JPH08511425A

JPH08511425A - 磁気サイクル反応

Info

Publication number: JPH08511425A
Application number: JP7502156A
Authority: JP
Inventors: アレックミアン、
Original assignee: ガメラバイオサイエンスコーポレイション
Priority date: 1993-06-09
Filing date: 1994-06-08
Publication date: 1996-12-03
Also published as: WO1994029484A1; AU690124B2; CA2164706C; DK0702728T3; DE69409646D1; US5545540A; KR960703174A; AU7106794A; ATE165118T1; EP0702728B1; GR3026678T3; DE69409646T2; ES2114692T3; EP0702728A1; CA2164706A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、電磁場による核酸鎖の分離に基づく特異的核酸配列の増幅方法を提供する。分離のこの手段は増幅プロセスにおいて中温性のポリメラーゼの使用を可能とし、それにより、増幅プロセスのスピードおよび正確性、ならびに増幅できる標的核酸のサイズを増大させる。

Description

【発明の詳細な説明】磁気サイクル反応発明の背景１．発明の分野本発明は、特異的核酸配列の増幅に関する。さらに詳しくは、本発明は、かかる特異的増幅を行うための試薬および方法、ならびにその使用に関する。２．関連技術の概要特異的ＤＮＡ配列を増幅する能力は、分子生物学、医学および法医学の分野における発展を大いに容易としてきた。ＰＣＲとして公知の、特異的ＤＮＡ配列を増幅する初期のプロセスは、二本鎖ＤＮＡ分子の熱変性、続いてのプライマーの一本鎖への低温でのアニーリングおよび再度二本鎖を得るためのポリメラーゼによるプライマーの伸長の交互サイクルを利用した。Mullis（米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７））は、熱変性工程の高温によって既に不活化されたポリメラーゼを置き換えるために、サイクル間で新しいポリメラーゼを添加しなければならないプロセスを開示している。Mullisら（米国特許第４，６８３，１９５号（１９８７））は、試料中の特異的核酸配列の存在または不存在を検出するための、あるいは試料中の異なる特異的核酸配列間を区別するためのプロセスの使用を教示している。これらの初期のプロセスは、ポリメラーゼ酵素をサイクル間で添加しなければならないというかなりの不便を被っていた。この不便は精製した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの発見によって克服された。Gelfandら（米国特許第４，８８９，８１８号（１９８９））は、好熱性細菌テルマス・アカティカス（Thermus aqua ticus）からの精製した熱安定性ポリメラーゼ酵素を開示している。Mullisら（米国特許第４，９６５，１８８号（１９９０））は、熱安定性ポリメラーゼを用い、それにより、反応サイクルの間にポリメラーゼを添加する必要性を無くした特異的ＤＮＡ配列の増幅方法を開示している。Johnsonら（米国特許第５，０３８，８５２号（１９９１））は、熱安定性ポリメラーゼ酵素を用いるポリメラーゼ連鎖反応を自動化するための装置を開示している。熱変性をベースとする連鎖反応における熱安定性ポリメラーゼ酵素の使用は、特異的核酸配列を増幅する際の不便を低減し、当該方法が広く商業的に受け入れられるのを助けた。不幸なことに、熱変性工程に必要となった熱安定性酵素の使用は、増幅プロセスにかなりの制限を課すこととなった。これらの制限として真っ先に挙げられるのは、増幅プロセスの正確性、増幅できる核酸配列のサイズ、および増幅プロセスを行うのに必要な時間である。熱安定性ポリメラーゼ酵素は、中温性源からの多くの公知のポリメラーゼよりもプライマー伸長反応でエラーを生じやすい。これは、増幅プロセスをクローニングのために調製的に用いる場合にかなりの問題となり得る。また、熱安定性ポリメラーゼ酵素は、約１０キロ塩基またはそれ未満の核酸配列を増幅するのに首尾よく使用されてきたに過ぎない。最後に、熱安定性ポリメラーゼ酵素は非常に遅い速度でしかデオキシリボヌクレオシド三リン酸を重合できない。熱変性およびアニーリング工程に必要な取るに足りなくはない時間を合わせると、この遅い重合のため時間単位で測るような増幅プロセスとなってしまう。従って、熱サイクルをベースとしたプロセスの制限を克服する特異的核酸配列の増幅方法に対する要望がある。理想的には、かかる方法は、増幅できる標的核酸のサイズと同様、増幅プロセスに必要な時間を減少させるべきである。最も好ましくは、かかる方法は、機械として比較的簡単な装置によるべきである。発明の概要本発明は、既存の方法よりも速く、大きな正確性を有し、かつかなり大きな標的核酸を増幅できる、特異的核酸配列の増幅方法を提供する。この新しい方法を、ここに、「磁気サイクル反応（magnetic cycle reaction）」または「ＭＣＲ」と命名する。ＭＣＲの効果は、増幅に必要な鎖分離を行うために電磁気を用いるところから生まれる。鎖分離のために電磁気を使用すると、ポリメラーゼ酵素を脱安定化させる条件下で増幅プロセスを行う必要性を無くする。その結果、本発明は熱安定性酵素を使用する必要がなく、その代わりに中温性のポリメラーゼ酵素を使用する、特異的核酸のノンストップサイクル増幅を提供する。これらの中温性のポリメラーゼは、公知の熱安定性ポリメラーゼのそれよりも少なくとも１．５桁速い速度で配列伸長を触媒する。さらに、中温性のポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼよりもかなり大きな複製の正確性を有する。加えて、中温性のポリメラーゼは熱安定性酵素よりもかなり進行的で、標的核酸の１００キロ塩基またはそれ以上の長さまでの増幅を可能とする。かくして、本発明は既存のノンストップ方法よりも速く正確で、かつかなり大きな標識核酸配列に適用できる特異的核酸の増幅を提供する。本発明は、２の異なる種類の結合した粒子を有するプライマーのタイプを利用することによって、核酸鎖の電磁気分離を達成する。第１のプライマータイプは「固相プライマー」と呼ばれ、固相または固定可能な粒子もしくは表面に物理的に結合したプライマーを有する。第２のプライマータイプは「磁性プライマー」と呼ばれ、現実に、電磁場に応答する粒子に物理的に結合したプライマーである。本発明の方法の最初の工程において、固相プライマーおよび磁性相プライマーを標的核酸配列に、固相鎖および磁性鎖として知られる鎖に一体化させる。一本鎖標的配列については、この工程は、単一の介在する変性工程と共に、固相プライマーおよび磁性プライマーからの各１ラウンドのポリメラーゼ伸長を必要とする。二本鎖標的核酸配列については、同一の最初のポリメラーゼプライマー伸長工程を用いるが、各々に変性工程が先立つ。これらの工程の結果、（固相鎖の５’末端を介して）固相に付着した一端を有し、かつ（磁性鎖の５’末端を介して）磁性粒子に付着した一端を有する標的核酸が得られる。かかる標的核酸が一旦得られたら、まず磁場を適用して固相鎖および磁性鎖を分離し、次いで、さらなる固相プライマーおよび磁性プライマーを分離鎖とアニールし、次いで、最後にアニールされたプライマーからの通常のポリメラーゼ伸長を行うことによって増幅が行われる。本発明の増幅方法は種々の目的で有用である。まず、該方法は、試料中の特異的標的核酸配列の存在または不存在を決める診断目的で使用できる。この使用において、本発明の方法は、標的核酸配列のより迅速な分離および中温性のポリメラーゼのより迅速な重合のため、既存の増幅プロセスよりも速い診断アプローチを提供する。第２に、本発明の増幅方法は、既存の増幅プロセスで可能なよりも迅速で、試料中の特異的標的核酸の量を定量的に測定するのに有用である。また、本発明の増幅方法は、クローニング用の特異的標的核酸基質の生成、配列分析および突然変異誘発のごとき調製的使用で有用である。この使用において、本発明の増幅方法は、その大きな迅速性のためのみならず、中温性のポリメラーゼの大きな正確性の結果、調製的基質に突然変異が少ないため、既存の方法よりも好ましい。加えて、本発明の増幅方法は、既存の増幅方法を用いては不可能であった適用である、核酸のマッピングに使用できる。この使用は、低い進行性の熱安定性ポリメラーゼで得られる最大約５〜１０キロ塩基と比較して、長さ１００ないし２００キロ塩基までの核酸の大きな進行性によって可能となった。本発明の増幅方法のこの使用は、酵母人工染色体クローニングアプローチのごとき既存のマッピング手法を補足しまたはそれを置き換えるであろう。本発明の増幅方法のある好ましい具体例を、本出願の以下のセクションおよび図面により詳しく記載する。図面の簡単な記載図１は、二本鎖標的核酸を用いる磁気サイクル反応の基本的工程の模式図である。工程１および２は変性工程および伸長工程である。長い実線は最初の標的核酸鎖を表す。短い実線はプライマーを表す。プライマーの端部の星印および丸印は、各々、付着した磁性粒子および固相表面を表す。ダッシュ線はプライマー伸長産物を表す。工程５は標的鎖の電磁気パルス分離を表し、続いて、追加磁性プライマーおよび固相プライマーをアニールし、プライマーのポリメラーゼ媒介伸長を行う。図２は、磁性粒子−結合および固相結合−標的鎖の電磁気分離がどのようにして達成されるかの一般的スキームを示す。ソレノイド１がテスト試験管２の回りに巻かれ、試験管中では増幅プロセスが起こる。ソレノイドを通して電気パルスを一方向にかけることにより、長い矢印３の方向に磁場が発生する。１の標的鎖の固相表面４への付着は、磁場に応答してその鎖の移動を妨げる。対照的に、他の標的鎖は、磁性粒子５へのその付着のため、磁場によって第１の標的鎖から分離される。電気パルスを逆にして、短い矢印６によって表される反対方向の磁場を発生し、これは、磁性粒子−結合鎖およびプライマー７を固相結合標的鎖の近くまで戻す。図３は、実施例６に記載した実験で用いる実験スキームを示す。該図はタイプＡ（ウェルＡ）およびＢ（ウェルＢ）の２つの代表的なウェルを示し、その各々に、複数の７５０ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子が各ＤＮＡ分子の５’にて共有結合的に付着されている。ウェルＢ中の該ＤＮＡ分子は放射能標識されており（星印によって示す）、一方、ウェルＡのものは標識されていない。実験プロトコルの第２の工程において、共有結合的に付着した７５０ヌクレオチドＤＮＡ分子の３’範囲に相補的な、複数の５００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子がウェルＡおよびＢの各々において７５０ヌクレオチドのＤＮＡ分子とアニールされている。５００ヌクレオチドＤＮＡ分子はその５’末端がビオチニル化されており、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズに非共有結合的に付着している。次いで、これらのＤＮＡ分子を、プロトコルの工程３において、放射性同位体標識ヌクレオチド前駆体の存在（ウェルＡ）または不存在（ウェルＢ）下、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させる。工程４において、外部磁場の適用によって、２のＤＮＡ鎖を５０℃で分離し、該分離し伸長させた磁性ビーズ連結鎖を電気泳動分析のために単離する。この分離の後、ウェルを９０℃で溶出させ、電気泳動分析のためにＤＮＡを回収する。図４は、実施例６により生じたＤＮＡ断片の電気泳動分析の結果を示す。左側の第１の電気泳動パターンは放射性同位体標識した７５０ヌクレオチドの鋳型ＤＮＡの電気泳動によって得られたもので、対照として示す。電気泳動ウェルの原点、および７５０、および５００ヌクレオチドＤＮＡ断片の位置を矢印で示す。磁気鎖分離（５０℃）および熱変性（９０℃）によってウェルＡおよびＢ各々から回収したＤＮＡの電気泳動パターンを示す。好ましい具体例の詳細な記載本発明は、特異的標的核酸配列の増幅に関する。本発明は、かかる特異的核酸増幅を行うための新しい試薬および新しい方法を提供する。第１の態様において、本発明は、既存の方法よりも速く、大きな正確性を有し、かつかなり大きな標的核酸を増幅できる、特異的標的核酸配列の増幅を行うための改良された方法を提供する。既存の増幅方法よりも優れたこれらの改良は、増幅に必要な鎖の分離を行うために電磁気を使用することに由来する。従って、この新しい方法は「磁気サイクル反応」または「ＭＣＲ」と命名する。一本鎖標的核酸配列を増幅するためのＭＣＲプロセスに関係する基本的工程は以下の通りである。第１に、標的核酸配列に相補的な核酸配列に固相プライマーまたは磁性プライマーを一体化させる。この工程により、１の鎖が固相プライマーまたは磁性プライマーいずれかに結合した、各々固相鎖または磁性鎖であるが、二本鎖標的核酸が得られる。第２に、標的核酸配列およびその相補物を変性する。第３に、相補鎖に一体化されなかった磁性プライマーまたは固相プライマーを、標的核酸配列に相同な、すなわち、固相鎖または磁性鎖に相補的な核酸鎖に一体化させる。これらの工程により、固相プライマーに結合した１の鎖を有する二本鎖核酸配列（固相鎖）および磁性プライマーに結合したもう１つの鎖（磁性鎖）が得られる。第４に、磁場を適用することによって、固相が固定され磁性鎖が移動して、２の鎖が相互に分離される。第５に、分離した鎖をさらなる固相プライマーおよび磁性プライマーとアニールする。この工程において、固相鎖は、その３’末端に相補的な磁性オリゴヌクレオチドプライマーとアニールし、磁性鎖は、その３’末端に相補的な固相プライマーとアニールされる。第６に、固相鎖および磁性鎖とアニールしたプライマーをポリメラーゼによって伸長させて、固相プライマーに結合した１の鎖および磁性プライマーに結合した１の鎖を有する二本鎖核酸のコピーを得る。第７に、工程４ないし６を必要な回数反復して、所望の量の核酸コピーを得る。二本鎖標的核酸配列を増幅するためのＭＣＲプロセスに関係する基本的工程は、最初の工程に以下の修飾を施す以外は、一本鎖標的核酸配列を増幅するためのものと同一である。最初に、前置きとしての変性工程が、２の標的核酸配列を相互に分離するために必要である。次いで、分離した標的核酸配列をプライマーとアニールし、１の鎖は固相プライマーとアニールし、他の鎖は磁性プライマーとアニールするようにする。次に、ポリメラーゼによってプライマーを伸長させる。これらの前置きの工程により２の二本鎖標的核酸が得られ、その１つは１の固相鎖を有し、他は１の磁性鎖を有する。残りのプロセスは、一本鎖標的核酸の増幅のための工程２ないし７で前記したごとくに行う。本発明の目的では、「固相プライマーまたは磁性プライマーを核酸鎖に一体化させる」なる語は、かかるプライマーを合成すべき鎖に相補的な核酸鎖にハイブリダイズさせ、次いで、デオキシリボースもしくはリボースヌクレオシド三リン酸の存在下でポリメラーゼ酵素で該プライマーを伸長させることを意味する。本発明の目的では、「磁性プライマー」なる語は、磁場に応答する粒子に共有結合的に付着したオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。かかる磁性プライマーで用いる好ましい粒子の例は、フェリチン分子、その他Dynabead^TM常磁性ビーズ（Dynel，Oslow,Norway）のごとき、双極子モーメントを有するのに十分な大きさの金属粒子を含む。該粒子は粒子に結合した鎖を固相に付着した固定化相補的鎖から分離する最大力を与えるのに十分なサイズとすべきである。所与の粒子につき、速度は経験的に決定でき、最大力はストークス式：Ｆ_M＝６πηｒｖ［式中、ｒは粒子径、ηは増幅で用いる緩衝液の粘度、ｖは緩衝液を通っての未結合粒子の測定された速度］によって計算できる。本発明の目的では、「固相プライマー」なる語は、固相または固定化相に付着したオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。好ましい具体例において、固相は制御された多孔質ガラス（ＣＰＧ）であり、プライマーは、オリゴヌクレオチドを合成するのに使用する常法により固相に共有結合されている。もう１つの好ましい具体例において、プライマーは受容体−リガンド相互作用を介して固相に間接的に付着されている。この具体例において、受容体は固相に共有結合的に付着され、そのリガンドはプライマーに共有結合的に付着されているか、またはその逆である。かくして、プライマーは非共有結合的受容体−リガンド結合を介して固相に結合するようになる。固相への結合は非常に強いので、受容体−リガンドの親和性は、アビジン−ビオチン系のそれのごとく、非常に高いはずであり、それは約１０¹⁵／モルの親和性である。本発明におけるプライマーは、好ましくは、磁性粒子、固相表面、受容体、またはリガンドに共有結合的に付着される。かかる付着は種々の手段によるものでよく、好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基を含む。プライマーの長さは、一般に、よく知られたポリメラーゼ鎖反応で用いられるプライマーについての通常の長さであり、好ましくは、約８ないし約５０ヌクレオチドである。本発明の目的では、「磁性鎖」は一体化された磁性プライマーを有する核酸鎖であり、「固相鎖」は一体化された固相プライマーを有する核酸鎖である。本発明の方法において、固相プライマーおよび磁性プライマー双方の一体化に先立つ二本鎖標的核酸の変性は、種々の方法で行うことができる。１の好ましい具体例において、かかる変性は、例えば、試料を９４℃の温度に約１ないし５分間、好ましくは約２分間付すことによって熱的に達成できる。別の具体例において、かかる変性は、好ましくは、約１３ないし１４のｐＨにおける、試料の塩基への暴露によって達成できる。第１の場合において、固相プライマーまたは磁性プライマーの分離鎖への引き続いてのアニーリングは、過剰のプライマーの存在下で、５分間までの間、温度をＴｍ未満、通常約４５℃から約６５℃まで低下させることによって達成される。第２の場合において、アニーリングは、試料を中性のｐＨ、好ましくは約ｐＨ７ないしｐＨ９にすることによって達成される。いずれの場合においても、好ましくは、標的核酸以上の過剰のプライマーのモル数は、クローン化標的核酸については１０³−倍、ゲノム標的核酸については約１０⁶−倍であり、最も好ましくは、反応当たりのプライマー濃度は約１００ピコモルである。いずれの場合においても、次いで、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシド三リン酸の存在下で適当なポリメラーゼ酵素を添加する。適当なポリメラーゼは、いずれかの真核生物もしくは原核生物またはウイルスからのＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましいポリメラーゼはＴ７ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリ（E．coli）ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素またはクレノウ（Klenow）断片を含む。好ましくは、ヌクレオシド三リン酸はデオキシリボヌクレオシド三リン酸であって、各ｄＮＴＰにつき約１００〜３００μＭの濃度で存在させる。最も好ましくは、プライマー伸長は、約５〜１５ｍＭＭｇ²⁺、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭの各固相プライマーまたは磁性プライマー、０〜５ｍＭベタインを含有し、かつ約１０〜２０ｍＭトリス−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ緩衝液を存在させた約７〜８のｐＨ中で伸長させる。一旦、固相プライマーが標的核酸の１の鎖に一体化され、かつ磁性プライマーが対向鎖に一体化されたら、すべてのさらなる鎖分離工程を電磁場の適用によって行うことができる。図２に示すごとく、１の鎖を固相もしくは固定化相に付着させ、他の鎖を電磁力によって引く結果、塩基のスタッキングおよび鎖間の水素結合相互作用が破壊され、鎖分離が最高点に達する。二本鎖標的核酸に適用される電磁気力は、塩基スタッキングおよび鎖間の水素結合相互作用を破壊するのに十分な程強いが、個々の鎖内の共有結合相互作用を破壊する程は強くないようにすべきである。ＤＮＡ分子における最も弱い鎖内結合を破壊するのに必要な力は約３６８，０００ジュール／モル、または約６×１０^-19ジュール／分子である。仕事（Ｗ）＝力（Ｆ）×距離（Ｄ）であるので、鎖内開裂を引き起こすのに必要な最小の力はＦ＝Ｗ／Ｄである。ＤＮＡについては、力が作用する距離は３．３×１０^-10 メートル／分子である（Smith et al.，1992，Science 258:1122-1126参照）。かくして、最小の鎖開裂力は以下の通りである。対照的に、ＤＮＡデュプレックス分子を破壊するのに必要な力は原理的式：２ｆ／［１−ｆ］²Ｃ_o＝ｅｘｐ（−ΔＧ⁰／ＲＴ）［式中、Ｃ₀＝一本鎖ＤＮＡの濃度；ｆ＝０．９（Ｔ＝Ｔ₉₀（９０％解離温度）の場合）；ｆ＝０．５（Ｔ＝Ｔ₅₀（５０％解離温度＝Ｔｍの場合）；ｆ＝０．１（Ｔ＝Ｔ₁₀（１０％解離温度の場合）］に基づく。 ΔＧの温度依存性はギブス−ヘルムホルツ式： ΔＧ＝−ＴΔＳ＋ΔＨの積分形に従う。かくして、２００量体については、 ΔＧ⁰＝３１．４−ΔＧ＋（開始エネルギー）＝２６．５ｋｃａｌ／モル ΔＳ⁰＝０．３２９２８ｋｃａｌ／モル ΔＨ⁰＝１４８．８ｋｃａｌ／モル、および ΔＧ₉₀−ΔＧ₁₀＝３１ｋｃａｌ／モルまたは約２×１０^-19ジュール／分子。かくして、これらの値に従い、解離力Ｆ_Dは、解離すべきデュプレックスが約６００ｂ．ｐ．に達するまでは開裂力Ｆ_sに近づかない。しかしながら、このサイズ範囲より十分に小さいとき、デュプレックスの解離は協同的となり、Ｆ_sに達することなくしても完全な解離が可能となる。示したごとく、デュプレックスのＴ_m近くの温度で解離を行うのが有利である。しかしながら、プライマー伸長で用いたポリメラーゼ酵素を脱安定化しない温度で解離が起こるはずである。従って、デュプレックスのＴ_mを低下させる試薬を使用するのが好ましい。例えば、＞５Ｍ濃度において、双子イオンのベタインは、中性ｐＨで蛋白質−ＤＮＡ相互作用に影響することなく、ウシ胸腺ＤＮＡの融解温度を約６２℃から約４８℃にシフトさせる。かくして、好ましい具体例において、ＭＣＲは、＞１Ｍのベタイン、最も好ましくは約５．２Ｍないし約５．６Ｍベタインを含有する緩衝液中で行う。別法として、融解温度は約２．４Ｍの塩化トリエチルアンモニウムの存在によって低下させることができる。融解温度を低下させるかかる試薬の使用は、一般に、より長い標的核酸またはより高いＧ＋Ｃ含量を有する標的核酸のいずれかが関与する場合により望ましいことに注意すべきである。二重らせんのさらなる脱安定化は、イー・コリ（E ．coli）ｓｓｂのごとき一本鎖結合（ｓｓｂ）蛋白質、および／またはイー・コリ（E．coli）ＤＮＡヘリカーゼＩ、ＩＩおよびＩＶのごときヘリカーゼの添加によって達成できる（Wood and Matson，1987，J．Biol．Chem．262:152−169および1989、J．Biol．Chem．264:82-97参照）。また、さらに融解温度を低下させるために他の化学品変性剤を限定された量にて添加することもできる。これらの変性剤は、低級アルキル（１−４Ｃ）アルコール、尿素、ホルムアミド、他の水素結合競合剤を含む。かかる化学品変性剤を用いる場合、ポリメラーゼ酵素を過剰に脱安定化させない量でそれらを追求するように注意を払うべきである。適当に使用されるかかる試薬は、現実に、反対の効果を有し得る。例えば、１０％エタノールは、現実に、ポリメラーゼ酵素を安定化させる。ＭＣＲ反応緩衝液中で種々の水素結合脱安定化剤を組み合わせることによって、ＤＮＡ融解温度の丁度下の温度であるが、中温性のポリメラーゼが安定で活性なままであるような温度でＭＣＲを行うことができるように標的核酸の融解温度を低下させるのが可能となる。これらの条件下でＭＣＲを行うと、標的核酸鎖を分離するのに必要な力は、鎖内共有結合開裂が起こるレベルよりも十分に低いことが保証される。第２の態様において、本発明は、試料中の特異的標的核酸の豊富さを測定する迅速な定量的アッセイを提供する。かかる定量的アッセイはポリメラーゼ連鎖反応での使用でよく知られている（例えば、Noonan et al.，1990，Proc．Natl．A cad．Sci．U.S.A.87:7160-7164参照）。本発明の方法であるＭＣＲは、ＰＣＲに対するＭＣＲのスピードのため、既存のアッセイよりもかなり短い時間で行うことができるよく知られた定量的アッセイにおいてＰＣＲの代わりに簡単に使用できる。第３の態様において、本発明は、クローニング用の基質核酸分子の調製的生成、配列分析、または突然変異誘発についての改良されたプロセスを提供する。本発明の方法は、中温性のポリメラーゼの大きな正確性のため、現行の増幅手法によって生産されるものよりも少ない突然変異を有する基質を提供する。その結果、本発明の方法は、引き続いての分子生物学的操作のためのより信頼できる基質を提供する。第４の態様において、本発明は、長い範囲のゲノムマッピングを行う方法を提供する。これは、１００ないし２００キロ塩基サイズの範囲にて標的核酸を増幅する中温性のポリメラーゼの能力によって可能となる。現在、このサイズ範囲を超えるマッピングは、ＤＮＡの酵母人工染色体（ＹＡＣ）への幾分煩わしいクローニングによってのみ行うことができる。しかしながら、かかる大きな標的核酸領域を増幅する能力は、より単純なアプローチを提供する。配列タッグ部位（ＳＴＳ）が５０〜１００ｋｂ間隔でゲノム内で同定されているので（例えば、Olso n et al.，1989，Science 245:1434-1435参照）、連続的ＳＴＳ間の領域は、都合よくは、本発明の方法によって増幅でき、それにより、常法によってより細かいスケールのマッピングのための基質が提供される。以下の実施例は、本発明のある好ましい具体例をさらに説明するが、性質上限定的なものではない。実施例１電磁場における特定の磁性粒子によって提供される現実の最大力の決定 Dynabead^TM常磁性ビーズはDynal（オスロ、ノルウェー）から得られる。ビーズに作用する最大磁気力は、電磁場に応答するマイクロチャンバーを緩衝液に通して移動させる場合のビーズの速度を測定することによって決定される。該マイクロチャンバーはガラス製スライドおよびシールされたカバースリップから構成され、容量はＭＣＲ緩衝液によって占められる２つの間のものである（後記実施例４参照）。該ビーズはシールされ流体を満たしたチャンバーの一端に位置させる。次いで、該スライドをソレノイドで囲み、それを通して電流を流して電磁場を発生させる。コンピューターカーソルを、顕微鏡の像に重ね、ビーズの速度を記録するのに用いる。ビーズ間で変動があるため、この測定はいくつかのビーズについて行う。速度測定は、理論的には１０^-10、５×１０^-9、１０^-8、５×１０^-8、１０^- ⁷ および５×１０^-7ニュートンの力をビーズに課する場の強さで行う。次いで、ビーズの観察された速度を平均し、ストータスの関係：Ｆ_M＝６πηｒｖ［式中、ｒは粒子径、ηは緩衝液の粘度、ｖはビーズの速度］を適用することによって、いくつかのビーズの平均につき現実の最大力を決定する。次いで、この値を、電磁場がビーズに課すはずの理論的力と比較し、かくして、以下の各実施例で用いる電磁場をキャリブレートするのに使用する。実施例２鎖内共有結合開裂を引き起こすのに必要な最小力の決定５’ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基の除去に先立って、標準的な手法によって５０量体オリゴデオキシヌクレオチドをその３’ヒドロキシルにてビオチニル化する。次いで、該ＤＭＴ基を酢酸水溶液中で除去し、Ｃ₁₈ＨＰＬＣでオリゴヌクレオチドを精製する。ガラス製顕微鏡スライドを標準的な手法に従ってアルキルアミドプロパン酸で被覆する。次いで、ビオチニル化オリゴヌクレオチドを、該アルキルアミドプロパン酸のカルボキシル基に直接的にエステル化する。次に、アビジン結合Dynabead^TM常磁性ビーズを該スライドの目的部分に添加し、未結合ビーズを濯いで除去する。次いで、該スライドの目的部分をＭＣＲ緩衝液で満たし（実施例４参照）、カバースリップを添加する。該スライドをソレノイド中に包み、電流をソレノイドに通すように向けることによって、各ビーズに対して１０^-10Ｎの現実の力を発生する適当な強さの電磁場を発生させる。オリゴヌクレオチドが約１０^-9Ｎの力の開裂を受けるまで、現実の力を増大させる。従って、Ｆ＝〜２×１０^-9ジュール／分子＝〜２×１０^-9Ｎである。実施例３オリゴヌクレオチド二重らせんの脱安定化に必要な最小力の決定３’レブリニルオリゴヌクレオチド（５０量体、実施例２に同一）をその５’ ヒドロキシルを介してアルキルアミドプロパン酸被覆ガラス製顕微鏡スライドのカルボキシル基に対し直接エステル化する。次いで、該レブリニル保護基を塩基中で除去する。次いで、ガラス結合したオリゴヌクレオチドの１０個の最も３’ 側のヌクレオチドに相補的なその１０個の最も３’側ヌクレオチドを有する５’ −常磁性ビーズ誘導体化５０量体オリゴヌクレオチドを、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを含有するＭＣＲ緩衝液中に添加する（実施例４参照）。オリゴヌクレオチドの伸長により、９０量体デュプレックスが得られる。カバースリップを添加し、顕微鏡スライドをソレノイド中に包み、顕微鏡のステージ上に置く。次いで、該ソレノイドに電流を通して、約１０^-10Ｎの常磁性ビーズに対する現実の力を発生させる。この力は、デュプレックスの鎖が約６．１×１０^-10Ｎの力で分離されるまで徐々に増加させる。実施例４ＭＣＲを用いる標的ＤＮＡ配列を増幅させるための増幅プロトコル pBluescript^TMＳＫ＋１−ベクターをＰｖｕＩＩで線状化し、該ポリリンカーにわたる２１０ｂ．ｐ．断片を以下のごとく増幅させる。１５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．２ｍＭｄＮＴＰ、０．５ｍＭ固相プライマーおよび０．５ｍＭベタインを含有する溶液を含むエッペンドルフ試験管に、１ｎｇの消化したプラスミドを添加する。該固相プライマーは５’−AACAGCTATGACCATG−３’（配列番号１）であり、５ ’ヒドロキシル基はアルキルアミドプロパン酸−制御多孔質ガラスのカルボキシル基に対してエステル化されている。磁性プライマーは５’−GTAAAACGACGGCCAT −３’（配列番号２）であり、５’末端はビオチニル化され、かつストレプトアビジン誘導体化Dynabead^TMに連結されている。溶液を２分間で９７℃まで加熱し、次いで、５０℃まで冷却する。次いで、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの１０ユニットを添加し、溶液を４５℃で２分間インキュベートする。溶液を２分間で９７ ℃まで加熱し、次いで、再度５０℃まで冷却する。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの１０ユニットを添加し、溶液を４５℃で２分間再度インキュベートする。次いで、４５〜５０℃の温度でソレノイド内に適合したエッペンドルフ試験管付きのＭＣＲ機に溶液を移す。デュプレックスの鎖を分離するが、鎖内の開裂を引き起こさない強さの電磁場（例えば、約５×１０^-11および１×１０^-9Ｎの間の現実の最大力を各磁性ビーズに課す場）を１５秒間適用し；次いで、５秒間逆転させ、溶液を４５〜５０℃で２分間インキュベートする。次いで、これらの電磁場パルスおよびインキュベーション工程を約２０回繰り返す。次いで、得られた２１０ｂｐ増幅産物をゲル電気泳動で分析する。実施例５ＭＣＲを用いる標的ＤＮＡ配列の増幅１５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール、０．０５ｍＭの各ｄＮＴＰ、５％グリセロール、５％エチレングリコール、０．１％ツィーン（Tween）洗剤、および各０．５ｍＭの２つのオリゴヌクレオチドプライマーの溶液中、３０アットモル（at tomole）の線状ラムダファージＤＮＡ（〜１００ｐｇ）を含有するＭＣＲ反応混合物を調製した。これらのプライマーのうち１つは、その５’末端がビオチニル化され、かつストレプトアビジン−被覆常磁性ビーズ（Dynabead^TM）に非共有結合的に付着された磁性プライマーであった。該磁性プライマーのヌクレオチド配列は：であった。他のプライマーは、ＭＣＲ増幅を行った反応容器よりなるマイクロタイターディッシュ（Covalink，Nunc Inc.，Naperville，IL）のウェルの底に５ ’末端リン酸基によって共有結合的に付着された固相プライマーであった。該固相プライマーのヌクレオチド配列は：であった。該ＭＣＲ反応混合物を１分間、９４℃に加熱し、５０ ℃まで冷却し、１〜２ユニットのＴ７ＤＮＡポリメラーゼを添加した。５０℃ におけるインキュベーションを約１分間継続した。次いで、溶液を約１分間、９４℃に加熱し、５０℃まで冷却し、前記したごとくＭＣＲ装置に入れた。１〜２ユニットのＴ７ＤＮＡポリメラーゼを該ＭＣＲ反応混合物に添加し、ＭＣＲ増幅の持続のために４５〜５０℃でインキュベートした。ＭＣＲ装置のソレノイドによって発生した電磁場を約１５秒間適用し、次いで、場の極性を約５秒間逆転させ、続いて外部磁場の不存在下で５秒間インキュベーションした。電磁気パルスおよびインキュベーションのこのサイクルをさらに２０回反復した。次いで、得られた７５０ｂｐＤＮＡ産物を、９０％ホルムアミド／１０ｍＭＥＤＴＡの溶液中でDynabeadから溶出させ、ゲル電気泳動によって分析した。かかる電気泳動分析の結果により、特異的７５０ｂｐＭＣＲ産物の増幅が確認された。実施例６電磁気力を用いる鎖分離の証明前記したＭＣＲ装置によって発生させた場の強さを有する適用電磁場によって生じた力による、７５０ｂｐ二本鎖ＤＮＡ分子の鎖を分離する能力を決定した。さらに、この決定で用いたアッセイを用いて、いずれかの鎖開裂がＤＮＡデュプレックス変性に伴うか否かを検出した。このアッセイのための実験スキームは図３に示す。２つのタイプのマイクロタイターウェルを調製した。両ウェルにおいて、約０．２ピコモルの７５０ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ断片をマイクロタイターウェルに共有結合により連結させた。ウェルＡにおいて、このＤＮＡ断片は未標識であり、一方ウェルＢにおいてはＤＮＡ断片はその５’末端で放射能標識されていた。これらのウェルにおける各７５０ヌクレオチド断片を、該７５０ヌクレオチド断片の３’の５００ヌクレオチドに相補的な５００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子と共にアニールした。該５００ヌクレオチド断片をその５’末端でビオチニル化し、ストレプトアビジン−被覆磁性ビーズに非共有結合にて連結させた。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを適当な緩衝液、塩およびｄＮＴＰの存在下で添加し、該５００ヌクレオチド断片を伸長させた。ウェルＡにおいて、伸長は（³²Ｐ）−標識ｄＣＴＰの存在下で行い、一方、ウェルＢにおいては放射能ｄＮＴＰは存在しなかった。伸長の後、伸長した鎖を、５０℃における前記した外部磁場の適用によって分離した。次いで、伸長産物を、実施例５におけるごとくにホルムアミド溶液でDynabeadから溶出させ、電気泳動によって分析した。次いで、ウェルを９０ ℃まで加熱し、得られた上清を電気泳動により分析した。これらの実験の結果を図４に示す。放射性同位体標識７５０ヌクレオチド鋳型の試料を比較のために示す。ウェルＡからの試料において、放射性同位体標識（伸長）ＤＮＡは５００〜７５０ヌクレオチドの広いスメアに観察され、これは、種々の程度に伸長したＤＮＡ分子の集団を表す。さらなる９０℃における熱的変性は実質的に放射性同位体標識ＤＮＡを示さず、これは、磁気分離はこれらの実験において定量的であったことを示す。ウェルＢは５０℃または９０℃において放射性同位体標識ＤＮＡを示さず、これは、磁気分離は有意な鎖開裂なくして達成され、放射性同位体標識鋳型鎖の共有結合的付着は９０℃での加熱に対して安定であることを示す。これらの結果は、長さが少なくとも７５０ヌクレオチドのＤＮＡ断片が、実施例１〜３で行った理論的考察から予測されるごとく、汚染鎖開裂なくして外部磁場を用いて定量的に分離できることを示す。これまでの開示は本発明のある特別の具体例を強調するもので、同等の修飾および改変は添付の請求の範囲に記載した発明の精神および範囲の内にあることを理解すべきである。

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）標的核酸に相補的な核酸鎖に固相プライマーを一体化させて、該標的核酸に結合した固相鎖を生じさせ；（ｂ）該固相鎖と該標的核酸とを分離し；（ｃ）該固相鎖に相補的な核酸鎖に磁性プライマーを一体化させて、１の固相鎖および１の磁性鎖を有するデュプレックス生じさせ；（ｄ）該デュプレックスを解離させるのに十分な強度の電磁場を適用することによって、該固相鎖を該磁性鎖から分離し；（ｅ）該固相鎖に相補的な磁性プライマーを固相鎖とアニールし、該磁性鎖に相補的な固相プライマーを磁性鎖とアニールし；（ｆ）アニールしたプライマーを適当なＤＮＡポリメラーゼで伸長し；次いで、（ｇ）所望の量の増幅されたＤＮＡを得るのに必要な回数だけ工程（ｄ）ないし（ｆ）を反復する：工程よりなることを特徴とする特異的一本鎖標的核酸の増幅方法。２．（ａ）標的核酸に相補的な核酸鎖に磁性プライマーを一体化させて、該標的核酸に結合した磁性鎖を生じさせ；（ｂ）該磁性鎖と該標的核酸とを分離し；（ｃ）該磁性鎖に相補的な核酸鎖に固相プライマーを一体化させて、１の固相鎖および１の磁性鎖を有するデュプレックス生じさせ；（ｄ）該デュプレックスを解離させるのに十分に強度の電磁場を適用することによって、該固相鎖を該磁性鎖から分離し；（ｅ）該固相鎖に相補的な磁性プライマーを固相鎖とアニールし、該磁性鎖に相補的な固相プライマーを磁性鎖とアニールし；（ｆ）アニールしたプライマーを適当なＤＮＡポリメラーゼで伸長し；次いで、（ｇ）所望の量の増幅されたＤＮＡを得るのに必要な回数だけ工程（ｄ）ないし（ｆ）を反復する：工程よりなることを特徴とする特異的一本鎖標的核酸の増幅方法。３．（ａ）標的核酸の鎖を分離して第１の鎖および第２の鎖を生じさせ；（ｂ）第１鎖に相補的な鎖に固相プライマーを一体化させて、第１鎖および固相鎖を有する第１のヘテロデュプレックスを生じさせ、第２鎖に相補的な鎖に磁性プライマーを一体化させて、第２鎖および磁性鎖を有する第２のヘテロデュプレックスを生じさせ：（ｃ）第１のヘテロデュプレックスの鎖および第２のヘテロデュプレックスの鎖を分離し；（ｄ）該固相鎖に相補的な磁性プライマーを固相鎖とアニールし、該磁性鎖に相補的な固相プライマーを磁性プライマーとアニールし；（ｆ）アニールしたプライマーを適当なＤＮＡポリメラーゼで伸長させ；次いで、（ｇ）所望の量の増幅されたＤＮＡを得るのに必要な回数だけ工程（ｄ）ないし（ｆ）を反復する：工程よりなることを特徴とする特異的二本鎖標的核酸の増幅方法。４．該磁性プライマーがフェリチン分子に結合したオリゴヌクレオチドである請求項１記載の方法。５．該磁性プライマーが常磁性ビーズに結合したオリゴヌクレオチドである請求項１記載の方法。６．該固相プライマーがガラスマトリックスに結合したオリゴヌタレオチドである請求項１記載の方法。７．該磁性プライマーがフェリチン分子に結合したオリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。８．該磁性プライマーが常磁性ビーズに結合したオリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。９．該固相プライマーがガラスマトリックスに結合したオリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。１０．該磁性プライマーがフェリチン分子に結合したオリゴヌクレオチドである請求項３記載の方法。１１．該磁性プライマーが常磁性ビーズに結合したオリゴヌクレオチドである請求項３記載の方法。１２．該固相プライマーがガラスマトリックスに結合したオリゴヌクレオチドである請求項３記載の方法。１３．次の（ａ）〜（ｈ）（ａ）約１０ないし約２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７〜８）；（ｂ）約５ないし約１５ｍＭＭｇＣｌ₂；（ｃ）約１ｍＭＤＴＴ；（ｄ）約０．１ないし０．３ｍＭの各４種のｄＮＴＰ；（ｅ）約０．５ｍＭ固相プライマー；および／または（ｆ）約０．５ｍＭ磁性プライマー；および（ｇ）約０ないし約５．６Ｍベタイン；および（ｈ）標的核酸；よりなる緩衝液中で該方法が行われる請求項１記載の方法。１４．次の（ａ）〜（ｈ）（ａ）約１０ないし約２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７〜８）：（ｂ）約５ないし約１５ｍＭＭｇＣｌ₂；（ｃ）約１ｍＭＤＴＴ；（ｄ）約０．１ないし０．３ｍＭの各４種のｄＮＴＰ；（ｅ）約０．５ｍＭ固相プライマー；および／または（ｆ）約０．５ｍＭ磁性プライマー；および（ｇ）約０ないし約５．６Ｍベタイン；および（ｈ）標的核酸；よりなる緩衝液中で該方法が行われる請求項２記載の方法。１５．次の（ａ）〜（ｈ）（ａ）約１０ないし約２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７〜８）；（ｂ）約５ないし約１５ｍＭＭｇＣｌ₂；（ｃ）約１ｍＭＤＴＴ；（ｄ）約０．１ないし０．３ｍＭの各４種のｄＮＴＰ；（ｅ）約０．５ｍＭ固相プライマー；および／または（ｆ）約０．５ｍＭ磁性プライマー；および（ｇ）約０ないし約５．６Ｍベタイン；および（ｈ）標的核酸；よりなる緩衝液中で該方法が行われる請求項３記載の方法。