JPH08511684A - 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼ - Google Patents

熱安定性ｄｎａポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼ

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JPH08511684A
JPH08511684A JP7501963A JP50196395A JPH08511684A JP H08511684 A JPH08511684 A JP H08511684A JP 7501963 A JP7501963 A JP 7501963A JP 50196395 A JP50196395 A JP 50196395A JP H08511684 A JPH08511684 A JP H08511684A
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イー． ダールバーグ，ジェームス
アイ． リャミチェフ，ヴィクター
アン ディー． ブロウ，メアリー
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サード ウェーヴ テクノロジーズ，インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 部位特異的に核酸開裂構造を開裂する方法を開示する。核酸合成流性を妨げずに、５’ヌクレアーゼ溶性を有する開裂酵素は、特異的な核酸配列を検出する新規な方法の基礎として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼ 本願は１９９２年１２月１２日出願の特許出願第０７／９８６，３３０号の一 部継続出願である１９９３年６月４日出願の特許出願第０８／０７３，３８４号 の一部継続出願である。発明の分野 本発明は部位特異的に核酸開裂構造を開裂する方法に関する。特に、本発明は 核酸合成能を阻害しない５’ヌクレアーゼ活性をもつ開裂酵素に関する。発明の背景 特定の核酸配列を検出することにより、感染を示唆するウイルスまたは細菌の 核酸配列の存在を診断したり、病気と関連する哺乳動物遺伝子の変異または対立 遺伝子の存在を診断したり、また法廷での試料中の核酸源を同定したり、父親を 決定するのに利用されてきた。 特定核酸配列の検出は典型的にはハイブリダイゼーションによって行われる。 ハイブリダイゼーション法はターゲット核酸（検出すべき配列）と相補的な配列 のアニーリングを含む。相補的配列を含む核酸の２つのポリマーがお互いを見つ け出し、塩基対相互作用により結合する能力を有することはよく知られた現象で ある。「ハイブリダイゼーション」法はＭａｒｍｕｒとＬａｎｅ（Proc．Natl． Acad．Sci．USA 46:453，1960）およびＤｏｔｙら（Proc．Natl．Acad．Sci．US A 46:461，1960）によって最初に観察されたが、その後この方法は改良されて現 代生物学に必須の 道具となった。 Ｈａｙａｓｈｉら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 50:664，1963）によって実 施された初期のハイブリダイゼーション研究は溶液中で行われた。さらに、ター ゲットＤＮＡまたはＲＮＡを固体支持体に固定する方法が開発された。Ｓｍｉｔ ｈとＷｉｌｃｏｘ（J．Mol．Biol．51:379，1970）による特異的制限エンドヌク レアーゼの発見でＤＮＡの別々のフラグメントを単離することが可能となった。 制限酵素と組み合わせて、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（J．Mol．Biol．98:501，1975）に よって記載された固定化法を用いることにより、多数の分画したゲノムＤＮＡ中 から単一コピー遺伝子をハイブリダイゼーションによって同定することが可能と なった。 ハイブリダイゼーション法における進歩にもかかわらず、ハイブリダイゼーシ ョンをヒトの診断の道具として大規模に用いるには多数の問題がある。やっかい な問題には次のようなものがある：１）ハイブリダイゼーションの効率が悪いこ と；２）ゲノムＤＮＡ混合物中の特定ターゲット配列の濃度が低いこと；そして ３）ただ部分的に相補的なプローブとターゲットとのハイブリダイゼーション。 １．効率の悪いハイブリダイゼーション 可能性のある多数のプローブ−ターゲット複合体のうちの一部のみがハイブリ ダイゼーション反応で形成されることが実験的に観察されている。特に短いオリ ゴヌクレオチドプローブ（長さ１００塩基以下）の場合にはこれが顕著である。 これには次の３つの主な理由がある：ａ）二次および三次構造の相互作用によっ て ハイブリダイゼーションが起こり得ない；ｂ）ターゲット配列を含むＤＮＡ鎖が 相補鎖と再ハイブリダイズ（再結合）する；そしてｃ）いくつかのターゲット分 子は、ターゲット核酸を固体表面に固定するハイブリダイゼーション方式に用い ると、ハイブリダイゼーションが妨げられる。 たとえプローブの配列がターゲット配列、すなわちターゲットの一次構造と完 全に相補的であっても、高次構造の再配置によってプローブがターゲット配列に 接近できるものでなければならない。これらの高次構造再配置は分子の二次また は三次構造に関係する。二次構造は分子内結合によって決定される。ＤＮＡやＲ ＮＡターゲットの場合、分子内結合は（２本の異なる鎖間のハイブリダイゼーシ ョンとは異なり）１本の連続塩基鎖内でのハイブリダイゼーションによる。分子 内結合の程度と位置によって、プローブはターゲット配列から遠ざけられハイブ リダイゼーションが妨げられる。 変性２本鎖ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドプローブの溶液ハイブリダイゼーシ ョンは、より長い相補的ターゲット鎖が再変性されたり再結合されたりするため に、もっと複雑である。この場合もハイブリダイズしたプローブはこの理由によ って遠ざけられる。その結果、プローブやターゲットの最初の濃度と比較して低 いハイブリダイゼーション率（低い「適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）」）となる 。 ナイロンやニトロセルロースなどの固定表面へのターゲット核酸の固定化は分 子生物学では周知の技術である。固定化方式はターゲット分子の相補鎖間に起き る再会合の問題を解決するが、二 次構造効果に関する問題を解決しない。しかしながら、これらの混合相方式（す なわち、サザンハイブリダイゼーションまたはドットブロットハイブリダイゼー ション）は時間のかかる固定工程を必要とする。ハイブリダイゼーション反応自 体は液相ハイブリダイゼーション反応よりも動力学的にはるかに遅い。固定化と ハイブリダイゼーションの工程を合わせると、実施に最低数時間から数日を要す る。さらに、標準的固定化法はしばしば効率が悪く、固体表面の複数の部分にタ ーゲット分子を多数結合させることになり、次のプローブ分子とのハイブリダイ ゼーションを不可能にする。これらの種々の効果のため全体として、最初のター ゲット分子のうちの数％のみがハイブリダイゼーション反応でプローブと結合す るだけである。 ２．低いターゲット配列濃度 実験室での試験では精製プローブとターゲットが用いられる。また、これらの プローブとターゲットの濃度は必要とする感度に応じて調整できる。これとは対 照的に、ハイブリダイゼーションを医学診断に応用する目的は、ゲノムＤＮＡ混 合物からターゲット配列を検出することである。ターゲット配列を含むＤＮＡフ ラグメントは通常ゲノムＤＮＡ中に比較的少量しか含まれていない。これが大き な技術的困難をもたらし、オリゴヌクレオチドプローブを用いる多くの慣用法で はこのような低濃度でハイブリダイゼーションを検出するのに必要な感度をもっ ていない。 ターゲット配列濃度の問題を解決する１つの試みは検出シグナルの増幅である 。これには多くの場合、オリゴヌクレオチドプローブに１またはそれ以上の標識 を付ける。非放射性標識の場合に は、最高の親和性をもつ試薬であっても、オリゴヌクレオチドプローブを用いて ゲノムＤＮＡ中の１コピー遺伝子を検出することはできないことが見いだされた 。Ｗａｌｌａｃｅら（Biochimie67:755，1985）を参照されたい。放射性オリゴ ヌクレオチドプローブの場合には、極めて高い特異的活性をもつもののみがゆっ くりとした満足できる結果を示すことが見いだされた。Ｓｔｕｄｅｎｃｋｉおよ びＷａｌｌａｃｅ（DNA 3:1，1984）およびＳｔｕｄｅｎｋｉら（Human Genetic s 37:42，1985）を参照されたい。 ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法は低いターゲット配列濃度の 問題に対する別のアプローチを提供する。ＰＣＲはハイブリダイゼーション前に ターゲット濃度を直接増加する。米国特許第４，６８３，１９５号および第４， ６８３，２０２号において、Ｍｕｌｌｉｓらはクローニングや精製を行うことな くゲノムＤＮＡ混合物中でターゲット配列セグメントの濃度を増加する方法を開 示する。 ターゲット配列を増幅するこの方法は、所望のターゲット配列を含むＤＮＡ混 合物に過剰モルの２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入することからなる 。２つのプライマーは２本鎖配列のそれぞれの鎖と相補的である。混合物を変性 してハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、プライマーをポリメ ラーゼで伸長させて相補鎖を形成する。比較的高濃度の所望のターゲット配列セ グメントを得るのに必要な回数だけ変性、ハイブリダイゼーション、ポリメラー ゼ伸長の工程を繰り返すことができる。所望するターゲット配列セグメントの長 さは２つのプライマー同志の相対的位置によって決定されるので、この長さは調 整し うるパラメーターである。繰り返し工程のゆえに、この方法は発明者によって” ポリメラーゼチェインリアクション”（またはＰＣＲ）と呼ばれている。所望す るターゲット配列セグメントが混合物中において（濃度の点で）優勢な配列とな るので、このセグメントが「ＰＣＲ増幅された」という。 しかしながら、ＰＣＲ法は増幅工程で非ターゲットフラグメントを生産しやす い。ＰＣＲ反応の途中で部分的に相対的な領域でにせのプライマー伸長が起こり 得る。増幅工程の特異性に影響する要因には次のものを含む：ａ）分析すべきＤ ＮＡ中のターゲット配列の濃度；ｂ）Ｍｇ++、ポリメラーゼ酵素およびプライマ ーの濃度；ｃ）増幅サイクルの回数；そしてｄ）増幅反応での各種工程に用いる 温度と時間［ＰＣＲ法−ＤＮＡ増幅の原理と応用（H.A．Erlich編集，Stockton Press，New York，pp.7-16，1989）。特定ターゲット配列が試料ＤＮＡ中に低濃 度で存在する場合には、非ターゲットフラグメントが生産されやすい。臨床試料 ではターゲットがゲノム中に１コピーだけ存在したり、ＨＩＶ感染のように非常 に少量のウイルスＤＮＡしか存在しなかったりで、ターゲット濃度が低いのが通 常である。 検出すべき特定ターゲット配列を表さない増幅産物が生産されるので、ＰＣＲ 反応の産物はターゲットＤＮＡに特異的なプローブを用いて分析しなければなら ない。特異的増幅産物の検出は、ターゲット配列に特異的なプローブと固体支持 体に固定した反応産物とのハイブリダイゼーションによって行ってきた。このよ うな検出法は煩雑で上述したハイブリダイゼーションによるターゲット分子の検 出と関連した同様の問題を有する。 特異的ＰＣＲ産物の非ハイブリダイゼーションによる検出法がＨｏｌｌａｎｄ ら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:7276，1991）によって記載されている。こ の検出法では、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ ｓ）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼ（「ＤＮＡＰＴａｑ」）の５’ヌクレアー ゼ活性を用いて、増幅に伴う特異的検出可能な産物を作製する。ターゲットＤＮ Ａに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを５’末端で標識し、増幅すべきター ゲットの伸長に用いる非標識プライマーと一緒にＰＣＲ反応に加える。ＤＮＡＰ Ｔａｑの５’ヌクレアーゼ活性が、プライマーの伸長が完了する前にターゲット ＤＮＡに結合した標識プローブを開裂し、より小さいプローブフラグメントを生 じる。この検出法では、試料に増幅を行って特異的検出産物を生産することを必 要とする。これでは時間がかかり、かつ煩雑な装置を必要とする。 この検出系では、ターゲットＤＮＡの最低１００コピーの出発コピー数（すな わち増幅前のコピー数）を用いており、これよりも少ない数の出発コピー数でも この方法で検出できるのかは明らかでない。試料サイズが制限されるために非常 に少量のＤＮＡしか得られない臨床試料（新生児や胎児の血液や法廷試料など） では非常に少ないコピー数が問題となるかも知れない。 このような方法は従来のハイブリダイゼーション検出法の改良ではあるが、な お試料にＰＣＲ反応を実施しなければならず、固有の問題を含んでいる。このよ うな問題の１つは、この系では検出プローブがプライマー伸長の起こる前にター ゲットＤＮＡに結合しなければならないことである。伸長が先に起こると、プロ ー ブ結合部位が使用できなくなり、プローブ消化ができなので検出シグナルがでて こない。この問題を解決するために、ユーザーはプライマーとプローブの相対量 を変更したり、プローブの配列や長さを調節しなければならない。このような最 適化の必要は臨床実験室ではあまりにも煩雑である。 ３．部分的相補性 これに用いる方法のいかんにかかわらず、ハイブリダイゼーションは、検出す べき配列（ターゲット配列）と試験の実施に用いるＤＮＡ断片（プローブ）との 間のある程度の相補性を必要とする（もちろん、相補性が全くなくとも結合が得 られるが、このような結合は非特異的であり避けるべきである）。多くの診断上 の利用では、ハイブリダイゼーションが完全であるか、部分的に相補的であるか を決定することは重要でない。例えば、病原体ＤＮＡ（ウイルス、細菌、真菌、 マイコプラズマ、原生動物など）の存在または不在を単に検出するのが目的なら ば、関連の配列が存在するときにそのハイブリダイゼーション法によってハイブ リダイゼーションが確実に起こることだけが重要であり、部分的に相補的なプロ ーブと完全に相補的なプローブの両方がハイブリダイズする条件を選択できる。 しかし、その他の診断上の利用では、ハイブリダイゼーションによって変異ター ゲット配列を識別することが必要である。例えば、病原体の特定の対立遺伝子変 異が存在することが問題となる。このような正常配列と変異配列とは１または数 塩基で異なっている。 ハイブリダイゼーション法が部分的相補性と完全相補性とを識別することを必 要とする別の利用がある。遺伝子多型性を検出す ることが重要となりうる。ヒトヘモグロビンは部分的には４つのポリペプチド鎖 からなる。これらの鎖のうち２つは１４１アミノ酸からなる同一の鎖（α鎖）で あり、２つは１４６アミノ酸からなる同一の鎖（β鎖）である。β鎖をコードす る遺伝子は多型性を示すことが知られている。正常な対立遺伝子は６番目にグル タミン酸をもつβ鎖をコードする。突然変異対立遺伝子は６番目にバリンをもつ β鎖をコードする。このアミノ酸の違いは、鎌状赤血球貧血として臨床的に知ら れる重大な（その人が突然変異対立遺伝子に対して同型接合であるときには最も 重大な）生理学的意味をもつ。正常な対立遺伝子ＤＮＡ配列と突然変異対立遺伝 子ＤＮＡ配列との間にただ１つの塩基が異なることによってアミノ酸の変更が起 きるという遺伝学の基礎はよく知られたことである。 その他の方法（制限酵素分析など）と組み合わせなけれは、部分相補性の場合 も完全相補性の場合も同レベルのハイブリダイゼーションを起こすハイブリダイ ゼーション法はこのような利用には不適切である。プローブが正常ターゲット配 列と変異ターゲット配列のどちらにもハイブリダイズするからである。 部分相補性と完全相補性との区別を可能にする方法が開発されてきた。１つの アプローチは、研究中の特定ハイブリダイゼーションの温度要求を利用すること である。Ｗａｌｌａｃｅら（Nucl．Acids Res．6:3543，1979；Nucl．Acids Res ．9:879，1981）によって記載されたように、典型的な融解曲線試験では、非平 衡条件下で温度を上昇させながら固定化プローブ−ターゲット複合体を洗浄する 。完全相補的なプローブ−ターゲット複合体と比較して、部分相補的なプローブ −ターゲット複合体は温度安定性が 低いことが観察された。したがって、この違いを利用してプローブが部分相補的 ターゲット配列とハイブリダイズしたか、完全相補的ターゲット配列とハイブリ ダイズしたかを決定できる。 ハイブリダイゼーションの温度依存性を利用する従来の方法には技巧を要する 。この方法を用いてヒトゲノムターゲット中の１塩基の突然変異を区別するには 、ターゲット配列とのハイブリダイゼーション相互作用が１７塩基から２５塩基 の長さである短いオリゴヌクレオチドプローブを用いる場合に限定される。長さ の下限はヒトゲノム中のプローブと相補性をもつかどうかのランダムな可能性に よって決定した。これはランダムな１６塩基対の相互作用では１以上であるが、 １７塩基またはそれ以上の長さの相互作用では１以下である。上限は実施可能性 の問題である。２５塩基よりも長い相互作用では温度安定性に基づいて１塩基の ミスマッチを区別することは困難である。またこれらの従来法は残念なことに時 間がかかり過ぎる。この実験でのプローブ濃度は約１−５ｘ１０-10Ｍである。 この濃度は経験的に導き出された；すなわち、プローブの使用量を最小にし、同 時に約２０ヌクレオチドの長さのプローブを用いて１コピーの遺伝子を十分区別 できるものである。ハイブリダイゼーション時間はこの条件では２〜１０時間で ある。ハイブリダイゼーションの後、種々のストリンジェンシーを用いて数回洗 浄して過剰のプローブ、非特異的結合、およびターゲットゲノム中で部分相補的 配列と結合したプローブを除去する。実験のノイズ（非特異的結合プローブ）に 対するシグナル（特異的結合プローブ）比は究極的には洗浄工程で決定されるの で、洗浄工程を注意深く制御することが必要である。 上述した検出法はいずれも上述した３つの問題すべてを解決するものではない 。ＰＣＲ法は低いターゲット濃度の問題を解決する。しかしながら、どのような ハイブリダイゼーション法を用いてＰＣＲ産物を特異的に検出しようとも、すべ てのターゲット分子の検出と関連する同じ問題に直面する。ＰＣＲターゲット間 の１塩基の違いの検出は最初、オリゴヌクレオチドプローブとＰＣＲターゲット との間に形成されるハイブリダイゼーション産物の制限酵素分析を用いてなされ た。この方法は制限酵素がすべての配列に存在する訳ではないという事実によっ て限定される。最近の研究では、制限酵素を用いないで区別をしているが、しか しこれらの研究では固体支持体へのターゲット核酸の固定が不十分である（ドッ トブロットハイブリダイゼーション；Saiki et at.，Nature 324:163，1986）。 対立遺伝子特異的変異の別の検出法がＫｗａｋら（Nucl．Acids Res．18:999 ，1990）に開示されている。この方法は、鋳型鎖とプライマーとの間にミスマッ チがある場合にはＤＮＡＰがＤＮＡ鎖を合成することが困難であるという事実に 基づいている。ミスマッチは、ＰＣＲ反応で用いるプライマーに完全に相補的で ないターゲットＤＮＡの伸長を妨げ、増幅を妨げる作用をする。対立遺伝子特異 的変異は、可能性のある対立遺伝子のうちの１つだけと完全にマッチするプライ マーを用いることによって検出できるが、この検出法は技巧を要し、制限が多い 。特に面倒なのは、ミスマッチの塩基組成がミスマッチを越えて伸長するのを妨 げる能力に影響するという事実である。ある種のミスマッチは伸長を妨げず、少 しの影響しか及ぼさない。 特定ターゲットＤＮＡを検出する理想的方法は、試料ＤＮＡをまず増幅する必 要なく検出できるものであり、ＤＮＡ試料中に低コピー数で存在するターゲット 配列の検出ができるものである。このような理想的検出法はまた、哺乳動物遺伝 子の対立遺伝子間の１塩基の変異でも識別できるように、ターゲット配列の変異 間の区別ができるものである。 本発明の１つの目的は上述した問題点を解決する特定核酸配列の検出法を提供 することである。発明の概要 本発明は部位特異的手法で核酸開裂構造を開裂する手段に関する。ある態様で は、開裂手段は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼを含む開裂 酵素である。これらのポリメラーゼは特定核酸配列の新規検出法の基礎となる。 本発明は、多くの他の用途のうち、臨床診断目的に新規検出法を用いることを含 む。 ある態様では、本発明は、天然の（すなわち「野生型」）ＤＮＡポリメラーゼ のＤＮＡ合成活性とは異なるＤＮＡ合成活性を示すように、天然の配列を変更し たＤＮＡポリメラーゼ（すなわち「突然変異体」ＤＮＡポリメラーゼ）をコード するＤＮＡ配列を含む。コードされるＤＮＡポリメラーゼが天然ＤＮＡポリメラ ーゼよりも低い合成活性を示すように変更することが好ましい。このようにして 、本発明の酵素は主として５’ヌクレアーゼであり、妨害となる合成活性の不在 下に構造特異的に核酸を開裂することができる。 重要なことは、本発明の５’ヌクレアーゼが直鎖状二本鎖構造を開裂して単一 の分離した開裂産物を生じることである。これら の直鎖構造は、１）野生型酵素によって（有意な程度には）開裂されないか、あ るいは２）野生型酵素によって開裂されて複数の産物を生じるか、のいずれかで ある。この５’ヌクレアーゼの特徴は真性細菌熱安定性種に見られる熱安定性ポ リメラーゼから同様にして得られる酵素と一致することが発見された。 ポリメラーゼ合成を欠失させるのに必要な変更の性質や欠失の程度によっては 本発明は限定されない。本発明は変更された構造（一次、二次など）とともに、 合成阻害剤によって阻害される天然の構造も含む。 構造を変更する場合には、ポリメラーゼの構造を変更する手段によっては本発 明は限定されない。ある態様では、天然ＤＮＡ配列の変更は１ヌクレオチドの変 化を含む。別の態様では、天然ＤＮＡ配列の変更は１以上のヌクレオチドの欠失 を含む。さらに別の態様では、天然ＤＮＡ配列の変更は１以上のヌクレオチドの 挿入を含む。いずれの場合にも、ＤＮＡ配列の変更はアミノ酸配列の変更となっ て現れることがある。 本発明は各種の起源由来の５’ヌクレアーゼを意図する。好ましい５’ヌクレ アーゼは熱安定性である。熱安定性５’ヌクレアーゼは、核酸ハイブリダイゼー ションが極めて特異的な温度で作用しうる点で特に有用であり、対立遺伝子特異 的検出（１塩基のミスマッチを含む）を可能にする。ある態様では、熱安定性５ ’ヌクレアーゼは、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉ ｃｕｓ）、サーマス・フラヴァス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）およびサー マス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の天然ポ リメラーゼ由来の変 更ポリメラーゼからなる群から選択される。 上述したように、本発明は変更ポリメラーゼを検出法に使用することを意図す る。ある態様では、本発明は特定ターゲット核酸分子の存在を検出する方法を意 図しており、該方法は、ａ）ｉ）開裂手段、ii）ターゲット核酸、iii）ターゲ ット核酸の第１部分と相補的な第１オリゴヌクレオチド、iv）第２オリゴヌクレ オチドをもつ第１固体支持体であって、該第２オリゴヌクレオチドのある領域が ターゲット核酸の第２部分と相補的であって、第２オリゴヌクレオチドの非相補 的領域がその５’末端に一本鎖アームを提供し、該５’アームの一部が第１シグ ナルオリゴヌクレオチドを含む、上記第１固体支持体、ｖ）第３オリゴヌクレオ チドをそれぞれもつ複数の「未開裂」第２固体支持体であって、該第３オリゴヌ クレオチドのある領域が第１シグナルオリゴヌクレオチドと相補的であって、第 ３オリゴヌクレオチドの非相補的領域がその５’末端に一本鎖アームを提供し、 該５’アームの一部が第２シグナルオリゴヌクレオチドを含む、上記第２固体支 持体、ならびにvi）第４オリゴヌクレオチドをそれぞれもつ複数の「未開裂」第 ３固体支持体であって、該第４オリゴヌクレオチドのある領域が第２シグナルオ リゴヌクレオチドと相補的であって、第４オリゴヌクレオチドの非相補的領域が その５’末端に一本鎖アームを提供し、該５’アームの一部が第１シグナルオリ ゴヌクレオチドを含む、上記第３固体支持体、を提供し；ｂ）第１オリゴヌクレ オチドと第２オリゴヌクレオチドの３’末端がターゲットＤＮＡ配列にアニール して第１開裂構造を作り出し、第１開裂構造の開裂が第１シグナルオリゴヌクレ オチドの解放をもたらすよう な条件下で、上記開裂手段、ターゲット核酸、第１オリゴヌクレオチドおよび第 ２オリゴヌクレオチドを混合し；ｄ）第１シグナルオリゴヌクレオチドが第３オ リゴヌクレオチドの相補的領域とハイブリダイズして第２開裂構造を作り出し、 第２開裂構造の開裂が第２シグナルオリゴヌクレオチドの解放と「開裂した」第 ２固体支持体をもたらすような条件下で、上記解放された第１シグナルオリゴヌ クレオチドを複数の第２固体支持体のうちの１つと反応させ；ｅ）第２シグナル オリゴヌクレオチドが第４オリゴヌクレオチドの相補的領域とハイブリダイズし て第３開裂構造を作り出し、第３開裂構造の開裂が第１シグナルオリゴヌクレオ チドの解放と「開裂した」第３固体支持体をもたらすような条件下で、上記解放 された第２シグナルオリゴヌクレオチドを複数の第３固体支持体のうちの１つと 反応させ；そしてｈ）第１および第２シグナルオリゴヌクレオチドの存在を検出 する、ことからなる。 第１シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび第２シグナ ルオリゴヌクレオチドの解放の後に、第１シグナルオリゴヌクレオチド自体が「 開裂した」第２固体支持体から放出されて複数の「未開裂の」第２固体支持体の うちの１つと反応するのが好ましい。同様に、第２シグナルオリゴヌクレオチド のハイブリダイゼーションおよび第１シグナルオリゴヌクレオチドの第２分子の 解放の後に、第２シグナルオリゴヌクレオチド自体が「開裂した」第３固体支持 体から放出されて複数の「未開裂の」第３固体支持体のうちの１つと反応するの が好ましい。「開裂した」という用語、および「未開裂の」という用語は、固体 支持体（例えばビーズ）が物理的に開裂したり未開裂であることを意 味するのではない。むしろ、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドの状態を 示すのに用いる。 「固体支持体」という用語によって、本発明が分離した別々の支持体に限定さ れることを意味するのではない。例えば、本発明は、オリゴ体が同じ固体支持体 上であるが異なる領域に分離されている設計も含む。ある態様では、固体支持体 はミクロタイターウエルであり、オリゴ体はウエルの異なる領域に結合（例えば 共有結合的に）または被覆（例えば非共有結合的に）されている。 第２の態様では、本発明は、特定ターゲット核酸分子の存在を検出する方法を 含み、該方法は、ａ）ｉ）ターゲット核酸、ii）ターゲット核酸の第１部分と相 補的な第１オリゴヌクレオチド、およびiii）ある領域がターゲット核酸の第２ 部分と相補的である第２オリゴヌクレオチドであって、第２オリゴヌクレオチド の非相補的領域がその５’末端に一本鎖アームを提供する、上記第２オリゴヌク レオチド、を提供し；ｂ）第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドの ３’末端がターゲットＤＮＡ配列にア０ールして第１開裂構造を作り出すような 条件下で、上記ターゲット核酸、第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌク レオチドを混合し；ｃ）ターゲット核酸への第１および第２オリゴヌクレオチド のアニーリングに依存して第２オリゴヌクレオチド中に位置する部位において第 １開裂構造の開裂が優先的に起こるような条件下で開裂手段を提供し、これによ って第２オリゴヌクレオチドの一本鎖アームを解放して第３オリゴヌクレオチド を生成し；ｄ）一本鎖３’アームと一本鎖５’アームをもつ第１ヘアピン 構造を、第３オリゴヌクレオチドが第１ヘアピンの一本鎖３’アームとアニール して第２開裂構造を作り出すような条件下に提供し；ｅ）開裂手段によって第２ 開裂構造の開裂が起きて、第２開裂構造の一本鎖５’アームを解放し、第４オリ ゴヌクレオチドと第１開裂ヘアピン検出分子とを含む反応生成物を作り出すよう な条件を提供し；ｆ）一本鎖３’アームと一本鎖５’アームをもつ第２ヘアピン 構造を、第４オリゴヌクレオチドが第２ヘアピンの一本鎖３’アームとアニール して第３開裂構造を作り出すような条件下に提供し；ｇ）開裂手段によって第３ 開裂構造の開裂が起きて、第３開裂構造の一本鎖５’アームを解放し、第３オリ ゴヌクレオチドと同じ配列の第５オリゴヌクレオチドと第２開裂ヘアピン検出分 子とを含む反応生成物を作り出すような条件を提供し；そしてｈ）第１および第 ２開裂ヘアピン検出分子を検出する、ことからなる。 ある態様では、本発明の検出法は、検出前にターゲットコピー数を増幅する必 要なく試料中に存在する特定ターゲット核酸配列を検出できる。この態様では、 上記方法の工程ｄ）からｇ）を少なくとも１回繰り返す。 好ましい態様では、開裂手段は低い合成能をもつ変更熱安定性ＤＮＡポリメラ ーゼを含む開裂酵素、すなわち熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ由来の５’ヌクレア ーゼを含む。完全な合成の欠失は必要ではないが、検出に必要な識別を妨害する レベルのポリメラーゼ活性がない状態で開裂反応が起きるのが好ましい。 本発明の第２の態様の検出法における開裂はオリゴヌクレオチドのアニーリン グとは独立でありうるが、開裂がプライマー依存 的であることが好ましい。言い換えると、第１オリゴヌクレオチド、第３オリゴ ヌクレオチドおよび第４オリゴヌクレオチドのアニーリングがないときには工程 ｃ）、ｅ）およびｇ）の開裂反応が起こらないことが好ましい。 開裂は部位特異的であるが、本発明では多くの部位での開裂が可能である。あ る態様では、工程ｃ）の開裂反応は第２オリゴヌクレオチドのアニールした部分 内で起こる。別の態様では、工程ｃ）の開裂反応は第２オリゴヌクレオチドの非 アニール部分内で起こる。図面の説明 図１Ａは、本発明の検出法の１態様を示す模式図である。 図１Ｂは、本発明の検出法の第２の態様を示す模式図である。 図２は、サーマス・アクアティカス、サーマス・フラヴァスおよびサーマス・ サーモフィラスから単離されたＤＮＡＰ遺伝子のヌクレオチド構造を比較する図 であり、コンセンサス配列を各列の上部に示す。 図３は、サーマス・アクアティカス、サーマス・フラヴァスおよびサーマス・ サーモフィラスから単離されたＤＮＡＰ遺伝子のアミノ酸配列を比較する図であ り、コンセンサス配列を各列の上部に示す。 図４Ａ−Ｇは、野生型および合成−欠失ＤＮＡＰＴａｑ遺伝子の模式図である 。 図５Ａは、野生型サーマス・フラヴァスポリメラーゼ遺伝子を示す。 図５Ｂは、合成−欠失サーマス・フラヴァスポリメラーゼ遺伝 子を示す。 図６は、ＤＮＡＰＴａｑを用いて増幅できない構造を示す。 図７は、ＤＮＡＰＴａｑまたはＤＮＡＰＳｔｆのいずれかを用いて分岐二本鎖 を増幅する試みを示す臭化エチジウム染色ゲルである。 図８は、ＤＮＡＰＴａｑによる分岐二本鎖の開裂、およびＤＮＡＰＳｔｆによ る開裂の不在を分析するゲルのオートラジオグラムである。 図９Ａ−Ｂは、ＤＮＡＰＴａｑで分岐二本鎖を開裂する試みにおいて、種々の 反応成分の添加、およびインキュベーション温度の変化による開裂の有無を分析 するゲルのオートラジオグラムである。 図１０Ａ−Ｂは、プライマーの存在下および不在下における開裂反応の経時変 化を示すオートラジオグラムである。 図１１Ａ−Ｂは種々のＤＮＡＰを用いて（プライマーの存在下および不在下に おける）分岐二本鎖の開裂の試みを示すゲルのオートラジオグラムである。 図１２Ａは、パイロットオリゴヌクレオチドによってターゲットされた基質Ｄ ＮＡの特異的開裂を試験するのに用いた基質およびオリゴヌクレオチドを示す。 図１２Ｂは図１２Ａに示す基質とオリゴヌクレオチドを用いた開裂反応の結果 を示すゲルのオートラジオグラムである。 図１３Ａは、パイロットオリゴヌクレオチドによってターゲットされた基質Ｒ ＮＡの特異的開裂を試験するのに用いた基質およびオリゴヌクレオチドを示す。 図１３Ｂは、図１３Ａに示す基質とオリゴヌクレオチドを用いた開裂反応の結 果を示すゲルのオートラジオグラムである。 図１４は、ベクターｐＴＴＱ１８の模式図である。 図１５は、ベクターｐＥＴ−３ｃの模式図である。 図１６Ａ−Ｅは、ＤＮＡＰの５’ヌクレアーゼ活性による開裂に適した基質で ある分子のセットを示す。 図１７は、合成−欠失ＤＮＡＰで行った開裂反応の結果を示すゲルのオートラ ジオグラムである。 図１８は、合成−欠失ＤＮＡＰＴａｑクローンでの合成活性アッセイの生成物 を解析するＰＥＩクロマトグラムのオートラジオグラムである。 図１９Ａは、合成−欠失ＤＮＡＰの短いヘアピン構造を開裂する能力を試験す るのに用いた基質分子を示す。 図１９Ｂは、図１９Ａに示す基質を用いて行った開裂反応の生成物を解析する ゲルのオートラジオグラムを示す。 図２０Ａは、引き金／検出アッセイに用いたＡ−およびＴ−ヘアピン分子を示 す。 図２０Ｂは、引き金／検出アッセイに用いたαプライマーの配列を示す。 図２０Ｃは、開裂したＡ−およびＴ−ヘアピン分子の構造を示す。 図２０Ｄは、Ａ−およびＴ−ヘアピン分子間の相補性を示す。 図２１は、本発明の５’ヌクレアーゼ用基質として用いた完全な２０６−ｍｅ ｒの二本鎖配列を示す。 図２２ＡおよびＢは、野生型ＤＮＡＰおよびサーマス・アクア ティカスおよびサーマス・フラヴァスから単離した５’ヌクレアーゼによる直鎖 核酸基質（図２１の２０６−ｍｅｒに基づく）の開裂を示す。 図２３は、本発明の検出法の１態様に対応する詳細な図である。 図２４は、本発明の５’ヌクレアーゼによる図２３の直鎖二本核酸構造の開裂 の生成物を示す。 図２５Ａは、本発明のＤＮＡＰで検出した「ニブリング（ｎｉｂｂｌｉｎｇ） 」現象を示す。 図２５Ｂは、図２５Ａの「ニブリング」が５’ヌクレアーゼ開裂であってホス ファターゼ開裂でないことを示す。 図２６は、「ニブリング」現象が二本鎖依存的であることを示す。 図２７は、検出アッセイにおいてどのように「ニブリング」を用いるかを示す 模式図である。 図２８は、「ニブリング」がターゲット指向性でありうることを示す。発明の説明 本発明は部位特異的な手法で核酸開裂構造を開裂する手段に関する。特に、本 発明は、妨害となる核酸合成能をもたずに５’ヌクレアーゼ活性をもつ開裂酵素 に関する。 本発明は、天然の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとは異なる変更ＤＮＡ合成活性 を示す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼを提供する。ポリメ ラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は保持されるが、合成活性は減少するか、あるい はない。このような５’ヌクレアーゼは、妨害となる合成活性の不在下に核酸の 構 造特異的開裂を触媒することができる。開裂反応の間に合成活性がないために、 均一な大きさの核酸開裂生成物をもたらす。 本発明のポリメラーゼの新規な性質は特定核酸配列を検出する方法の基礎とな る。従来の特定ターゲット配列の検出法のようにターゲット配列自体を増幅する のではなく、この方法は検出分子の増幅に基づく。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）やサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属の好熱細菌から単離 されたようなＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）は新規なＤＮＡ鎖を合成する酵素 である。既知のＤＮＡＰのうちのいくつかが酵素の合成活性に加えて関連のヌク レアーゼ活性を含む。 いくつかのＤＮＡＰがＤＮＡ鎖の５’および３’末端からヌクレオチドを除去 することが知られている（Kornberg，DNA Replication，W.H．Freeman and Co. ，San Francisco，pp.127-139，1980）。これらのヌクレアーゼ活性は通常それ ぞれ５’エキソヌクレアーゼおよび３’エキソヌクレアーゼと呼ばれる。例えば 、いくつかのＤＮＡＰのＮ−末端ドメインに位置する５’エキソヌクレアーゼ活 性は、ＤＮＡ複製中のラギング鎖合成におけるＲＮＡプライマーの除去および修 復における損傷ヌクレオチドの除去に関与している。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ （ＤＮＡＰＥｃｌ）のようないくつかのＤＮＡＰは、ＤＮＡ合成における校正（ ｐｒｏｏｆ−ｒｅａｄｉｎｇ）の役割をもつ３’エキソヌクレアーゼ活性ももつ （Kornberg、前出）。 サーマス・アクアティカスから単離されたＤＮＡＰはＴａｑＤＮＡポリメラー ゼ（ＤＮＡＰＴａｑ）と呼ばれ、５’エキソヌク レアーゼ活性をもつが、機能的３’エキソヌクレアーゼドメインをもっていない （Tindall and Kunkell，Biochem．27:6008，1988）。ＤＮＡＰＥｃｌおよびＤ ＮＡＰＴａｑの誘導体はそれぞれクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）およびストフェル（ Ｓｔｏｆｆｅｌ）フラグメントと呼ばれ、酵素または遺伝子操作の結果５’エキ ソヌクレアーゼドメインをもっていない（Brutlag et al.，Biochem．Biophys． Res．Commun．37:982，1969；Erlich et al.，Science 252:1643，1991；Setlow and Kornberg，J．Biol．Chem．247:232，1972）。 ＤＮＡＰＴａｑの５’エキソヌクレアーゼ活性は同時に合成を必要とすること が報告されている（Gelfand，PCR Technology-Principles and Applications fo r DNA Amplification（H.A．Erlich，編集），Stockton Press，New York，p.19 ，1989）。ＤＮＡＰＴａｑおよびＤＮＡＰＥｃｌの５’エキソヌクレアーゼの消 化生成物中ではモノヌクレオチドが主なものであるが、短いオリゴヌクレオチド （≦１２ヌクレオチド）も観察され、これらのいわゆる５’エキソヌクレアーゼ がエンドヌクレアーゼ的に機能しうることを示唆する（Setlow，前出；Holland et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:7276，1991）。 国際公開ＷＯ９２／０６２００号において、Ｇｅｌｆａｎｄらは熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性の好ましい基質は置き換え（ｄｉ ｓｐｌａｃｅｄ）一本鎖ＤＮＡであることを示している。ホスホジエステル結合 の加水分解が置き換え一本鎖ＤＮＡと二重らせんＤＮＡとの間で起こり、好まし いエキソヌクレアーゼ開裂部位は二重らせん領域中のホスホジエス テル結合である。したがって、ＤＮＡＰに関連する５’エキソヌクレアーゼ活性 は通常構造依存性の一本鎖エンドヌクレアーゼであり、より正しくは５’ヌクレ アーゼと呼ばれる。エキソヌクレアーゼは核酸分子の末端から核酸分子を開裂す る酵素である。一方、エンドヌクレアーゼは末端よりもむしろ内部で核酸分子を 開裂する酵素である。いくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関連するヌクレ アーゼ活性はエンドヌクレアーゼ的に開裂するが、この開裂には開裂すべき分子 の５’末端との接触が必要である。したがって、これらのヌクレアーゼは５’ヌ クレアーゼと呼ばれる。 ５’ヌクレアーゼ活性が真性細菌Ａ型ＤＮＡポリメラーゼと関連する場合には 、タンパク質の３分の１のＮ−末端領域が独立の機能性ドメインであることが見 いだされた。分子のＣ−末端の３分の２はＤＮＡ合成の役割を果たす重合ドメイ ンを構成する。いくつかのＡ型ＤＮＡポリメラーゼは、分子のＣ−末端の３分の ２領域と関連する３’エキソヌクレアーゼ活性ももつ。 ＤＮＡＰの５’エキソヌクレアーゼ活性と重合活性とは、ポリメラーゼ分子の タンパク質分解的開裂または遺伝子操作によって分離された。今日までに、熱安 定性ＤＮＡＰはポリメラーゼ活性をそのまま保持しながら５’ヌクレアーゼ活性 量を除去または減少するように修飾されてきた。 ＤＮＡＰＥｃｌのクレノウまたは大きなタンパク質分離開裂フラグメントはポ リメラーゼ活性と３’エキソヌクレアーゼ活性を含むが、５’ヌクレアーゼ活性 をもっていない。ＤＮＡＰＴａｑのストフェルフラグメントは、ポリメラーゼ分 子のＮ−末端の２ ８９アミノ酸を欠失する遺伝子操作によって５’ヌクレアーゼ活性をもっていな い（Erlich et al.，Science 252:1643，1991）。ＷＯ９２／０６２００号は変 更したレベルの５’から３’へのエキソヌクレアーゼをもつ熱安定性ＤＮＡＰを 記載する。米国特許第５，１０８，８９２号は５’から３’へのエキソヌクレア ーゼをもたないサーマス・アクアティカスＤＮＡＰを記載する。しかしながら、 分子生物学の当業界では少ない量の合成活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ が得られていない。 本発明は、５’ヌクレアーゼ活性を保持するが、合成活性を減少またはもたな い熱安定性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼを提供する。５’ヌ クレアーゼ活性から酵素の合成能を分離することができるために、５’ヌクレア ーゼ活性が従来報告されてきたような同時に起こるＤＮＡ合成を必要としない（ Gelfand，PCR Technology，前出）。 本発明は、Ｉ．５’ヌクレアーゼを用いる特定核酸配列の検出；II．熱安定性 ＤＮＡポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼの作製；III．５’ヌクレアーゼの 治療用途；およびIV．二重捕捉アッセイによる抗原または核酸ターゲットの検出 に分けて記載する。本発明の理解を容易にするために、多数の用語を以下に定義 する。 「遺伝子」の用語は、ポリペプチドまたは前駆体の生成に必要な制御配列とコ ード配列を含むＤＮＡ配列をいう。ポリペプチドは全長コード配列または所望の 酵素活性が保持される限りコード配列の一部によってコードされる。 「野生型」の用語は、天然起源のものから単離した遺伝子または遺伝子産物の 特徴をもつ遺伝子または遺伝子産物をいう。対照 的に、「修飾体」または「突然変異体」とは、野生型遺伝子または遺伝子産物と 比較して変更した特徴を示す遺伝子または遺伝子産物をいう。天然に起こる突然 変異体を単離することができ、これらは野生型遺伝子または遺伝子産物と比較し て変更した特徴をもつという事実によって同定できることに注意されたい。 本明細書中で用いる「組換えＤＮＡベクター」の用語は、所望のコード配列と 、機能的に連結したコード配列を特定の宿主生物中で発現するのに必要な適当な ＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ配列をいう。原核細胞中での発現に必要なＤＮＡ配列 には、プロモーター、任意のオペレーター配列、リボゾーム結合部位およびその 他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエン ハンサーを用いることが知られている。 本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」の用語は、２以上のデオキシリボヌ クレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは３以上、そして通常は１０以上 を含む分子と定義される。正確な大きさは多くの要因に依って決まり、これら要 因はオリゴヌクレオチドの最終的機能と用途に依って決まる。オリゴヌクレオチ ドは化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはその組み合わせを含む多くの方法で 製造できる。 モノヌクレオチドを反応させてオリゴヌクレオチドを作るには、モノヌクレオ チドペントース環の５’リン酸を１方向の隣接するモノヌクレオチドの３’酸素 とホスホジエステル結合によって結合させるので、オリゴヌクレオチドの末端は 、もしもその５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と結合して いないならば「５’末端」と呼び、もしもその３’酸素が次のモノ ヌクレオチドペントース環の５’リン酸と結合していないならば「３’末端」と 呼ぶ。本明細書では、大きいオリゴヌクレオチドの内部であっても核酸配列は５ ’および３’末端をもつという。 ２つの異なるオーバーラップしないオリゴヌクレオチドが同じ直鎖状の相補的 核酸配列の異なる領域とアニールし、一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が他 方の５’末端に向くとき、前者のオリゴヌクレオチドを「上流」オリゴヌクレオ チドと呼び、後者のオリゴヌクレオチドを「下流］オリゴヌクレオチドと呼ぶ。 「プライマー」の用語は、プライマー伸長が開始する条件下においたときに合 成開始点として作用できるオリゴヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチド「プ ライマー」は精製した制限酵素消化の場合のように天然で起こり得るし、また合 成で作ることもできる。 プライマーは鋳型の特定配列鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。 プライマー伸長を起こさせるためには、プライマーは鋳型鎖とハイブリダイズす るのに十分なほど相補的でなければならない。例えば、非相補的ヌクレオチドフ ラグメントをプライマーの５’末端につけて、残りのプライマー配列を鎖と実質 的に相補的とすることができる。プライマー配列が鋳型とハイブリダイズできる ほどに鋳型の配列との十分な相補性を有し、それによって鋳型−プライマー複合 体を形成してプライマーの伸長生成物を合成することができる限り、非相補的塩 基またはより長い配列をプライマー中に挿入できる。 本明細書で用いる核酸配列の相補鎖とは、一方の配列の５’末 端を他方の３’末端と対になるように核酸配列を並べたときに「逆平行鎖会合」 であるオリゴヌクレオチドをいう。本発明の核酸には、例えばイノシンや７−デ アザグアニンなどの天然の核酸に通常見られないいくつかの塩基を含む。相補性 は完全である必要はなく、安定な二本鎖にはミスマッチ塩基対やマッチしない（ ｕｎｍａｔｃｈｅｄ）塩基を含むことができる。核酸技術の当業者は、例えば、 オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチド配列、イオン強 度およびミスマッチ塩基対の頻度を含む多数の可変要因を考慮して二本鎖の安定 性を経験的に決定することができる。 核酸二本鎖の安定性は融解温度または「Ｔm」によって測定する。特定条件下 での特定核酸二本鎖のＴmは塩基対の半分が解離する温度である。 本明細書で用いる「プローブ」の用語は、プローブ中の少なくとも１つの配列 が別の核酸中の配列と相補的であるために、別の核酸中の配列と二本鎖構造を形 成する標識オリゴヌクレオチドをいう。 本明細書で用いる「標識」の用語は、検出可能な（好ましくは定量的に）シグ ナルを提供するために用いられ、核酸またはタンパク質に結合しうる何らかの原 子または分子をいう。標識は蛍光、放射能活性、比色分析、重力、Ｘ線回折また は吸収、磁性、酵素活性などによって検出しうるシグナルを提供する。 本明細書で用いる「開裂構造」とは、ＤＮＡＰの５’ヌクレアーゼ活性の基質 である核酸構造をいう。 本明細書で用いる「開裂手段」とは、特定の方法で開裂構造を 開裂できる何らかの手段をいう。開裂手段には、５’ヌクレアーゼ活性をもつ天 然ＤＮＡＰ、およびより特定するならば、５’ヌクレアーゼ活性をもつが、合成 活性をもたない修飾ＤＮＡＰを含む。 本明細書で用いる「解放（ｌｉｂｅｒａｔｉｎｇ）」とは、放出された（ｒｅ ｌｅａｓｅｄ）フラグメントがもはや共有結合的にオリゴヌクレオチドの残り部 分に結合しないように、５’ヌクレアーゼの作用によってオリゴヌクレオチドな どのより大きな核酸フラグメントから核酸フラグメントを放出することをいう。 本明細書で用いる「基質鎖」の用語は、５’ヌクレアーゼ活性によって媒介さ れる開裂が起こるような開裂構造中の核酸鎖を意味する。 本明細書で用いる「鋳型鎖」の用語は、基質鎖と少なくとも部分的に相補的で あり、かつ基質鎖とアニールして開裂構造を形成する開裂構造中の核酸鎖を意味 する。 本明細書で用いる「Ｋm」の用語は、酵素のミカエリス−メンテン定数をいい 、ある酵素が酵素触媒反応における最大速度の半分を生じる特定基質の濃度と定 義される。 Ｉ．５’ヌクレアーゼを用いる特定核酸配列の検出 本発明の５’ヌクレアーゼは特定核酸配列の同定のための新規検出アッセイの 基礎を与える。この検出系はターゲット配列の２つの部分への２つのオリゴヌク レオチドプローブのアニーリングを要求することによって特定核酸配列の存在を 同定する。本明細書で用いるように、「ターゲット配列」または「ターゲット核 酸 配列」の用語は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチド配列中の、 検出すべきまたは開裂すべき、あるいはその両方である特定核酸配列をいう。 図１Ａは、本発明の検出法の１態様の模式図である。ターゲット配列は発射（ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）または引き金（ｔｒｉｇｇｅ）反応において２つの異な るオリゴヌクレオチドによって認識される。これらのオリゴヌクレオチドのうち の１つが固体支持体上に提供されることが好ましい。他方は遊離状態で提供され うる。図１Ａでは遊離のオリゴは「プライマー」として示されており、他方のオ リゴは１型と呼ぶビーズに結合して示されている。ターゲット核酸は、本発明の ＤＮＡＰ（図１Ａには示されていない）によって、（ビーズ１上のオリゴの）５ ’アームの特異的開裂のための２つのオリゴヌクレオチドと並ぶ。 開裂部位（大きな黒矢印で示されている）は、「プライマー」の３’末端とビ ーズ１上のオリゴの下流フォークの間の距離によって制御される。後者は未開裂 領域（斜線で示す）で設計される。このようにして、いずれのオリゴヌクレオチ ドも並び方が間違っていたりターゲット核酸に結合していないときには開裂され ない。 開裂が達成されるとαシグナルオリゴと呼ばれる単一コピーを放出する。この オリゴは検出可能な部分（例えば蛍光）を含むことができる。あるいは、未標識 であってもよい。 検出法の１態様では、さらに２つのオリゴヌクレオチドが固体支持体上に提供 される。図１Ａでビーズ２上に示すオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーシ ョン可能なαシグナルオリゴと相 補的な領域（α’で示す）をもつ。この構造は本発明のＤＮＡＰで開裂すること ができ、βシグナルオリゴを放出する。βシグナルオリゴは次に、相補的領域（ β’で示す）をもつオリゴをもつ３型ビーズとハイブリダイズできる。再度この 構造は本発明のＤＮＡＰで開裂されて新規なαオリゴを放出する。 この時点では増幅はリニアである。この方法の効率を増加するには、βオリゴ の放出後に２型ビーズとハイブリダイズしたαシグナルオリゴを解放することが 望ましく、これによって２型ビーズ上の別のオリゴとさらにハイブリダイズでき る。同様に、３型ビーズからのαオリゴの放出後に、βオリゴを解放するのが望 ましい。 「捕捉された」シグナルオリゴの解放は多くの方法によって実施できる。第１ に、本発明のＤＮＡＰはα’（およびβ’）プライムオリゴの５’末端を「ニブ リング」することができる真性の５’エキソヌクレアーゼをもつことが見いださ れた（後程さらに詳述する）。したがって、適当な条件下では、ＤＮＡＰのニブ リングによってハイブリダイゼーションが脱安定化される。第２に、α−α’プ ライム（β−β’プライムも同様）複合体は熱（例えば熱サイクリング）によっ て脱安定化される。 このような方法でシグナルオリゴを解放すると、各開裂の結果、シグナルオリ ゴの数が２倍になる。このようにして検出可能なシグナルが急速に得られる。 図１Ｂは、本発明の検出法の第２態様の模式図である。再び、ターゲット配列 が発射または引き金反応において２つの異なるオリゴヌクレオチドによって認識 されて、ターゲット核酸は本発明 のＤＮＡＰ（図１Ｂには示していない）によって、５’アームの特異的開裂のた めの２つのオリゴヌクレオチドと並ぶ。第１のオリゴはターゲット配列の一部と 完全に相補的である。第２のオリゴヌクレオチドはターゲット配列と部分的に相 補的であり；第２オリゴヌクレオチドの３’末端はターゲット配列と十分相補的 であるが、５’末端は非相補的であって一本鎖アームを形成する。第２オリゴヌ クレオチドの非相補的末端は一連の標準のヘアピン構造に使用しうる一般的配列 でありうる（後程詳述する）。異なるターゲット配列の検出には２つのオリゴヌ クレオチドの独特の部分を必要とする；第１オリゴヌクレオチドの全部と第２オ リゴヌクレオチドの３’末端である。第２オリゴヌクレオチドの５’アームの配 列は不変であるか、または一般的である。 ターゲット配列に沿って互いの近くで第１と第２オリゴヌクレオチドがアニー リングして、フォーク状の開裂構造を形成し、これがＤＮＡポリメラーゼの５’ ヌクレアーゼの基質となる。開裂部位のおよその位置が図１Ｂ中、大きな黒矢印 で示されている。 本発明の５’ヌクレアーゼはこの構造を開裂することができるが、第１オリゴ ヌクレオチドの３’末端の伸長を重合することはできない。第１オリゴヌクレオ チドの伸長は第２オリゴヌクレオチドのアニール領域を置き換える（ｄｉｓｐｌ ａｃｅｍｅｎｔ）ことになり、また第２オリゴヌクレオチドに沿った開裂部位を 動かすことになるので、この重合活性の欠失は有利である。もしも有意な量の重 合が起こると、様々な長さの開裂生成物が生じてしまう。開裂生成物が検出反応 を開始するので、均一な長さの単一開裂生成物が望ましい。 引き金反応は熱サイクリングができるような条件下で行う。反応の熱サイクリ ングは反応に放出される引き金オリゴヌクレオチドの量を対数的に増加する。 検出法の第２部では、引き金反応で形成された第１開裂構造の開裂によって解 放された第２オリゴヌクレオチドのフラグメント（第３のまたは引き金オリゴヌ クレオチドと呼ぶ）と、第１ヘアピン構造とのアニーリングが起きる。第１ヘア ピン構造は一本鎖５’アームと一本鎖３’アームをもつ。第３オリゴヌクレオチ ドは、第１ヘアピン構造の３’アームにアニーリングすることによって第１ヘア ピン構造の開裂の引き金を引き、これによって本発明の５’ヌクレアーゼによる 開裂の基質を形成する。第１ヘアピン構造の開裂は以下の２つの反応生成物を生 じる：１）第４オリゴヌクレオチドと呼ばれるヘアピンの開裂した５’アーム、 および２）５’アームをもたない開裂したヘアピン構造であって未開裂ヘアピン よりも大きさが小さいもの。この開裂した第１ヘアピンが、引き金または第３オ リゴヌクレオチドによって指示された開裂が起こったことを示唆するための検出 分子として用いられる。したがって、これは最初の２つのオリゴヌクレオチドが 見いだされたことを示唆し、これによって試料中のターゲット配列の存在を示唆 する。 第４オリゴヌクレオチドを第２ヘアピン構造とアニールさせることによって検 出生成物を増幅できる。このヘアピン構造は５’一本鎖アームと３’一本鎖アー ムをもつ。第１ヘアピン構造の開裂によって生じた第４オリゴヌクレオチドは、 第２ヘアピン構造の３’アームにアニールし、これによって５’ヌクレアーゼに よ り認識される第３開裂構造を生じる。第２ヘアピン構造の開裂は以下の２つの反 応生成物を生じる：１）第３ヌクレオチドよりも小さいか、あるいは同じ配列の 第５オリゴヌクレオチドと呼ばれるヘアピンの開裂した５’アーム、および２） ５’アームをもたない開裂した第２ヘアピン構造であって未開裂ヘアピンよりも 大きさが小さいもの。この開裂した第２ヘアピンが検出分子であり、第１ヘアピ ン構造の開裂によって生じたシグナルを増幅する。第４オリゴヌクレオチドのア ニーリングと同様に、第３オリゴヌクレオチドは開裂した第１ヘアピン分子から 解離して、遊離となって第１ヘアピン構造の新たなコピーとアニールする。ヘア ピン構造からのオリゴヌクレオチドの解離は、加熱または塩基対相互作用を破壊 する適当な他の手段によって実施できる。 検出シグナルをさらに増幅するには、第５オリゴヌクレオチド（第３オリゴヌ クレオチドと類似または同じ配列）と第１ヘアピン構造の別の分子とをアニーリ ングすることによって実施できる。次に開裂を行い、解放されたオリゴヌクレオ チドを次に第２ヘアピン構造の別の分子とアニーリングする。過剰に提供される 第１および第２ヘアピン構造のアニーリングと開裂を連続的に繰り返すと検出す べき開裂ヘアピン生成物が十分量で生じる。検出反応の温度は、ヘアピン構造の 直接開裂に使用するオリゴヌクレオチドのアニーリング温度のすぐ下とすぐ上、 一般的には約５５℃と７０℃をサイクルさせる。各サイクルで開裂物の数が２倍 になり、ついには残るヘアピン構造の量が該ヘアピン構造のＫm以下になる。ヘ アピン構造が実質的に消費され尽くしたときにこの到達点に達する。検出反応を 定量的に用いる場合には、開裂したヘ アピン検出生成物の蓄積がプラトーに達する前にサイクル反応を停止する。 開裂ヘアピン構造の検出は幾つかの方法で実施できる。ある態様では、アガロ ースゲルまたはポリアクリルアミドゲルで分離した後、臭化エチジウムで染色す ることにより検出を実施する。別の態様では、開裂および未開裂ヘアピン構造を ゲルで分離した後にオートラジオグラフィーで検出を実施する。このとき、ヘア ピン構造をまず放射性プローブで標識し、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣのカラムクロ マトグラフィーで分離した後、異なる大きさのフラグメントをＯＤ260で検出す る。その他の検出手段は、一本鎖５’アームが開裂によって放出されたときの蛍 光分極変化の検出を含み、ヘアピン構造の３’アームとアニールしたプライマー の量が増加するとインターカレーション蛍光指示薬の蛍光が増加する。連続的な 開裂の繰り返しが起きると、（プライマーとヘアピンの３’アームとの間の）二 本鎖ＤＮＡの量の増加が起きる。 ヘアピン構造はアガロース、スチレンまたは磁気ビーズなどの固体支持体にヘ アピンの３’末端を介して結合させることができる。所望する場合には、ヘアピ ンの３’末端とビーズの間にスペーサー分子を入れることもできる。ヘアピン構 造を固体支持体に結合する有利な点は、２つのヘアピン構造が相補的領域で互い にハイブリダイズすることを防止できることである。ヘアピン構造が互いにアニ ールすると、開裂反応中に放出されるプライマーとのハイブリダイゼーションに 使用できるヘアピン量が減少する。ヘアピン構造を固体支持体に結合する場合に は、開裂反応の生成物の検出にさらに別の方法を用いることもできる。これらの 方法 には、５’アームが５’末端に標識を含むときには放出された一本鎖５’アーム の測定を行うことを含むが、これに限定されない。この標識は放射活性、蛍光、 ビオチンなどでありうる。ヘアピン構造が開裂しない場合には、５’標識は固体 支持体に結合したままである。開裂が起きると、５’標識は固体支持体から放出 される。 ヘアピン分子の３’末端はジデオキシヌクレオチドを用いてブロックすること ができる。ジデオキシヌクレオチドを含む３’末端は、末端トランスフェラーゼ などの一定のＤＮＡ修飾酵素を用いる反応に関与できない。３’末端ジデオキシ ヌクレオチドをもつヘアピンの開裂は、開裂部位に新たなブロックされていない ３’末端を生じる。この新たな３’末端は遊離のヒドロキシ基をもっており、こ れが末端トランスフェラーゼと相互作用して開裂生成物を検出する別の手段を提 供する。 ヘアピン構造は、その自己相補的領域が非常に短い（一般に３〜８塩基対）よ うに設計される。したがって、ヘアピン構造は、ヘアピンの３’アームにアニー ルしたオリゴヌクレオチドの存在によって安定化しない限り、反応が実施される 高温（一般に５０〜７５℃の範囲）では不安定である。この不安定性は、関連プ ライマーがないときにポリメラーゼがヘアピン構造を開裂することを防ぎ、これ によってオリゴヌクレオチドに指示されていない開裂による誤った正の結果が生 じるのを防ぐ。 上述したように、減少した重合活性をもつ本発明の５’ヌクレアーゼを使用す ると、特定核酸配列の検出法に有利である。開裂反応の最中に有意な量の重合が あると、開裂部位が予測できずに シフトし、単一の簡単に定量できる生成物ではなく種々の大きさの開裂ヘアピン 構造を生成することとなる。さらに、１回の開裂に使用したプライマーが伸長し てしまうと、不正確な構造を形成したり、あるいは中程度の温度サイクル条件で 融解するには長すぎることによって、次のサイクルに使用できなくなる。プリス チン系（すなわち、ｄＮＴＰが存在しない）では、未修飾ポリメラーゼを使用で きるが、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が存在すると、１サイクル当たりの効率が減 少し、誤った負の結果を生じる。粗抽出物（ゲノムＤＮＡ調製物、粗細胞溶解物 など）、ＰＣＲ反応からのＤＮＡ試料やｄＮＴＰで汚染されているかも知れない その他の試料を用いる場合には、熱安定性ポリメラーゼ由来である本発明の５’ ヌクレアーゼが特に有用である。 II．熱安定性ＤＮＡポリメラーゼからの５’ヌクレアーゼの作製 Ａ型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子はＤＮＡ配列レベルで互いに約８ ５％の相同性をもつ。熱安定性ポリメラーゼの好ましい例としては、サーマス・ アクアティカス、サーマス・フラヴァスおよびサーマス・サーモフィリスから単 離したものを含む。しかしながら、５’ヌクレアーゼ活性をもつその他の熱安定 性Ａ型ポリメラーゼも好適である。図２および図３は、上記３つのポリメラーゼ のヌクレオチドとアミノ酸配列を比較したものである。配列番号１−３は３つの 野生型ポリメラーゼのヌクレオチド配列を示し、配列番号４−６はアミノ酸配列 を示す。配列番号１はＹＴ−１株から単離した野生型サーマス・アクアティカス ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に対応する（Lawyer e t al.，J．Biol．Chem．264:6427，1989）。配列番号２は野生型サーマス・フラ ヴァスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に対応する（Akhmetzjanov and Vakhitov，Nucl．Acids Res．20:5839，1992）。配列番号３は野生型サー マス・サーモフィリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に対応する （Gelfand et al.，WO 91/09950，1991）。配列番号７−８は上記３つのＤＮＡ Ｐそれぞれのコンセンサスヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す（図２および 図３の上の列にも示してある）。 熱安定性ポリメラーゼ由来の本発明の５’ヌクレアーゼは合成能を減少してい るが、天然のＤＮＡポリメラーゼと実質的に同じ５’エキソヌクレアーゼ活性を 保持する。本明細書で用いる「実質的に同じ５’ヌクレアーゼ活性」の用語は、 修飾酵素の５’ヌクレアーゼ活性が構造依存性の一本鎖エンドヌクレアーゼとし て機能する能力を保持するが、未修飾酵素と比較して必ずしも同じ開裂速度では ないことを意味する。Ａ型ＤＮＡポリメラーゼは、５’ヌクレアーゼ活性を増加 するが、減少した合成活性をもつように修飾することもできる。減少した合成活 性と増加した５’ヌクレアーゼ活性をもつ修飾酵素も本発明の意図するところで ある。 本明細書で用いる「減少した合成活性」の用語は、修飾酵素が未修飾または「 天然」酵素に見られる合成活性レベルよりも低いことを意味する。修飾酵素は合 成活性が全く残っていないか、あるいは後述する検出アッセイで修飾酵素の使用 を妨害しないレベルの合成活性をもつ。本発明の５’ヌクレアーゼはポリメラー ゼの開裂活性は望ましいが、合成活性は望ましくない場合（本発明の検出アッセ イの場合など）には有利である。 上述したように、本発明はポリメラーゼに合成欠失を与えるのに必要な変更の 特性によって限定することを意図するものではない。本発明は、１）タンパク質 分解；２）組換え構築体（突然変異体を含む）；および３）物理的および／また は化学的修飾および／または阻害、を含む各種方法を含むが、これに限定されな い。 １．タンパク質分解 減少した合成活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは未修飾酵素をタンパク 質分解酵素で物理的に開裂して、合成活性を欠失するが５’ヌクレアーゼ活性は 保持する酵素フラグメントを生成する。タンパク質分解消化に続いて、得られる フラグメントを標準のクロマトグラフ法で分離し、ＤＮＡ合成能と５’ヌクレア ーゼとしての作用をアッセイする。合成活性と５’ヌクレアーゼ活性を測定する アッセイを以下に記載する。 ２．組換え構築体 以下の実施例は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ由来の５’ヌクレアーゼをコード する構築体の好ましい作製法を記載する。Ａ型ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ配列 が似ているので、サーマス・アクアティカスおよびフラヴァスポリメラーゼに用 いたクローニング法はその他の熱安定性Ａ型ポリメラーゼにも応用できる。一般 に、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性Ａ型ＤＮＡポリメラーゼを含む細菌 から分子生物学的方法を用いてゲノムＤＮＡを単離することによってクローン化 される。このゲノムＤＮＡをＰＣＲによってポリメラーゼ遺伝子を増幅できるプ ライマーにさらす。 増幅されたポリメラーゼ配列を次に標準の欠失法に付して遺伝 子のポリメラーゼ部分を欠失させる。適当な欠失法を以下の実施例に記載する。 以下の実施例は、５’ヌクレアーゼ活性を排除することなくＤＮＡＰＴａｑポ リメラーゼドメインのどの部分を除去すればよいかを決定するための方策を記載 する。タンパク質からのアミノ酸の欠失は、コードする遺伝物質を欠失するか、 あるいは突然変異またはフレームシフトによって転写ストップコドンを導入する ことによって実施できる。さらに、タンパク分子の分解処理はタンパク質セグメ ントを除去するために実施できる。 以下の実施例において、Ｔａｑ遺伝子の特異的変更は、ヌクレオチド１６０１ から２５０２の間の欠失（コーディング領域の末端）、２０４３の位置への４ヌ クレオチドの挿入、およびヌクレオチド１６１４から１８４８の間とヌクレオチ ド８７５と１７７８の間（配列番号１）の欠失であった。これらの修飾配列を以 下の実施例ならびに配列番号９−１２に記載する。 単一の塩基対の変更は酵素の構造と機能には特に害がないことを当業者は理解 する。同様に、これらの酵素のエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼ機能を実 質的に変更することなく小さな付加や欠失を行いうる。 その他の欠失も本発明の５’ヌクレアーゼを作製するのに適している。欠失に よって、合成活性が本発明の検出アッセイにおける５’ヌクレアーゼの使用を妨 害しないレベルまで５’ヌクレアーゼのポリメラーゼ活性を減少させることが好 ましい。最も好ましくは、合成活性がない。修飾ポリメラーゼを用いて、後述す るアッセイで合成活性と５’ヌクレアーゼ活性の存在を試験する。 これらのアッセイを十分検討することによって、構造未知の酵素の候補をスクリ ーニングすることができる。言い換えると、構築体”Ｘ”が、構造的によりもむ しろ機能的に定義する本発明の５’ヌクレアーゼ属のメンバーであるか否かを決 定するために、後述するプロトコルに従ってこれを評価することができる。 以下の実施例では、増幅したサーマス・アクアティカスのゲノムＤＮＡのＰＣ Ｒ産物は天然のゲノムＤＮＡと同じヌクレオチド配列をもたず、また元のクロー ンと同じ合成能をもっていなかった。ポリメラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅中にＤＮ ＡＰＴａｑの背信（ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）によって生じる塩基対の変化による のもポリメラーゼ遺伝子の合成能を不活性化できる方法の１つである。以下の実 施例ならびに図４Ａおよび図５Ａは、合成能にとって重要でありそうな天然サー マス・アクアティカスおよびフラヴァスＤＮＡポリメラーゼ中の領域を示す。こ の他にもポリメラーゼを不活性化しそうな別の塩基対の変化や置換がある。 しかしながら、このような突然変異増幅産物でＤＮＡポリメラーゼから５’ヌ クレアーゼを作製する方法を出発する必要はない。これは合成欠失ＤＮＡＰＴａ ｑ突然変異体を作製するために以下の実施例で行った方法であるが、野生型ＤＮ Ａポリメラーゼ配列を欠失、挿入および付加を導入するための出発物質として用 いて５’ヌクレアーゼを作製できることが当業者には理解されよう。例えば、合 成欠失ＤＮＡＰＴｆｌ突然変異体を作製するには、配列番号１３−１４に挙げる プライマーを用いてサーマス・フラヴァスＡＴ−６２株からの野生型ＤＮＡポリ メラーゼ遺伝子を増幅する。増幅されたポリメラーゼ遺伝子を次に制限酵素によ る消 化に付して合成能をコードするドメインの大部分を除去する。 本発明は、好適な宿主内で発現できる本発明の核酸構築体を含む。遺伝子構造 に種々のプロモーターや３’配列を結合して効率良い発現を達成する方法が当業 者には公知である。以下の実施例は２つの好適なベクターおよび６つの好適なベ クター構築体を開示する。もちろん、その他のプロモーター／ベクターの組み合 わせも好適である。本発明の核酸構築体の発現に宿主生物を用いることは必要で はない。例えば、核酸構築体によってコードされるタンパク質の発現は無細胞イ ンビトロ転写／翻訳系を用いることによって実施できる。このような無細胞系の 例としては市販のＴｎＴTM結合網状赤血球溶解系（Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃ ｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）がある。 適当な核酸構築体が得られると、５’ヌクレアーゼをこの構築体から得ること ができる。以下の実施例および標準の生物学的知識によって種々の適当な方法で 構築体を操作することができる。 ５’ヌクレアーゼを発現させた後、後述するようにしてポリメラーゼの合成活 性とヌクレアーゼ活性とを試験する。 ３．物理的および／または化学的修飾および／または阻害 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの合成能を化学的および／または物理的手段で減 少することができる。ある態様では、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によ って触媒される開裂反応を、ポリメラーゼの合成活性を阻害することが好ましい 条件下に実施する。有意な合成活性を必要としない開裂反応を妨害しないような 活 性レベルまで合成活性レベルを減少させることのみが必要である。 以下の実施例に示すように、５ｍＭ以上のＭｇ++濃度は天然ＤＮＡＰＴａｑの 重合活性を阻害する。合成活性が阻害される条件下で機能する５’ヌクレアーゼ の能力は、後述するように、一定範囲のＭｇ++濃度（５〜１０ｍＭ）の存在下に 、合成活性と５’ヌクレアーゼ活性のアッセイを行うことによって試験する。一 定濃度のＭｇ++の効果は、各アッセイの標準反応と比較した試験反応の合成量お よび開裂量を定量することによって決定する。 その他のイオン、ポリアミン、変性剤（尿素、ホルムアミド、ジメチルスルホ キシド、グリセロールや非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００やＴ ｗｅｅｎ−２０））、核酸結合剤（アクチノマイシンＤ、臭化エチジウムやプソ ラレン）の阻害効果は、合成および５’ヌクレアーゼアッセイ用の標準反応緩衝 液にこれらを添加することによって試験する。熱安定性ポリメラーゼの合成活性 に好ましい阻害効果をもつこれらの化合物を用いて、次に合成活性は減少または 排除されているが、５’ヌクレアーゼ活性（開裂）は保持される反応条件を作り 出す。 ポリメラーゼの合成活性を好ましく阻害するには物理的手段を用いる。例えば 、熱安定性ポリメラーゼの合成活性は、ポリメラーゼを高温（典型的には９６〜 １００℃）に長時間（２０分またはそれ以上）さらすことによって破壊される。 各酵素によって特異的耐熱性が少々異なるが、これらは容易に決定できる。ポリ メラーゼを種々の時間、熱で処理して、合成活性と５’ヌクレアーゼ活性に及ぼ す熱処理の効果を決定する。 III．５’ヌクレアーゼの治療上の有用性 本発明の５’ヌクレアーゼは上述した診断用途のみでなく、感染細胞内の特定 ｍＲＮＡの開裂と不活性化のための治療上の用途をもつ。病原体によって産生さ れるあるｍＲＮＡと相補的オリゴヌクレオチドを合成欠失ポリメラーゼとともに 感染細胞中に導入することにより、ウイルスや細菌などの病原体のｍＲＮＡは、 合成欠失ＤＮＡポリメラーゼによる開裂のためのターゲットとされる。適当なオ リゴヌクレオチドが合成できるようにヌクレオチド情報が入手できる限り、どの ような病原体もこの方法によってターゲットとされうる。合成オリゴヌクレオチ ドは相補的ｍＲＮＡとアニールし、それによって修飾酵素によって認識される開 裂構造を形成する。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを 開裂する５’ヌクレアーゼ活性の能力を実施例１Ｄに示す。 リポソームは便利な送達システムである。合成オリゴヌクレオチドをヌクレア ーゼと共役または結合させてこれらの分子を同時送達できる。別の送達システム も用いることができる。 アンチセンス遺伝子制御およびリボザイムを用いる病原体ｍＲＮＡの不活性化 が報告されている（Rossi，米国特許第５，１４４，０１９号：本明細書に参照 として包含する）。これらの方法にはいずれも限界がある。 アンチセンスＲＮＡを用いて遺伝子発現を阻害するには化学量論的量、すなわ ち病原体ＲＮＡに比べて大過剰モルのアンチセンスＲＮＡが有効であるためには 必要である。他方、リボザイム治療は触媒的であり、したがってアンチセンス法 で見られる治療化合物の大過剰モルの必要性の問題はない。しかしながら、ある Ｒ ＮＡのリボザイム開裂には、触媒的に活性な開裂構造を形成するための高度に保 存された配列の存在することが必要である。このためにはターゲット病原体ｍＲ ＮＡが保存配列（ＧＡＡＡＣ（Ｘ）nＧＵ）を含むことが必要であり、したがっ てこの方法で開裂できる病原体ｍＲＮＡの数が限定される。これとは対照的に、 ＤＮＡオリゴヌクレオチドと５’ヌクレアーゼの使用によるＲＮＡの開裂は構造 のみに依存する；したがって実際にあらゆる病原体ＲＮＡ配列が適当な開裂構造 を設計するために使用できる。 IV．二重捕捉アッセイによる抗原または核酸ターゲットの検出 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼからの５’ヌクレアーゼの生成能が抗原または核 酸ターゲットの新規検出法のための基礎となる。この二重捕捉アッセイでは、合 成活性とヌクレアーゼ活性をコードするポリメラーゼドメインを、２つの別々で 異なる抗体またはオリゴヌクレオチドに共有結合する。合成ドメインとヌクレア ーゼドメインの両方が同じ反応に存在し、かつｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよび少量の ポリｄ（Ａ−Ｔ）が提供されると、大量のポリｄ（Ａ−Ｔ）が生産される。新規 に生産されたポリｄ（Ａ−Ｔ）を５’ヌクレアーゼが開裂してプライマーを生成 し、これが次に合成ドメインによってより多くのポリｄ（Ａ−Ｔ）を生産するた めの触媒として用いられる結果、大量のポリｄ（Ａ−Ｔ）が生産される。ポリｄ （Ａ−Ｔ）は自己相補的であり、高温で変更した構造を容易に形成するので、５ ’ヌクレアーゼはポリｄ（Ａ−Ｔ）を開裂することができる。これらの構造は５ ’ヌクレアーゼによって認識されて開裂され、合成反応のためのより多くのプラ イマーを生成する。 以下に抗原を検出するための二重捕捉アッセイの一例を示す：ある抗原検出用 の分析すべき試料を準備する。この試料は細胞混合物を含んでいてよく、例えば ウイルスで感染された細胞はその表面にウイルスでコードされる抗原を提示する 。もしも検出すべき抗原が溶液中に存在するときは、まずこれをミクロタイター ディッシュの壁やビーズなどの固体支持体に慣用手段を用いて結合する。次に試 料を、１）抗原上の第１抗原または第１エピトープのいずれかを認識する抗体と 共役させた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの合成ドメイン、および２）合成ドメイ ンと共役させた抗体によって認識されるのと同じ抗原上の第２の異なる抗原また は第２エピトープのいずれかを認識する第２抗体と共役させた熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼの５’ヌクレアーゼドメイン、と混合する。抗体をその同起源の抗原 と相互作用させるための適当な時間（使用する抗体により条件は異なる；適当な 条件は当業者に公知である）の後、試料を洗浄して未結合抗体−酵素ドメイン複 合体を除去する。次にｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよび少量のポリｄ（Ａ−Ｔ）を洗浄 試料に加え、試料を高温（一般に６０〜８０℃、より好ましくは７０〜７５℃） でインキュベートして熱安定性合成および５’ヌクレアーゼドメインを機能させ る。もしも試料が、ポリメラーゼの別々に共役させたドメインの両方によって認 識される抗原を含んでいる場合には、ポリｄ（Ａ−Ｔ）生産の対数増加が起こる 。もしもポリメラーゼの合成ドメインと共役させた抗体のみが試料中に存在し、 ５’ヌクレアーゼドメインが洗浄試料中に存在しない場合には、ポリｄ（Ａ−Ｔ ）の算術増加のみが得られる。反応条件は、ポリｄ（Ａ−Ｔ）における算術増加 が検出域値 以下になるように制御できる。反応進行時間の長さを制御することによるか、あ るいは非常に少量のポリｄ（Ａ−Ｔ）を加えて鋳型として作用させ、新規ポリｄ （Ａ−Ｔ）プライマーを生成するためのヌクレアーゼ活性の不在下では非常に少 量のポリｄ（Ａ−Ｔ）のみが合成されるようにすることにより上記制御は達成で きる。 酵素の両方のドメインを１つの抗体に共役させる必要はない。合成ドメインを １つの抗体に共役させ、５’ヌクレアーゼドメインは溶液中に提供するか、ある いはその逆も可能である。このような場合、共役した抗体−酵素ドメインを試料 に加えてインキュベートし次に洗浄する。溶液中のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ポリｄ （Ａ−Ｔ）と残りの酵素ドメインを次に加える。 さらに、ターゲット核酸配列が検出できるように２つの酵素ドメインをオリゴ ヌクレオチドに共役させてもよい。２つの異なる酵素ドメインに共役させたオリ ゴヌクレオチドは同じターゲット核酸鎖上の異なる領域を認識するかも知れない し、あるいは２つの関連しないターゲット核酸を認識するかも知れない。 ポリｄ（Ａ−Ｔ）の生産は以下のものを含む多くの方法で検出できる：１）ポ リｄ（Ａ−Ｔ）の合成に供給したｄＡＴＰまたはｄＴＴＰのいずれかに放射性標 識し、次に反応生成物のサイズ分画とオートラジオグラフィーを用いる；２）ポ リｄ（Ａ−Ｔ）の合成に供給したｄＡＴＰに蛍光標識し、ｄＴＴＰにビオチン化 プローブを用い、次に反応生成物をアビジンと共役させた磁気ビーズなどのアビ ジンビーズを通過させ；蛍光化ｄＡＴＰがビオチン化ｄＴＴＰとの共有結合中に 導入されるときのみ蛍光プローブが アビジンビーズと結合するので、アビジン含有ビーズ上の蛍光プローブの存在は ポリｄ（Ａ−Ｔ）が形成されたことを示唆する；および３）蛍光分極の変化によ るサイズ増加の示唆。ポリｄ（Ａ−Ｔ）の存在を検出するためのその他の手段に は、二本鎖ＤＮＡ形成の増加をモニターするためのインターカレート性蛍光指示 薬の使用を含む。 上述した抗原または核酸ターゲット検出のための二重捕捉アッセイは以下の有 利な点を含む： １）試料の熱サイクリングが全く必要でない。ポリメラーゼドメインおよびｄＡ ＴＰおよびｄＴＴＰは固定温度（一般に約７０℃）でインキュベートする。イン キュベートの約３０分後に添加ｄＮＴＰの７５％までがポリｄ（Ａ−Ｔ）に導入 される。熱サイクリングがないことによりこのアッセイが臨床試験室に適してい る；熱サイクリング装置を購入する必要がなく、非常に正確な温度コントロール の必要がない。 ２）反応条件が簡単である。結合酵素ドメインのインキュベーションは０．５ｍ Ｍ ＭｇＣｌ2（より高濃度でもよい）、２−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．５、約５０μＭｄＡＴＰおよびｄＴＴＰを含む緩衝液中で行う。反応容量は １０−２０μｌであり、反応生成物は１０−２０分後に検出できる。 ３）合成活性とヌクレアーゼ活性の両方がない場合には反応が検出されない。し たがって、正の結果は両方のプローブ（抗体またはオリゴヌクレオチド）がその ターゲットを認識したことを示唆し、これによって２つの異なるプローブがター ゲットに結合することによる認識の特異性が増大する。 ＤＮＡＰの２つの酵素活性を分離することができるため、ポリｄ（Ａ−Ｔ）産 生の対数増加が得られる。もしもＤＮＡＰＥｃｌのクレノウフラグメントのよう な５’ヌクレアーゼ活性をもたないＤＮＡＰを用いる場合には、ポリｄ（Ａ−Ｔ ）産生のリニアまたは算術増加のみが得られる（Setlow et al.，J．Biol．Chem ．247:224，1972）。５’ヌクレアーゼ活性はもつが、合成活性はもたない酵素 を提供することができることが本発明の開示により可能となった。実施例 以下の実施例は本発明の好ましい態様と局面を説明するためのものであり、そ の範囲を限定するものと解してはならない。 以下の記載において、以下の略号を使用する：℃（セ氏温度）；ｇ（重力場） ；ｖｏｌ（容量）；ｗ／ｖ（重量／容量）；ｖ／ｖ（容量／容量）；ＢＳＡ（ウ シ血清アルブミン）；ＣＴＡＢ（臭化セチルトルメチルアンモニウム）；ＨＰＬ Ｃ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｐ（プラス ミド）；μｌ（マイクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｇ（マイクログ ラム）；ｐｍｏｌｅ（ピコモル）；ｍｇ（ミリグラム）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミ リモル）；μＭ（マイクロモル）；ｎｍ（ナノメートル）；ｋｄａｌ（キロダル トン）；ＯＤ（光学密度）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ＦＩＴＣ（ 蛍光イソチオシアネート）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；ＮａＰＯ4（ リン酸ナトリウム）；Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン） ；ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）；ＴＢＥ（トリス−ボレ ート−ＥＤＴＡ、すな わち、ＨＣｌでなく硼酸で滴定したトリス緩衝液でＥＤＴＡを含む）；ＰＢＳ（ リン酸緩衝生理食塩水）；ＰＰＢＳ（１ｍＭ ＰＭＳＦ含有リン酸緩衝生理食塩 水）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；Ｔｗｅｅｎ（ポリオキシ エチレンソルビタン）；Ｄｙｎａｌ（Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，オスロー、ノルウ ェー）；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ，マディソン、ＷＩ）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（プリモス 、ＭＮ）；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ベヴァリー、ＭＡ）；Ｎ ｏｖｅｇｅｎ（Ｎｏｖｅｇｅｎ，Ｉｎｃ．マディソン、ＷＩ）；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（ノーウォーク、ＣＴ）；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（マディソン 、ＷＩ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ ｙｓｔｅｍｓ，ラホラ、ＣＡ）；ＵＢＡ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ク リーブランド、ＯＨ）。 実施例１ 天然熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの性状 Ａ．ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼ活性 ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）（Saiki et al.，Science 239: 487，1988；Mullis and Faloona，Methods in Enzymology 155:335，1987）の間 、ＤＮＡＰＴａｑは多くの、しかし全てではないＤＮＡ配列を増幅することがで きる。ＤＮＡＰＴａｑを用いて増幅できない配列を図６に示す（ヘアピン構造は 配列番号１５、プライマーは配列番号１６−１７）。このＤＮＡ配列は、ＰＣＲ で用いるプライマーに対応する２つの一本鎖アームを用いてそれ自体の上に折り 畳まれてヘアピンを形成することが できるという顕著な特徴をもつ。 この増幅不能が酵素の５’ヌクレアーゼ活性によるものかどうかを試験するた めに、３０サイクルのＰＣＲ中におけるＤＮＡＰＴａｑおよびＤＮＡＰＳｔｆの このＤＮＡ配列を増幅する能力を比較した。合成オリゴヌクレオチドはウィスコ ンシン大学−マジソンのＴｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒか ら入手した。ＤＮＡＰＴａｑおよびＤＮＡＰＳｔｆはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ から入手した（すなわち、ＡｍｐｌｉｔａｑTMＤＮＡポリメラーゼおよびＡｍｐ ｌｉｔａｑTMＤＮＡポリメラーゼのストフェルフラグメント）。基質ＤＮＡはｐ ＵＣ１９中に二本鎖型でクローン化した図６に示すヘアピン構造を含む。増幅に 用いたプライマーは配列番号１６−１７に示す。プライマー配列番号１７は図６ のヘアピン構造の３’アームとアニールしたことを示す。プライマー配列番号１ ６は図６のヘアピンの５’アーム中の太字で示す２０ヌクレオチドとして示され る。 ポリメラーゼチェインリアクションはスーパーコイルプラスミドターゲットＤ ＮＡ１ｎｇ、各プライマー５ｐｍｏｌｅ、各ｄＮＴＰ４０μＭ、およびＤＮＡＰ ＴａｑまたはＤＮＡＰＳｔｆ２．５ユニットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ８．３の５０μｌ溶液中に含んでいた。ＤＮＡＰＴａｑ反応は５０ｍＭ Ｋ Ｃｌと１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含んでいた。温度は９５℃で３０秒；５５℃で １分；および７２℃で１分で、これを３０サイクル行った。各反応の１０％を、 ４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ、ｐＨ８．３、１．４ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝 液中での６％ポリアクリルアミド（架橋２９：１）でゲル電気泳動により分析し た。 結果を図７に示す。予想された生成物はＤＮＡＰＳｔｆ（単に「Ｓ」で示す） によって生成したが、ＤＮＡＰＴａｑ（「Ｔ」で示す）によっては生成しなかっ た。ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼ活性がこのＤＮＡ配列の増幅欠失の理由 であると結論した。 この構造のＤＮＡの基質領域中にある５’の対合しないヌクレオチドがＤＮＡ ＰＴａｑによって除去されるかどうかを試験するために、ＰＣＲ４サイクル中の 末端標識５’アームの行方を、同じ２つのポリメラーゼを用いて比較した（図８ ）。図６に示すようなヘアピンの鋳型をＤＮＡＰＳｔｆおよび32Ｐ−５’−末端 標識プライマーを用いて作製した。ＤＮＡの５’末端はＤＮＡＰＴａｑによる少 数の大きなフラグメントとして放出されたが、ＤＮＡＰＳｔｆによっては放出さ れなかった。これらのフラグメントの大きさ（移動度に基づく）は、これらがＤ ＮＡの対合しない５’アームのほとんど全てを含むことを示す。したがって、分 岐二本鎖の根元（ｂａｓｅ）で、またはその近くで開裂が起こる。直接配列決定 分析と、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるフラグメ ントの伸長能力によって確認されたように、これらの放出されたフラグメントは ３’ＯＨ基で終わる。 図９〜１１は、ＤＮＡＰＴａｑによって触媒される開裂反応を特徴づけるため に設計された実験の結果を示す。特記しない限り、開裂反応は、熱変性末端標識 ヘアピンＤＮＡＰ０．０１ｐｍｏｌｅ（未標識相補鎖も存在させた）、（３’ア ームに相補的な）プライマー１ｐｍｏｌｅ、およびＤＮＡＰＴａｑ０．５ユニッ ト（０．０２６ｐｍｏｌｅと推定される）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．５、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１．５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ2の全量１０μｌ中に含んだ。上記したように、いくつかの反応では異なる ＫＣｌ濃度をもち、各試験に用いられる正確な時間と温度はそれぞれの図面に示 してある。プライマーを含む反応では図６に示すもの（配列番号１７）を用いた 。いくつかの場合には、ポリメラーゼと選択されたヌクレオチドを与えて結合部 位までプライマーを伸長した。 ＭｇＣｌ2または酵素のいずれかを添加することにより最終反応温度で反応を 開始した。９５％ホルムアミド８μｌを２０ｍＭ ＥＤＴＡと０．０５％マーカ ー染料とともに加えることにより反応をインキュベーション温度で停止した。記 載したＴmの計算はＮａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＯ ｌｉｇｏTMプライマー分析ソフトウェアを用いて行った。これには１５または６ ５ｍＭの全塩（すべての反応において１．５ｍＭＭｇＣｌ2はこの計算では１５ ｍＭ塩の容量を用いた）において、ＤＮＡ濃度を０．２５μＭとして決定した。 図９は、開裂部位での種々の実験および条件の結果を含むオートラジオグラム である。図９Ａは開裂を可能にする反応成分を決定するものである。５’−末端 −標識ヘアピンＤＮＡのインキュベーションを表示の成分とともに５５℃で３０ 分行った。生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、生成 物の長さをヌクレオチドで示した。図９Ｂはプライマーを添加しない場合の開裂 部位に及ぼす温度の効果を示す。反応は表示の温度でＫＣｌの不在下に１０分間 インキュベートした。生成物の長さをヌクレオチドで示す。 驚くべきことに、ＤＮＡＰＴａｑによる開裂にはプライマーも ｄＮＴＰも必要としない（図９Ａ）。したがって、５’ヌクレアーゼ活性は重合 化と連結していない。ヌクレアーゼ活性にはマグネシウムイオンを必要とするが 、マグネシウムイオンは他のもので代替しうる。ただし、特異性と活性に変化は あるかも知れないが。亜鉛もカルシウムイオンも開裂反応を支持しない。反応は ２５℃から８５℃の広範な温度領域で起きるが、高温で開裂速度は増加する。 図９についてさらに言及すると、添加ｄＮＴＰの不在下ではプライマーは伸長 しない。しかしながら、プライマーはヘアピンの開裂部位と開裂速度の両方に影 響を及ぼす。開裂部位の変化（図９Ａ）は明らかにＤＮＡ基質のアーム間に形成 される短い二本鎖の破壊の結果である。プライマーの不在下では、図６の下線で 示す配列同志は伸長二本鎖を形成する。伸長二本鎖の末端における開裂は、図９ Ａのプライマー不添加レーンに見られる１１ヌクレオチドフラグメントの放出を もたらす。過剰のプライマーの添加（図９Ａ、レーン３および４）または高温で のインキュベーション（図９Ｂ）は、二本鎖の短い伸長を破壊し、より長い５’ アームをもたらし、それ故より長い開裂生成物をもたらす。 プライマーの３’末端の位置は開裂の正確な部位に影響を及ぼしうる。電気泳 動分析により、プライマーの不在下（図９Ｂ）では、開裂は第１塩基対と第２塩 基対の間にある基質二本鎖（温度により伸長または短い形のいずれか）の末端で 起こることが判明した。プライマーが二本鎖の根元まで伸長している場合には、 開裂は１ヌクレオチド二本鎖側でも起こる。しかしながら、プライマーの３’末 端と基質二本鎖との間に４または６ヌクレオチドの ギャップが存在する場合には、開裂部位は５’方向に４から６ヌクレオチドシフ トする。 図１０は、プライマーオリゴヌクレオチドの存在下（図１０Ａ）または不在下 （図１０Ｂ）における開裂の速度論を示す。反応は５０ｍＭ ＫＣｌ（図１０Ａ ）または２０ｍＭ ＫＣｌ（図１０Ｂ）のいずれかを用いて５５℃で行った。反 応生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、生成物の長さをヌク レオチドで示す。マーカーである「Ｍ」は５’末端−標識１９−ｎｔオリゴヌク レオチドである。これらの塩濃度では、図１０Ａおよび図１０Ｂはプライマーの 存在下ではプライマーの不在下の約２０倍反応が早いことを示唆している。この 効率に及ぼす効果が基質上の酵素の正しい整列と安定化に寄与しているのかも知 れない。 開裂速度に対するプライマーの相対的影響は両反応を５０ｍＭ ＫＣｌで実施 するときにより大きくなる。プライマーの存在下では、開裂速度はＫＣｌ濃度と ともに約５０ｍＭまで増加する。しかしながら、プライマー存在下でのこの反応 の阻害は１００ｍＭで明らかであり、１５０ｍＭＫＣｌで完全である。これとは 対照的に、プライマーの不在下では速度は２０ｍＭまでＫＣｌ濃度によって増強 されるが、３０ｍＭ以上の濃度では減少する。５０ｍＭＫＣｌでは、反応はほぼ 完全に阻害される。プライマー不在下におけるＫＣｌによる開裂阻害は温度によ って影響され、低温でより顕著である。 切断されるべきアームの５’末端の認識が基質認識の重要な特徴である。環状 のＭ１３ＤＮＡのように遊離の５’末端をもたな い基質は試験したいかなる条件でも開裂されない。明らかな５’アームをもつ基 質であっても、ＤＮＡＰＴａｑによる開裂速度はアームの長さによって影響を受 ける。プライマーと５０ｍＭ ＫＣｌの存在下では、２７ヌクレオチドの長さの ５’伸長は５５℃、２分で本質的に完全であった。対照的に、８４および１８８ ヌクレオチドのアームをもつ分子の開裂は２０分後で約９０％および４０％のみ が完全であった。高温でのインキュベーションが長い伸長の阻害効果を減少し、 これは５’アーム中の二次構造または酵素の熱不安定な構造が反応を阻害するこ とを示唆する。基質過剰の条件下で行った混合実験では、長いアームをもつ分子 は非生産的（ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）複合体中では利用可能な酵素と好 ましく結びつかないことを示す。これらの結果は、５’アームが一端から他端へ と移動することによって、５’ヌクレアーゼドメインが分岐二本鎖の末端で開裂 部位に近づくことができることを示唆する。より長い５’アームは（特にＫＣｌ 濃度が高いときには）より偶発的な二次構造をとることが予想され、このため上 記移動が邪魔されるのであろう。 基質鎖ターゲット分子またはパイロット核酸のいずれかの長い３’アームによ っては、少なくとも２キロベースまでは、開裂が阻害されないように思われる。 別の極端な場合、１ヌクレオチド程度の短さのパイロット核酸の３’アームは効 率はよくないがプライマー独立の反応において開裂を支持する。完全に対合した オリゴヌクレオチドはプライマー伸長の間にＤＮＡ鋳型の開裂を引き出さない。 相補鎖がただ１つの対合しない３’ヌクレオチドを含む場合で あってもＤＮＡＰＴａｑが分子を開裂できることは、対立遺伝子特異的ＰＣＲの 最適化に有用である。対合しない３’末端をもつＰＣＲプライマーは、ヌクレオ チド三リン酸の不在下でＤＮＡＰＴａｑを用いて鋳型−プライマー複合体をプレ インキュベーションする間に望ましくない鋳型の選択的開裂を指示するためのパ イロットオリゴヌクレオチドとして作用した。 Ｂ．その他のＤＮＡＰの５’ヌクレアーゼ活性 その他のＤＮＡＰ中のその他の５’ヌクレアーゼが本発明に適しているかどう かを決定するために、１群の酵素（そのうちのいくつかは明瞭な５’ヌクレアー ゼ活性をもたないことが文献で記載されている）を試験した。各酵素の合成に最 適と報告されている条件下で図６に示すヘアピン基質を用いて、これらのその他 の酵素の構造特異的に核酸を開裂する能力を試験した。 ＤＮＡＰＥｃｌおよびＤＮＡＰクレノウはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎから；ピロコッカス・フリアス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓ ）のＤＮＡＰ（「Ｐｆｕ」、Bargseid et al.，Strategies 4:34，1991）はＳｔ ｒａｔａｇｅｎｅから；サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕ ｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡＰ（「Ｔｌｉ」、ＶｅｎｔTM（ｅｘｏ−）、 Perler et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5577，1992）はＮｅｗ Ｅｎ ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから；サーマス・フラヴァスのＤＮＡＰ（「Ｔｆｌ 」、Kaledin et al.，Biokhimiya 46:1576，1981）はＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから；サーマス・サイモフィリスのＤＮＡＰ（「Ｔｔｈ」 、Carballeira et al.，Biotechniques 9:276，1990； Myers et al.，Biochem．30:7661，1991）はＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ から入手した。 各ＤＮＡポリメラーゼ０．５ユニットを、プライマー依存性反応用に製造者か ら供給された緩衝液、または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５、１．５ｍ Ｍ ＭｇＣｌ2、および２０ｍＭ ＫＣｌを用いる反応２０μｌ中でアッセイし た。反応混合物を酵素添加前に７２℃に保持した。 図１１は試験結果を報告するオートラジオグラムである。図１１Ａは幾つかの 好熱細菌のＤＮＡＰのエンドヌクレアーゼの反応を示す。反応は、プライマー存 在下に５５℃で１０分、あるいはプライマー不在下に７２℃で３０分インキュベ ートし、生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。生成物の長 さをヌクレオチドで示す。図１１ＢはＤＮＡＰＥｃｌの５’ヌクレアーゼによる エンドヌクレアーゼ開裂を示す。ＤＮＡＰＥｃｌおよびＤＮＡＰクレノウ反応は ３７℃で５分インキュベートした。ＤＮＡＰＥｃｌレーンの２５および１１ヌク レオチドの開裂生成物の薄いバンドに注意されたい（それぞれプライマーの存在 下および不在下に実施）。図７Ｂもプライマーの存在下（＋）および不在下（− ）におけるＤＮＡＰＴａｑの反応を示す。これらの反応はそれぞれ５０ｍＭおよ び２０ｍＭ ＫＣｌで行い、５５℃で１０分インキュベートした。 図１１Ａに関しては、真性細菌サーマス・サーモフィラスおよびサーマス・フ ラヴァスからのＤＮＡＰは、プライマーの存在下でも不在下でも、ＤＮＡＰＴａ ｑと同じ場所で基質を開裂する。これとは対照的に、古細菌ピコッカス・フリオ サスおよびサーモ コッカス・リトラリスからのＤＮＡＰは基質をエンドヌクレアーゼ的に開裂でき ない。ピコッカス・フリオサスおよびサーモコッカス・リトラリスからのＤＮＡ Ｐは真性細菌酵素とほとんど配列相同性をもっていない（Ito et al.，Nucl．Ac ids Res．19:4045，1991；Mathur et al.，Nucl．Acids Res．19:6952，1991；P eter et al．も参照のこと）。図１１Ｂに関しては、ＤＮＡＰＥｃｌは基質も開 裂するが、得られる開裂生成物の検出は３’エンドヌクレアーゼが阻害されない 限り難しい。ＤＮＡＰＥｃｌおよびＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼドメイン のアミノ酸配列は約３８％相同である（Gelfand前出）。 ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼドメインもバクテリオファージＴ７の遺伝 子６によってコードされる５’エキソヌクレアーゼと約１９％相同である（Dunn et al.，J．Mol．Biol．166:477，1983）。ＤＮＡＰ重合化ドメインと共有結合 しないこのヌクレアーゼは、添加プライマーの不在下に上述した５’ヌクレアー ゼによって切断される部位と類似または同一の部位で、ＤＮＡをエンドヌクレア ーゼ的に開裂することもできる。 Ｃ．トランス開裂 どのような特定配列でも効率よく開裂できる５’ヌクレアーゼの能力を以下の 実験で示す。「パイロットオリゴヌクレオチド」と呼ぶ部分的に相補的なオリゴ ヌクレオチドを所望の開裂点にある配列とハイブリダイズさせた。パイロットオ リゴヌクレオチドの非相補的部分は鋳型の３’アームと類似の構造（図６参照） を提供し、一方基質鎖の５’領域が５’アームとなった。パイロットの３’領域 がそれ自体の上に折り畳まれて安定したテトラルー プをもつ短いヘアピンを作るように３’領域を設計することによってプライマー を提供した（Antao et al.，Nucl．Acds Res．19:5901，1991）。２つのパイロ ットオリゴヌクレオチドを図１２Ａに示す。オリゴヌクレオチド１９−１２（配 列番号１８）、３０−１２（配列番号１９）および３０−０（配列番号４０）は それぞれ３１、４２および３０ヌクレオチドである。しかしながら、オリゴヌク レオチド１９−１２（配列番号１８）および３４−１９（配列番号１９）は、基 質鎖中の異なる配列と相補的であるのはそれぞれ１９および３０ヌクレオチドに 過ぎない。パイロットオリゴヌクレオチドは約５０℃（１９−１２）および約７ ５℃（３０−１２）で相補体を溶融するように計算される。いずれのパイロット も３’末端に１２ヌクレオチドをもち、これが結合した塩基対プライマーとの３ ’アームとして作用する。 パイロットオリゴヌクレオチドによって開裂が指示されることを示すために、 ２つのパイロットオリゴヌクレオチドとなりうるものの存在下に、一本鎖ターゲ ットＤＮＡをＤＮＡＰＴａｑとともにインキュベートした。ターゲットとパイロ ット核酸が共有結合していないトランス開裂反応は、一端標識基質ＤＮＡ０．０ １ｐｍｏｌｅ、ＤＮＡＰＴａｑｌユニットおよびパイロットオリゴヌクレオチド ５ｐｍｏｌｅを、同じ緩衝液２０μｌ中に含む。これらの成分を９５℃で１分イ ンキュベートする間に一緒にし、ＰＣＲ生成二本鎖基質ＤＮＡを変性し、次に反 応温度を最終インキュベーション温度に下げる。オリゴヌクレオチド３０−１２ および１９−１２は、ターゲット鎖の５’末端から８５および２７ヌクレオチド である基質ＤＮＡの領域とハイブリダイズすることが できる。 図２１は、完全２０６ｍｅｒの配列（配列番号３２）を示す。２０６ｍｅｒは ＰＣＲによって生成した。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手し たＭ１３／ｐＵＣの２４ｍｅｒ逆配列（−４８）プライマーおよびＭ１３／ｐＵ Ｃ配列（−４７）プライマー（それぞれカタログ番号１２３３および１２２４） を各５０ｐｍｏｌｅで、ターゲット配列を含む鋳型（１０ｎｇ）としてのｐＧＥ Ｍ３ｚ（ｆ＋）プラスミドベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）とともに用 いた。ＰＣＲの条件は以下の通りである：各ｄＮＴＰ５０μＭおよびＴａｑＤＮ Ａポリメラーゼ２．５ユニットを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０５ ％ＮＰ−４０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌの１００μｌ中で用いた。反応は９５℃、４５秒；６ ３℃、４５秒；次いで７２℃、７５秒を３５サイクル行った。サイクルの後、７ ２℃で５分インキュベートすることによって反応を停止した。得られるフラグメ ントを４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ、ｐＨ８．３、１．４ｍＭ ＥＤＴＡ の緩衝液中の６％ポリアクリルアミドゲル（２９：１架橋）の電気泳動によって 精製し、臭化エチジウム染色またはオートラジオグラフィーによって可視化し、 ゲルから切り出して、受動拡散で溶出し、そしてエタノール沈殿で濃縮した。 パイロットオリゴヌクレオチド１９−１２の存在下、５０℃で基質ＤＮＡの開 裂が起きた（図１２Ｂ、レーン１および７）が、７５℃では起きなかった（レー ン４および１０）。オリゴヌクレオチド３０−１２の存在下では、いずれの温度 でも開裂が観察さ れた。基質中の５０℃の偶発的構造はＫＣｌの不在下でもプライマー独立性の開 裂を可能にした（図１２Ｂ、レーン９）が、添加オリゴヌクレオチドの不在下（ レーン３、６および１２）または約８０℃では開裂は起きなかった。基質ＤＮＡ と相補的でない非特異的オリゴヌクレオチドは５０ｍＭ ＫＣｌの存在下でも不 在下でも５０℃で開裂を指示しなかった（レーン１３および１４）。したがって 、開裂反応の特異性は基質への相補性の程度およびインキュベーション温度によ って制御できる。 D．RNAの開裂 前述した交差開裂（transcleavage）試験で使用された配列の短縮RNA版を、反 応時に基質となり得る能力について試験した。RNAは、パイロットオリゴヌクレ オチドの存在に依存している反応において予想された場所で開裂された。［α-3 2 P］UTP存在下でT7 RNAポリメラーゼにより生成されたRNA基質は、図12Bで使用 されたDNA基質の切断された型と一致する。反応条件は、50mM KCl存在下、55℃ で40分間インキュベートするという上述のDNA基質に使用した条件と同様のもの であった。使用したパイロットオリゴヌクレオチドは30-0（配列番号２０）と指 称し、図13Aに示す。 開裂反応の結果を図13Bに示す。反応は図13Bに示したようにDNAPTaqまたはパ イロットオリゴヌクレオチドの存在下もしくは非存在下で行った。 驚くべきことに、RNA開裂の場合は、3'アームはパイロットオリゴヌクレオチ ドに不要である。この開裂が、30塩基対長RNA-DNA二重鎖（duplex）に沿ってRNA を数箇所切断すると考えられる前述したRNアーゼＨによるものとは考えにくい。 DNAPTaqの5'ヌクレアーゼは、ヘテロ二重鎖領域の5'末端付近の単一部位でRNAを 開裂させる構造特異的RNアーゼＨである。 3'アームを欠くオリゴヌクレオチドは、天然（native）DNAPを用いたDNAター ゲットの開裂を効率的に行うことができないため、そのようなオリゴヌクレオチ ドがRNAターゲットの効率的な開裂を行うパイロットとして作用し得るというこ とは驚くべきことである。しかしながら、本発明の5'ヌクレアーゼのいくつか（ 例えば、図４のクローンE、F及びG）は3'アームが欠落してもDNA を開裂できる。いいかえれば、非延長可能開裂構造は、熱安定性DNAポリメラー ゼから誘導されたいくつかの本発明の5'ヌクレアーゼによる特異的開裂に必要と されない。 我々は、完全に相補的なプライマーの存在下でDNAPTaqによるRNA鋳型の開裂が 、DNAPTaqが逆転写酵素の反応に似た反応においてRNA鋳型上でDNAオリゴヌクレ オチドを延長することができないことを説明する一助となり得るかどうかについ て検討を行った。また別の耐熱DNAP、DNAPTthはRNAを鋳型として使用することが 可能であるが、Mn++の存在下においてのみであり、そこで我々はこの酵素がこの 陽イオン存在下ではRNAを開裂しないであろうと予測した。従って、我々はRNA分 子をDNAPTaqもしくはDNAPTthの存在下、Mg++もしくはMn++を含むバッファー中で 、適当なパイロットオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。予想された ように両酵素はMg++の存在下でRNAを開裂した。しかしながら、Mn++存在下ではD NAPTaqはRNAを分解したが、DNAPTthはしなかった。我々は多くのDNAPの5'ヌクレ アーゼ活性がそれらがRNAを鋳型として使用できないことの原因になり得るもの と結論するものである。 実施例２ 熱安定性DNAポリメラーゼからの5'ヌクレアーゼの生成 合成活性（本発明の検出アッセイ時のＤＮＡ開裂中の好ましくない副反応であ る活性）については減少しているが、熱安定性ヌクレアーゼ活性をなお維持する 熱安定性DNAポリメラーゼを生成した。結果として、極度に特異的に核酸DNAを開 裂する熱安定性ポ リメラーゼが得られる。 Thermus属真正細菌から得たタイプA DNAポリメラーゼは、広範囲のタンパク質 配列同一性を共有しており（DNAStar社、WIのDNA分析ソフトウェアにおいてリッ プマン−ピアソン法を使用すると、重合ドメインの90%）、重合及びヌクレアー ゼアッセイの両方において類似した挙動を示す。そこで我々は、Thermus aquati cus（DNAPTaq）とThermus flavus（DNAPTfl）のDNAポリメラーゼの遺伝子をこの 種類の代表として使用した。Thermus thermophilus、Thermus sp.、Thermotoga maritima，Thermosipho africanus及びBacillus stearothermophilusのような他 の真正細菌生物から得たポリメラーゼ遺伝子も同様に適している。これらの耐熱 性生物から得たDNAポリメラーゼは高温でも生存し機能し得、従って温度を核酸 鎖の非特異的ハイブリダリゼーションに対する選択として使用する反応において も使用できる。 以下に記載する欠失突然変異誘発のために使用した制限部位は便宜上選んだ。 Thermus thermophilus遺伝子には同様な便宜を有する別の部位があり、関連する 生物からの他のタイプAポリメラーゼ遺伝子により同様な構築物を作るのに使用 できる。 A． 5'ヌクレアーゼ構築物の生成 1． 改変DNATaq遺伝子 第一段階は、Taq DNAポリメラーゼの改変遺伝子を誘発可能プロモーターの制 御下のプラスミド上に置くことであった。改変Taqポリメラーゼ遺伝子は次のよ うにして単離した。即ち、Taq DNAポリメラーゼ遺伝子を、Thermus aquaticusの YT-1株（Lawyer ら．，上出）のゲノムDNAから、配列番号13-14に記載したオリゴヌクレオチドを プライマーとして使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。得られたDNA のフラグメントは、コード配列の5'末端に制限エンドヌクレアーゼEcoRIの認識 配列と、3'末端にBglII認識配列を有している。BglIIによる開裂は、BamHIによ って生成された末端に適合する5'の突出部分、即ち「粘着末端」を残す。PCR-増 幅DNAをEcoRIとBamHIにより消化した。ポリメラーゼ遺伝子のコード領域を含む2 512bpフラグメントをゲル精製し、次いで誘発可能プロモーターを含むプラスミ ド中に結合した。 本発明の一つの態様においては、ハイブリッドtrp-lac(tac)プロモーターを含 むpTTQ18ベクターを使用したが（M.J.R．Stark，Gene 5:255(1987)）、これは図 14に示す。tacプロモーターはE．coli lacリプレッサーの制御下にある。抑制に より、菌増殖が所望のレベルに到達するまで遺伝子産物の合成を抑制し、所望の レベルにおいて特異的な誘発剤、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ IPTG）を加えることにより抑制を解除することができる。このような系により、 形質転換体の増殖を遅らせたり阻害する外来タンパク質の発現が可能となる。 tacのような細菌プロモーターは、複数コピーのプラスミド上に存在する場合 はうまく抑制できない。もし毒性の高いタンパク質がそのようのプロモーターの 制御下に置かれると、少量の発現リークスルーが細菌に有害となり得る。本発明 のもう一つの態様においては、クローン化遺伝子産物の合成抑制のための別の方 法を使用した。バクテリオファージT7由来の、プラスミドベクター 系pET-3中に見られる非細菌プロモーターを、クローン化変異体Taqポリメラーゼ 遺伝子を発現させるために使用した（図15、Studier and Moffatt，J．Mol．Bio l．189:113(1986)）。このプロモーターはT7 RNAポリメラーゼによってのみ転写 を開始する。BL21(DE3)pLYSのような適した株においては、このRNAポリメラーゼ の遺伝子はlacオペレーターの制御下で細菌ゲノム上に保持される。この配置は 、コピー数の多い遺伝子（プラスミド上）の発現が、単一コピー中に存在するた め容易に抑制されるT7 RNAポリメラーゼの発現に完全に依存するという利点を持 っている。 pTTQ18ベクター（図14）中に結合するためにTaqポリメラーゼコード領域を含 むPCR生成物DNA（mutTaq、クローン4B、配列番号21）をEcoRIとBglIIで消化し、 このフラグメントを標準的な「粘着末端」条件（Sambrookら．，Molecular Clon ing，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(1989)）でプ ラスミドベクターpTTQ18のEcoRI及びBamHI部位に結合した。この構築物の発現に より、天然タンパク質の最初の２つの残基（Met-Arg）がベクターからの３つ（M et-Asn-Ser）に置換されているが天然タンパク質の残りは変化していない翻訳融 合産物が得られる。この構築物をE.coliのJM109株中に形質転換し、形質転換体 を、天然タンパク質を発現する細菌が増殖できない不完全な抑制条件下でプレー ティングした。これらのプレーティング条件により、増幅過程でのTaqポリメラ ーゼの不忠実性の結果生じたもののような前もって存在する突然変異を含む遺伝 子を単離することができる。 この増幅／選択手順を使用して、突然変異Taqポリメラーゼ遺 伝子（mutTaq、クローン4B）を含むクローン（図４Ｂに記載した）を単離した。 突然変異体は最初にその表現型により検出され、それにおいては粗細胞抽出物中 の熱安定型5'ヌクレアーゼ活性は正常であったが、重合活性はほとんどなかった （野生型Taqポリメラーゼ活性の約１％以下）。 組換え体遺伝子のDNA配列分析では、２個のアミノ酸の置換を生じるポリメラ ーゼ領域での変化有することが示され、即ち、ヌクレオチド位置1394でのAからG への変化がアミノ酸位置465でのGluからGlyへの変化を生じ（天然の核酸、アミ ノ酸配列により番号を付した、配列番号１及び４）、そしてヌクレオチド位置22 60でのAからGへのもう一つの変化によりアミノ酸位置754でのGlnからArgへの変 化を生じる。GlnからGlyへの変異は保存されない位置におけるものであり、また GluからArgへの変異は事実上全ての公知のタイプAポリメラーゼで保存されてい るアミノ酸を変化させるので、この後者の変異がこのタンパク質の合成活性を省 略する原因である可能性が非常に高い。図4B構築物のヌクレオチド配列は配列番 号21に示す。 DNAPTaq構築物のその後の誘導体はmutTaq遺伝子から生成され、そのためそれ らは全て、これら特定領域が削除されない限り、他の変化に加えてこれらのアミ ノ酸置換を保有する。これらの変異部位は、図４の図表中でこれらの位置におけ る黒い枠で示す。図4E、F及びGに示す遺伝子を除く全ての構築物はpTTQ18ベクタ ー中で生成した。 図4E及びFの遺伝子に使用したクローニングベクターは、上述したように、市 販されているpET-3系からのものである。このベ クター系は、T7プロモーターのクローニングの下流にBamHI部位のみを持ってい るが、この系は３つのリーディングフレームのいずれかへのクローニングを可能 とする変異体を含んでいる。上述したPCR生成物のクローニングのために、pET-3 cとよばれる変異体を使用した（図15）。ベクターをBamHIで消化し、仔ウシ腸ホ スファターゼで脱リン酸化し、粘着末端はDNAPEclのKlenowフラグメントとdNTP を用いて充填した。EcoRIとSalIで消化することにより図4Bに示した変異体TaqDN APの遺伝子（mutTaq、クローン４Ｂ）がpTTQ18より放出され、そして「粘着末端 」はベクターと同様の方法で充填した。フラグメントは標準平滑末端条件（Samb rookら．，Molecular Cloning,上出）でベクターに結合し、構築物をE.coliのBL 21(DE3)pLYS株中に形質転換し、そして単離物をスクリーニングしてプロモータ ーに対して正しい方向に遺伝子に結合されているもの同定した。この構築物は別 の翻訳融合産物を産出し、その産物においてはDNAPTaqの最初の２個のアミノ酸 （Met-Arg）がベクターからの13とPCRプライマーからの２個により置換されてい る（Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly-Arg-Ile-Asn-Ser）（配列 番号29）。 我々の目的は、DNA合成能力を欠いているが、5'ヌクレアーゼ活性により核酸 を切断する能力を保持する酵素を作りだすことであった。プライマーと鋳型によ るDNAの合成の作用は実際には順序よく配列された一連の現象であるので、他に 影響を与えずに一つの現象を中断することによりDNA合成をできなくさせること は可能である。これらの段階は、限定されないが、プライマー認識と結合、dNTP 結合とヌクレオチド間のホスホジエステル結合の触 媒作用を含む。DNAPEcI上の重合領域にあるいくつかのアミノ酸がこれらの機能 と関連しているが、正確なメカニズムはまだほとんど明らかにされていない。 DNAポリメラーゼの重合能力の破壊する方法の一つは、タンパク質のその領域 をコードする遺伝子部分の全てまたは一部を削除するか、さもなければ遺伝子を 完全な重合ドメインを作ることができないようにすることである。個々の変異体 酵素は細胞内及び細胞外での安定性や溶解性の点で互いに異なる。例えば穏やか なタンパク質分解により重合ドメインから活性形態で放出され得るDNAPEcIの5' ヌクレアーゼドメイン（Setlow and Kornberg，J．Biol．Chem．247:232(1972) ）と比べてみると、Thermusヌクレアーゼドメインは同様に処理すると溶解性が 低くなり、開裂活性が消失することが多い。 図4Bに示した変異体遺伝子を出発物質として使用して、いくつかの欠失構築物 を生成した。全てのクローニング技術は標準的なものであり（Sambrookら．，上 出）、以下に要約する。 図4C：mutTaq構築物をPstIにより消化し、これは示したようにポリメラーゼコ ード領域内で一旦切断し、そしてベクターの複数のクローニング部位にある遺伝 子のすぐ下流を切断する。これらの２つの部位の間にあるフラグメントを放出し た後、ベクターを再結合し、894-ヌクレオチド欠失を生成し、フレーム内の結合 点の40ヌクレオチド下流に停止コドンを導入した。この5'ヌクレアーゼ（クロー ン4C）のヌクレオチド配列は配列番号９に示す。 図4D：mutTaq構築物をNheIで消化し、これは遺伝子を位置2047を一旦切断する 。その結果生じた４ヌクレオチドの5'側の突出末 端を上述のように充填し、平滑末端を再結合した。その結果生じた４ヌクレオチ ドの挿入物はリーディングフレームを変化させ、変異の１０個のアミノ酸下流で 翻訳の終結を引き起こす。この5'ヌクレアーゼ（クローン4D）のヌクレオチド配 列は配列番号10に示す。 図4E：mutTaq遺伝子の全体を、EcoRIとSaIIを用いてpTTQ18から切断し、上述 したようにpET-3c中にクローン化した。このクローンを図4Eで示した位置にある 特定部位でBstXI及びXcmIにより消化した。該DNAをDNAPEclのKlenowフラグメン トとdNTPにより処理すると、両方の部位の3'側の突出部分が除去されて平滑末端 となった。これらの平滑末端は一緒に結合し、1540ヌクレオチドのフレーム外欠 失を生じた。フレーム内終結コドンは結合部を18トリプレット過ぎたところにあ った。この5'ヌクレアーゼ（クローン4E）のヌクレオチド配列は、配列番号30に 示した適切なリーダー配列とともに配列番号11に示す。またこれはCleavase（商 標）BXとも指称される。 図4F：全mutTaq遺伝子をEcoRIとSaIIを用いてpTTQ18より切断し、上述したよ うにpET-3c中にクローン化した。このクローンは図で示した位置にある特定の部 位においてBstXIとamHIにより消化した。このDNAをDNAPEclのKlenowフラグメン トとdNTPにより処理し、BstXI部位の3'側の突出部分を除去して平滑末端とし、 一方Bam HI部位の5'側の突出部分は充填して平滑末端とした。これらの末端を一 緒に結合し、903ヌクレオチドのフレーム内欠失を生じた。この5'ヌクレアーゼ （クローン4F）のヌクレオチド配列は配列番号12に示す。これはCleavase（商標 ）BBとも指称され る。 図4G：このポリメラーゼは図4Eに示したものの変形である。これをプラスミド ベクターpET-21（Novagen）中にクローン化した。このベクター中に見られるバ クテリオファージT7由来の非細菌プロモーターは、T7 RNAポリメラーゼによって のみ転写が開始される。Studier and Moffatt、上出を参照。（DES）pLYSのよう な適当な株中では、このRNAポリメラーゼの遺伝子はlacオペレーターのコントロ ール下で細菌性ゲノムに保有される。この配置は、コピー数の多い遺伝子（プラ スミド上）の発現が、単一コピー内に存在するため容易に抑制されるT7 RNAポリ メラーゼの発現に完全に依存しているという利点を持っている。これらの変異体 遺伝子の発現が、厳格にコントロールされているこのプロモーターの下にあるも のであるため、発現タンパク質の毒性による宿主細胞に対する潜在的な問題はほ とんど無視できる。 pET-21ベクターも、発現されたタンパク質のカルボキシ末端に付加される６個 の連続したヒスチジン残基を伸長した物である「His*タグ」を特徴とする。得ら れるタンパク質は、次いで市販されているNi++イオンを固定したカラム樹脂（No vagen）を用いた金属キレートクロマトグラフィーにより１段階で精製され得る 。2.5mlカラムは再利用でき、供与または変性（グアニジン*HClまたは尿素）条 件下で目的タンパク質を20mgまで固定することができる。 E．coli（DES）pLYS細胞を、上述した構築物で標準的な形質転換方法により形 質転換し、標準増殖培地（例えばLuria-Bertani液体培地）に接種するのに使用 した。T7 RNAポリメラーゼの生成 は、IPTGの添加により対数増殖期の間誘導し、さらに12〜17時間インキュベート した。誘導の前後に培養物のアリコートを取り出し、タンパク質をSDS-PAGEによ り調べた。外来タンパク質が細胞タンパク質の3-5%を占め、主要なタンパク質バ ンドのいずれとも共に移動しない場合、クーマシーブルー染色により外来タンパ クを可視化することができる。主要な宿主タンパク質と共に移動するタンパク質 は、分析のこの段階で可視化するためには総タンパク質の10%以上発現されなけ ればならない。 いくつかの変異体タンパク質は、細胞により封入体内に隔離される。これらは 細菌が高レベルの外来タンパク質を発現するようにされた場合に細胞質内で形成 される粒子であり、粗溶解物から精製し、SDS-PAGEにより分析してタンパク質含 有物（量）を決定することができる。封入体内にクローン化タンパク質がある場 合は、開裂とポリメラーゼ能力をアッセイするために放出されなければならない 。それぞれのタンパク質にあった溶解方法があり、様々な方法が知られている。 例えば、Builder & Ogez、米国特許第4,511,502号（1985）；Olson、米国特許第 4,518,526号（1985）；Olson & Pai、米国特許第4,511,503号（1985）；Jonesら ．、米国特許第4,512,922号（1985）を参照されたい。これらは全て引用により 本明細書の一部とする。 可溶化タンパク質を、前述したNi++カラムで、製造者の使用説明書（Novagen ）に従い精製する。洗浄したタンパク質を、イミダゾール競合物質（1M）と高濃 度塩（0.5M NaCl）の組み合わせによりカラムから溶出し、バッファーを交換し て透析し、変性タンパク質を再度折り畳ませる。典型的な回収量は、出発培養物 １mlあた り約20μｇの特異的タンパク質である。DNAP変異体は、Cleavase（商標）BNと称 し、配列は配列番号31に示す。 2．改変DNAPTfl遺伝子 Thermus flavusのDNAポリメラーゼ遺伝子は、American Type Tissue Collecti onより得た“Thermus flavas”AT-62株（ATCC33923）より単離した。この菌株は 、Akhmetzjanov and Vakhitov、上出、により発表された配列を生成するのに使 用されたT．flavus株とは異なった制限地図を有する。発表された配列は、配列 番号２として挙げられている。T．flavusのAT-62株由来のDNAポリメラーゼ遺伝 子の配列データは発表されていない。 T．flavus由来のゲノムDNAは、T．aquaticus DNAポリメラーゼ遺伝子（配列番 号13〜14）を増幅するのに使用したものと同じプライマーを使用して増幅した。 約2500塩基対PCRフラグメントをEcoRI及びBamHIにより消化した。DNAPEc1のKlen owフラグメントとdNTPにより突出した末端を平滑化した。得られたN-末端のコー ディング領域を含む約1800塩基対フラグメントを、上述したようにpET-3cに結合 した。この構築物、クローン5Bは図5Bに示す。野生型T．flavus DNAポリメラー ゼ遺伝子は図5Aに示す。5BクローンはpET-3cにクローン化したDNAPTaqクローン4 E及びＦと同じリーダーアミノ酸を有している。翻訳終結がどこで起こるかは正 確にはわからないが、ベクターはクローニング部位のすぐ下流に強い転写終結シ グナルを有する。 B．形質転換細胞の増殖と誘導 細菌細胞は、標準の形質転換技術を用い上記の構築物により形質転換し、標準 的な増殖培地（例えば、Luria-Bertani肉汁培地）の２mlに接種するのに使用し た。得られる培養物を、使用した特定の菌株について適当なようにイキュベート し、特定の発現系について必要ならば誘導した。図４及び５に示した構築物の全 てについて、培養物は0.5 ODの光学密度（波長600mmにおいて）まで増殖させた 。 クローン化遺伝子の発現を誘導するために、培養物を0.4mM IPTGの最終濃度と し、インキュベーションを12〜17時間継続した。それぞれの培養物の50μｌのア リコートを誘導の前後で取り出し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用の標準ゲルロードバッファーの20μｌと合わせた 。外来タンパク質が細胞タンパク質の約3-5%を占め、主要なE．coliタンパク質 バンドのいずれとも共に移動しない場合は、それらはその後のクーマシーブルー 染色（Sambrook at al.、上出）により可視化される。主要な宿主タンパク質と 共に移動するタンパク質は、分析のこの段階で見るためには、総タンパク質の10 %以上発現されなければならない。 C．熱溶菌と分画化 発現された熱安定性タンパク質、即ち5'ヌクレアーゼを、粗細胞抽出物を加熱 し、熱安定性のより低いE．coliタンパク質を変性し、沈殿させることによって 単離した。次に沈殿したE．coliタンパク質を他の細胞の断片と共に遠心分離に より除去した。1.7mlの培養物を12,000-14,000 rpmで30-60秒マイクロ遠心分離 することによりペレット化した。上清の除去後、細胞を400μｌのバッファーＡ （50mMトリス-HCl，pH7.9，50mMデキストロース、1mM EDTA）に再懸濁し、再度 遠心分離し、次に４mg/mlリゾチームを含む80μｌのバッファーＡに再懸濁した 。細胞を室温で15分インキュベートし、次に80μｌのバッファーＢ（10mMトリス -HCl，pH7.9，50mM KCl，１mM EDTA，１mM PMSF，0.5% Tween-20，0.5% Nonidet -P40）と合わせた。 この混合物を75℃で１時間放置し、宿主タンパク質を変性させ、沈殿させた。 この細胞抽出物を４℃において14,000 rpmで15分間遠心分離し、上清を新しい試 験管に移した。この上清の0.5-1μｌのアリコートを各試験反応に直接使用し、 抽出物のタンパク質含有物（量）は、前述のように７μlを電気泳動分析にかけ ることにより決定した。本来の組換え体Taq DNAポリメラーゼ（Englke，Anal．B iochem 191:396(1990)）と図４Ｂに示した２個所に突然変異があるタンパク質は 、両方とも可溶性でこの時点では活性である。 熱処理後は封入体内へ細胞により外来タンパク質が隔離されるため、外来タン パク質は検出できない。これらは、細菌が高レベルの外来タンパク質を発現する ようにされるときに細胞質内に生成される粒子であり、粗溶解物から精製し、SD S PAGEで分析してそのタンパク質含有物（量）を測定することができる。文献に は多数の方法が記載されているが、以下に１つの方法を記載する。 D．封入体の単離と溶解化 上述したようにして小培養物を増殖させ誘導した。1.7mlのアリコートを短時 間の遠心分離によってペレット化し、細菌細胞を100μｌの溶解バッファー（50m M Tris-HCl，pH8.0，１mM EDTA，100mM NaCl）中に再懸濁した。20mM PMSFの2.5 μｌを最終濃度が0.5mMになるように添加し、リゾチームを1.0mg/mlの濃度まで 加えた。細胞を室温で20分間インキュベートし、デオキシコール酸を１mg/ml（1 00mg/ml溶液の１μl）加え、混合物をさらに37℃で約15分間または粘性が出るま でインキュベートした。DNアーゼIを10μg/ml加え、混合物は室温で約30分間ま たは粘性でなくなるまでインキュベートした。 ４℃で15分間の14,000 rpmでの遠心分離により封入体をこの混合物から回収し 、上清は捨てた。ペレットを10mM EDTA（pH 8.0）と0.5% Triton X-100を含む10 0μｇの溶解バッファー中に再懸濁した。室温で５分間置いた後、封入体を前と 同様にペレット化し、上清は後で分析するために残した。封入体は50μｇの蒸留 水中に再懸濁し、５μｇをSDSゲルロードバッファー（封入体を溶解する）と合 わせ、上清のアリコートと共に電気泳動法により分析した。 クローン化タンパク質が封入体中にある場合は、それを放出させ開裂とポリメ ラーゼ活性をアッセイすることができるが、溶解方法は特定の活性に適合するも のでなければならない。種々のタンパク質に適した種々の溶解方法があり、様々 な方法がMolecular Cloning（Sambrookら．，上出）に記載されている。次に示 すのは、我々の分離物のいくつかに用いた改良法である。 封入体−水懸濁液の20μｌを室温で４分間、14,000 rpmでの遠心分離でペレッ ト化し、上清を廃棄した。封入体をさらに洗浄するために、ペレットを２Ｍ尿素 を含む20μｌの溶解バッファー中に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした 。その後、洗浄済み封入体は８Ｍ尿素を含む２μｌの溶解バッファー中に再懸濁 した。封入体が溶解するにつれて溶液は視覚的に清澄化した。不溶残渣を室温で ４分間、14,000 rpmでの遠心分離で除去し、そして抽出物の上清を新しい試験管 に移した。 尿素濃度を減らすために抽出物をKH2PO4中に希釈した。180μｌの50mM KH2PO4 ，pH 9.5，１mM EDTA及び50mM NaClが入った新しい試験管を準備した。抽出物の ２μｌアリコートを加え、短時間攪拌して混合した。この処理を、全部で10回の 添加により全抽出物が加えられるまで繰り返した。混合物を室温で15分間放置し 、その間に若干の沈殿物がしばしば形成した。沈殿物は室温で15分間、14,000 r pmでの遠心分離により除去し、上清を新しい試験管に移した。KH2PO4溶液中のタ ンパク質200μｌに140-200μｌの飽和（NH4）2SO4を加え、得られた混合物は（N H4）2SO4の約41%飽和から50%飽和になった。混合物を氷上で30分間冷却してタン パク質を沈殿させ、その後室温で４分間、14,000 rpmでの遠心分離によりタンパ ク質を回収した。上清を廃棄し、ペレットを20μlバッファーＣ（20ml HEPES，p H 7.9，１mM EDTA，0.5% PMSF，25mM KCl及びそれぞれ0.5%のTween-20とNonidet P 40）中に溶解した。タンパク質溶液を再度４分間遠心分離して不溶物質をペ レット化し、上清を新しい試験管に移した。この方法で調製した抽出物のタンパ ク質含有物は、SDS-PAGEで1-4μｌ分離す ることにより可視化し、0.5〜１μｌの抽出物を記載した開裂及び重合アッセイ において試験した。 E．ヌクレアーゼの存在と合成活性に関するタンパク質分析 上述の図４及び５に示した5'ヌクレアーゼを次の方法により分析した。 1．構造特異性ヌクレアーゼアッセイ 改変ポリメラーゼの候補を、その構造特異性開裂を触媒する能力を調べること により5'ヌクレアーゼ活性について試験した。ここで使用した「開裂構造」とい う用語は、DNAPの5'ヌクレアーゼ活性による開裂の基質である核酸構造を意味し ている。 ポリメラーゼを図16に示した構造を持つ試験用複合体に露出させた。5'ヌクレ アーゼ活性の試験は次の３反応を含む。1）反応時の塩濃度の変化に比較的鈍感 であり、従って改変酵素が活性のために必要とするどのような溶液条件中でも行 い得るため、プライマー指示型開裂（図16B）が行われる。これは一般的に非改 変ポリメラーゼにとって好ましい条件と同様である。2）プライマー非依存型開 裂を可能とするバッファー、即ち低塩バッファー中で同様のプライマー指示型開 裂を行い、酵素がこれらの条件下で活性を有し続けられるということを示す。3 ）プライマー非依存型開裂（図16A）を同様の低塩バッファー中で行う。 図16に示したように基質鎖と鋳型鎖間で分岐型二重鎖が生成される。本明細書 中で使用する用語「基質鎖」とは、5'ヌクレアーゼ活性による開裂が生じる核酸 の鎖を意味する。基質鎖は、5'ヌ クレアーゼ開裂の基質として働く分岐複合体において常に上の鎖として示す（図 16）。本明細書中で使用する用語「鋳型鎖」とは、基質鎖に対して少なくとも部 分的に相補的であり、基質鎖にアニールして開裂構造を形成する核酸鎖を意味す る。鋳型鎖は常に分岐開裂構造の下の鎖として示す（図16）。プライマー依存型 開裂が試験されるときのように、プライマー（19から30ヌクレオチド長の短いオ リゴヌクレオチド）が複合体に付加される場合は、鋳型鎖の3'アームにアニール するように設計される（図16B）。そのようなプライマーは、反応に使用したポ リメラーゼが合成活性を有する場合、鋳型鎖に沿って延長される。 開裂構造は、ターゲットの3'末端とパイロットの5'末端を、図16Eに示すよう なループになるように結合した単一ヘアピン分子として形成され得る。プライマ ーの存在に対する酵素の感度を分析できるように、3'アームに相補的なプライマ ーオリゴヌクレオチドもこれらの試験に必要である。 試験用の開裂構造を形成するために使用される核酸は化学的に合成し得、ある いは標準的なDNA組換え技術により生成し得る。後者の方法によれば、クローニ ングベクター内に短いDNAセグメントの二重鎖コピーを、互いに隣接しているが 逆の方向に挿入することにより、分子のヘアピン部分を生成することができる。 この逆転反復を包含し、短い（約20ヌクレオチド）不対の5'と3'アームを生成す るために十分な隣接配列を含む二重鎖フラグメントを、その後の制限酵素消化に より、または5'-エキソヌクレアーゼを欠いている酵素（例えばAmplitaq（商標 ）DNAポリメラーゼのStoffelフラグメント、Vent（商標）DNAポリメラーゼ）に よる PCRにより、ベクターから放出し得る。 試験DNAは一端もしくは両端または内部を放射性同位体もしくは非同位体標識 のどちらかにより標識し得る。ヘアピンDNAが合成単一鎖であるかクローン化さ れた二重鎖であるかにかかわらず、全二重鎖をメルトするためにDNAを使用前に 加熱する。氷上で冷却する場合、図16Eに示した構造が生成し、この構造はこれ らのアッセイを行うのに十分な時間安定である。 プライマー指示型開裂（反応１）を試験するために、試験分子の検出できる量 （典型的には、32P標識ヘアピン分子の1-100fmol）及び10-100倍モル過剰のプラ イマーを、試験酵素と適合できることが知られているバッファー中に置く。反応 ２では、プライマー指示型開裂がプライマー非依存型開裂を可能とする条件下で 行われ、反応１で使用したバッファーとpH、酵素安定剤（例えば、牛血清アルブ ミン、非イオン性界面活性剤、ゼラチン）及び還元剤（例えば、ジチオトレイト ール、２−メルカプトエタノール）に関して同じであるが、一価の陽イオン塩が 20ml KClと置き換えられている溶液中に同量の分子を置く。20mM KClはプライマ ー非依存型開裂に最適であることが示されているものである。通常は塩の不存在 下で作用する、DNAPEc1のような酵素のためのバッファーはこの濃度を得るため に添加しない。プライマー非依存型開裂を試験するために（反応３）、プライマ ー無しで、同量の試験分子を反応２で使用したのと同じバッファー条件下で合わ せる。 次に３種の試験反応物の全てを、試験用複合体に対する酵素のモル比が約1:1 である十分な量の酵素に露出させる。反応物は、酵素安定性と複合体安定性のど ちらかにより許容されるいずれか 低い方の温度を上回ることのない温度範囲で、好熱菌由来の酵素には80℃までで 、開裂させるのに十分な時間（10-60分）インキュベートする。反応１、２及び ３の生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、オートラジ オグラフィーまたは使用した標識系に適当な同等の方法で視覚化される。その他 の標識系としては、化学発光検出、銀あるいは他の染色、ブロッティング及びプ ロービング等を含む。開裂生成物の存在は、非開裂試験構造よりも低分子量で移 動する分子の存在により示される。これらの開裂生成物は、候補ポリメラーゼが 構造特異性5'ヌクレアーゼ活性を有することを示している。 改変DNAポリメラーゼが、天然DNAポリメラーゼのものと実質的に同じ5'ヌクレ アーゼ活性を持っているかどうかを決定するために、上述した試験の結果を、天 然DNAポリメラーゼでこれらの試験を行って得た結果と比較する。「実質的に同 じ5'ヌクレアーゼ活性」とは、改変ポリメラーゼと天然ポリメラーゼが両方とも 同様の形態で試験分子を開裂するという意味である。改変ポリメラーゼが天然DN Aポリメラーゼと同じ速度で開裂する必要はない。 ある酵素または酵素調製品は、上述した開裂条件下で機能し、5'ヌクレアーゼ 検出を妨害し得る他の関連したあるいは汚染活性を有し得る。これら他の活性を 考慮して反応条件を変更し、基質の破壊または5'ヌクレアーゼ開裂及びその生成 物のその他のマスキングを避けることができる。例えば、E．coliのDNAポリメラ ーゼI（Pol I）は、そのポリメラーゼ及び5'ヌクレアーゼ活性に加え、3'から5' 方向へDNAを分解することができる3'エキソヌクレアーゼを有する。その結果、 図16Eの分子が上述した条件下でこ のポリメラーゼに露出されると、3'エキソヌクレアーゼは不対3'アームをすぐに 取り除き、5'エキソヌクレアーゼ開裂のための基質に要求される分岐構造を破壊 し、開裂は検出されない。もし条件の変化（例えばpH）、突然変異、または活性 についての競合物の添加により3'エキソヌクレアーゼが阻害されるならば、Pol Iの前記構造を開裂する本来の活性を顕在化することができる。図16Eの構造に関 連の無い、競合する単一鎖オリゴヌクレオチドの500pmoleをPol Iによる開裂反 応に添加すると、5'エキソヌクレアーゼの5'アームの放出を妨げることなく図16 Eの構造の3'アームの消化が効果的に阻害される。競合物の濃度は重要でないが 、反応の間3'エキソヌクレアーゼを占領するのに十分に高くなければならない。 試験分子の同様な破壊は、候補ポリメラーゼ調製中の汚染により引き起こされ 得る。構造特異的ヌクレアーゼ反応のいくつかのセットを行い、候補ヌクレアー ゼの純度を決定し、研究しているポリメラーゼ調製物に対する試験分子の過少及 び過剰の露出の間の領域を見つけることができる。 上述した改変ポリメラーゼを、以下のようにして5'ヌクレアーゼ活性について 試験した。反応１は10mMトリス-Cl，pH8.5，20℃，1.5mM MgCl2及び50mM KClの バッファー中で行った。反応２ではKCl濃度は20mMに下げた。反応１及び２では 、図16Eの試験基質分子の10fmoleを、示したプライマーの１pmole及び改変ポリ メラーゼ（上記のように調製した）を含む抽出物の0.5-1.0μｌと合わせた。そ の後この混合物をその後55℃で10分間インキュベートした。試験した変異体ポリ メラーゼの全てについて 、これらの条件は完全な開裂を行うのに十分なものであった。図16Eに示した分 子を5'末端で標識した場合、25ヌクレオチド長の放出された5'フラグメントは、 20%ポリアクリルアミドゲル（19:１架橋）上で、45mMトリス−ホウ酸，pH8.3、1 .4mM EDTAを含むバッファー中の７Ｍ尿素により都合よく分離された。クローン4 C〜Ｆ及び5Bは、非改変DNAポリメラーゼのものに匹敵する構造特異性開裂を示し た。さらに、クローン4E、4F及び4Gは、上述の3'アームの不存在下でDNAを開裂 する能力をさらに有している。典型的な開裂反応を図17に示した。 図17に示した反応に関しては、変異体ポリメラーゼクローン4E（Taq変異体） 及び5B（Tfl変異体）について、それらの図16Eに示したヘアピン基質分子を開裂 する能力を調べた。基質分子は5'末端を32Pで標識した。熱変成され、末端を標 識された基質DNAの10fmoleと0.5単位DNAPTaq（レーン１）、または4eもしくは5b 抽出物（図17、レーン２〜７、抽出物は上記のように調製した）の0.5μｌを、1 0mMトリス-Cl，pH8.5，50mM KCl及び1.5mM MgCl2を含むバッファー中で一緒に混 合した。最終反応容量は10μlであった。レーン４及び７に示した反応では、さ らにそれぞれのdNTPを50μM含んでいる。レーン３、４、６及び７に示した反応 では、プライマーオリゴヌクレオチド（基質の3'アームと相補的であり、図16E に示されている）を0.2μM含んでいる。反応物は55℃で４分間インキュベートし た。反応は、反応容量10μｌに対して20mM EDTAと0.05%の標識染料を含む95%ホ ルムアミドの８μｌを添加することにより停止した。次に試料を12%変成アクリ ルアミドゲルに加えた。電気泳動の後、ゲルをオートラジオ グラフィーにかけた。図17に示すように、クローン4Eと5Bは天然DNAPTaqのもの と同等の開裂活性を示す。プライマー不在でも、これらの反応で起こる開裂があ ることは重要である。ここで使用したような（図16E）長ヘアピン構造を、50mM KClを含むバッファー中で行われる開裂反応で使用した場合、低レベルのプライ マー非依存型開裂が見られる。KClの濃度が高くなると，これらの条件下では、 プライマー非依存型開裂は抑制されるが、排除はされない。 2．合成活性についてのアッセイ プライマーが鋳型にアニールされ、DNA合成が添加した酵素により触媒される アッセイシステムに改変酵素を添加することにより、改変酵素またはタンパク質 分解フラグメントの能力をアッセイした。多くの標準的な実験技術がそのような アッセイを採用している。例えば、ニックトランスレーション及び酵素的配列決 定は、ポリメラーゼ分子によるDNA鋳型に沿ったプライマーの延長を使用するも のである。 改変酵素の合成活性を測定するための好ましいアッセイにおいては、オリゴヌ クレオチドプライマーを、単鎖DNA鋳型、例えばバクテリオファージM13 DNAにア ニールさせ、プライマー／鋳型二本鎖を対象の改変ポリメラーゼ、デオキシヌク レオシドトリホスフェート（dNTP）及び非改変、即ち天然酵素に適していること が知られているバッファー及び塩の存在下にインキュベートする。プライマーの 延長の検出（変性ゲル電気泳動による）またはdNTPの取り込みの検出（酸沈殿ま たはクロマトグラフィーによる）が 活性ポリメラーゼの指標となる。同位体あるいは非同位体の標識をプライマー上 にあるいはdNTPとして含有させ、重合生成物の検出を容易にすることが好ましい 。合成活性は、成長DNA鎖に取り込まれた遊離ヌクレオチドの量で定量化でき、 特異的な反応条件下で単位時間あたりの取り込み量で表される。 合成活性のアッセイの代表的な結果を図18に示す。変異体DNAPTaqクローン4B 〜Ｆの合成活性は、以下のようにして試験した。以下のバッファーのマスター混 合物を作製した。1.2X PCRバッファー（1X PCRバッファーは50mM KCl，1.5mM Mg Cl2，10mMトリス-Cl，pH 8.5及びTween 20とNonidet P40をそれぞれ0.05%含む） 、dGTP，dATP及びdTTPのそれぞれの50μM、５μM dCTPと600Ci/mmolの0.125μM α-32P-dCTP。この混合物を最終容量に調製する前に、２つの同量のアリコート に分割した。一方には50μｌの容量まで蒸留水を加え、上記の濃度とした。もう 一方は、一本鎖M13mp18 DNAの５μｇ（約2.5pmolまたは最終濃度0.05μM）、M13 配列決定プライマーの250pmol（最終濃度５μM）、及び蒸留水を加え最終容量50 μlとした。それぞれの混合物を75℃に５分間暖め、その後室温まで冷却した。 これによりDNA含有混合物中でプライマーをDNAにアニールさせることができる。 それぞれのアッセイについて、混合物の４μｌとDNAを、記載したように調製 された変異体ポリメラーゼの１μｌ、または１μｌのdH2O中の１単位のDNAPATaq （Perkin Elmer）と合わせた。「DNAなし」対照はDNAPTaqの存在下で行い（図18 、レーン１）、「酵素なし」対照は酵素の代わりに水を用いて行った（レーン２ ）。それぞれの反応物を混合し、室温（約22℃）で５分間、次に 55℃で２分間、さらに72℃で２分間インキュベートした。この段階的インキュベ ーションは、72℃より低い最適温度を有する変異体における重合を検出するため に行った。最終的なインキュベーションの後、試験管を短時間回転させて縮合物 を回収し、氷上に置いた。各反応物の１μｌをポリエチレンイミン（PEI）セル ロース薄層クロマトグラフィープレートの底辺から1.5cmの原点にスポットし、 乾燥させた。クロマトグラフィープレートはpH3.5の0.75M NaH2PO4中で、バッフ ァーの先端が原点より約９cmの所に来るまで展開した。プレートを乾燥させ、プ ラスチックラップで包み、蛍光インクでマークし、そしてX線フィルムに露出さ せた。取り込みはスポットした場所に停止しているカウントとして測定し、一方 取り込まれていないヌクレオチドは、塩溶液により原点から移動された。 ２つのコントロールのレーンでのカウントの場所の比較により、変異体試料で は重合活性が欠落していることが確認された。改変DNAPTaqクローンでは、クロ ーン4Bのみが図18に示すように残留合成活性を保持している。 実施例３ 熱安定性DNAポリメラーゼ由来5'ヌクレアーゼは短ヘアピン構造を特異的に開裂 できる 検出分子としてふさわしい開裂したヘアピン構造を生成するために、ヘアピン 構造体を開裂する5'ヌクレアーゼの能力を考察した。ヘアピン試験分子の構造と 配列は図19Aに示す（配列番号15）。オリゴヌクレオチド（図19A中の標識「プラ イマー」、配列 番号22）は、ヘアピン試験分子の3'アーム上のその相補的配列にアニールされる ことが示されている。ヘアピン試験分子は、ポリメラーゼ連鎖反応中に標識した T7プロモータープライマーを使用して32Pで単一末端標識した。標識はヘアピン 試験分子の5'アーム上にあり、図19Aでは星印で示している。 熱変成し、末端を標識したヘアピン試験分子の10fmole、プライマーオリゴヌ クレオチド（ヘアピンの3'アームに相補的）の0.2μM、各dNTPの50μM及びDNAPT aq（Perkin Elmer）の0.5単位または5'ヌクレアーゼを含む抽出物（上記のよう に調製した）の0.5μｌを加えることにより、10mMトリス-Cl，pH8.5，50mM KCl 及び1.5mM MgCl2を含むバッファー中の総容量10μｌで開裂反応を行った。レー ン３、５及び７に示した反応はdNTPなしに行った。 反応物を55℃で４分間インキュベートした。反応容量10μｌに対して８μｌの 、20mM EDTAと0.05%の標識染料を含む95%ホルムアミドを添加することにより、 反応を55℃で停止した。試料は変成ポリアクリルアミドゲル（10%ポリアクリル アミド，19:1架橋、７M尿素、89mMトリス−ホウ酸、pH8.3，2.8mM EDTA）上にロ ードする前には加熱しなかった。試料は、単一鎖や再二重鎖化した開裂していな いヘアピン分子の分離を可能とするために加熱しなかった。 図19Bは、開裂された生成物の一種を得るために、オリゴヌクレオチドをヘア ピンの単一鎖3'アームにアニールすると（図19B、レーン３及び４）、検出でき る合成活性が欠落している改変ポリメラーゼがヘアピン構造を開裂することを示 している。レーン ３及び４に示したクローン4Dのような5'ヌクレアーゼは、dNTPの存在下でも単一 開裂生成物を生成する。合成活性の残留量（野生型活性の1%未満）を保持してい る5'ヌクレアーゼは、該ポリメラーゼがヘアピンの3'アームにアニールしたオリ ゴヌクレオチドを伸長でき、それにより開裂位置を移動できるので、複数の開裂 生成物を生成する（クローン4B、レーン５及び６）。天然DNATaqは、残留合成活 性を保持している変異体ポリメラーゼより多種の開裂生成物を生成し、さらにdN TPの存在下で、天然ポリメラーゼの合成活性の高いレベルのために、ヘアピン構 造を二重鎖形態に変える（図19B、レーン８）。 実施例４ トリガー／検出アッセイの試験 トリガー／検出アッセイの検出反応中に検出されるトリガー／検出アッセイの トリガー反応中に放出される型のオリゴヌクレオチドの能力を試験するために、 図20Aに示した２個のヘアピン構造を一般的手法により合成した。２個のヘアピ ンはA-ヘアピン（配列番号23）及びT-ヘアピン（配列番号24）と称する。適当な アニールしたプライマーの存在下で予想される開裂の部位を矢印で示す。A-及び T-ヘアピンは、A-ヘアピン内のほとんどのT残基を除くことにより、またT-ヘア ピン内のほとんどのA残基を除くことにより鎖内の誤った折り畳み（intra-stran d mis-folding）を避けるように設計した。誤った開始やずれを避けるために、 ヘアピンは配列モチーフにおいて局部的に変化させて設計した（例えば、T残基 を１または２個のヌクレオチドを離してまたは対にし て置く）。A-及びT-ヘアピンは一緒にアニールして、pUC型ベクターで指向性ク ローニングをするために適当な末端を持つ二重鎖を形成することができる。即ち 、制限部位は二重鎖のループ領域にあり、所望によりステム領域の延長に使用で きる。 試験トリガーオリゴヌクレオチドの配列は図20Bに示す。このオリゴヌクレオ チドはアルファプライマーと称する（配列番号25）。アルファプライマーは図20 Aに示すようにT-ヘアピンの3'アームに対して相補的である。アルファプライマ ーがT-ヘアピンにアニールすると、熱安定性DNAポリメラーゼにより認識される 開裂構造が生成する。T-ヘアピンの開裂はT-ヘアピンの5'単一鎖アームを遊離さ せ、tauプライマー（配列番号26）と開裂されたT-ヘアピン（図20B、配列番号27 ）を生成する。tauプライマーは図20Aに示したようにA-ヘアピンの3'アームに相 補的である。tauプライマーのA-ヘアピンに対するアニーリングは、別の開裂構 造を生成する。この二番目の開裂構造の開裂はA-ヘアピンの5'単一鎖アームを遊 離し、アルファプライマーのもう一つの分子を生成し、これはT-ヘアピンの別の 分子にアニールする。熱的サイクルはプライマーを放出するので、付加的な開裂 反応として機能できる。アニーリングと開裂の複数のサイクルを行う。開裂反応 の生成物はプライマーと図20Cに示した短縮ヘアピン構造である。短縮しまたは 開裂したヘアピン構造は、変成アクリルアミドゲル電気泳動により非開裂ヘアピ ンから分離し得る。 アニーリングと開裂反応は、以下のように行う。10mMトリス-Cl，pH8.5，1.0M gCl2，75mM KCl，A-ヘアピン１pmole，T-ヘアピン１pmoleを含む反応容量50μｌ 中で、アルファプライマ ーをヘアピン構造（１pmole）に対して等モル量または10〜106倍の範囲の希釈物 で添加し、5'ヌクレアーゼを含む抽出物（上記のように製造した）の0.5μｌを 添加した。アルファ又はトリガープライマーの予想されるメルト温度は、上記の バッファー中では60℃である。アニーリングはこの予想されるメルト温度のすぐ 下の55℃で行う。Perkin Elmer DNA Thermal Cyclerを使用して、反応物を55℃ で30秒間アニールさせた。その後温度を開裂が可能となる72℃まで、５分間にわ たってゆっくり上昇させた。開裂後、反応物を急速に55℃にし（毎秒１℃）、ア ニーリングの別のサイクルが起こるようにした。一定の範囲でサイクル行い（20 ，40及び60サイクル）、反応生成物はこれらのサイクル回数のそれぞれにおいて 分析した。開裂したヘアピン生成物の蓄積がプラトーに達していないことを示し ている反応回数を、その後の量的な結果を得ることが望まれる場合の測定に使用 する。 所望のサイクル回数の後、反応容量10μｌに対して20mM EDTAと0.05%の標識染 料を含む95%ホルムアミドの８μｌを添加することにより、反応を55℃で停止し た。試料は変成ポリアクリルアミドゲル（10%ポリアクリルアミド，19:1架橋、 ７Ｍ尿素，89mMトリス−ホウ酸、pH8.3、2.8mM EDTA）にロードする前には加熱 しなかった。試料は、単一鎖及び再二重鎖化した非開裂ヘアピン分子の分離を可 能とするために加熱しなかった。 ヘアピン分子は、アガロースやスチレンまたは磁性ビーズのような独立した固 体支持体分子に、それぞれのヘアピンの3'末端で結合させることができる。所望 の場合は、スペーサ−分子をヘアピンの3'末端とビーズの間に置くことができる 。固体支持体にヘ アピンを結合させる利点は、これによりメルトとアニールのサイクル中にA-及び T-ヘアピン相互間のハイブリダイゼーションが防止されることである。A-及びT- ヘアピンは互いに相補的であり（図20Dに示したように）、もし相互に全長に渡 ってアニールすることを許容するならば、これは検出反応中にアルファ及びtau プライマーに対するハイブリダイゼーションに利用できるヘアピンの量を減少さ せることになる。 本発明の5'ヌクレアーゼは有意な合成活性を欠いているのでこのアッセイで使 用される。合成活性の欠如は、結果として単一開裂ヘアピン生成物の生成をもた らす（図19B、レーン４に示したように）。複数の開裂生成物は、1）合成活性阻 害の存在（図19B、レーン６及び８参照）または2）反応中のプライマー非依存型 開裂の存在により生成される。プライマー非依存型開裂の存在は、開裂構造の分 岐点の異なった大きさの生成物の存在によりトリガー／検出アッセイ中に検出さ れる。プライマー非依存型開裂は、存在する場合には、ヘアピン分子の分岐領域 で開裂不可能なヌクレオチドを使用することにより鈍化又は抑制し得る。例えば 、チオール化ヌクレオチドを分岐領域でいくつかのヌクレオチドと置き換えるの に使用してプライマー非依存型開裂を妨ぐことができる。 実施例５ 直鎖核酸基質の開裂 上記より、天然（即ち「野生型」）熱安定性DNAポリメラーゼが特異的な方法 でヘアピン構造を開裂でき、そしてこの発見を検 出アッセイにうまく適用できることが明らかである。この実施例では、本発明の 変異体DNAPを、図22Aに示した三種の異なるた開裂構造に対して試験する。図22A の構造１は単純な単一鎖206-マーである（この調製及び配列の情報は上記した） 。構造２及び３は二本鎖である。構造物２は図12A（下）に示したように同一の ヘアピン構造であり、構造３は構造物２のヘアピン部分が除かれている。 開裂反応物は、10mMトリス-Cl，pH8.3，100mM KCl，１mMMgCl2の総容量10μｌ 中の0.01pmoleの生成した基質DNAと、１pmoleパイロットオリゴヌクレオチドと からなっていた。反応物を55℃で30分間インキュベートし、20mM EDTAと0.05%の 標識染料を含む95%ホルムアミドの８μｌを添加することにより停止した。試料 は、45mMトリス−ホウ酸，pH8.3，1.4mM EDTAのバッファー中で、７Ｍ尿素を含 む10%ポリアクリルアミドゲル（19:1架橋）による電気泳動の直前に75℃で２分 間加熱した。 結果はオートラジオグラフィーにより可視化し、図22Bに示した。使用した酵 素は以下の通りである。Ｉは天然TaqDNAP；IIは天然TflDNAP；IIIは図4Eに示し たCleavase（商標）BX；IVは図4Fに示したCleavase（商標）BB；Ｖは図5Bに示し た変異体；VIは図4Gに示したCleavase（商標）BNである。 構造２は比較を「正常化（normalize）」するために使用した。例えば、30分 間で構造２の開裂の同量を与えるためには、50ngのTaq DNAPと300ngのCleavase （商標）BNを必要とすることが判った。このような条件下で、天然Taq DNAPは構 造３を有意な程度には開裂できない。天然Tfl DNAPは複数の生成物を作るような か たちで構造３を開裂する。 これに対し、試験した変異体の全てが構造３の直線二重鎖を開裂する。この知 見は、変異体DNAポリメラーゼのこの特性が、好熱菌種において熱安定ポリメラ ーゼに一貫しているということを示している。 本明細書に記載した、本発明の変異体DNAポリメラーゼが直線二重鎖構造を開 裂できるという発見は、より直接的なアッセイデザインに応用できる（図1A）。 図23は図1Aのアッセイデザインに対応するより詳細な図である。 図23に示した２つの43マーは標準的な方法により合成した。それぞれは検出の ために5'末端にフルオレセインを、ストレプトアビジンでコートした常磁性粒子 に結合できるようにするために3'末端にはビオチンを含んでいる（ビオチンーア ビジン結合は「 」で示している）。 トリチル基を除去する前に、オリゴをHPLCにより精製し、合成反応の切断され た副生成物を除いた。各43マーのアリコートはM-280 Dynabeads（Dynal）にビー ズのmg当たり100pmoleの密度で結合した。２mgのビーズ（200μl）を、洗浄１回 あたり200μｌの、0.1% BSAを含む１Ｘ洗浄／結合バッファー（１M NaCl，５mM トリス-Cl，pH 7.5，0.5mM EDTA）で２回洗浄した。洗浄の間に、ビーズは磁気 により沈殿させては上清を除いた。２回目の洗浄後、ビーズを2X洗浄／結合バッ ファー（１mM EDTAを含む２Ｍ NaCl,10mMトリス-Cl，pH7.5）の200μｌ中に再懸 濁し、２つの100μｌのアリコートに分けた。それぞれのアリコートに２種のオ リゴヌクレオチドのうちの１種の100μM溶液の１μｌを入れた。 混合後、時々静かに攪拌しながら、ビーズを室温で60分間インキュベートした。 次にビーズを沈殿させ、上清の分析では痕跡量のみの遊離オリゴヌクレオチドが 示され、結合が成功したことを示した。ビーズの各アリコートは、１回の洗浄に つき100μｌの１Ｘ洗浄／結合バッファーにより３回洗浄し、つぎに10mMトリス- Cl，pH8.3，75mM Kclのバッファー中で２回洗浄した。オリゴの１pmoleが懸濁液 のμｌ当たりビーズの10μｇに結合した濃度になるように、ビーズを最終容量10 0μｌのトリス/KClに再懸濁した。ビーズは使用の合間は４℃で貯蔵した。 ビーズのタイプは図1Aに対応している。即ち、タイプ２ビーズは、アルファシ グナルオリゴ（配列番号35）並びに遊離すると24マーであるベータシグナルオリ ゴ（配列番号36）について相補的な配列（配列番号34）を含むオリゴ（配列番号 33）を含んでいる。このオリゴには「Ａ」がなく、「Ｔ」に富んでいる。タイプ ３ビーズは、ベータシグナルオリゴ（配列番号39）並びに遊離すると20マーであ るアルファシグナルオリゴ（配列番号35）について相補的な配列（配列番号38） を含むオリゴ（配列番号37）を含んでいる。このオリゴには「Ｔ」がなく、「Ａ 」に富んでいる。 開裂反応物は、１μｌの示したビーズ、10pmoleの「パイロット」（示した場 合には）としての標識していないアルファシグナルオリゴ及び500ngのCleavase （商標）BNを、20μｌの75mM KCl，10Mmトリス-Cl，pH8.3，1.5mM MgCl2及び10 μM CTAB中に含む。酵素を除く全ての成分を合わせ、軽鉱物油で覆い、53℃に暖 めた。反応は事前に暖められた酵素の添加により開始させ、その温度で30分間イ ンキュベートした。反応はその温度で、20mM ED TAとそれぞれ0.05%のブロモフェノールブルーとキシレンシアノールを含む95%ホ ルムアミドの16μｌを添加することにより停止させた。この添加により酵素活性 が停止され、加熱することによりビオチン−アビジン結合が崩壊し、ビーズから オリゴの大部分（95%以上）が放出される。45mMトリス−ホウ酸，pH8.3，1.4mM EDTAのバッファー中で、７Ｍ尿素を含む10%ポリアクリルアミドゲル（19:1架橋 ）による電気泳動の直前に試料を75℃に２分間加熱した。結果は、分離されたDN Aを正に帯電したナイロン膜に接触移動させ、アルカリフォスファターゼに結合 された抗−フルオレセイン抗体によりブロックした膜をプロービングすることに より可視化した。洗浄後、抗体が結合している所に紫色の沈殿を生じさせるWest ern Blue（Promega）中で膜をインキュベートすることによりシグナルを発色さ せた。 図24は、本発明のDNAP変異体による図23の直鎖二重鎖核酸構造の開裂の増幅を 示している。中央の２つのレーンはビーズの両方のタイプを含んでいる。上述し たように、遊離したときベータシグナルオリゴ（配列番号36）は24マーであり、 アルファシグナルオリゴ（配列番号35）は遊離したとき20マーである。24マーと 20マーに対応する二つの低バンドの形成は「パイロット」に明らかに依存してい る。 実施例６ 熱安定性DNAPによる5'エキソヌクレオチド分解開裂（「ニッブリング」） 本発明のものを含む熱安定性DNAPは、直鎖二重鎖核酸構造を５ ’末端から少しずつ分解する（nibbling）ことができるという真の５’エキソヌ クレアーゼ活性を有していることが判明した。この実施例においてはやはり206 塩基対DNA二重鎖基質を使用する（上記参照）。この場合、ポリメラーゼ連鎖反 応において１種の32P-標識プライマー及び１種の非標識プライマーを使用するこ とによりそれを製造した。開裂反応物は、0.01pmolの熱変性され末端標識された 基質DNA（非標識鎖を有するものも存在する）、５pmoleのパイロットオリゴヌク レオチド（図12Aのパイロットオリゴを参照）及び0.5単位のDNAPTaqまたはE．co li抽出物（上記参照）中の0.5μのCleavase（商標）BBを、10mMトリス-Cl，ｐH8 .5，50mM KCl，1.5mM MgCl2の10μｌの総容量中に含んでいた。 反応は、予め温めた酵素を加えることにより65℃で開始し、その後最終的なイ ンキュベート温度に30分間変更した。結果を図25Aに示す。レーン１〜４の試料 は天然Taq DNAPによる結果であり、レーン５〜８はCleavase（商標）BBによる結 果を示している。レーン１、２、５及び６についての反応は65℃で行い、レーン ３、４、７及び８についての反応は50℃で行い、全てその温度で、20mM EDTAと0 .05％のマーカー染料を含む95%ホルムアミドの８μｌを添加することにより停止 させた。45mMトリス−ホウ酸，pH8.3，1.4mM EDTAのバッファー中で、７Ｍ尿素 を含む10%ポリアクリルアミドゲル（19:1架橋）による電気泳動の直前に試料を7 5℃で２分間加熱した。反応１、２、５及び６の予想された生成物は85ヌクレオ チド長であり、反応３及び７の予想された生成物は27ヌクレオチド長である。反 応４及び８はパイロット無しで 行われ、206ヌクレオチドに止まったままである。24ヌクレオチドで見られたか すかなバンドは、PCR由来の残留末端標識プライマーである。 Cleavase（商標）BBがこのような条件下で、微細種で標識の全てを出現させた ということは驚くべき結果であり、これは酵素が基質を完全に加水分解した可能 性を示唆している。レーン５〜８（欠失変異体で行った反応）に見られる最も速 く移動したバンドの組成を決定するために、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼ（US B）または仔ウシ腸アルカリ性フォスファターゼ（Promega）のいずれかで、製造 者の使用説明書に従い、206塩基対二重鎖の試料を処理し、標識モノヌクレオチ ド（図25Bのレーンa）または遊離32P標識無機リン酸（図25Bのレーンb）のいず れかをそれぞれ生成した。これらの生成物は、パネルＡのレーン７に見られる生 成物と共に、45mMトリス−ホウ酸，pH8.3，1.4mM EDTAのバッファー中で、７Ｍ 尿素を含む20%アクリルアミドゲル（19:1架橋）による短時間の電気泳動により 分離した。このようにCleavase（商標）BBは、基質をモノヌクレオチドに転換で きる。 実施例７ ニッブリングは二重鎖依存性である Cleavase（商標）BBによるニッブリングは二重鎖に依存している。この実施例 では、内部で標識された206-マーの単一鎖を、非標識206-bpフラグメントを鋳型 として用いて、４個全ての非標識dNTPと組み合わせたα-32P標識dCTPを導入する プライマー伸長の15サイクルにより生成した。単一及び二重鎖生成物を、45mMト リス−ホウ酸，pH8.3，1.4mM EDTAのバッファー中で、６%非変成アクリルアミド ゲル（29:1架橋）による電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーにより 可視化し、ゲルから切り出し、受動拡散により溶出し、エタノール沈降により濃 縮した。 開裂反応物は0.04pmoleの基質DNA、及び２μｌのCleavase（商標）BB（上述し たようにE．coli抽出物中）を10mMトリス-Cl，pH8.5，50mM KCl，1.5mM MgCl2の 総容量40μｌ中に含んでいた。反応は事前に暖められた酵素の添加により開始し 、10μｌのアリコートを５、10、20、30分で取り出し、30mM EDTAと0.05%のマー カー染料を含む95%ホルムアミドの８μｌを含むように準備した試験管に移した 。45mMトリス−ホウ酸，pH 8.3，1.4mM EDTAのバッファー中で、７Ｍ尿素を含む 10%アクリルアミドゲル（19:1架橋）による電気泳動の直前に試料を75℃で２分 間加熱した。結果は図26に見られるようにオートラジオグラフィーにより可視化 した。明らかに、Cleavase（商標）BBによる開裂は二重鎖構造に依存している。 即ち、単一鎖構造の開裂は検出されないが、206-マー二重鎖の開裂は完了してい る。 実施例８ ニッブリングはターゲット指揮下にある 本発明のDNAPのニッブリング活性は、検出アッセイでうまく使用できる。その ようなアッセイの一つの態様を図27に示す。このアッセイでは、ターゲット配列 に特異的な標識オリゴを使用する。オリゴはターゲットに対して過剰としハイブ ダリゼーションを急速に行う。この様態では、オリゴは２個のフルオレセイン標 識 を含み、これらがオリゴ上で近接していることによりそれらの放射が打ち消され る。DNAPがオリゴを末端から少しずつ分解できるとき、その標識は分離され、検 出され得る。短縮された二重鎖は不安定になり、解離する。重要なことは、ター ゲットはここでそのままの標識したオリゴと自由に反応できるということである 。反応は、望ましいレベルの検出が得られるまで継続できる。類似したタイプで あるが異なる、λエキソヌクレアーゼを使用したサイクルアッセイが記載されて いる。C.G．Copley and C．Boot，BioTechniques 13:888（1992）参照。 そのようなアッセイの成功は特異性に依存している。言い換えれば、オリゴは 特異的なターゲットにハイブリダイズしなければならない。アッセイが敏感であ ることも好ましい。即ち、理想的には、オリゴは少量のターゲットを検出しなけ ればならない。図28Aはプラスミドターゲット配列に結合された5'末端32P標識プ ライマーを示している。この場合、プラスミドは二分間煮沸しその後急冷するこ とにより熱変成したpUC19（市販品）であった。プライマーは21マー（配列番号3 9）である。使用した酵素は、100mM KCl，10Mmトリス-Cl，pH8.3，２mM MgCl2中 のCleavase（商標）BX（5×10-3μｌ抽出物に等価の希釈物）であった。反応は ゲノムバックグラウンドDNA（ニワトリ血液由来）の存在下または非存在下で、5 5℃で16時間行った。反応は、20mM EDTAと標識染料を含む95%ホルムアミドの８ μｌを添加することにより停止した。 反応生成物は、図28Bに見られるようにPAGE（10%ポリアクリルアミド、19:1架 橋１×TBE）により分離した。レーン「Ｍ」は標識 21マーを含む。レーン２及び３はそれぞれ100ng及び200ngのゲノムDNAをそれぞ れ含んでいるが、レーン１〜３は特異的ターゲットを含まない。レーン４、５及 び６は全て０ng、100ngまたは200ngのゲノムDNAのそれぞれと共に特異的ターゲ ットを含む。モノヌクレオチドへの変換がレーン４、５及び６でバックグラウン ドDNAの存在または量にかかわらず起こることは明らかである。従って、ニッブ リングはターゲット指揮下にあり、特異的であり得る。 実施例９ Cleavase精製 上述したように、発現された熱安定性タンパク質、即ち5'ヌクレアーゼを粗細 菌細胞抽出物により分離した。その後沈殿したE．coliタンパク質を他の細胞残 渣とともに遠心分離により除いた。本実施例では、BNクローンを発現する細胞を 培養し、回収した（500g）。各１ｇ（湿潤重量）のE．coliに対して、３mlの溶 菌バッファー（50mMトリス-HCl，pH8.0，1mM EDTA，100mM NaCl）を添加した。 細胞を室温で200μg/mlのリゾチームで20分間溶解した。その後デオキシコール 酸を最終濃度が0.2%になるように添加し、混合物を15分間室温でインキュベート した。 溶解物を０℃で約６〜８分間超音波処理した。沈殿を遠心分離（39,000g、20 分間）により除いた。ポリエチレンイミンを上清に加え（0.5%）、混合物を氷上 で15分間インキュベートした。混合物を遠心分離し（5,000g、15分間）、上清は 保存した。これを30分間60℃に加熱し、その後再び遠心分離し（5,000g、15分間 ）、上 清は再び保存した。 上清を35%硫酸アンモニウムで４℃で15分間沈殿させた。その後混合物を遠心 分離し（5,000g、15分間）、上清を除去した。次に沈殿を0.25M KCl，20トリスp H7.6，0.2%Tween 0.1EDTAに溶解し、そして結合バッファー（8X結合バッファー は40mMイミダソール，4M NaCl，160mMトリス-HCl，pH7.9を含む）に対して透析 した。 その後、溶解したタンパク質をNi++カラム（Novagen）上で精製した。結合バ ッファーをカラム床の上段に注入し、カラムに調製した抽出液をロードする。１ 時間当たり約10カラム容量の流速が効率的な精製に最適である。流速が高すぎる と、より多くの不純物が溶出フラクションに混入することになる。 カラムを1X結合バッファーの25ml（10容量）で洗浄し、次に1X洗浄バッファー （8X洗浄バッファーは480mMイミダゾール，4M NaCl，160mMトリス-HCl，pH7.9を 含む）の15ml（６容量）で洗浄する。結合タンパク質を1X溶出バッファー（4X溶 出バッファーは4mMイミダゾール，2M NaCl，80mMトリス-HCl，pH7.9を含む）で 溶出した。次にタンパク質を上記のように35%硫酸アンモニウムで再沈殿させた 。その後沈殿を再度溶解し、20mMトリス，100mM KCl，1mM EDTAに対して透析し た。溶液をTween20とNP-40のそれぞれ0.1%とし、４℃で貯蔵した。 上記より、本発明はこれまで開示されなかったヌクレアーゼ活性を有する新規 な開裂酵素を提供することは明らかである。この酵素は、種々の設計のターゲッ ト検出アッセイにおいて成功裏に 使用し得る。これらのアッセイは、試料DNAを検出の前に増幅する必要がなく、 従ってDNA-ベースの検出技術に改良をもたらすものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 リャミチェフ，ヴィクター アイ. アメリカ合衆国 53713 ウィスコンシン 州 マディソン，ポスト ロード シャー プ５，2221番地 (72)発明者 ブロウ，メアリー アン ディー. アメリカ合衆国 53711 ウィスコンシン 州 マディソン，ハマースリー ロード 5905番地

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 熱安定性DNAポリメラーゼをコードするDNA配列であって、天然DNAポリメ ラーゼのものから変更されたDNA合成活性を示すように天然配列に対して配列に おいて変更されている前記DNA配列。 ２． コードされたDNAポリメラーゼが天然DNAポリメラーゼのものよりも減少し た合成活性を示す、請求項１のDNA配列。 ３． 前記天然配列に対する変更が単一のヌクレオチドの変化を含む請求項１の DNA配列。 ４． 前記天然配列に対する変更が欠失を含む請求項１のDNA配列。 ５． 配列番号９〜12及び21からなる群から選択されるDNA配列を含む請求項４ のDNA配列。 ６． 前記天然配列に対する変更が挿入を含む請求項１のDNA配列。 ７． Thermus aquaticus、Thermus flavus及びThermus thermophilusからなる 群から選択された生物を起源とする請求項２のDNA配列。 ８． 天然DNAポリメラーゼのものから変更されたDNA合成活性を示すように天然 配列に対して配列において変更されている熱安定性DNAポリメラーゼをコードす るDNA配列を含む組換え体DNAベクター。 ９． 前記天然配列に対する変更が単一のヌクレオチドの変化を含む請求項８の DNA配列を含む組換え体DNAベクター。 10． 前記天然配列に対する変更が欠失を含む請求項８のDNA配列を含む組換え 体DNAベクター。 11． Thermus aquaticus、Thermus flavus及びThermus thermophilusからなる 群から選択された生物を起源とする請求項８のDNA配列を含む組換え体DNAベクタ ー。 12． 配列番号９〜12及び21からなる群から選択されるDNA配列を含む請求項11 のDNA配列を含む組換え体DNAベクター。 13． 請求項８の組換え体ベクターで形質転換された宿主細胞。 14． 天然DNAポリメラーゼのものから変更されたDNA合成活性を示すが、天然DN Aポリメラーゼのものと実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミ ノ酸配列において変更された熱安定性DNAポリメラーゼ。 15． 変更されたポリメラーゼが天然DNAポリメラーゼのものよりも減少した合 成活性を示す請求項14のポリメラーゼ。 16． 前記天然配列に対する変更がアミノ酸の変化を含む請求項15のポリメラー ゼ。 17． 前記天然配列に対する変更が欠失を含む請求項15のポリメラーゼ。 18． Thermus aquaticus、Thermus flavus及びThermus thermophilusからなる 群から選択された生物を起源とする請求項15のポリメラーゼ。 19． 配列番号９〜12及び21からなる群から選択される核酸配列によりコードさ れるアミノ酸配列を含む請求項18のポリメラーゼ。 20． 特異的なターゲットDNA分子の存在を検出する方法であって、 a) i) ターゲット核酸、 ii) 前記ターゲット核酸の第１の部分に相補的な第１のオリゴヌクレオチ ド、及び iii) 第２のオリゴヌクレオチドであって、そのある領域が前記ターゲット 核酸の第２の部分に相補的であり、該第２のオリゴヌクレオチドの非相補的領域 がその5'末端において一重鎖アームを提供するものである前記第２のオリゴヌク レオチドを用意し、 b) 前記ターゲット核酸、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴ ヌクレオチドを、前記第１のオリゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチ ドの3'末端が前記ターゲットDNA配列にアニールして第１の開裂構造を生成する ような条件下で混合し、 c) 前記第１の開裂構造の開裂が前記第２のオリゴヌクレオチド内に位置する部 位において前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドの前記ターゲット核酸上への アニーリングに依存するかたちで優先的に起こるような条件下で開裂手段を提供 し、これにより前記第２のオリゴヌクレオチドの一重鎖アームを遊離して第３の オリゴヌクレオチドを生成し、 d) 一重鎖3'アーム及び一重鎖5'アームを有する第１のヘアピン構造を、前記第 ３のオリゴヌクレオチドが前記第１のヘアピンの一重鎖3'アームにアニールし、 これにより第２の開裂構造を生成するような条件下に提供し、 e) 前記開裂手段により前記第２の開裂構造の開裂が起こり、前記第２の開裂構 造の一重鎖5'アームが遊離され、第４のオリゴヌ クレオチドと第１の開裂されたヘアピン検出分子を含む反応生成物を生成する条 件を提供し、 f) 一重鎖3'アーム及び一重鎖5'アームを有する第２のヘアピン構造を、前記第 ４のオリゴヌクレオチドが前記第２のヘアピンの一重鎖3'アームにアニールし、 これにより第３の開裂構造を生成するような条件下に提供し、 g) 前記開裂手段により前記第３の開裂構造の開裂が起こり、前記第３の開裂構 造の一重鎖5'アームが遊離され、配列において前記第３のオリゴヌクレオチドと 同一の第５のオリゴヌクレオチドと第２の開裂されたヘアピン検出分子を含む反 応生成物を生成する条件を提供し、 h) 前記第１及び第２の開裂されたヘアピン検出分子の存在を検出することを含 む前記方法。 21． 段階d)〜g)を少なくとも１回繰り返す請求項20の方法。 22． 前記開裂手段が変更された熱安定性DNAポリメラーゼを含み、開裂反応が 有意なポリメラーゼ活性の不存在下におこる請求項20の方法。 23． 前記第１のオリゴヌクレオチド、前記第３のオリゴヌクレオチド及び前記 第４のオリゴヌクレオチドのアニールの不存在下には段階c)、e)及びg)の開裂反 応がそれぞれ起こらない請求項20の方法。 24． 段階c)の開裂反応が前記第２のオリゴヌクレオチドのアニールした部分内 で起こる請求項20の方法。 25． 段階c)の開裂反応が前記第２のオリゴヌクレオチドのアニールしていない 部分内で起こる請求項20の方法。 26． 特異的なターゲット核酸分子の存在を検出する方法であって、 a) i) 開裂手段、 ii) ターゲット核酸、 iii) 前記ターゲット核酸の第１の部分に相補的な第１のオリゴヌクレオチ ド、 iv) そのある領域が前記ターゲット核酸の第２の部分に相補的である第２ のオリゴヌクレオチドを有する第１の固体支持体であって、前記第２のオリゴヌ クレオチドの非相補的領域がその5'末端において一重鎖アームを提供し、前記5' アームが第１のシグナルオリゴヌクレオチドを含むもの、 v) そのある領域が前記第１のシグナルオリゴヌクレオチドに相補的であ る第３のオリゴヌクレオチドをそれぞれ有する複数の開裂されていない第２の固 体支持体であって、前記第３のオリゴヌクレオチドの非相補的領域がその5'末端 において一重鎖アームを提供し、前記5'アームの部分が第２のシグナルオリゴヌ クレオチドを含むもの、及び vi) そのある領域が前記第２のシグナルオリゴヌクレオチドに相補的であ る第４のオリゴヌクレオチドをそれぞれ有する複数の開裂されていない第３の固 体支持体であって、前記第４のオリゴヌクレオチドの非相補的領域がその5'末端 において一重鎖アームを提供し、前記5'アームの部分が前記第１のシグナルオリ ゴヌクレオチドを含むもの、を用意し、 b) 前記開裂手段、前記ターゲット核酸、前記第１のオリゴヌクレオチド及び前 記第２のオリゴヌクレオチドを、前記第１のオリ ゴヌクレオチドと前記第２のオリゴヌクレオチドの3'末端が前記ターゲットDNA 配列にアニールして第１の開裂構造を生成し、前記第１の開裂構造の開裂により 前記第１のシグナルオリゴヌクレオチドが遊離されるような条件下で混合し、 c) 前記遊離された第１のシグナルオリゴヌクレオチドを前記複数の第２の固体 支持体の１つと、前記第１のシグナルオリゴヌクレオチドが前記第３のオリゴヌ クレオチドの前記相補的領域にハイブリダイズして第２の開裂構造を生成し、前 記第２の開裂構造の開裂が前記第２のシグナルオリゴヌクレオチドと開裂された 第２の固体支持体の遊離をもたらすような条件下で反応させ、 d) 前記遊離された第２のシグナルオリゴヌクレオチドを前記複数の第３の固体 支持体の１つと、前記第２のシグナルオリゴヌクレオチドが前記第４のオリゴヌ クレオチドの前記相補的領域にハイブリダイズして第３の開裂構造を生成し、前 記第３の開裂構造の開裂が前記第１のシグナルオリゴヌクレオチドの第２の分子 と開裂された第３の固体支持体の遊離をもたらすような条件下で反応させ、 e) 前記第１及び第２のシグナルオリゴヌクレオチドの存在を検出することを含 む前記方法。 27． 前記開裂手段が熱安定性DNAポリメラーゼから誘導された5'ヌクレアーゼ を含む請求項26の方法。 28． 前記熱安定性DNAポリメラーゼが、Thermus aquaticus、Thermus flavus及 びThermus thermophilusからなる群から選択された生物から誘導される請求項27 の方法。 29． 前記5'ヌクレアーゼが配列番号11、30及び31からなる群か ら選択されるDNA配列によりコードされている請求項28の方法。
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