接種に先立ち、それらのシステムを、グリセリンを洗い落とすため、1000mLの基本IC培地で、一晩洗浄した。洗浄後、2000mLの新しいIC培地を貯蔵器に無菌状態で注入した。 30日間の実験を５回、前もって滅菌したER-1をさまざまな量だけIC培地に添加し、実施した。IC培地中のER-1の濃度は、０、０.０００１、０.００１、０.０１および０.１％（ｗ／ｖ）が用いられた。培地条件：実行１（参照実験）：ＩＣＳ：５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋４ｍＭグルタミン＋１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシンを，DMEM（Dulbecco's Modif ied Eagle's高グルコース（4.5g/L）基本培地）1000mL中に加えたもの。ＥＣＳ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシンを、ＤＭＥＭ１０００ｍＬ中に加えたもの。実行２ＩＣＳ：１.０３ｍｇのER-1を、実行１で用いた培地と同じものに加えたもの。ＥＣＳ：実行１で用いた培地と同じもの。実行３ＩＣＳ：１０.３ｍｇのER-1を、実行１で用いた培地と同じものに加えたもの。ＥＣＳ：実行１で用いた培地と同じもの。実行４ＩＣＳ：１０３.０ｍｇのER-1を、実行１で用いた培地と同じものに加えたもの。ＥＣＳ：実行１で用いた培地と同じもの。実行５ＩＣＳ：１.０３ｇのER-1を、実行１で用いた培地と同じものに加えたもの。ＥＣＳ：実行１で用いた培地と同じもの。５×10⁸個の生細胞を含む接種物（生存率９０％以上）を、２本の滅菌されたシリンジを用いて、実施例１に於いて記述したようにして、BR 110バイオリアクターのECSに注入した。ＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ BR110バイオリアクター/OXY-1酸素供給器システムは、標準的な操作方法に従い操作し、サンプルは、前述したように（実施例１）、採取され分析された。 BR 110バイオリアクターのECSからのMAbの回収は、最初の日から始まり、最初の一週間は毎日取り続けられた。その後、採取は、典型的には一日置きに毎回10 mLの量で実行の残りの期間を通しておこなわれた。図７は、ER-1の添加を行ったものと行わないものの５回の異なる実行について、30日間に蓄積された抗体の生成の差を示す。ER-1の添加を行わなかったケースである実行１と比較し、ほぼ1.5倍のIgG₁生成の増加が、0.1_%（w/v）のER-1を、 BR 110/OXY-1システムに添加することにより、達成された（実行５）。驚くべき事に、0.0001%（w/v）のER-1を、BR-110/OXY-1システムに添加したときに（実行２）、同様のIgG₁生成の増加が観察された。これは、実施例２における、最低の添加量である。このような驚くべき結果は、ER-1をIC培地に適用したとき、参照実験（実行１）との比較において、細胞の増殖が昂進したことによって、説明される。接種物の急速な増大は最初の10日以内に起こり、15日目までには、空間の制約から、IgG₁生成の減少が生じ得る。低いER-1濃度においては（即ち0.0001% ，実行２），空間の制約は、劇的におそくなる。なぜなら、最初の接種物に対しより少ない酸素しか供給されない事により、増大がよりはっきりしなくなるからである。以上の事から、ER-1濃度がより低い場合、高い生存率を保ちながら細胞集団への酸素の供給を適当に行うことができるので、全体としての（長期の）バイオリアクターの性能は改善される。しかしながら、実行３及び４においては、最初の10日間に達した細胞密度が、最適な性能を維持する為のＥＲ−１濃度の酸素運搬能力に対し高すぎた。それゆえに、ＩｇＧ₁の生成は実行５と同様、最終的には低下した。これらの結果については、表１にさらに詳細に例示されている。図８は、LPRのGURに対する比が、実行２−５のようにER-1の濃度が増加するにしたがって、ほとんど直線的に低下することを示している。これらの結果は、ER -1濃度の増加にともない、培地が益々好気性となることを強く示唆しており、そしてそれゆえに、生物薬剤（biopharmaceuticals）に対する効率の良い、一貫したグリコシル化パターンが望まれる。実施例３ＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ^TM BR 110小型バイオリアクターシステム（1.5ft²，10kDセルロース中空繊維）を、何等改変せずに用いた。ガス交換の手段は、製造業者によってICSループに設置されたある長さを持ったシリコン管である。６回の30日にわたる3C11細胞培養の実行が、５種類の異なった血液代替物を0.1%（w/v）IS培地に加えてなされた。システムは、37℃の一定の温度を保つため、CO₂インキュベーター内に設置され、IC培地のpHの7.0.から7.4の範囲での調整は、CO₂インキュベーター内の空気中のCO₂を、7%に設定することにより確立した。培養システムの洗浄には、100mLの基本IC培地を一晩用いた。培地条件：実行１（参照実験）ＩＣＳ：次のものから成る完全培地：５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋４ｍＭグルタミン＋１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシンを，DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's高グルコース（4.5g/L）基本培地）１０００ｍＬ中に加えたもの。ＥＣＳ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシンを、ＤＭＥＭ１０００ｍＬ中に加えたもの。実行２ＩＣＳ：完全培地＋シグマより購入したウシのヘモグロビン，Ｈ２６２５（ＢＨ）１.０ｇＥＣＳ：実行１で用いたものと同じ物。実行３ＩＣＳ：完全培地＋エンゾン社（Enzon Inc.）からサンプルとして入手したポリエチレングリコール６％ヘモグロビン溶液（ＰＥＧ−Ｈｂ）２０ｍＬＥＣＳ：実行１で用いたものと同じ物。実行４ＩＣＳ：完全培地十バイオピュア社（Biopure Corp.）からサンプルとして入手したＦｏｒｍｕｌａＯｎｅ^TM（Ｆｏｒｍｕｌａ−１）とよばれる11.0%（ w/v）ウシのヘモグロビン１０ｍＬＥＣＳ：実行１で用いたものと同じ物。実行５ＩＣＳ：完全培地＋ヘマゲン（HemaGen/PFC）からサンプルとして入手した４０％（ｖ／ｖ）オキシフルオール（Oxyf1uor^TM）過フッ素酸化学乳濁液（PF C）１０ｍＬ．ＥＣＳ：実行１で用いたものと同じ物。実行６ＩＣＳ：完全培地＋バイオリリーステクノロジー（Biorelease Technol ogies，Inc.）から購入したエリトロゲン（Erythorogen^TM）と呼ばれる１０.３％（ｗ／ｖ）ウシのヘモグロビン（ＥＲ−１）１０ｍＬＥＣＳ：実行１で用いたものと同じ物。５×10⁸個の3C11ハイブリドーマ生細胞を含む接種物（生存率９０％以上）を、２本の滅菌されたシリンジを用いて、前記実施例に於いて記述した方法で、BR 110バイオリアクターのECSに注入した。これらの実行に於ける、育成、保守、サンプル採取およびサンプルの分析は、ＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅＢＲ１１０バイオリアクターの標準的な操作方法に従った。ＢＲ１１０バイオリアクターのECSからのMAbの回収は、最初の日から始まり、最初の一週間は毎日取り続けられた。その後、回収は実行の残りの期間を通して典型的には一日置きに、毎回10mLずつ行われた。グリコ社（Glyco，Inc.，ノヴァト、カリフォルニア）から入手した、N-リンクオリゴサッカライドプロファイリングキット（90000/90010）FACE^TMテストキットを用いて、選択された実行で生産されたIgG₁のグリコシル化パターンを決定した。実行１、５及び６からの蓄積された生産物は、ＵｎｉＳｙｎＡｖｉｄＡＬ^TMアフィニテイークロマトグラフのゲルを用い、あらかじめ精製された。グリコFACE技術を用いたN-リンクオリゴ糖分析サンプルの調製１．５００μｌの各サンプルを、スピンフィルターを用いて、濃縮する。２．スピードヴァック内で、サンプルを乾燥する。オリゴ糖の分離３．バッファー、ＳＤＳとβ-メルカプトエタノール４５μｌ中に、再懸濁する。４．室温で、10分間インキュベートする。５．ＮＰ−４０界面活性剤および、ペプチド N-グリコシダーゼ F（酵素）を添加する。６．３７℃で、一晩インキュベートする。７．スピードヴァックでサンプルを乾燥する。オリゴ糖のフルオロフォアによる標識８．フルオロフォア（ANTS）５μｌを添加する。９．還元剤５μｌを添加する。１０．３７℃で一晩インキュベートする。１１．スピードヴァックでサンプルを乾燥する。電気泳動用サンプルの調製１２．水１０μｌを添加する。１３．２×ロードバッファー10μｌを添加する。１４．４μｌのサンプルをゲルにのせる。これは、原料の100μｌに相当する。電気泳動１５．Ｎ−リンクゲルを、５℃、20maで、一時間、電気泳動する。図９は、30日間にわたる、血液代替物を用いた、および用いなかった６回の実行の全てに関する、蓄積された抗体生成の差を示している。0.1%（w/v）のER-1 をBR 110システムに添加することにより（実行６）、参照実験の実行１と比較して、ほぼ2.0倍のIgG₁生成増加が達成された。実行５で0.1%（v/v）のPFCを添加することにより、参照実験（実行１）に対して、1.8倍のIgG₁生成増加が、観察された。図１０は、物質代謝の表示としてLPRのGURとの比を、６回の実行全てについて示している。他の５回の実行と比較して、実行１でのより高い比率は、乳酸の代謝が、バイオリアクター中の高い細胞密度により必要とされる酸素量に比較して、酸素供給が低い事によって、増加していることを示唆している。他方、実行５で得られたより低い比率は、0.1%のPFC添加により、酸素が適当に供給されることによって、乳酸の代謝が効果的に減少していることを示している。表２に示す精製されたIgG₁産物（実行１、５及び６より）に対するグリコシル化試験の結果は、PFCが、MAbの生産性を増大させるのみでなく、グリコシル化の度合いおよび、潜在的には該分子の生理活性も、増大することができることを示している。この事は、図10の、他の全ての実行と比較してより低いLPR/GUR比（即ち、0.59）を示す物質代謝の表示と直接的に相関している。実施例４ＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ（商標）ＢＲ１１０小型スケールバイオリアクター（１.５ｆｔ.²、１０ｋＤセルロース中空繊維）およびＯＸＹ−１酸素供給器（１.０ｆｔ.²、０.２μｍ孔径のポリエチレン酸素化繊維）を含む培養システムを、図３に示したようにＩＣ培地流路に沿って無菌的に構築した。このシステムをオーブン内に配置し、実施例１で詳述したように作動させた。３種の３０日実行を、０.１％（Ｗ／Ｖ）Ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎ（ＥＲ−１）を接種後の種々の異なる期間添加して、または添加せずに行った。実行１（コントロール）ＩＣＳ：以下のものを含む完全培地：５％ウシ血清培地（ＦＢＳ）＋４ｍＭグルタミン＋１０００ｍＬＤＭＥＭ（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の修飾イーグル高グルコース（４.５ｇ／Ｌ）基本培地）中の１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン＋０.１％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１をＢＲ１１０中の細胞培養の最初の１日間加える。その後は実行の間、ＥＲ−１を完全培地から除く。ＥＣＳ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋１０００ｍＬＤＭＥＭ中の１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン実行２：ＩＣＳ：完全培地＋０.１％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１をＢＲ１１０中の細胞培養の最初の３日間加える。その後は実行の間、ＥＲ−１を完全培地から除く。ＥＣＳ：実行１に用いたのと同じ。実行３：ＩＣＳ：完全培地＋０.１％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１をＢＲ１１０中の細胞培養の最初の５日間加える。その後は実行の間、ＥＲ−１を完全培地から除く。ＥＣＳ：実行１に用いたのと同じ。５×１０⁸生存３Ｃ１１ハイブリドーマ細胞（９０％以上の生存率）を、実施例１で既に記載したように、各ＢＲ１１０バイオリアクターのＥＣＳに注入した。細胞培養を日々保持するために、３種の実行全てについてＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅＢＲ１１０バイオリアクター／ＯＸＹ−１酸素供給器システムの標準操作工程に従った。ＢＲ１１０のバイオリアクターのＥＣＳからのＭＡｂの回収を第一日目から開始し、最初の１週間毎日回収を行った。続いて、回収は典型的には１日置きに行い、実行の残りの期間中、１回当たり１０ｍｌの容量を取り出した。図１１は、接種後の異なる期間に加えられ、よって異なる細胞増大期を定めるＥＲ−１を添加した場合の蓄積する抗体生産の相違を示す。最初の１０日間に同様のＭＡｂ生産が観察された。ＥＲ−１を一時的に使用する期間が増加する程、蓄積生産は減少した。これは、ＥＲ−１を（１−３日に対して）５日間使用すると非常に大きな細胞が得られることに因る。増大した酸素運搬能力をＥＲ−１をＩＣＳ培地から除くことにより一旦止めると、慣用されているバイオリアクターシステムは通常の細胞より大きい細胞について生産率を同じに保つことができなかった。１−３日目の間に最大となると思われ、ＩＣＳ培地に０.１％ＥＲ−１を加えた場合も加えない場合も生産率は変化しなかった。実行１では実行３と比較してＭＡｂ生産の１.５倍増加が観察された。長期間の生産については、０.１％ＥＲ−１を全期間中使用した場合（実行５）よりも、１−３日間使用した場合の方が効率がよいであろうと予想される。実施例５ＭＡｂ生産用ＩＣ培地中に生物学的酸素キャリアーを加えた、スケールアップした中空繊維バイオリアクターシステム中で培養した懸濁液タイプの細胞系の増殖について記載する。細胞系はマウスハイブリドーマ３Ｃ１１である。放射性免疫拡散（ＲＩＤ）分析によって培養上清中のＩｇＧ₁抗体生産物を測定した。実行１ではこの研究のために、ＢＲ１９１０中空繊維バイオリアクター（１. ９ｆｔ²、１０ｋＤセルロース中空繊維）およびＯＸＹ−１０酸素供給器（１０ｆｔ²、平均０.２μｍ孔径のポリエチレン酸素化繊維）を伴うＵｎｉＳｙｎＣｅｌｌＰｈａｒｍ（商標）２０００細胞培養装置が選択された。培養システムは一般に”操作マニュアル”に記載されているように、滅菌され、組み立てられ、付属品および制御装置に接続され、燃料を注入され（ｐｒｉｍｅｄ）、洗浄された。Ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎ（商標）（ＥＲ−１）と呼ばれる０.０１％（Ｗ／Ｖ）ウシヘモグロビンを用いてＣｅｌｌＰｈａｒｍ（商標）２０００／ＢＲ１９１０バイオリアクター中で、３０日の実行を１回行った。実行の初めの１５日間にＩＣ灌流培地にＥＲ−１を添加した。対照として、１つのＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ（商標）小型スケールバイオリアクター（１.５ｆｔ²、１０ｋＤセルロース中空繊維）およびＯＸＹ−１酸素供給器（１.０ｆｔ²、０.２μｍのポリエチレン酸素化繊維）を使用した（実行２）。このシステムをオーブン中に配置し、実施例１に既述したのと同様に作動させた。ＩＣ再循環培地中にあらかじめ滅菌した０.１％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１を添加して３０日実行を１回行った。培地条件：実行／ＢＲ１９１０ＩＣＳ：５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋４ｍＭグルタミン＋２０ＬＤＭＥＭ（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の修飾イーグル高グルコース（４.５ｇ／Ｌ）基本培地）中の２００ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン溶液＋２０ｍＬの１０.３％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１を細胞培養の最初の１５日間加える。その後は実行の間、ＥＲ−１をＩＣ培地から除く。ＥＣＳ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋１０００ｍＬＤＭＥＭ中の１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン実行／ＢＲ１１０ＩＣＳ：５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋４ｍＭグルタミン＋１０００ｍＬＤＭＥＭ中の１００Ｋユニットペニシリン／ストレプトマイシン溶液＋１.０ｍＬの１０.３％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１ＥＣＳ：実行／ＢＲ１９１０で使用したものと同じＢＲ１９１０およびＢＲ１１０バイオリアクターのＥＣＳに、２２ゲージ（ｇｕａｇｅ）針を伴う２本の無菌の１０ｍＬシリンジを用い、５×１０⁸生存細胞（生存率９０％以上）を含む接種物を、これらのバイオリアクターのＥＣＳの後に注入した。ＢＲ１１０のＥＣＳを洗浄するのに２０ｍＬのＥＣ培地を使用し、Ｂｒ１９１０には１８０ｍＬのＥＣ培地を使用した。片方のシリンジは５ｍＬのＥＣ培地と細胞を含んだ。もう片方のシリンジは空であり、接種中に置き換えられた培地を集めるのに使用された。実行に際し、培養された細胞を日々維持するためにＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅＢＲ１１０バイオリアクター／ＯＸＹ−１酸素供給器システムの標準的な操作工程に従った。培養実行の１日目にＢＲ１１０バイオリアクターのＥＣＳからＭＡｂの回収を開始し、最初の１週間毎日回収を継続した。その後は典型的には１日おきに回収を行い、実行の残りの期間中１回あたり１０ｍＬの容量を回収した。ＢＲ１９１０のＥＣＳからのＭＡｂの回収は、実行の間１回あたり６０ｍＬの容量を回収した。トリパンブルー排除／ヘマサイトメーター法を用いて各回収物における細胞の生存率を測定した。グルコース取込み、乳酸生産、ＮＨ₃生産およびＭＡｂ生産をモニターするために細胞培養システム中に工程パラメーターを設定した。ＫｏｄａｋＥｋｔａｃｈｅｍ分析機を用いてシステム外でグルコース、乳酸およびＮＨ₃分析を行うためにＢＲ１１９バイオリアクターのＩＣ培地から定期的に試料を回収した。ＢＲ１１０のＩＣＳ中で使用される培地は、培地中のグルコース濃度が１.５μｇ／Ｌより低くなるか、または乳酸濃度が２０ｍＭより高くなった場合に新鮮な培地と交換した。ＢＲ１１９０バイオリアクターの実行中、再循環速度は４００ｍＬ／分に設定した。この場合、ＢＲ１９１０の各繊維の管腔中のＩＣ培地の流速は、ＢＲ１１０中で使用されたのと同じであった。ＩＣ培地の灌流速度（perfus ion rate）は、接種後１.０Ｌ／日で開始された。この速度は、グルコース消費および乳酸生産等の細胞代謝の速度に応じて徐々に上げられた。７日後に最大灌流速度は５.０Ｌ／日到達し、実行中維持された。図１２は、中空繊維細胞培養ＩＣ培地中に使用されたＥＲ−１の規模依存性（ｓｃａｌｅａｂｉｌｉｔｙ）を示す。これは中空繊維が最初に使用されてから２０年間で初めて、その直線的な規模依存性を示すものである。従って、主に培養の最初の１５日間を考慮した場合、繊維表面面積が１.５ｆｔ²から１９ｆｔ² に増加するに伴い、生産率が約１０倍に増加した。１５日以降、実行１ではＩＣ培地からＥＲ−１を取り除いた。図１３は、回収物中における生産率および細胞生存率の双方に対するＥＲ−１の影響を顕著に示している。ＥＲ−１を取り除くまでは生存率は８０％以上であり、他のバイオリアクターの接種物として利用するのに適当であった。さらに、細胞培養物におけるそのように高い生存率および高い細胞密度は、高い生産物濃度（例えば、生物的薬剤）および生存粒子（例えば、ベクター）の高い力値という結果をもたらすこととなる。実行１においてＩＣ培地からのＥＲ−１の除去後、生存率は通常の中空繊維システムの典型的なレベルまで急速に下がった。同様に、日々の回収物中の抗体濃度および、従って蓄積生産率も顕著に減少した。実施例６２回の２５日ハイブリドーマ細胞培養実験を記載する。細胞はＡＴＣＣ（ＨＢ８５１１）から得られたマウスハイブリドーマ３Ｃ１１で、これは細菌ペプチドグリカンに対するモノクローナル抗体ＩｇＧ₁を分泌する。細胞上清中のこのＩｇＧ₁抗体生産物は、放射性免疫拡散（ＲＩＤ）分析によって測定する。実行１および２ではスケールアップしたＢＲ３５１０バイオリアクター（３５ｆｔ²、１０ｋＤセルロース中空繊維）およびＯＸＹ−１０酸素供給器（１０. ０ｆｔ²、０.２μｍポリエチレン酸素化繊維）を伴うＵｎｉＳｙｎＣｅｌｌＰｈａｒｍ（商標）２０００システムを使用した。培養システムは一般に”操作マニュアル”に記載されているように、滅菌され、組み立てられ、付属品および制御室に接続され、燃料を注入され、洗浄された。０.０１Ｌ％ＥＲ−１（Ｗ／Ｖ）濃度をＩＣ培地に加えた。両実行においてＩＣ培地はＵｎｉＳｙｎ'ｓＨｙｂｒｉｄＧｒｏｗ（商標）（ＨＧ）基本培地であった。実行１においてのみＥＲ−１が培地に添加された。培地条件：実行１：ＩＣＳ：５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋２ｍＭグルタミン＋２０ＬバッグのＨＧ基礎培地（高グルコース（４.５ｇ／Ｌ））中の２００ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン溶液＋２０ｍＬの１０.３％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１ＥＣＳ：２０％ＦＢＳ＋２ｍＭグルタミン＋１０００ｍＬＨＧ中の１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン実行２：ＩＣＳ：高グルコース４.５ｇ／Ｌ（４ｍＭグルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン）を含む２０ＬバッグのＨＧ完全培地ＥＣＳ：２０％ＦＢＳ＋１０００ｍＬのＨＧ完全培地５×１０⁸生存細胞（生存率９０％以上）を含む接種物を実施例５で既述したようにＢＲ３５１０のＥＣＳに注入した（実行１）。実行２では、１×１０⁹生存細胞（生存率９０％以上）を含む接種物をＥＣＳに適用した。試料を回収し、既に記載した方法に従って分析した。ＢＲ３５１０バイオリアクターのＥＣＳからのＭＡｂの回収は１日目に開始し、実行１の期間中１回当たり１２０ｍＬの容量の回収を毎日継続した。実行２では典型的な回収は、１回当たり６０ｍＬの容量をウィークデー毎に（１週間につき５回）回収することにより行った。実行１におけるＩＣ培地の灌流速度は、細胞接種後１.０Ｌ／日で開始し、細胞代謝の速度に従って日々増加した。最大灌流速度は８日後に６.０Ｌ／日到達し、実行中維持された。ＢＲ３５１０のＩＣＳの管腔を通るＩＣ再循環培地は７００ｍＬ／分に設定され、１４日目に８００ｍＬ／分まで上げられた。実行２には、ＢＲ３５１０を通るＩＣ再循環培地は９９９ｍＬ／分に設定され、灌流速度は４日目以降５.０Ｌ／日に固定された。図１４は、３５ｆｔ²バイオリアクター（実行１）においてＥＲ−１が、同様のバイオリアクターシステム中の慣用された培地と比較して、ＩｇＧ₁生産に影響を与えることを示す。表３は、イソタイプ（ＩｇＧ₁）特異的および非イソタイプ特異的な、あるいは一般的な（ＩｇＧ₁）ＲＩＤプレートを用いてて定められた生産率の点における，ＥＲ−１を使用することの経済的利益を示す。典型的には、３Ｃ１１細胞から生産物について２つのタイプのＲＩＤプレートにおいて、７の相違を有する因子がある。このような大きな不一致は極めて稀であるが、本ケースの場合には再現的に生じる。異なる細胞培養法の間で比較を行う場合、典型的には一般のＩｇＧＲＩＤプレートが分析に使用される。これに基づくと、典型的な３０Ｌ撹拌タンクと比較して、実験は抗体１グラム当たり実質的に低い値段で行えることを示す。慣用された中空繊維細胞培養システムは、以前は決して撹拌タンクに勝ることはできなかった。実施例７本実験の３つの実行全てにおいて、ＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ（商標）ＢＲ１１０小型バイオリアクター（１.５ｆｔ² １０ｋＤセルロース中空繊維）を適用した。３７℃の定温を維持するためにこのシステムをＣＯ₂インキュベーター中に配置し、ＣＯ₂インキュベーター中の空気を７％ＣＯ₂に設定することにより、ＩＣ培地のｐＨを７.０から７.４の範囲に制御した。各ＩＣ培地にあらかじめ滅菌した０.１％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１を添加して３０日の実行を３回行った。培地条件実行１：ＩＣＳ：以下のものを含有する完全培地：５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋４ｍＭグルタミン＋１０００ｍＬＤＭＥＭ（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の修飾イーグル高グルコース（４.５ｇ／Ｌ）基本培地）中の１００ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシンＥＣＳ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋１０００ｍＬＤＭＥＭ中の１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン実行２：ＩＣＳ：完全培地＋１０ｍＬの１０.３％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１ＥＣＳ：実行／ＢＲ１９１０で使用したものと同じ実行３：ＩＣＳ：完全培地ＥＣＳ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋１０００ｍＬＤＭＥＭ中の１００Ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン＋１０ｍＬの１０. ３％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１５×１０⁸の生存３Ｃ１１ハイブリドーマ細胞（生存率９０％以上）を含む接種物を、実施例１で既述したようにＢＲ１１０のＥＣＳに注入した。３つの実行全てに際し、培養細胞を日々維持するためにＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ（商標）ＢＲ１１０バイオリアクターの標準的な操作工程に従った。図１５は、３０日の実行においてＥＲ−１をＢＲ１１０のＩＣＳに添加した場合とＥＣＳに添加した場合の、蓄積抗体生産における相違を示す。０.１％ＥＲ−１をＩＣＳに添加した場合（実行２）、実行１のＥＲ−１を加えない場合と比較してＩｇＧ₁生産がほぼ２倍に増加した。しかしながら、ＥＲ−１をＥＣＳに添加した場合には（実行３）、コントロールのＥＲ−１を加えない場合（実行１）と比較してＩｇＧ₁生産は１．４倍の増加が観察された。図１６は、代謝工程の相対的評価として３つの実行全てについてＬＰＲのＧＵＲに対する割合を示す。実行１における割合が他の実行と比較して高いことは、バイオリアクター中の高い細胞密度によって、酸素化装置と比較して酸素の供給が少ないため乳酸代謝が増加したことを示唆している。一方実行２および３で得られたより低い値は０.１％ＥＲ−１の添加により酸素供給が増強されたことによって、乳酸代謝が著しく減少したことを示す。対照的に、実行３では実行２と比較して抗体濃度の有意な変動が観察された。これは試料調製の頻度に応じて変化し、ＥＲ−１の細胞に対する細胞毒性効果は、双方がＥＣＳ中にある場合回収プロトコールによって調節し得ることを示している。従って、培地添加物が細胞と混合された場合、低いＬＰＲ／ＧＵＲ率の競合効果（ｉ）および細胞毒性効果（ii）が、工程の不一致ならびに細胞系から細胞系への変異という結果をもたらす可能性がある。実施例８定常培養実験において４種の酸素キャリアーについて生存研究を行った。標準的な６穴細胞培養プレート中で各添加物について５つの異なる培地条件を用いた６日間の研究によって、各添加物を評価した。これをＣＯ₂インキュベーターにいれて３７℃の低温状態に保ち、ＣＯ₂インキュベーター中の空気のＣＯ₂濃度を７％にセットすることにより、培地中のｐＨを７.０から７.４の範囲に制御した。培地条件は以下の通りである：実行１（ａ）０.１％ＢＨネガティブコントロール：０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋４ｍＭグルタミン＋４８.５ｍＬＤＭＥＭ（ダルベッコの修飾イーグル高グルコース（４.５ｇ／Ｌ）基本培地）中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋シグマ社から購入した５０ｍｇウシヘモグロビン（ＢＨ）（ｂ）０.１％ＢＨ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋５０ｍｇＢＨ（ｃ）１.０％ＢＨ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋５００ｍｇＢＨ（ｄ）１０.０％ＢＨ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋５０００ｍｇＢＨ（ｅ）ポジティブコントロール：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン実行２（ａ）０.１％ＥＲ−１ネガティブコントロール：０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋４８.０ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋Biorelease Technologies，Inc.社から購入したＥｒｙｔｈｒｏｇｅｎ（商標）（ＥＲ−１）と呼ばれる１０.３％（ｗ／ｖ）ウシヘモグロビン０.５ｍｌ（ｂ）０.１％ＥＲ−１：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３８.０ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋０.５ｍｌの１０.３％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１（ｃ）１.０％ＥＲ−１：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３３.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋０.５ｍｌの１０.３％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１（ｄ）２.０％ＥＲ−１：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋２８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋１０ｍｌの１０.３％（Ｗ／Ｖ）ＥＲ−１（ｅ）ポジティブコントロール：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン実行３（ａ）０.１１％Ｆｏｒｍｕｌａ−１ネガティブコントロール：０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋４８.０ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋Biopure Co.社から購入したＦｏｒｍｕｌａ−Ｏｎｅ（商標）（Ｆｏｒｍｕｌａ−１）と呼ばれる１１.０％（ｗ／ｖ）ウシヘモグロビン０.５ｍｌ（ｂ）０.１１％Ｆｏｒｍｕｌａ−１：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３８.０ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋０.５ｍｌの１１.０％（Ｗ／Ｖ）Ｆｏｒｍｕｌａ−１（ｃ）１.１％Ｆｏｒｍｕｌａ−１：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３３.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋０.５ｍｌの１１.０％（Ｗ／Ｖ）Ｆｏｒｍｕｌａ−１（ｄ）２.０％Ｆｏｒｍｕｌａ−１：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋２８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋１０ｍｌの１１.０％（Ｗ／Ｖ）Ｆｏｒｍｕｌａ−１（ｅ）ポジティブコントロール：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン実行４（ａ）０.１％ＰＦＣネガティブコントロール：０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋４８.０ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋HemaGen/PFC社から購入した４０.０％（Ｗ／Ｖ）過フッ素化炭素乳濁液（ＰＦＣ）０.５ｍｌ（ｂ）０.１％ＰＦＣ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋４８.０ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋０.５ｍｌの４０.０％（Ｗ／Ｖ）ＰＦＣ（ｃ）１.０％ＰＦＣ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋３３.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋０.５ｍｌの４０.０％（Ｗ／Ｖ）ＰＦＣ（ｄ）２.０％ＰＦＣ：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋２８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン＋１０ｍｌの４０.０％（Ｗ／Ｖ）ＰＦＣ（ｅ）ポジティブコントロール：２０％ＦＢＳ＋４ｍＭグルタミン＋２８.５ｍＬＤＭＥＭ中の５ｋユニットペニシリン／５ｍｇストレプトマイシン１×１０⁵の３Ｃ１１ハイブリドーマ生存細胞を含む接種物を、標準的な６穴培養プレートの各穴に均等にピペッティングし、各穴が５ｍＬの条件培地および細胞を含むようにした。典型的には各実行は５つのプレートで行い、各プレートの各穴中の細胞上清から毎日サンプルを採取した。グルコースの取り込み、乳酸生産、ＮＨ₃生産およびＭａｂ生産をモニターするために、実験において工程パラメーターを定めた。細胞培養プレートの穴からサンプルを回収し、コダックのＥｘｔａｃｈｅｍ分析器を用いてグルコース、乳酸およびＮＨ₃のオフライン分析を行った。トリパンブルー排除／ヘマサイトメーターを用いてサンプル中の生存細胞および非生存細胞を数えた。図１７−２０は、種々の酸素キャリアーを添加した場合および添加しない場合の、異なる培地条件中の細胞生存曲線を示す。データは、ＦＢＳが培地に加えられた場合（即ち、ネガティブコントロール）添加物は細胞毒性効果を発揮することを示す。さらに、酸素キャリアーとして劇的な細胞毒性を示したＦｏｒｍｕｌａ−１を除き、全ての添加物は２０％ＦＢＳ下でも０.１％から２％まで（およびそれ以上）増加した。ＦＢＳはこれらの添加物の細胞毒性効果を何らかの機構により減ずると思われる。実施例９ＯＸＹ−１（１.０ｆｔ²、０.２μｍポリプロピレン繊維）で修飾した小型（１.５ｆｔ²、１０ｋＤＭＷＣセルロース繊維）ＵｎｉＳｙｎＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ（商標）ＢＲ１１０酸素供給器を使用して、Telios Pharmaceuticals， Inc.からの足場依存性組換えチャイニーズハムスター卵巣（ｒＣＨＯ）細胞系を培養した。細胞系は組換え治療用タンパク質、即ちデコリンを発現する。この生物薬剤は腎臓繊維症の治療に使用できる。３回の実験を実行した。標準的なＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ作動工程の後回収を行い、サンプルを実施例１において既述したように処理した。既述した方法から特に変更した点を以下に示す。実行１（コントロール）：このシステムは、３７℃の定温を保持するためのオーブンの中に配置された。ＣＯ₂と空気をあらかじめ混合したガスを、約７５．０（ＳＴＤ）ｍＬ／分の速度でバイオリアクターのＩＣＳ中の環状に再循環する培地とは反対の方向に、酸素供給器を通した。２つの流速計を用いてＣＯ₂と空気の流速を調整し、バイオリアクターシステム中のｐＨ値を制御した。このシステムを１０００ｍＬのＨｙｂｒｉｄＧｒｏｗ（商標）培地で一晩かけて洗浄した。洗浄の後、この使用済基本ＩＣ培地を廃棄ビンに無菌状態で流し込み、２０００ｍＬの新鮮なＩＣ培地と無菌状態で交換した。５ｘ１０⁸の生存細胞を含む接種物を、１０ｍＬのＨｙｂｒｉｄＧｒｏｗ（商標）中の１０％ＦＢＳ＋４ｍＭＬ−グルタミン＋１００ｋユニットペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシン（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ，ＶＡ）に再懸濁し、既述したように（実施例１）バイオリアクターのＥＣＳ中に接種した。実行２この実行は２つの段階からなった。第一段階は、Telios Pharmaceuticals，In c.，San Diego，CaliforniaによるＰｅｐＴｉｔｅ（商標）２０００（ＲＧＤペプチド）Ｐ−２０００のＢＲ１１０バイオリアクター中の繊維上へのコーティングである。第二段階は、細胞培養の実行である。小型のバイオリアクターＢＲ１１０（ＵｎｉＳｙｎ１.５ｆｔ²、１０ｋＤ）セルロース中空繊維）をＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）中１００μｇ／ｍＬのＰ− ２０００溶液でコーティングした。Ｐ−２０００溶液を１００ｍＬのＰＢＳ（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ，ＶＡ）に溶解し、外部の蠕動ポンプで一晩中ＥＣＳ中を再循環させた。ＰＢＳを含んだ通常のＩＣＳ培地として別のポンプを据え付けた。ＩＣＳ再循環は１日の処理の後停止し、一方、ＥＣＳ再循環はコーティングが生じるまでさらに約３日間続けられた。２.７×１０⁸生存ｒＣＨＯ細胞を含む接種物を、１０％ＦＢＳ＋４ｍＭＬ− グルタミン＋１００ペニシリン／１００ｍｇストレプトマイシンと共に５ｍＬ容量でバイオリアクターに装填した。細胞培養システム中の工程パラメーターは、既に実行１において記載したように設定した。実行３このシステムは、小型のバイオリアクターＢＲ１１０（ＵｎｉＳｙｎ、１.５ｆｔ²１０ｋＤ、セルロース中空繊維）の使用を含み、ＭｉｃｒｏＭｏｕｓｅ（商標）のための使用者用マニュアルに従って、無菌的に設置した。このシステムの操作は、実行１の場合と全く同じに行った。この実行では、メトトレキセート（６４０ｎＭ）およびＥＲ−１（０.１％）の両方を、実行の最初の５日間だけＩＣＳ培地に加えた。グリコシル化パターンについて、５日目、１５日目および３０日目に回収した上清試料を分析した。図２１は、繊維をＰｅｐＴｉｔｅ（商標）２０００でコーティングすると、またはＩＣ培地中にＥＲ−１を使用すると、デコリンの蓄積生産率が２倍になったことを示す。メトトレキセートの役割は、ＥＲ−１が適用された場合に接種物が最も迅速に増大する期間中、遺伝子の正確な複製を保証することである。ｒＣＨＯ細胞はＰ−２０００中のＲＧＤアミノ酸配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）に結合し、よって、実行２におけるこれらの足場依存性細胞の生長および生産率を、実行１と比較して高めるであろう。驚くべきことに、ＥＲ−１の使用により可能となった酸素供給の向上は、生産性において（実行３）Ｐ−２０００コーティング（実行２）と同等の効果を生じさせる。これはおそらく、細胞増殖および接種物の代謝が高まり、細胞接着を促進するように、細胞が培地の繊維表面の条件を迅速に整えることに因ると思われる。実行１および２では接種後約２−３週間、有意な細胞増殖の徴候を示さなかったのに対し、数日以内にバイオリアクターが目に見えてコンフルエントになったことが注目される。図２２は、実行３で生産されたデコリンのグリコシル化パターンを、治療上活性なデコリン標準と比較して描いたものである。ウェスタンブロット分析の結果は、低濃度にもかかわらず（上清は分析前に精製されなかった）、実行３は３０日間の実行中ＧＡＧ−鎖の付加されたデコリンを生産した。従って、この物質は治療上活性であろうと期待された。

Claims

【特許請求の範囲】１．酸素キャリアー１ｇあたり少なくとも０．００１ｍＭの遊離酸素を培地に提供するのに有効な量の前記酸素キャリアーを含む、細胞培養用組成物。２．メテモグロビンを実質的に含まない安定化されたヘモグロビンまたはパーフルオロケミカルエマルジョンを含む、細胞培養用組成物。３．０.００００１から１.０％Ｗ／Ｖの安定化ヘモグロビンまたは過フッ素酸化学乳濁液を含む、請求項２に記載された細胞培養用組成物。４．前記安定化ヘモグロビンが、実質的にメテモグロビンを含まない安定化ウシヘモグロビンである、請求項２または３に記載の細胞培養用組成物。５．前記安定化されたヘモグロビンが、架橋された組換えヒトヘモグロビンである、請求項２または３に記載の細胞培養用組成物。６．中空繊維バイオリアクター中で細胞を培養する方法であって、細胞栄養培地を前記バイオリアクター中の中空繊維の管腔を通して循環させる方法において、請求項１、２、３または４に記載された細胞培養用組成物を循環させる点が改良されている方法。７．バイオリアクター中で培養される細胞の接種物増大期にのみ、栄養培地を管腔を通して循環させる、請求項６に記載の方法。８．培養培地が、０.００００１から０.１％（Ｗ／Ｖ）の安定化ウシヘモグロビンを含む、請求項６または７に記載の方法。９．栄養培地のｐＨを、二酸化炭素または二酸化炭素と空気の混合物を中空繊維の管腔に導入することによって制御する、請求項６または７に記載の方法。１０．中空繊維バイオリアクター中で細胞を培養する方法であって、細胞栄養培地を前記バイオリアクター中の中空繊維の管腔を通して循環させる方法において、前記培地のｐＨを、二酸化炭素または二酸化炭素と空気の混合物を中空繊維の管腔に導入することによって制御し、その後前記二酸化炭素の導入を停止し、空気または純粋な酸素を導入することによって培地中のｐＨを制御する点が改良されている方法。１１．請求項１ないし４のいずれか１項に記載の培地組成物を伴う細胞培養の方法であって、前記培地組成物は高い細胞密度ならびに８０％から１００％の間の高い細胞生存率を与え、バイオリアクターに特性を与え、適切に感染させた場合ウイルスに高い力価を与えるのに有用である、前記方法。１２．培地に添加した場合に、高濃度の生物薬剤ならびに高力価のベクター等のウイルス粒子の迅速な生産を含む改善された培養状況を、あらゆる種類の細胞に明らかにもたらすことができ、それによって、足場依存性および足場非依存性の真核細胞および原核細胞が発酵において利益を受けられる、請求項２または３に記載の細胞培養培地添加物。１３．高密度で、かつ少なくとも８０％の生存率を有する細胞培養生産物をもたらす、請求項６に記載の方法。１４．細胞がウイルスの宿主細胞で、高力価のウイルス粒子を与えるものである、請求項１３に記載の方法。１５．中空繊維細胞培養生産物のグリコシル化を促進および制御する方法であって、細胞を請求項６に記載の方法で培養して、ＬＰＲ／ＧＵＲ比が約０.８５より大きくならないように調節することを含む、前記方法。１６．中空繊維バイオリアクターが低いパッケージング密度を有する、請求項６に記載の方法。１７．バイオリアクターのパッケージング密度が２０％から７０％である、請求項１６に記載の方法。１８．管腔外細胞培養空間中に含まれた中空繊維膜ならびに培地添加物の管腔内空間再循環のための手段を有する、細胞培養酸素供給システム。１９．中空繊維膜、ならびに該中空膜の管腔内空間を通して栄養培地添加物を再循環させるための手段を有する、請求項１８に記載の撹拌タンク細胞培養システム。