JPS63133982A

JPS63133982A - 動物細胞増殖用組成物およびそれを用いる動物細胞の増殖方法

Info

Publication number: JPS63133982A
Application number: JP61279774A
Authority: JP
Inventors: Kazuaki Kitano; 北野　一昭; Yasushi Shintani; 靖新谷
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1986-11-26
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1988-06-06
Anticipated expiration: 2010-04-12
Also published as: JPH0732705B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】灸泉直Δ秤亜立Ｊ本発明は、動物細胞を増殖するための組成物。

動物細胞の増殖方法および生理活性物質の製造法に関す
る。

従来の技術動物細胞を大量に効率よく培養する技術は、新しい有用
な生理活性物質の探索や生産に、ざらに遺伝子操作技術
を施した細胞を用いる生理活性物質生産に必須の技術と
して、種々の方向からの研究が進められている。従来動
物細胞の培養には、血清を約ＩＯ％程度添加した培地が
主として用いられ、とりわけ牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ、）
含有培地が賞用されて来た。

発明が解決しようとする問題点しかしながら、血清は非常に高価であり、かつ原因不明
のロット差があるため、細胞を大量に培養するには問題
が多い。さらに血清には多種類の異種蛋白質が含まれろ
ため、生産される有用物質を培毘液から回収精製する際
にも不都合か生ずる。

これらの不都合を解消しようとして、血清を含まない培
地（ｊ＠血清培地）が種々開発されて来たが、一般に汎
用性が低く、増殖性および生理活性物質生、産性の面で
も血清含有培地に比べると必ずしら十分なしのとはいえ
ない。

いずれにしても従来知られている培地は、細胞陪従によ
って有用物質を大量に効率よく得るためには必ずしも十
分満足できるものではなかった。

そこで、本発明者らは、ポリエチレングリコールを添加
した動物細胞増殖用組成物により動物細胞を培養すると
、動物細胞が著しく増殖され、またこれにより、産生さ
れる生理活性物質の量が増大されろ旨の発明を行なっｊ
コ（特願昭６１−１２８１１２号）。

また、ポリビニールアルコールまたはこれとポリエチレ
ングリコールとを添加した動物細胞増殖用組成物により
動物細胞を培養すると、動物細胞が著しく増殖され、ま
たこれにより、産生される生理活性物質の量か増大され
る旨の発明を行なった（特願昭６１−２２７１９０号）
。

問題点を解決するための手段本発明者らは、さらに種々研究を重ねたところ、ポリエ
チレングリコールまたは／およびポリビニールアルコー
ルにさらに低密度リポ蛋白質を添加すると、血清無添加
の状態でら動物細胞の増殖か昔しく促進され、またこれ
により、産生されろ生理活性物質の量が増大され、しか
も動物細胞に対する汎用性が高まることを見い出し、こ
れに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）ポリエチレングリコールまたは／およびポリビニ
ールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有してなる動
物細胞増殖用組成物、（２）ポリエチレングリコールまたは／およびポリビニ
ールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有してなる動
物細胞増殖用培地で動物細胞を培養することを特徴とす
る動物細胞の増殖方法および（３）ポリエチレングリコ
ールまたは／およびポリビニールアルコールと低密度リ
ポ蛋白質とを含有する動物細胞増殖用培地で、生理活性
物質を産生ずる動物細胞を培養し、培養物中にこれを生
成蓄積せしめ、採取することを特徴とする生理活性物質
の製造法である。

本明細書においては、ポリエチレングリコール。

ポリビニールアルコールおよび低密度リポ蛋白質をそれ
ぞれＰＥＧ、ＰＶＡおよびＬＤＬと略記することらある
。

本発明の組成物は、基礎培地、ポリエチレングリコール
または／およびポリビニールアルコールと低密度リポ蛋
白質とからなる。

該病礎培地としては、動物細胞の培養に用いることので
きるものであればいずれのものでもよい。

本発明に用いられる基礎培地としては、たとえば市販さ
れている各種基礎培地［たとえば、イーグルの最小必須
培地（ＭＥＭＸサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１３０
巻　４３２頁　１９５９年）、イーグルの基礎培地（Ｂ
ＭＥＸプロン−ディンゲス・才ブ・ザ・ソサイエティ・
フォア・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・
メディスン（Ｐｒｏｃｅｅ−ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ＥｘｐｅｒｉＩＱｅｎｔａ
ｌＢｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）８９巻
　３６２頁　１９６５年）、ダルベツコ改変イーグル培
地（ＤＭＥＸパイロロジ−（ＶｉｒｏｌｏｇＹ）　８巻
　３９６頁　１９５９年）、イスコツ改変ダルベツコ培
地（Ｉ　Ｍ　Ｄ　Ｍ　）　（サ・ジャーナル・オブ・エ
キスペリメンタル・メディスン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）　１４７巻　９２３頁　１９７８年）、Ｌ−１５培
地（アメリカン・ジャーナル中オブψハイノーン（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆｔｌｙｇｉｅｎｅ）
７８巻　１７３頁　１９６３年）。

マツコイ５ａ培地（ブロン−ディンゲス・オブ・ザ・ソ
ザイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メディスン１００巻　１１５頁　１９５９
年）、ハムＦＩ２培地（プロン−ディンゲス・オフ・ナ
ショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニー・ニス
・ニー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆＮａｔｉｏｎａ
ｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏ「５ｃｉｅｎｃｅ、　ＵＳＡ）
５３巻２８１４　１９６５年）、ＲＰＭＩ　　１６４０
培地（ジャーナル・オフ・ザ・アメリカン・メディカル
・アソシエーション（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　
ＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉ
ｏｎ）　Ｉ　９９巻　５１９頁　１９６７年）など］あ
るいはこれらを混合した培地が挙げられる。さらに該基
礎培地にそれぞれの細胞の増殖に必須な因子（補助増殖
因子）たとえばホルモン類（たとえばインスリン１トラ
ンスフエリン、ステロイドホルモンなと）１蛋白性増殖
因子［たとえば上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由
来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ
）など］１１重金属類たとえば亜セレン酸ナトリウムな
ど）やリン指貫（たとえばエタノールアミン、ホスファ
チジルエタノールアミンなど）を必要により添加した無
血清培地が挙げられる。

さらに、これらに通常の使用量またはそれ以下の血清代
替物質「たとえばＧＦＳ　　（第２回欠け代産業基盤技
術ノンボノウムーバイオテクノロジー予講集１６１頁、
　１９８４年）、ＮＵ−ンーラム（コラボレーティプリ
サーチ社製）、ンーラムプラス（ＫＣバイオロジカルズ
社製）などコが添加された培地や、通常の使用量以下の
血清［たとえば牛脂加面ｒｌ’ｔ　（Ｆ　ＣＳ　）、新
生子牛血清、子牛血清、ブタ血ｌ？ｔ、ヤギ血／ｎ、ニ
ワトリ血清など］を添加した培地でもよい。また市販の
無血清培地［たとえばハイブリティー１（日本薬品開発
製）、ＨＩ３−１０２（ハナ・メディア社製）、［（Ｌ
−１（ベントレット社製）など］を基礎培地として用い
てもよく、市販の基礎培地に学じてアミノ酸などの濃度
を最適化した培地を作成して用いてらよい。

本発明で用いられるポリエチレングリコールは、（ｃｌ
ｌ！ｃｌｌｔｏ　　）　ｎ　（ｎは重合度を表す。）の
構造を持つ高重合体であり、重合分子量が約１０００以
上のらのが好ましく、なかでも約２，０００ないし２０
，０００のらのが好ましく、さらに約４，０００、約６
，０００．約２０，０００のらのか好まし本発明で用い
られるポリエチレングリコールの咄は、使用時の濃度が
約１０％（ｗ／ｖ）以下となる債が好ましい。なおここ
において、「以下」は「０」を含まないことを示す。ま
た、ポリエチレングリコールの量としては、使用時の濃
度が、より好まシくハ約０．００１なイＬ　１０　％（
Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは約０．０１ないし２％Ｕ／
ｖ）となる量である。

また、本発明で用いられるポリビニールアルコールは、
Ｃ−Ｃ１ｌ、Ｃｔｌ（Ｏｌｌ）　−）ｎ’　（ｎ’は重
合度を表す。）の構造を持つ高重合体であり、平均重合
度が約５００ないし２，０００のものが好ましく、なか
でも約５００のらの、ｌ、５００〜１，８００のらのが
好ましい。

本発明で用いられるポリビニールアルコールの量は、使
用時において約０．００１ないし１０％（Ｗ／Ｖ）が好
ましく、なかても約０．０１ないし３％（Ｗ／Ｖ）とな
る虫がより好ましい。

ポリエチレングリコールとポリビニールアルコールは単
独で使用しても良いし、両者を同時に使用しても良い。

両者を同時に使用する場合、その混合比は、ＰＥＧを１
とした場合、ＰＶＡは約００１〜１００（重量比）とな
るのが好ましく、なかでら約０．１〜１０（重重比）と
なるように混合するのがより好ましい。

本発明で用いられる低密度リポ蛋白質は、動物の血しょ
うから分離される比重１．０１９ないし１．０６３、分
子！ａ（２，２ないし２．３）ｘ　）　０６、直径１９
〜２５ｎｍの粒子を形成するリポ蛋白質で、脂質７糖お
よび蛋白質からなり、生体内では細胞へコレステロール
を供給する役割を荷っている。

本発明においては、市販のＬＤＬ（例、ヒトＬＤＬ、ウ
ンＬＤＬ等）を用いてもよいし、例えばセル・カルチュ
アー・メソッド・フォー・モルキュラー・アンド・セル
・バイオロジー（ＣｅｌｌＣｕＤｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＣｅｌｌＢ
ｉｏｌｏｇｙ、　　八ｆａｎ　　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　　Ｉ
ｎｃ、、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）Ｊ　　巻６９頁１９
８４年に記載の方法、以下の参考例に示４一方法なとに
より、動物（例、ウン、ブタ等）の血清から調整したＬ
ＤＬを用いてもよいが、参考例に示す方法により調整し
たＬＤＬがとりわけ好都合に用いられる。

本発明で用いられるＬＤＬの虫としては、使用時の濃度
が、約０．Ｏｌないし１０００μｇ／ｄとなるのか好ま
しく、なかでも約０．０５ないし５００μｇ／ｄとなる
のがより好ましく、さらに好ましくは約０．５ないし１
００μｇ／旙となる量である。なお本明細書において、
ＬＤＬの量はＬＤＬが含有する蛋白質量として表す。

ＰＥＧまたは／およびＰＶＡとＬＤＬとは、あらかじめ
組成物中に混合されていても良いし、培地として使用す
る際に混入しても良い。

本発明の動物細胞増殖用組成物は、固体状態のものおよ
び水溶液であるもののいずれでもよい。

固体状態のものは、それをたとえば水に溶解あるいは懸
濁して用いられる。

また、該組成物を動物細胞増殖用の培地として用いろこ
とができるが、培地として用いる場合には、血清を含ま
ない培地としても良く、さらに、通常の使用量以下の血
清を含む培地としても良い。

ここで、通常の使用量としては、たとえば約ｌＯ％（Ｖ
／Ｖ）が挙げられる。

本発明の組成物を培地として用いる場合には、通常の使
用量またはそれ以下の血清代替物を含む培地としてもよ
い。ここで、通常の使用量としては、たとえば、ＧＦＳ
の場合は約３〜４ｇ／＆（蛋白質として）であり、Ｎｔ
Ｊ−シーラムの場合は約１０％（Ｖ／Ｖ）であり、シー
ラムプラスの場合は約ｌＯ％（Ｖ／Ｖ）である。

本発明方法によって培養される動物細胞としては、特に
限定されない。その例としては、たとえばヒト、マウス
、ラット、ウシ、ハムスターなど゛の口重乳動物由来の
リンパ系細胞（例、正常リンパ球、ミエローマ細胞、Ｂ
−リンパ芽球様細胞、Ｔリンパ性白血病紬胞など）、各
種ハイブリドーマ（例、マウスハイブリドーマ、マウス
・ヒトヘテロハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマなど
）、正常２倍体細胞（例、繊維芽細胞など）、その他の
種々の接骨依存性細胞などを挙げることが出来る。

より具体的には、ヒトリンパ系細胞としては、Ｎａｍａ
ｌｖａ（ＡＴＣＣＣＲＬ　ｌ　４３２Ｘインターナンヨ
ナル・ジャーナル・オフ・キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ）
　１２巻　３９６頁　１９７３年）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ８６８ランセント（Ｌａｎｃｅｔ）　１巻　２
３８頁　１９６４年）、ＥＢ−３（ＡＴＣＣＣＣＬ８５
０ランセット１巻２５２頁　１９６４年）、ＷＩ−Ｌ２
（キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）　２２巻　５１７頁　１
９６８年）、　Ｄａｕｄｆ（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３Ｘキ
ャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
）　２８巻　１３００頁１９６８年）、ＲＰＭＩ　　　
８２２６（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０）（プロノーデインダ
ス・オフ・ザ・ソサイエティ・フォア・エキスペリメン
タル・バイオロジー・アンド・メディスン　１２５巻　
１２４６頁１９６７年）、ＣＯＲＰ−ＯＥＭ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ　Ｉ　ｌ　９Ｘキヤンサー　１８巻　５２２頁　
１９６５年）、ＲＰＭｌｌ　７８８（ＡＴＣＣＣＣＬ　
＋　５６）（ジャーナル・オフ・ザ・ナショナル・キャ
ンサー・インスティチュート（ユナイティド・ステーブ
ＸＪｏｕｒｎａｌ　ｏｒｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃ
ａｎｃｅｒ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（Ｕｎｉｔｅｄ　
５ｔａｔｅｓ））４３巻　１１１９頁１９６９年）、Ｃ
ＲＣＰ−９Ｂ（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０）（キャンサー・
リサーチ　２７巻　２４７９頁　１９６７年）、　Ｊｕ
ｒｋａｔ（イムノノエネティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ）　１０巻　２４７頁　１９８０年）などが
、マウスリンパ系細胞としては、たとえば、ＭＰＣ−Ｉ
Ｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０Ｘザ・ジャーナル・オフ・エ
キスペリメンタル・メディスン１３１巻　５１５頁　１
９７０年）、　ＭＳ　−１（ＡＴ　ＣＣＴＩＢ！８）（
ユーロピアン・ジャーナル・オフψイムノロジー（Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ）　６巻　５１１頁　１９７６年）、Ｐ３Ｘ６３Ａ
ｇ８Ｕ−１（Ｐ３ｕｌＸＡＴＣＣＣＲＬ１５９７）（カ
レント・トピックス・オフ・マイクロバイオロジー・ア
ンド・イムノロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｏ
ｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ）８１巻　１頁　１９７８年）などが、ハイ
ブリドーマとしては、たとえばマウスハイブリドーマＣ
ＥＡ（第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオ
チクノロノー　予稿集　１７５頁　昭和５９年）。

Ｈ５−ＩＩ　（同上）、Ｅ２３５１６３（バイブリド−
７（ｔｌｙｂｒｉｄｏｍａ）　４巻　４７頁　１９８５
年）、マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマＮ１２
−１６・６３（第２回次阻代産業基盤技術シンポジウム
−バイオテクノロジー　予稿集　１７５頁　昭和５９年
）、およびＮｌ２−１６・６３から誘導された高産生株
（Ｎ１２−１６・６３・４９・１９．Ｎ１２−１６・６
３・４９・１９・６９など）（第３回次世代産業基盤技
術シンポンラム−バイオチクノロノー　予稿集　１５５
頁　昭和６０年）、■１２−２２・２５（バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィンカル・リサーチ・コミュニケ
ーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａｌ　　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍａｎｉ
ｃａｔｉｏｎ）　１２９巻　２６頁　１９８５年）、ト
ＩＢＩＩＩ−４３・１（同上）ヒトＢハイブリドーマＷ
４７１−７．２４（ＩＦＯ５００９４）などが、接着依
存性細胞としては、たとえばＦＬ（ＡＴＣＣＣＣＬ６２
Ｘプロン−ディンゲス・オフ・ザ・ソサイエティ・フォ
ア・エキスベリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィスン　９４巻５３２頁　１９５７年）、）ＩｅＬａ（
ＡＴＣＣＣＣＬ２Ｘキャンザー・リサーチ　１２巻　２
６４頁　１９５２年）。

〜Ｖｉｓｈ（ＡＴＣＣＣＣＬ　２５Ｘエキスペリメンタ
ル・セル・リサーチ（ＩＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　
Ｃｅ１ｌＲｅｓｅａｒｃｈ　）２３巻　１４頁　１９６
１年）、ＣＨＯ−Ｋｌ（Ａ’Ｉ’ＣＣＣＣＬ６１）（ザ
・ジャーナル・オフ・エキスベリメンタル・メディスン
　１０８巻　９４５頁　１９５８年）、Ｌ細胞（ＡＴＣ
ＣＣＣＬｌ）（ジャーナル・オフ・ナショナル・キャン
サー・インスヂチュート・ニー・ニス・ニー　９巻２２
９頁　１９４８年）などがそれぞれ挙げられる。

上３己ヒトＢハイブリドーマＷ４７＋−７，２４は日本
特願昭６１−２２７１９１号に記載の方法で得られ、昭
和６１年８月２０日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
にＩＦＯ５００９４として寄託されている。

本発明の生理活性物質の製造法において用いられる生理
活性物質を生産する動物細胞としては、たとえば、マウ
スモノクローナル抗体を産生するＣＥＡ、ｌｌ５−ＩＩ
、Ｅ２３５１６３など、ヒトモノクローナル抗体を産生
ずるＮ１２−１６・６３お上びその変異株、＋１２−２
２・２５．ＨＢＩ−４３・１Ｗ４７１−７．２４などか
、白血球インフターフェロンを産生するＮ　ａｍａｌｖａ細胞、インター
ロイキン−２を産生するＪ　ｕｒｋａｔ細胞、遺伝子組
換え細胞（マウス＞ＩＬ−２１３−３細胞、ヒトＰＬ−
１Ｌ３８５−６細胞、ハムスターＣ−ＩＬ４８５−１４
細胞（特開昭６１−６３２８２号公報参場合には、マル
チウェルプレート。培養フラスコ。

スピナーフラスコ、ジャーファーメンタ−、ファーメン
タ−などが用いられ、さらにホローファイバー培荏装置
、セラミックマトリックスを用いた培養装置さらにマイ
クロカプセル培養法などが適宜採用される。接着依存性
細胞の場合には、マルチウェルプレート１培養フラスコ
、ローラーボトル。

マイクロキャリアー培養法、十ローフアイバー培養法、
セラミックマトリックス培養法などが用いられる。

本発明の培養は、用いられる動物細胞の培養に適した条
件が採用される。一般的には、培養温度約３７℃前後で
、ｐＨ約６．５ないし７．５て°、数日ないし３か月培
養される。たとえば、本発明の培地に通常０．１ないし
５×１０５個／ｍｌの細胞を播種し、マルチウェルプレ
ートやフラスコの場合には約３７°Ｃ，５％炭酸ガス培
養器（炭酸ガス濃度５％の培８．器）中でｐ　ｔ−ｉ約
６５ないし７５て約１゜ないし２０日間培培養れる。ジ
ャーファーメンタ−やファーメンタ−などでは通気攪拌
培養が行わ続的に交換することにより生理活性物質の生
産性を向上させることができろ。連続層流培養の場合に
は１ないし数ケ月（約３か月）ら続ける場合がある。ま
た、必要により通気される。

培徨液から細胞を採取するには、たとえば、浮遊細Ｉｌ
江の場合は、培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて
集める。接着依存性細胞の場合にはたとえば、０　、１
　ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのト
リプシンを添加して、３７°Ｃ，Ｉないし２分反応させ
て細胞を分散させたのち、遠心分離またはろ過によって
集める。

細胞培養によって生産される生理活性物質は、その物質
が培養液中に蓄積される場合、ろ過または遠心分離によ
って上澄液を得、これから採取されろ。また細胞内に蓄
積される物質の場合には、ろ過または遠心分離によって
得た細胞を物理的方法（例、超音波、フレンチプレス、
ダイノミルなど）または化学的方法（例、塩酸グアニジ
ン等）にて処理し、生産物を抽出したのち、上澄液を得
る。

上記上澄液から生理活性物質を分離、精製するなどの溶
解度を利用する方法、透析法、限外ろ適法。

ゲルろ適法、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法フイオン交
換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、
アフィニティクロマトグラフイーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法１等電点電気泳動などの等重
点の差を利用する方法などが適用される。

本発明の方法に従って増殖させた動物細胞は、たとえば
これにウィルスを感染させてワクチンの製造に利用した
り、各種リンフ才力イン類（例、インターフェロン類、
インターロイキン−２なと）。

各種増殖因子類（例、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増
殖因子など）、各種ホルモン類（例、ヒト成長ホルモン
、インスリンなど）、各種酵素類（例、ウロキナーゼ、
組織プラスミノーゲン活性化因子など）や各種モノクロ
ーナル抗体（例、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノ
クローナル抗体なと）などの生理活性物質の生産にｐＨ
用される。また遺伝子操作によって特定の遺伝子を導入
した細胞を用いろことにより該物質を効率よく生産“さ
せることができる。また本発明の方法に従って増殖し、
集めた細胞を直接に、人工皮膚や人工器官（例、膵臓べ
る。

本発明方法において、生理活性物質を生産する動物細胞
を培養した場合には、該細胞が効率良く増殖されるので
、生理活性物質を効率良く生産することができ、工業生
産上有利である。

実施例以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。ＰＥＧおよびＰＶＡの添加％はＷ／Ｖ％を
表す。また、ＬＤＬの添加量はＬＤＬが含有する蛋白質
量として表している。なお、実施例で用いたヒトＬＤＬ
は、シグマ社製の市販のＬＤＬであり、ブタＬＤＬは参
考例１に示す方法で製造されたものである。

参考例１ブタ血清ＩＱを５ｍＭＥＤＴＡとＩＭＮａＣＣを添加し
たｌ０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７、２）に対して
透析したのち、同じ緩衝液で平衡化したシバクロン・ブ
ルー１”３Ｇ−Ａ（バイオランド社製）カラム（２，５
ｃｍφｘ１８ｃｍ）へ通液した。同じ緩衝液で十分洗滌
したのち、この緩衝液に０．５ＭＮａ５ＣＮを添加した
溶出液３００ｈ、ｎで溶出した。

活性画分を集め、低比重液（０，１５ＭＮａＣＱ、ｄ−
１，００６）を添加して比重をｄ＝１．０１９に調整し
たのち、３５０００　ｒｐｍで３０時間遠心分離した。

底部層約１００Ｍｌを集めて、これに高比重液（ｄ＝１
．３４６．ＮａＣ＆　　１５３．０ｇとＫＢｒ３５４、
Ｏｇとを水に溶かしてＩｃとしたもの）を添加して比重
をｄ＝１．０６９に調整したのち、超遠心分離機（３５
０００ｒｐｍ、３０分、４℃）にかけて、ＬＤＬ層（最
上層）約１０滅（蛋白質として約１０．６ｍｇのＬＤＬ
を含む）を得た。

実施例１ＩＭＤＭ、ハムＦ１２およびＬ−１５培地を１゜１．２
の比率で混合した培地に、２　ｍｇ／Ｑインスリン、　
２　ｍｇ＃！　トランスフェリン、２　Ｘ　ｆ　Ｏ−ｅ
Ｍエタノールアミン、２．５Ｘ　ｌ　０−８Ｍ亜セレン
酸ナトリウム（４つを合せてＩＴＥＳと称する。）を添
加し、これにＰＥＧ２０，０００（平均分子量２０，０
００）を０．１％添加した培地と、無添加の培地とを用
色し、それぞれ２４穴マルチウエルプレートへ１ｍｌ宛
分注した。この各穴へ、第１図に示す各種濃度のヒトＬ
ＤＬ（シグマ社製）を添加したのち、マウス・ヒト−ヒ
トへテロハイブリドーマＮ１２−１６・６３・４９・１
９妹の細胞をｌＸｌ０’個／轍になるように播種し、５
％炭酸ガス培養器中で３７°Ｃ，３日間培養後、コール
タ−カウンターにて細胞数を測定した。結果を第１図に
示す。

第１図において、−〇−はヒトＬＤＬのみを添加した場
合、−・−はヒトＬＤＬと０．１％ＰＥＧ２０．０００
とを同時に添加した場合の細胞数を示す。

第１図から明らかなように、０，１％ＰＥＧと至適濃度
（３，１２ないし２５μｇ／滅）のヒトＬＤＬとを添加
すると、０．１％ＰＥＧのみあるいは至適濃度のヒトＬ
ＤＬのみを添加した場合に比べて、細胞増殖は著しく促
進された。

実施例２実施例１におけるヒトＬＤＬの代りに、参考例に従って
調整したブタＬＤＬを各種濃度添加し、実施例１と同一
条件下で実施して細胞数を測定した。結果は第２図に示
す。第２図において、−〇−はブタＬＤＬのみを添加し
た場合、−・−はブタＬＤＬと０．１％ＰＥＧ２０，０
００とを同時に添加した場合の細胞数を示す。

べて、細胞増殖は著しく促進された。

第１図、第２図を比較すると、参考例１に示す方法によ
り調整したブタＬＤＬは、市販のヒトＬＤＬ（ノグマ社
製）に比べて、ＰＥＧとの相乗効果が大きく、かつ広い
濃度域で安定した増殖を示すことが明らかである。

実施例３実施例１と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加した培地（１
）、更にこれに０１％ＰＥＧ２０，０００を添加した培
地（２）、培地（１）に０．１％ＰＶＡ（平均重合度５
００）を添加した培地（３）、培地（１）に０．０５％
ＰＥＧ２０，０００と０．０５％Ｐ　Ｖ　Ａ　Ｃ平均重
合度５００）とを添加した培地（４）、およびその各々
に参考例に従って調製したブタＬＤＬ　Ｉ　Ｏμｇ／寸
を添加した培地（５）ないしく８）をＪ′Ｔ１．意し、
これらを２４穴マルチウエルプレートへｔｙ宛分注した
。これに表１に示す各種細胞をｌＸＩＯ３個／轍の割合
で播種し、３７℃、５％炭酸ガス培養器中で３日間培養
したのち、コールターカウン表１の結果から、ＰＥＧま
たは／およびＰＶＡとＬＤＬとを添加すると、各種細胞
に対して幅広く細胞増殖を示すことが明らかである。

実施例４実施例１と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加した培地（１
）、更ニコれｉ、：０．　Ｉ　％ＰＥＧ　２０，０００
を添加しｆこ培地（２）、培地（１）に０．１％ＰＶＡ
（平均重合度５００）を添加した培地（３）、培地（１
）に０．０５％ＰＥＧ２０．０００と０．０５％ＰＶＡ
（平均重合度５００）とを添加した培地（４）、および
その各々に参考例に従って調製したヒトＬＤＬ　Ｉ　Ｏ
μｇ／旋を添加した培地（５）ないしく８）を用意し、
これらを２４穴マルチウエルプレートへ１Ｍ／、宛分注
した。これに表２に示す各種細胞をｌＸＩＯ３個／顧の
割合で播種し、３７°Ｃ，５％炭酸ガス培養器中で３日
間培養したのち、コールタ−カウンターで細胞数を計数
し、表２の結果を得た。

表２の結果から、ＰＥＧまたは／およびＰＶＡとＬＤＬ
とを添加すると、各種細胞に対して幅広培地（１）、培
地（１）にＩＯμｇ／ＭｌヒトＬＤＬを添加した培地（
２）、培地（１）に０．１％ＰＥＣ；２０，０００とｌ
Ｏμｇ／ｄヒトＬＤＬとを添加した培地（３）を用意し
、これらをそれぞれｌ００ｄスピナーフラスコへ仕込み
、これにマウス・ヒト−ヒトヘテロハイブリドーマＮ＋
２−１６・６３・４９・１９・６９株をｌＸｌ０’個／
威になるように添加し、回転数２５ｒｐｍ、３７℃にて
６日間培養し、細胞数および抗体産生量を測定した。結
果を表３に示す。

表３　マウス・ヒト−ヒトヘテロハイプリドーマ七新液（ｐｌ−Ｉ　７　、５　）に対して透析し、生じる
沈澱を集め、５ｍＭＥＤＴＡと０．５ＭＮａＣ１とを添
加した５０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）３．
２ノ通に溶解させたのち、同じ緩衝液で平衡化したセフ
ァクリルＳ−３００ゲルカラム（約１００ｙｕ）にかけ
、活性画分を集めたところ、約１３ｍｇの抗破傷風トキ
ソイドヒトＩｇＭが得られた。

参考例２実施例１と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加した培地、さ
らにこれに０２５％ＰＥＧ２０，０００を添加しｆこ培
地を用意し、これを２４穴マルチウエルプレートへｌり
宛それぞれ分注した。これらに、それぞれ〜Ｖ４７＋−
７．２４細胞（ｒＦｏ　　５００９４）をｌＸＩＯ３個
／滅の割合で播種し、３７°Ｃ，５％炭酸ガス培養器中
で５日間培養したのちコールター力ウノターで細胞数を
計数し、表４の結果を得た。

表４細　胞　　　　無添加　　　ＰＥＧ２０，０００添加胃
４７１−７．２４　　　　　　８．３ｘ　ｔｏ’　　　
　　　　　７．４ｘ　１０５の状態でも、広範囲の動物
細胞に対して細胞増殖作用を示すので、該組成物による
培地を用いると動物細胞を大量に効率良く増殖させるこ
とができる。また、生理活性物質を生産する動物細胞を
培養すると、該細胞が大量に効率良く増殖されるので、
生理活性物質を効率よく生産させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた各種農度ヒＨ。ＤＬの添加効果を示す。第２図は、実施例２で得られた各種濃度ブタＬＤＬの添
加効果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）、ポリエチレングリコールまたは／およびポリビ
ニールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有してなる
動物細胞増殖用組成物。
（２）、固体状態にある特許請求の範囲第１項記載の組
成物。
（３）、水溶液である特許請求の範囲第１項記載の組成
物。
（４）、血清を含まない特許請求の範囲第３項記載の組
成物。
（５）、ポリエチレングリコールまたは／およびポリビ
ニールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有してなる
動物細胞増殖用培地で動物細胞を培養することを特徴と
する動物細胞の増殖方法。
（６）、動物細胞増殖用培地が血清を含まない培地であ
る特許請求の範囲第５項記載の増殖方法。
（７）、ポリエチレングリコールまたは／およびポリビ
ニールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有する動物
細胞増殖用培地で、生理活性物質を産生する動物細胞を
培養し、培養物中にこれを生成蓄積せしめ、採取するこ
とを特徴とする生理活性物質の製造法。
（８）、動物細胞増殖用培地が血清を含まない培地であ
る特許請求の範囲第７項記載の製造法。