JPH08511779A - Ａｓｐ▲上Ｂ２８▼インスリン結晶 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Asp^B28とプロタミンを含んで成るインスリン結晶、並びにこれらを含む医薬調製品に関する。本結晶と調製品は、インビボにおいて投与されるとき速い開始と遅延化された活性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】 Asp^B28インスリン結晶 導入 本発明はAsp^B28ヒト・インスリンの結晶に、そしてこのような結晶を含む調製 品に関する。 技術分野 糖尿病は、真性糖尿病（diabetes mellitus）と尿崩症（diabetes insipidus ）における如き過剰の尿排泄をもつヒトにおける失調についての一般用語である 。真性糖尿病は、グルコースを利用する能力が幾分完全に失なわれている代謝失 調である。糖尿病患者が適切に治療されない場合には、真性糖尿病は、口渇、飢 餓、やつれ（emaciation）衰弱のような症状を与える高血糖症をもたらす。糖尿 病は、また、結果として生じるアシドーシスを伴う脂肪の不完全な代謝をも生じ させ、しばしば、呼吸困難（dysproea）、脂肪血症（lipidemia）、ケトン尿症 （ketonurea）及び、最終的には、昏睡（coma）を導びくであろう。真性糖尿病 は、特に眼と腎臓に影響を及ぼすことにより小さな管の進行性の衰弱、並びにア テローム性硬化症（atherosclerosis）と、しばしば関連し、そしてまた発熱原 感染に対する抵抗性が低下されることができる。インスリンの生産を全くもたな いか又はほんの少しもつ患者は、インスリン調製品により治療されることができ る。 真性糖尿病の治療においては、多様なインスリン調製品が提案され、そして使 用されてきた。糖尿病患者は、数十年間にわたりインスリンにより治療されてい るので、安全で、かつ、生活の質を改善 するインスリン調製物についてのかなりの必要性が存在する。商業的に入手可能 なインスリン調製品の中のいくつかは、作用の速い開始を特徴とし、そして他の 調製品は、比較的遅い開始をもつが、いくぶん延長された作用を示す。速効作用 のインスリン調製品は、通常、インスリンの溶液であるが、一方、遅延作用のイ ンスリン調製品は、亜鉛塩単独の添加により又はプロタミンの添加により又は両 方の組合せにより沈殿された結晶及び／又は非晶質形態におけるインスリンを含 む懸濁液であることができる。さらに、いくらかの患者は、速い作用開始とより 延長された作用の両方をもつ調製品を使用している。このような調製品は、プロ タミン（protamine）インスリン結晶が懸濁されるインスリン溶液であることが できる。このような患者自身が、着目の患者により所望される比においてインス リン溶液を懸濁調製品と混合することにより最終調製品を調製している。 通常、インスリン調製品は、皮下注射により投与される。患者にとって重要な のは、その注射からの時間の関数としてのグルコース代謝に対するインスリンの 作用であるインスリン調製品の作用特性である。この特性においては、とりわけ 、その開始のための時間、その最大値、及び全作用経過時間が重要である。異な る作用特性をもつさまざまなインスリン調製品が患者により所望され、そして要 求されている。同一日において、その患者は、ひじょうに異なる作用特性をもつ インスリン調製品を作用することができる。必要とされる作用特性は、例えば、 その日の時刻、及びその患者が食べた各食事の量と組成に依存している。 技術背景 最初の安定性の中性インスリン懸濁液は、プロタミンと亜鉛塩の 過剰の存在（IU（国際単位）インスリン当り２μｇ亜鉛）がHagedorn et al．：J．Am．Med．Assn． 106(1936)，177-180により記載されたプロタミン・インス リン調製品を安定化することができたことを発見したScott and Fischer（J．Ph armacol．Exp．Ther．５８ (1936)，78）により発見された。 米国又は欧州薬局方に従って作られたプロタミン亜鉛インスリンは、非晶質プ ロタミン亜鉛インスリン並結晶プロタミン亜鉛インスリンを含む。新たに調製さ れたプロタミン亜鉛インスリンは、保存の間に結晶性粒子に部分的に転換し、よ り遅延化された効果を導くであろう非晶質沈殿物を主に含む。 NPHインスリン又はイソフェン・インスリン（Isophane Insulin）と命名され た完全に結晶性のプロタミン亜鉛インスリン修飾品が inlab．１(1946)，60;及びデンマーク国特許第64,708号参照）により開発された 。彼らは、少量の亜鉛とフェノール、又はフェノール誘導体、好ましくはｍ−ク レゾールの存在中中性pHにおいてイソフェン部分と一緒に運ばれたインスリンも プロタミンが、放置される間にピラミッド面によりそれらの端に限定された長方 形の正方晶系（obloug tetragoncl）結晶に徐々にではあるが完全に変換される 非晶質沈殿を形成するであろうということを発見した。インスリンとサケ・プロ タミンは、１mgのインスリン当り約0.09mgの硫酸プロタミンに対応する重量化に おいて共沈する。１mgのインスリン当り少なくとも3.5μｇの量における亜鉛と0 .1％よりも高い濃度におけるフェノールが、この正方晶系の調製のために必要で ある。 初期においては、この種の結晶は、天然源からのブタとウシのインスリンを使 用して調製されたが、’80年代から遺伝子工学又は半合成により作られたヒト・ インスリンも使用されている。 ヒト・インスリンは、２つのポリペプチド鎖、それぞれ21と30アミノ酸を含む いわゆるＡ鎖とＢ鎖から成る。このＡ鎖をＢ鎖は、２つのシステイン・ジスルフ ィド橋により相互に結合されている。ほとんどの他の種からのインスリンは、類 似の構造をもつが、ヒト・インスリンにおけるようにそれらの鎖における対応位 置において同一アミノ酸を含まなくてもよい。 遺伝子工学として知られた方法の発達は、ヒト・インスリンに類似うるひじょ うに多様なインスリン化合物を容易に作ることを可能にした。これらのインスリ ン類似体においては、１以上のアミノ酸が、ヌクレオチド配列によりコードされ ることができる他のアミノ酸により置換されいている。ヒト・インスリンは、先 に説明したように、51アミノ酸残基を含むので、多様のインスリン同族体が可能 であることは自明であり、そして実際、ひじょうに重要な特性をもつひじょうに 多様な類似体が調製されてきた。注射調製品のための着目の濃度をもつヒト・イ ンスリン溶液中、インスリン分子は、ヘキサマー(hexamer)として会合形態で存 在する(Brange etal.:Diahetes Care 13，(1990)，923-954)。皮下注射後、血 流による吸収速度がそのヌクレオチドのサイズに依存するということが信じられ ており、そしてこのヘキサマー形成を中和し（counteract）又は阻害するアミノ 酸置換をもつインスリン類似体が普通でない速い作用開始をもつということが発 見されている(Brange et al.：前掲)。これは、糖尿病患者にとってひじょうに 治療的な価値をもつ。 遅延作用性プロタミン・インスリン調製品の結晶においては、そのインスリン もヘキサマーであることが判明しており(Balschmidtet al.:Acta Chryst． B 47，(1991)，975-986)、そして我々が知っている限り、プロタミンを含む遺伝子 工学又は（半）合成により 調製された低会合性インスリン同族体の結晶に対する例は、これまで全く公開さ れていない。 本発明の１の目的は、インスリン調製品のために便利に使用されることができ る低会合性インスリン同族体の結晶を含むプロタミンを製造することである。 本発明の他の目的は、ひじょうに速いインスリン作用の開始と遅延化されたイ ンスリン作用の両方をもつ混合された調製品を可能とするインスリン類似体結晶 を含むプロタミンを製造することである。 本発明の簡単な訳 驚ろくべきことに、少量の亜鉛とフェノールの存在中、溶液中でほとんどモノ マーであるインスリン類似体Asp^B28ヒト・インスリンとプロタミンとを併合する とき、懸濁調製品のための物理的要求、すなわち遅い沈殿と容易な再懸濁を達成 するNPHインスリン様結晶を製造することができるということが発見された。こ れに反し、例えば、そのアミノ酸側鎖内の追加のメチレン基によりAsp^B28類似体 と構造的にのみ異なる、他のひじょうに類似のインスリン類似体、Glu^B28ヒト・ インスリンの結晶の好適な懸濁液を製造することはできない。 発明の詳細な説明 本発明の１の態様は、Asp^B28ヒト・インスリンとプロタミンを含んで成る結晶 である。所望により、この結晶は亜鉛をも含む。本発明の他の態様は、Asp^B28ヒ ト・インスリン、プロタミン及び、所望により亜鉛を含んで成る医薬調製品であ る。この調製品は好ましくは、水性媒質中にある。 プロタミンは、核酸との塩様組合せにおける精子細胞核中に存在する一群の強 塩基性タンパク質の一般名である。商業的に入手可能なプロタミンは、成熟魚精 子から単離されることができ、そして通常、硫酸塩として得られる。特定のプロ タミンのペプチド組成は、それが由来する魚の科、属又は種に依存して変化する ことができる。通常、インスリンと一緒に使用されるべきプロタミンは、サケ（ salmon）から得られた（salmine）又はニジマス（rainbow trout）から得られた （iridine）である。サケ又はマスからのプロタミンは、さらに分離されること ができるタンパク質の２〜３の主要画分に分離されることができる。異なる親か らのペプチドは、20以上がアルギニンである約30のアミノ酸から成る。プロタミ ンの平均分子量は、約4,300である。好ましくは、高純度の硫酸プロタミンが使 用される。 本発明の好ましい態様においては、本発明の結晶中のプロタミンの含量は、約 10〜約15（重量／重量）％のプロタミン、好ましくは、約12.5〜約14％（重量／ 重量）％のプロタミンのレンジ内にある。 本発明の結晶と調製品中の亜鉛の含量は、その調製品の製造の間に添加される 亜鉛塩、例えば塩化亜鉛、硫酸亜鉛又は酢酸亜鉛から全体的に又は部分的に起因 することができる。 本発明の好ましい態様においては、本発明の結晶中の亜鉛の容量は、約0.35〜 約1.5（重量／重量）％の亜鉛、好ましくは約0.5〜約１（重量／重量）％の亜鉛 のレンジ内にある。本発明の他の好ましい態様においては、本発明の調製品中の （結合及び、場合により遊離形態における）亜鉛の全含量は、Asp^B28ヒト・イン スリンの１IU当り約0.3μｇ〜約２μｇの亜鉛のレンジ内にある。 さらに好ましい本発明の態様においては、本発明の調製品中（結 晶及び、場合により溶解形態における） Asp^B28ヒト・インスリンの全含量は、 約10〜約500IU／mlのレンジ内、好ましくは約20〜約200IU／mlのレンジ内、最も 好ましくは、約40〜約100IU／mlのレンジ内にある。 さらに好ましい本発明の態様においては、本発明の調製品は、約6.5〜約８の レンジ内の、好ましくは約７〜約7.5のレンジ内の、最も好ましくは、約7.2〜約 7.4のレンジ内のpH値をもつ。 そしてさらに好ましい本発明の態様においては、本発明の結晶と調製品は、フ ェノール又はその誘導体、例えばｍ−クレゾール酢酸エステルを含む。この結晶 においては、フェノール又はフェノール誘導体は、その結晶格子内に構築される と信じられている。おそらく、それらの結晶は、Asp^B28ヒト・インスリンの１分 子当り１分子のフェノールを含み、約1.5（重量／重量）％のフェノールを含む 結晶をもたらす。 本発明の好ましい態様は、フェノール又はその誘導体の含量が約0.05〜約２（ 重量／容量）％のレンジ内、好ましくは約0.1〜約0.6（重量／容量）％のレンジ 内にある本発明に係る調製品である。 より記載された結晶と調製品の調製と同様に調製されることができる。 プロタミンと一緒にAsp^B28ヒト・インスリンを結晶化させる方法は、むしろ遅 いものであることができ、そして約１週間継続することができる。しかしながら 、得られる結晶は、普通のNPH結晶の外観とサイズを示す。Asp^B28ヒト・インス リン分子内の追加のカルボキシル基の結果として、そのイソフェン比は、慣用の 哺乳類インスリンによるものよりも実質的に高いが、高いプロタミン含量は、ブ タにおける皮下消失テストにおいて反映しない。なぜなら、^{1 25} Ｉ−標識Asp^B28ヒト・インスリンNPH結晶とヒト・インスリンNPH結晶の消失曲 線は、事実上重複しているからである。 従って、NPH調製品として配合されたAsp^B28ヒト・インスリンは、特に、溶解 されたAsp^B28ヒト・インスリンとの組合せにおいて使用されるとき、新規の有用 な中間体として作用するインスリン調製品である。 ひじょうに望ましいインスリン調製品は、ひじょうに速い開始と延長された作 用の両方を示さなければならない。このような調製品は、溶解されたモノマー・ インスリン類似体とヒト・インスリンNPH結晶の懸濁液との混合物として配合さ れることができるであろう。不幸なことに、このような調製品は、安定ではない ことが明らかとなった。なぜなら、その結晶中のヒト・インスリンとその溶解さ れたインスリン類似体との間の交換がゆっくりと生じ、そしてそれ故、その調製 品のひじょうに速い作用特性をそこなうからである。 溶解相中とNPH結晶中の両方に排他的にAsp^B28ヒト・インスリンを含む調製品 は安定であり、そしてブタにおける¹²⁵Ｉ−標識調製品の皮下消失テストにより ひじょうに速い吸収開始並びに延長された吸収を示すことが示された。 このような調製品は、それ自体公知のやり方、例えばAsp^B28ヒト・インスリン の溶液とAsp^B28ヒト・インスリンNPH結晶の懸濁液との混合により、製造される ことができる。このような混合物の比は、約10％〜約50％の、好ましくは約30％ のインスリン類似体溶液と約50％〜約90％の、好ましくは約70％のインスリン類 似体結晶懸濁液であることができる。従って、本発明の好ましい態様は、溶解さ れたAsp^B28ヒト・インスリンとAsp^B28ヒト・インスリンを含んで成る結晶の両方 を含む本発明に係る調製品である。そしてさらに好ましい本発明の好ましい態様 は、一方において、Asp^B28ヒ ト・インスリンを含んで成る結晶とプロタミンとの間の比、他方において、溶解 されたAsp^B28ヒト・インスリンとの比が、約90：10〜約50：50のレンジ内、好ま しくは約70：30であるような本発明に係る調製品である。 本発明に係る調製品は、水性媒質中、さまざまな構成成分、例えばAsp^B28ヒト ・インスリン、プロタミン、場合により亜鉛塩、例えば塩化亜鉛、保存剤、例え ばフェノール、等張性剤、例えば塩化ナトリウム又はグリコール、及びバッファ ー、例えばリン酸水素２ナトリウムを混合することにより製造されることができ る。これを実施する１つの方法は、例えば、希塩酸の使用により、Asp^B28ヒト・ インスリン、硫酸プロタミン、塩化亜鉛、フェノール及びグリセロールの酸性溶 液を調製することである。この溶液を次に室温において撹拌しながらリン酸ナト リウム溶液とゆっくりと混合し、そし混合後、この混合物のpH値を、所望により 約7.3のpH値に調整する。 本発明の好ましい態様は、本発明に係る結晶が非晶質材料のほんの僅かな含有 量をもつ。この非晶質材料は、リン酸プロタミン亜鉛（ZINC protamin phosphat e）又はプロタミンとAsp^B28ヒト・インスリンを含む材料であることができる。A sp^B28ヒト・インスリンを含む結晶材料の含量に基づき、本発明に係る結晶は、 好ましくは、プロタミンとAsp^B28ヒト・インスリンを含む10％未満の、より好ま しくは約５％未満の非晶質材料を含む。結晶性材料の含量に基づき、本発明に係 る結晶は、10％未満の、より好ましくは約５％未満の、非晶質リン酸プロタミン 亜鉛を含む。 Asp^B28ヒト・インスリンを含む結晶性材料の含量に基づき、本発明に係る調製 品は、好ましくは、プロタミンとAsp^B28ヒト・インスリンを含む10％未満の、よ り好ましくは５％未満の非晶質材料 を含む。結晶性材料の含量に基づき、本発明に係る調製品は、好ましくは、10％ 未満の、より好ましくは５％未満の、非晶質リン酸プロタミン亜鉛を含む。 本発明に係る調製品は、例えば内科医により処方されるような通常の商業的調 製品の使用に類似して、好ましくは、人類に対する、糖尿病の治療のために、使 用されることができる。 本明細書中に記載する新規の特徴のいずれも又はそれらの特徴の組合せも本発 明に本質的であると考えられる。 本発明をさらに以下の実施例により説明する。しかしながらこれらは、限定と して解釈されてはならない。Mixtardは、溶解されたインスリン（速効作用性） と懸濁されたインスリン（遅延作用性）の両方を含むインスリン調製品のための 商標である。Mixtard30／70は、30％の溶解されたインスリンと70％の懸濁され たインスリンを含む。 実施例１Asp^B28ヒト・インスリンNPH調製品： 結晶懸濁液を以下の２つの溶液から調製した： 溶液Ｉ：197.5mgのAsp^B28ヒト・インスリン、400μｌの１Ｎ塩酸、359μｌのZ n⁺⁺溶液（５mg／ml）、2.57mlの硫酸プロタミン溶液（10mg/ml）、12.5mlの、0. 3％のｍ−クレゾール、0.13％のフェノール及び3.2％のグリセロールを含む水溶 液並びに25mlまでの水。 溶液II：5.0mlの0.13Ｍリン酸水素２ナトリウム、12.5mlの、0.3％のｍ−クレ ゾール、0.13％のフェノール及び3.2％のグリセロールを含む水溶液、並びに25m lまでの水。 溶液IIを溶液Ｉに添加し、そしてそのpH値を7.30に調整した。得 られた懸濁液を24時間20℃において放置し、その後、完全な結晶化のために４℃ において６日間放置した。消失テスト ： 遅延作用を、ブタにおける皮下注射後、¹²⁵Ｉ−標識されたヒト・インスリンN PHに比較して、¹²⁵Ｉ−標識されたAsp^B28ヒト・インスリンNPHの消失により評価 した。このインスリン類似体調製品を、先に示したように配合した。但し、その 最終調製品中の２μCi／mlの放射能に対応する¹²⁵Ｉ−標識されたAsp^B28ヒト・ インスリン／ヒト・インスリンの一定量をその結晶化の前に添加した。ヒト・イ ンスリンNPH調製品を同様に製造した。このテストを６匹のブタについて設定し 、それぞれがその首の片側に100μｌのテスト調製品(Asp^B28ヒト・インスリンNP H調製品)と他の側に100μｌの標準調製品（ヒト・インスリンNPH調製品）を受容 した。上記注射部位における残存放射能を外部γ−係数により好適な間隔におい て測定した。結果 Asp^B28ヒト・インスリンNPH結晶は、ヒト・インスリンNPH調製品と同一の薄い 棒状のイメージを示し、そして６〜８μｍの長さをもっていた。この調製品の顕 微鏡外観を、図１における写真上に２つの異なる倍率において示す。 ¹²⁵Ｉ−標識されたAsp^B28ヒト・インスリンNPH調製品の皮下消失テストは、そ の注射部位からの消失の速度が標識されたヒト・インスリンNPH調製品の消失に ひじょうに類似していたことを示した。Ｔ_50%値（すなわち、50％残存放射能に ついての時間）がその標準的なNPH調製品（ヒト・インスリン）についての10.9 ±0.9時間に対して、10.1±1.0時間であることが見い出された。これらの結果を 図２においてグラフ形態で示す。結論 Asp^B28ヒト・インスリンは、通常のNPH製造手順によりプロタミンと結晶化す ることができることが発現されたが、１週間の放置が完全な結晶化のために必要 であった。得られる結晶懸濁液は、ヒト・インスリンNPH調製品から公知の普通 の外観をもっていた。 ブタにおける皮下消失テストにより評価される場合、Asp^B28ヒト・インスリン NPH調製品の作用特性は、ヒト・インスリンNPH調製品とは異なっていなかった。 実施例２Asp^B28ヒト・インスリンの混合された溶解及びNPH調製品 ： 結晶懸濁液を以下の２つの溶液から調製した： 溶液Ｉ：158.1mgのAsp^B28ヒト・インスリン、130μｌの１Ｎ塩酸、142μｌのZ n⁺⁺f溶液（10mg／ml）、2.087mlの硫酸プロタミン溶液（10mg／ml）、2.0mlの、 ３％のフェノール及び16％のグリセロールを含む水溶液並びに25mlまでの水。 溶液II：4.0mlの0.13Ｍリン酸水素２ナトリウム、2.0mlの、３％のフェノール 及び16％のグリセロールを含む水溶液、並びに25mlまでの水。 溶液IIを溶液Ｉに添加し、そしてそのpH値を7.30に調整した。得られた懸濁液 を24時間20℃において放置し、その後、完全な結晶化のために４℃において６日 間放置した。 溶液を、32μｌの１Ｍ塩酸の添加により２mlの水に39.5mgのAsp^B28ヒト・イン スリンを溶解することにより製造し、そして次に7.4μｌのZn⁺⁺溶液（10mg／ml ）、1.0mlの、３％フェノールと16％グリセロールを含む水溶液、1.0mlの0.13Ｍ リン酸水素２ナトリウム並びに最後に10mlまでの水を添加した。得られたpH値は 7.27であった。 最終混合調製品を、６ml溶液を14mlの結晶懸濁液に添加し、これ故30／70比の 速効作用性と延長作用性のインスリン類似体を形ることにより製造した。 20℃において一夜放置した後、上清中の溶解タンパク質の相対量を逆相HPLCに より測定した。消失テスト ： 作用特性を、ブタにおける皮下注射後のヒト・インスリンMixta 較して、混合Asp^B28ヒト・インスリン調製品からの¹²⁵Ｉ−標識Asp^B28ヒト・イ ンスリンの消失により評価した。Asp^B28ヒト・インスリン調製品を先に示したよ うに配合した。但し、その最終調製品中の1.7μCI／mlの放射能に対応する、¹²⁵ Ｉ−標識されたAsp^B28ヒト・インスリン類似体の量は、コールド類似体と一緒に 添 調製した。このテストを実施例１に記載したように設定した。結果 ： 混合されたAsp^B28ヒト・インスリン調製品は、逆相HPLCにより のと同様の相対量の、上清中の溶解タンパク質を示した。 混合されたAsp^B28ヒト・インスリン調製品の皮下消失テストは 調製品よりも、最初の１時間の間には実質的に速いが、その後、その速度がひじ ょうに遅くなったことを示した。この混合されたAsp^B28ヒト・インスリン調製品 についてのＴ_75%値（すなわち、75％ についての2.2±0.5時間に対し、1.6±0.5時間であることが見い出された。それ ぞれ、そのＴ_50%値は、4.9±1.0時間対5.7± 1.0時間であり、そしてそのＴ_75%値は、12.8±2.3時間対13.4±2.4時間であるこ とが思い出された。これらの結果を図３においてグラフ形態で示す。結論 ： ブタにおける皮下消失テストにより、実質的により速い開始吸収 見られる、ものと同様な遅延化された吸収特性を示す、溶解されたAsp^B28ヒト・ インスリンとNPH結晶化Asp^B28ヒト・インスリンの混合調製品を配合することが できた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ， ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Asp^B28ヒト・インスリンとプロタミンとを含んで成る結晶。 ２．亜鉛を含んで成る、請求項１に記載の結晶。 ３．約0.35〜約1.5、好ましくは約0.5〜約１（重量／重量）％の亜鉛を含んで 成る、請求項１又は２に記載の結晶。 ４．約10〜約15、好ましくは約12.5〜約14（重量／重量）％のプロタミンを含 んで成る、先の請求項の中のいずれか１項に記載の結晶。 ５．水性媒質中に懸濁された先の請求項の中のいずれか１項に記載の結晶を含 んで成る調製品。 ６．亜鉛を含んで成る、請求項５に記載の調製品。 ７．Asp^B28ヒト・インスリンの含有が、約10〜約500IU／mlのレンジ内、好ま しくは約20〜約200IU／mlのレンジ内、最も好ましくは、約40〜約I00IU/mlのレ ンジ内にある、請求項５又は６に記載のいずれか１項に記載の調製品。 ８．亜鉛の含量が、Asp^B28ヒト・インスリンの１IU当り約0.3μｇ〜約２μｇ の亜鉛のレンジ内にある、請求項５〜７のいずれか１項に記載のプロタミン亜鉛 インスリン調製品。 ９．約6.5〜約８のレンジ内の、好ましくは約７〜約7.5のレンジ内の、最も好 ましくは約7.2〜約7.4のレンジ内のpH値をもつ、請求項３〜８のいずれか１項に 記載の調製品。 10．溶解されたAsp^B28ヒト・インスリンを含んで成る、請求項５〜９のいずれ か１項に記載の調製品。 11．一方において、Asp^B28ヒト・インスリンを含んで成る結晶とプロタミンの 間の比が、他方において溶解されたAsp^B28ヒト・ インスリンについての比が、約90：10〜約50：50のレンジ内に、好ましくは約70 ：30にある、先の請求項のいずれかに記載の調製品。 12．本明細書中に記載する新規の特徴のいずれか又はこれらの特徴の組合せ。