JPH0853366A - Ｎ−グリコリル化ガングリオシドに対する免疫応答を誘発させるワクチン組成物および癌処置におけるその使用 - Google Patents
Ｎ−グリコリル化ガングリオシドに対する免疫応答を誘発させるワクチン組成物および癌処置におけるその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、Ｎ−グリコリル化ガングリオシド
に対する免疫応答を誘発させるワクチン組成物およびこ
の組成物を癌の処置に使用することに関するものであ
る。 【構成】 本発明に係わるワクチン組成物は、場合に応
じて、適当な蛋白質または複合蛋白質からなる担体に、
非共有結合によりあるいは共有結合により、カプリング
させた、Ｎ−グリコリル化ガングリオシドおよび（また
は）その誘導体および（または）その相当するオリゴサ
ッカリドの適量およびさらにいずれか適当なアジュバン
トを含有するものである。
に対する免疫応答を誘発させるワクチン組成物およびこ
の組成物を癌の処置に使用することに関するものであ
る。 【構成】 本発明に係わるワクチン組成物は、場合に応
じて、適当な蛋白質または複合蛋白質からなる担体に、
非共有結合によりあるいは共有結合により、カプリング
させた、Ｎ−グリコリル化ガングリオシドおよび（また
は）その誘導体および（または）その相当するオリゴサ
ッカリドの適量およびさらにいずれか適当なアジュバン
トを含有するものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、癌の能動性特異免疫療
法の分野に関するものであり、特にＮ−グリコリル化ガ
ングリオシド、特にＮ−グリコリルＧＭ3 （ＮＧｃＧＭ
3 ）に対する抗体免疫応答を発現または増大させるため
のワクチン組成物に関するものである。このワクチン組
成物は、癌の予防および処置に使用することができる。
法の分野に関するものであり、特にＮ−グリコリル化ガ
ングリオシド、特にＮ−グリコリルＧＭ3 （ＮＧｃＧＭ
3 ）に対する抗体免疫応答を発現または増大させるため
のワクチン組成物に関するものである。このワクチン組
成物は、癌の予防および処置に使用することができる。
【０００２】
従来技術の説明：ガングリオシドは、シアル酸を含有す
るスフィンゴ糖脂質であり、全ての哺乳動物の細胞膜で
発現される。これらは、サッカリド極性部分と疎水性セ
ラミド（スフィンゴシンと長鎖状脂肪酸）からなる。こ
れらの化合物は、細胞外膜に整合している脂質２層内に
挿入されており、そのオリゴサッカリド鎖は外側周辺に
露出している。ガングリオシドの発現は、種々の細胞の
分化段階および増殖様相により変化する。腫瘍形質転換
中に生じる分化または脱分化は、ガングリオシドの分布
において生じる変化を付随する。
るスフィンゴ糖脂質であり、全ての哺乳動物の細胞膜で
発現される。これらは、サッカリド極性部分と疎水性セ
ラミド（スフィンゴシンと長鎖状脂肪酸）からなる。こ
れらの化合物は、細胞外膜に整合している脂質２層内に
挿入されており、そのオリゴサッカリド鎖は外側周辺に
露出している。ガングリオシドの発現は、種々の細胞の
分化段階および増殖様相により変化する。腫瘍形質転換
中に生じる分化または脱分化は、ガングリオシドの分布
において生じる変化を付随する。
【０００３】さらにまた、哺乳動物組織における或る種
のガングリオシドの発現は、種に限定されている。これ
らのガングリオシド（これは好中球と称される）は、Ｎ
−グリコリルノイラミン酸を含有し、ヒトおよびニワト
リを除く、大部分の種の動物（マウス、ラット、イヌ、
ウマ、ブタなど）に存在している。Ｎ−グリコリル化ガ
ングリオシドのこの「非自己性」（“ｎｏｎ ｓｅｌ
ｆ”）特徴は、これらの化合物のヒトにおける免疫原性
にとって、非常に重要な意味を有する。この事実は、或
る種の病気の処置にウマ血清が実際に慣用であった時代
に、ＨａｎｇａｎａｔｚｉｕおよびＤｅｉｃｈｅｒ（Ｈ
−Ｄ）により、２０人で間接的に見出だされた。
のガングリオシドの発現は、種に限定されている。これ
らのガングリオシド（これは好中球と称される）は、Ｎ
−グリコリルノイラミン酸を含有し、ヒトおよびニワト
リを除く、大部分の種の動物（マウス、ラット、イヌ、
ウマ、ブタなど）に存在している。Ｎ−グリコリル化ガ
ングリオシドのこの「非自己性」（“ｎｏｎ ｓｅｌ
ｆ”）特徴は、これらの化合物のヒトにおける免疫原性
にとって、非常に重要な意味を有する。この事実は、或
る種の病気の処置にウマ血清が実際に慣用であった時代
に、ＨａｎｇａｎａｔｚｉｕおよびＤｅｉｃｈｅｒ（Ｈ
−Ｄ）により、２０人で間接的に見出だされた。
【０００４】これらの患者は、いわゆる血清病といわれ
る病気を発病していた。かれらの血清は、ウマ抗血清の
成分および異なる種の赤血球と反応することが示され
た。後に、これらのＨ−Ｄ抗原は、ウマ赤血球ガングリ
オシドとして抽出され、それらの主要エピトープはＮＧ
ａＮＡα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）Ｇｌｃ（１→
Ｒ）として同定された。培養ヒト腫瘍細胞およびＨ−Ｄ
抗血清を用いて行われた実験により、これらの抗原が一
群のヒト腫瘍に存在することが証明された。従って、腫
瘍特異性抗原であることが見出だされたものと見做され
た。
る病気を発病していた。かれらの血清は、ウマ抗血清の
成分および異なる種の赤血球と反応することが示され
た。後に、これらのＨ−Ｄ抗原は、ウマ赤血球ガングリ
オシドとして抽出され、それらの主要エピトープはＮＧ
ａＮＡα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）Ｇｌｃ（１→
Ｒ）として同定された。培養ヒト腫瘍細胞およびＨ−Ｄ
抗血清を用いて行われた実験により、これらの抗原が一
群のヒト腫瘍に存在することが証明された。従って、腫
瘍特異性抗原であることが見出だされたものと見做され
た。
【０００５】後に、ウシ血清を含有しない培地を使用す
る細胞培養実験および腫瘍生検試料中のガングリオシド
エキス中の脂質結合したＮＧｃＮＡの存在の確認が、ガ
スクロマトグラフイ−質量分析技術により行われ、被験
試料中のＮ−グリコリル化ガングリオシドの濃度が、総
シアル酸の０．０５％以下であることが示された（Ｆｕ
ｒｕｋａｗａらによる、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
３、１８５０７）。上記結果から、Ｎ−グリコリル化ガ
ングリオシドは、癌の免疫療法のターゲットとしては実
用的価値がないものとする、現在の認識が誘導された。
る細胞培養実験および腫瘍生検試料中のガングリオシド
エキス中の脂質結合したＮＧｃＮＡの存在の確認が、ガ
スクロマトグラフイ−質量分析技術により行われ、被験
試料中のＮ−グリコリル化ガングリオシドの濃度が、総
シアル酸の０．０５％以下であることが示された（Ｆｕ
ｒｕｋａｗａらによる、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
３、１８５０７）。上記結果から、Ｎ−グリコリル化ガ
ングリオシドは、癌の免疫療法のターゲットとしては実
用的価値がないものとする、現在の認識が誘導された。
【０００６】しかしながら、本発明により、乳癌は例外
であるらしいことが証明される。乳癌には、比較的大量
のＮ−グリコリル化ガングリオシドが存在する（キュー
バ国特許出願Ｎｏ．１３１／９３）。ガングリオシドを
伴う腫瘍が、主として神経外胚葉由来腫瘍の処置実験の
ターゲットとして使用された（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ
ｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、Ｈ．Ｆ．Ｏｅｔｔｇｅｎ編
集、１９８９、７頁）。これらの実験は、一般に２つの
原則、すなわち特定のｍＡｂによる受動免疫療法、およ
び対象ガングリオシドによる能動免疫感作、に基づくも
のである。
であるらしいことが証明される。乳癌には、比較的大量
のＮ−グリコリル化ガングリオシドが存在する（キュー
バ国特許出願Ｎｏ．１３１／９３）。ガングリオシドを
伴う腫瘍が、主として神経外胚葉由来腫瘍の処置実験の
ターゲットとして使用された（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ
ｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、Ｈ．Ｆ．Ｏｅｔｔｇｅｎ編
集、１９８９、７頁）。これらの実験は、一般に２つの
原則、すなわち特定のｍＡｂによる受動免疫療法、およ
び対象ガングリオシドによる能動免疫感作、に基づくも
のである。
【０００７】ＢＣＧに吸着させたＧＭ2 ガングリオシド
を用いる免疫感作プロトコールが、メラノーマの患者に
施された。ＩｇＭおよびＩｇＧイソタイプの抗−ＧＭ2
抗体の存在が、これらの患者で証明された。高力価を有
する患者は、さらに１５ヶ月の遅延再発を示した（Ｌｉ
ｖｉｎｇｓｔｏｎらによる（１９８９）、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４９、７０４５−７０５０）。さらにまた、
メラノーマの患者における初期臨床試験が行われた。単
独またはリポソーム中に封入された、第一期腫瘍細胞か
ら得たガングリオシドの混合物による免疫感作は、ガン
グリオシドＧＭ3 、ＧＤ3 、ＧＭ2 および９−Ｏ−アセ
チルＧＤ3 に対して、主としてＩｇＧイソタイプの低い
抗体力値を示した。
を用いる免疫感作プロトコールが、メラノーマの患者に
施された。ＩｇＭおよびＩｇＧイソタイプの抗−ＧＭ2
抗体の存在が、これらの患者で証明された。高力価を有
する患者は、さらに１５ヶ月の遅延再発を示した（Ｌｉ
ｖｉｎｇｓｔｏｎらによる（１９８９）、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４９、７０４５−７０５０）。さらにまた、
メラノーマの患者における初期臨床試験が行われた。単
独またはリポソーム中に封入された、第一期腫瘍細胞か
ら得たガングリオシドの混合物による免疫感作は、ガン
グリオシドＧＭ3 、ＧＤ3 、ＧＭ2 および９−Ｏ−アセ
チルＧＤ3 に対して、主としてＩｇＧイソタイプの低い
抗体力値を示した。
【０００８】この抗体応答は、短時間持続性であり、反
復免疫感作により維持することはできず、あるいは増加
させることもできなかった。しかしながら、免疫応答を
有する患者は、もう一度統計学的に有意の再発遅延を示
した（Ｐｏｒｔｏｕｋａｌａｉｎらによる（１９９
１）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４９、８９３−８９
９）。ガングリオシドに対する免疫応答を改善するため
に、蛋白質−ＧＭ2 ガングリオシド複合体、とくにＫＬ
Ｈ−ＧＭ2 を使用して、メラノーマの患者の臨床試験が
開始された。
復免疫感作により維持することはできず、あるいは増加
させることもできなかった。しかしながら、免疫応答を
有する患者は、もう一度統計学的に有意の再発遅延を示
した（Ｐｏｒｔｏｕｋａｌａｉｎらによる（１９９
１）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４９、８９３−８９
９）。ガングリオシドに対する免疫応答を改善するため
に、蛋白質−ＧＭ2 ガングリオシド複合体、とくにＫＬ
Ｈ−ＧＭ2 を使用して、メラノーマの患者の臨床試験が
開始された。
【０００９】今日までに得られた結果は、さらに大きい
ＩｇＭ抗体力価の発現およびエフェクター品質を有する
特異的ＩｇＧ抗体の存在を示したが、この免疫応答は、
典型的なＴ細胞依存性抗原二次応答ではなかった（Ｌｉ
ｖｉｎｇｓｔｏｎ（１９９３）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ“Ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃ
ｅｒ ｗｉｔｈ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”、Ｔｈｅ Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ；ａｂｓ
ｔ．２４）。別の担体、例えばナイゼリア メニンギチ
ジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓ）のＯＭＰＣ（外膜複合蛋白質）に、疎水性結合また
は共有結合によりカプリングされたＧＤ3 を使用する、
マウスにおける免疫原性に係わる最近の実験では、ガン
グリオシドに対する免疫応答の質的改善には成功しなか
った。これは多分、ＧＤ3 の「自己」抗原の特徴が、主
としてＴ細胞依存性抗原に類似した特徴を有する免疫応
答の隠蔽を生じさせたものと見做された（Ｌｉｖｉｎｇ
ｓｔｏｎらによる（１９９３）、Ｖａｃｃｉｎｅ １
１、１１９９−１２０４）。
ＩｇＭ抗体力価の発現およびエフェクター品質を有する
特異的ＩｇＧ抗体の存在を示したが、この免疫応答は、
典型的なＴ細胞依存性抗原二次応答ではなかった（Ｌｉ
ｖｉｎｇｓｔｏｎ（１９９３）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ“Ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃ
ｅｒ ｗｉｔｈ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”、Ｔｈｅ Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ；ａｂｓ
ｔ．２４）。別の担体、例えばナイゼリア メニンギチ
ジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓ）のＯＭＰＣ（外膜複合蛋白質）に、疎水性結合また
は共有結合によりカプリングされたＧＤ3 を使用する、
マウスにおける免疫原性に係わる最近の実験では、ガン
グリオシドに対する免疫応答の質的改善には成功しなか
った。これは多分、ＧＤ3 の「自己」抗原の特徴が、主
としてＴ細胞依存性抗原に類似した特徴を有する免疫応
答の隠蔽を生じさせたものと見做された（Ｌｉｖｉｎｇ
ｓｔｏｎらによる（１９９３）、Ｖａｃｃｉｎｅ １
１、１１９９−１２０４）。
【００１０】好中球抗原の免疫原性および乳房腫瘍にお
けるその発現の利点を考慮すると、Ｎ−グリコリル化ガ
ングリオシドに由来する治療用ワクチンは、ヒト乳癌の
処置に有効であることができる。ワクチンの開発には、
適当な抗原供給源の同定が重要である。Ｎ−グリコリル
化ガングリオシドに係わり、この特徴を有する天然源は
開示されたことはない。別の手段として、Ｎ−グリコリ
ル化ガングリオシド誘導体の総合成が提案された（Ｏｇ
ａｗａらによる、米国特許Ｎｏ．４９５０７５０）。こ
の別の手段は、都合の良い手段ではない。これは、ガン
グリオシド誘導体に対して得られる抗体が一般に、元の
ガングリオシドを認識しないからである。
けるその発現の利点を考慮すると、Ｎ−グリコリル化ガ
ングリオシドに由来する治療用ワクチンは、ヒト乳癌の
処置に有効であることができる。ワクチンの開発には、
適当な抗原供給源の同定が重要である。Ｎ−グリコリル
化ガングリオシドに係わり、この特徴を有する天然源は
開示されたことはない。別の手段として、Ｎ−グリコリ
ル化ガングリオシド誘導体の総合成が提案された（Ｏｇ
ａｗａらによる、米国特許Ｎｏ．４９５０７５０）。こ
の別の手段は、都合の良い手段ではない。これは、ガン
グリオシド誘導体に対して得られる抗体が一般に、元の
ガングリオシドを認識しないからである。
【００１１】これに反して、本発明は、抗原の適当な天
然供給源を提供するものである。ＧＭ3 およびＮＧｃＧ
Ｍ3 は、ｍＡｂｓの工業的生産に使用されるハイブリド
ーマ細胞の主要ガングリオシドであり、このことは、本
発明の治療用ワクチンの成否にとって重要なことであ
る。その蛋白質担体としての使用が、宿主免疫系の免疫
ターゲット設定および活性化という利益をもたらすにも
かかわらず、複合ワクチンの蛋白質担体としてのモノク
ローナル抗体の使用は、一般にほとんど行われたことは
なく、また癌治療用ワクチンにおける使用は全く開示さ
れたことはない。
然供給源を提供するものである。ＧＭ3 およびＮＧｃＧ
Ｍ3 は、ｍＡｂｓの工業的生産に使用されるハイブリド
ーマ細胞の主要ガングリオシドであり、このことは、本
発明の治療用ワクチンの成否にとって重要なことであ
る。その蛋白質担体としての使用が、宿主免疫系の免疫
ターゲット設定および活性化という利益をもたらすにも
かかわらず、複合ワクチンの蛋白質担体としてのモノク
ローナル抗体の使用は、一般にほとんど行われたことは
なく、また癌治療用ワクチンにおける使用は全く開示さ
れたことはない。
【００１２】
本発明の要旨 本発明は、Ｎ−グリコリル化ガングリオシドに対する免
疫抗体応答を刺激または増大させるワクチン組成物を提
供する。従って、本発明の目的は、癌の予防用または処
置用のワクチン組成物であって、適当な担体にカプリン
グさせた（疎水性結合または共有結合による）、純粋な
Ｎ- グリコリル化ガングリオシド、主としてＮＧｃＧＭ
3 および（または）その誘導体および（または）その相
当するオリゴサッカリドの有効量および例えば天然由来
のまたはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であることがで
きる、アジュバントを含有するワクチン組成物を提供す
る。
疫抗体応答を刺激または増大させるワクチン組成物を提
供する。従って、本発明の目的は、癌の予防用または処
置用のワクチン組成物であって、適当な担体にカプリン
グさせた（疎水性結合または共有結合による）、純粋な
Ｎ- グリコリル化ガングリオシド、主としてＮＧｃＧＭ
3 および（または）その誘導体および（または）その相
当するオリゴサッカリドの有効量および例えば天然由来
のまたはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であることがで
きる、アジュバントを含有するワクチン組成物を提供す
る。
【００１３】本発明のもう一つの目的は、ガングリオシ
ドの適当な生物学的供給源として、モノクローナル抗体
の工業的産生に使用されたハイブリドーマ バイオマス
を使用することにある。本発明の重要な特徴は、ｍＡｂ
ｓの工業的産生から得られるハイブリドーマバイオマス
から、Ｎ−グリコリル化ガングリオシドを得ることにあ
る。特に、乳房腫瘍に存在する抗原であるＮＧｃＧＭ3
を、この方法で得ることができる。このガングリオシド
および（または）その誘導体および（または）その相当
するオリゴサッカリドを、疎水性結合性または共有結合
性担体蛋白質、特にｍＡｂｓにより、適当な担体にカプ
リングさせる。
ドの適当な生物学的供給源として、モノクローナル抗体
の工業的産生に使用されたハイブリドーマ バイオマス
を使用することにある。本発明の重要な特徴は、ｍＡｂ
ｓの工業的産生から得られるハイブリドーマバイオマス
から、Ｎ−グリコリル化ガングリオシドを得ることにあ
る。特に、乳房腫瘍に存在する抗原であるＮＧｃＧＭ3
を、この方法で得ることができる。このガングリオシド
および（または）その誘導体および（または）その相当
するオリゴサッカリドを、疎水性結合性または共有結合
性担体蛋白質、特にｍＡｂｓにより、適当な担体にカプ
リングさせる。
【００１４】発明の詳細な説明 １．ハイブリドーマ バイオマスからのガングリオシド
の採取 Ｈａｋｏｍｏｒｉの方法（Ｈａｋｏｍｏｒｉらによる、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏ
ｌ．３２、ＰａｒｔＢ、３５０（１９７４））の変法を
用いて、発酵槽におけるｍＡｂｓの工業的生産から得
た、ハイブリドーマバイオマスを処理する。培養培地の
濾過により得られたバイオマス（０．５−１ｋｇ）を、
メタノール２−５リットルとともに均質にした。その後
に、メタノール２−５リットルをさらに添加し、次いで
還流の下に、５−２０時間抽出した。
の採取 Ｈａｋｏｍｏｒｉの方法（Ｈａｋｏｍｏｒｉらによる、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏ
ｌ．３２、ＰａｒｔＢ、３５０（１９７４））の変法を
用いて、発酵槽におけるｍＡｂｓの工業的生産から得
た、ハイブリドーマバイオマスを処理する。培養培地の
濾過により得られたバイオマス（０．５−１ｋｇ）を、
メタノール２−５リットルとともに均質にした。その後
に、メタノール２−５リットルをさらに添加し、次いで
還流の下に、５−２０時間抽出した。
【００１５】このエキスを熱いうちに濾過し、得られた
透明な液体を−２０℃ないし−７０℃で４８時間放置し
た。この沈殿を、４℃で遠心分離により採取し、中程度
のアルカリ処理に付する（０．２Ｎ ＮａＯＨ−ＭｅＯ
Ｈ、３７℃、１−７時間）。その後に、０．２Ｎ ＨＣ
ｌ−ＭｅＯＨにより中和し、次いで４０℃の温度で、濃
縮乾燥させた。４℃において、炭酸塩緩衝液（ｐＨ７）
に対して過度に透析処理し、次いで凍結乾燥させた。
透明な液体を−２０℃ないし−７０℃で４８時間放置し
た。この沈殿を、４℃で遠心分離により採取し、中程度
のアルカリ処理に付する（０．２Ｎ ＮａＯＨ−ＭｅＯ
Ｈ、３７℃、１−７時間）。その後に、０．２Ｎ ＨＣ
ｌ−ＭｅＯＨにより中和し、次いで４０℃の温度で、濃
縮乾燥させた。４℃において、炭酸塩緩衝液（ｐＨ７）
に対して過度に透析処理し、次いで凍結乾燥させた。
【００１６】ＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５（Ｐａｒ
ｍａｃｉａ、スエーデン国）Ａｃ−型において、ＭｅＯ
Ｈ中の０．０２Ｍ ＮａＡｃにより溶出する、イオン交
換クロマトグラフイにより（マトリックス容積／使用試
料：１ｍＬ ＤＥＡＥ−セファデックス／ＮＡＮＡ０．
１−１μｍｏｌ）、モノシアロガングリオシドフラクシ
ョンを得る。４℃で透析によって脱塩した後に、このフ
ラクションを凍結乾燥させる。このガングリオシドＧＭ
3 およびＮＧｃＧＭ3 の精製は、シリカゲル６０（２３
０−４００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ国）を用いる
吸着クロマトグラフイにより行う。
ｍａｃｉａ、スエーデン国）Ａｃ−型において、ＭｅＯ
Ｈ中の０．０２Ｍ ＮａＡｃにより溶出する、イオン交
換クロマトグラフイにより（マトリックス容積／使用試
料：１ｍＬ ＤＥＡＥ−セファデックス／ＮＡＮＡ０．
１−１μｍｏｌ）、モノシアロガングリオシドフラクシ
ョンを得る。４℃で透析によって脱塩した後に、このフ
ラクションを凍結乾燥させる。このガングリオシドＧＭ
3 およびＮＧｃＧＭ3 の精製は、シリカゲル６０（２３
０−４００メッシュ、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ国）を用いる
吸着クロマトグラフイにより行う。
【００１７】シリカゲル１０−４０ｇを含有するカラム
を、平衡化し、次いでＣＣｌ3 Ｈ：ＭｅＯＨ：２．５Ｍ
ＮＨ3 （ｖ／ｖ）６５：２５：４により溶出する。Ｇ
Ｍ3 およびＮＧｃＧＭ3 をそれぞれ単独で含有するフラ
クションを混合し、次いで乾燥させる。１０×２０ｃｍ
シリカゲル６０プレート（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ国）およ
びＣＣｌ3 Ｈ：ＭｅＯＨ：０．２５％ＫＣｌ中２．５Ｍ
のＮＨ3 （５０：４０：１０）を使用するＨＰＴＬＣに
よりカラムを追跡し、レゾルシノール試薬により染色す
る（Ｓｅｖｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、２４（１９５７）、６０４
−６１１）。ガングリオシドの定量分析をまた、レゾル
シノール法により行う。２０−６０ｍｇの量のＧＭ3 お
よびＮＧｃＧＭ3 が得られる。
を、平衡化し、次いでＣＣｌ3 Ｈ：ＭｅＯＨ：２．５Ｍ
ＮＨ3 （ｖ／ｖ）６５：２５：４により溶出する。Ｇ
Ｍ3 およびＮＧｃＧＭ3 をそれぞれ単独で含有するフラ
クションを混合し、次いで乾燥させる。１０×２０ｃｍ
シリカゲル６０プレート（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ国）およ
びＣＣｌ3 Ｈ：ＭｅＯＨ：０．２５％ＫＣｌ中２．５Ｍ
のＮＨ3 （５０：４０：１０）を使用するＨＰＴＬＣに
よりカラムを追跡し、レゾルシノール試薬により染色す
る（Ｓｅｖｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、２４（１９５７）、６０４
−６１１）。ガングリオシドの定量分析をまた、レゾル
シノール法により行う。２０−６０ｍｇの量のＧＭ3 お
よびＮＧｃＧＭ3 が得られる。
【００１８】２．ワクチン免疫原の構築 免疫原調製物のための抗原としては、次のいずれかを使
用することができる：腫瘍中に存在するＮ−グリコリル
化ガングリオシド；それらの還元性末端が種々のスペー
サーにより適当に修飾されており、これにより当該免疫
系の各種成分に対するそれらの接近が改善されている、
それらのオリゴサッカリド；またはそのセラミド中に、
担体蛋白質への共有結合を可能にする、官能性基（アミ
ノ基、カルボキシル基またはアルデヒド基）を導入する
ことによって修飾されている、これらのガングリオシド
の誘導体。担体蛋白質としては、いずれか生理学的に耐
容性の蛋白質を使用することができる。これらの担体
は、いずれか慣用の結合方法（ＳＰＤＰ、カルボジイミ
ド、還元性アミノ化、等）を用いて、前記抗原への共有
結合を可能にする、遊離のアミノ基およびカルボキシル
基を有するべきである。
用することができる：腫瘍中に存在するＮ−グリコリル
化ガングリオシド；それらの還元性末端が種々のスペー
サーにより適当に修飾されており、これにより当該免疫
系の各種成分に対するそれらの接近が改善されている、
それらのオリゴサッカリド；またはそのセラミド中に、
担体蛋白質への共有結合を可能にする、官能性基（アミ
ノ基、カルボキシル基またはアルデヒド基）を導入する
ことによって修飾されている、これらのガングリオシド
の誘導体。担体蛋白質としては、いずれか生理学的に耐
容性の蛋白質を使用することができる。これらの担体
は、いずれか慣用の結合方法（ＳＰＤＰ、カルボジイミ
ド、還元性アミノ化、等）を用いて、前記抗原への共有
結合を可能にする、遊離のアミノ基およびカルボキシル
基を有するべきである。
【００１９】ネズミ モノクローナル抗体または種々の
バクテリア、例えばナイゼリアメニンギチジス、の外膜
蛋白質は、適当な担体蛋白質である。公知の一級アミノ
酸配列を有する、これらの蛋白質の場合には、適当な結
合法の選択に、ヘルパーＴ細胞エピトープの予想に係わ
り開示されている、いくつかの数学的アリゴリズムを使
用することができる。これによって、抗原の結合によっ
て生じる、これらのエピトープの可能な損傷が回避され
る。本発明の場合には、Ｍａｒｇａｌｉｔらにより開示
されたアリゴリズムが使用された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３８、２２１３−２２１９、１９８７）。
バクテリア、例えばナイゼリアメニンギチジス、の外膜
蛋白質は、適当な担体蛋白質である。公知の一級アミノ
酸配列を有する、これらの蛋白質の場合には、適当な結
合法の選択に、ヘルパーＴ細胞エピトープの予想に係わ
り開示されている、いくつかの数学的アリゴリズムを使
用することができる。これによって、抗原の結合によっ
て生じる、これらのエピトープの可能な損傷が回避され
る。本発明の場合には、Ｍａｒｇａｌｉｔらにより開示
されたアリゴリズムが使用された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３８、２２１３−２２１９、１９８７）。
【００２０】Ｎ．メニンギチジスの外膜の複合蛋白質か
ら形成されるプロテオリポソームの成分として、天然ガ
ングリオシドを使用する。このタイプの免疫原の調製に
は、ナトリウム デオキシコレート（０．１−１％）ま
たはドデシル硫酸ナトリウム（０．１−１％）またはＢ
ｒｉｊ９６（０．１−１％）を使用する、Ｎ．メニンギ
チジスのプロテオリポソームの予備分散液が必要であ
る。この分散は、超音波浴中で１０−３０分間行い、次
いで５−２０倍過剰のガングリオシド（あるいはガング
リオシドを多価ワクチンにするガングリオシド）を含有
する溶液を加える。生成する分散液を再度、５−２０分
間超音波処理し、次いで室温で３０分間放置する。最後
に、デタージェントが消失するまで、透析する。
ら形成されるプロテオリポソームの成分として、天然ガ
ングリオシドを使用する。このタイプの免疫原の調製に
は、ナトリウム デオキシコレート（０．１−１％）ま
たはドデシル硫酸ナトリウム（０．１−１％）またはＢ
ｒｉｊ９６（０．１−１％）を使用する、Ｎ．メニンギ
チジスのプロテオリポソームの予備分散液が必要であ
る。この分散は、超音波浴中で１０−３０分間行い、次
いで５−２０倍過剰のガングリオシド（あるいはガング
リオシドを多価ワクチンにするガングリオシド）を含有
する溶液を加える。生成する分散液を再度、５−２０分
間超音波処理し、次いで室温で３０分間放置する。最後
に、デタージェントが消失するまで、透析する。
【００２１】本発明に係わる免疫原調製物の最も効果的
な組成は、蛋白質の質量単位当たりで２−５個のガング
リオシドの含有を示すものである。最も効果的なガング
リオシド用量は、１０−４００μｇである。結合免疫原
（担体蛋白質に共有結合した抗原）の構築においては、
ガングリオシドオリゴサッカリドまたは構造的に修飾さ
れているガングリオシドを使用する。抗原として、ガン
グリオシドオリゴサッカリドが使用される場合には、ス
ペーサー アームを加えて、距離を長くし、これによっ
てこれらを免疫系でさらに利用できるようにし、そして
また潜伏（ｃｒｉｐｔｉｃｉｔｙ）を回避しなければな
らない。
な組成は、蛋白質の質量単位当たりで２−５個のガング
リオシドの含有を示すものである。最も効果的なガング
リオシド用量は、１０−４００μｇである。結合免疫原
（担体蛋白質に共有結合した抗原）の構築においては、
ガングリオシドオリゴサッカリドまたは構造的に修飾さ
れているガングリオシドを使用する。抗原として、ガン
グリオシドオリゴサッカリドが使用される場合には、ス
ペーサー アームを加えて、距離を長くし、これによっ
てこれらを免疫系でさらに利用できるようにし、そして
また潜伏（ｃｒｉｐｔｉｃｉｔｙ）を回避しなければな
らない。
【００２２】このスペーサー試薬としては、鎖の一端に
１個の遊離アミノ基を有し、かつまた他の一端にカルボ
キシル基またはアミノ基を有する、脂肪族化合物を使用
することができる。このスペーサー試薬の糖へのカプリ
ングは、還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウムを
使用する、還元的アミノ化反応により行われる（Ｓｔｏ
ｌｌ Ｍ．Ｓらによる、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２５
６，６６１−６６４，１９８８）。代表的反応条件は次
のとおりである：オリゴサッカリド（５−２５μｍｏ
ｌ）、スペーサー アーム（２５０−１２５０μｍｏ
ｌ）、水素化シアノホウ素ナトリウム（５−２５ｍ
ｇ）、室温（４０−７０℃）および反応時間（２４−７
２時間）。
１個の遊離アミノ基を有し、かつまた他の一端にカルボ
キシル基またはアミノ基を有する、脂肪族化合物を使用
することができる。このスペーサー試薬の糖へのカプリ
ングは、還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウムを
使用する、還元的アミノ化反応により行われる（Ｓｔｏ
ｌｌ Ｍ．Ｓらによる、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２５
６，６６１−６６４，１９８８）。代表的反応条件は次
のとおりである：オリゴサッカリド（５−２５μｍｏ
ｌ）、スペーサー アーム（２５０−１２５０μｍｏ
ｌ）、水素化シアノホウ素ナトリウム（５−２５ｍ
ｇ）、室温（４０−７０℃）および反応時間（２４−７
２時間）。
【００２３】このようにして得られたアミノ化オリゴサ
ッカリドを次いで、オリゴサッカリドよりも３−５倍モ
ル過剰のＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｃａｒｌｓｓｏｎ
Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１７３，７２３−７３
７，１９７８）に、室温で６−１０時間カプリングさせ
る。次いで、このＳＰＤＰに室温で４−１２時間の反応
により、オリゴサッカリドよりも３−５倍モル過剰の担
体蛋白質をカプリングさせる必要がある。
ッカリドを次いで、オリゴサッカリドよりも３−５倍モ
ル過剰のＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｃａｒｌｓｓｏｎ
Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１７３，７２３−７３
７，１９７８）に、室温で６−１０時間カプリングさせ
る。次いで、このＳＰＤＰに室温で４−１２時間の反応
により、オリゴサッカリドよりも３−５倍モル過剰の担
体蛋白質をカプリングさせる必要がある。
【００２４】このＳＰＤＰ−複合蛋白質の還元は、１０
−５０ｍＭのジチオスレイトール溶液を使用して、室温
で１−５時間行う。このアミノ化オリゴサッカリド−Ｓ
ＰＤＰと還元された蛋白質−ＳＰＤＰとの引き続くカプ
リングは、この糖を、蛋白質中の遊離アミノ基の数に対
して２−５モル過剰で使用する反応で行う。この反応
は、室温で２４−７２時間行う。これらの条件の下に、
１０−１００モルのオリゴサッカリド（またはその均等
物）が、担体蛋白質にカプリングされる。多価ワクチン
に使用されるべき免疫原を構築するための、もう一つの
方法には、前記の２工程が包含される：１個または２個
以上のガングリオシドが非共有結合されているプロテオ
リポソームの形成およびスペーサー アームが結合され
ているガングリオシドからの１個のオリゴサッカリドの
共有結合。
−５０ｍＭのジチオスレイトール溶液を使用して、室温
で１−５時間行う。このアミノ化オリゴサッカリド−Ｓ
ＰＤＰと還元された蛋白質−ＳＰＤＰとの引き続くカプ
リングは、この糖を、蛋白質中の遊離アミノ基の数に対
して２−５モル過剰で使用する反応で行う。この反応
は、室温で２４−７２時間行う。これらの条件の下に、
１０−１００モルのオリゴサッカリド（またはその均等
物）が、担体蛋白質にカプリングされる。多価ワクチン
に使用されるべき免疫原を構築するための、もう一つの
方法には、前記の２工程が包含される：１個または２個
以上のガングリオシドが非共有結合されているプロテオ
リポソームの形成およびスペーサー アームが結合され
ているガングリオシドからの１個のオリゴサッカリドの
共有結合。
【００２５】
【実施例】下記の例は説明のためのものである。 例 １：ハイブリドーマ バイオマスからのＧＭ3 およ
びＮＧｃＧＭ3 の単離 モノクローナル抗体 ｉｏｒ ｔ３の発酵製造業者（Ｃ
ＩＭＡＢ Ｓ．Ａ．、キューバ国）から得たハイブリド
ーマ バイオマスを、Ｈａｋｏｍｏｒｉの方法の変法を
用いて処理した（Ｈａｋｏｍｏｒｉらによる、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３２、Ｐ
ａｒｔＢ、３５０（１９７４））。
びＮＧｃＧＭ3 の単離 モノクローナル抗体 ｉｏｒ ｔ３の発酵製造業者（Ｃ
ＩＭＡＢ Ｓ．Ａ．、キューバ国）から得たハイブリド
ーマ バイオマスを、Ｈａｋｏｍｏｒｉの方法の変法を
用いて処理した（Ｈａｋｏｍｏｒｉらによる、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３２、Ｐ
ａｒｔＢ、３５０（１９７４））。
【００２６】培養培地の濾過により得られたハイブリド
ーマ バイオマス（５００ｇ）を、ホモジナイザーを用
いて、メタノール（２．５リットル）と均質化した。さ
らにメタノールを添加し（２．５リットル）、次いで還
流の下に、１０時間抽出を行った。このエキスを熱いう
ちに濾過し、得られた透明な液体を−２０℃で２日間放
置した。沈殿を、４℃で遠心分離により採取し、中程度
のアルカリによる処理に付した（０．２Ｎ ＮａＯＨ／
ＭｅＯＨ、３７℃、２時間）。０．２Ｎ ＨＣｌにより
中和した後に、回転蒸発器で乾燥させ、得られた固形物
を４℃で炭酸塩緩衝液（ｐＨ７）に対する過度の透析に
より脱塩させた。この透析生成物を凍結乾燥させた。
ーマ バイオマス（５００ｇ）を、ホモジナイザーを用
いて、メタノール（２．５リットル）と均質化した。さ
らにメタノールを添加し（２．５リットル）、次いで還
流の下に、１０時間抽出を行った。このエキスを熱いう
ちに濾過し、得られた透明な液体を−２０℃で２日間放
置した。沈殿を、４℃で遠心分離により採取し、中程度
のアルカリによる処理に付した（０．２Ｎ ＮａＯＨ／
ＭｅＯＨ、３７℃、２時間）。０．２Ｎ ＨＣｌにより
中和した後に、回転蒸発器で乾燥させ、得られた固形物
を４℃で炭酸塩緩衝液（ｐＨ７）に対する過度の透析に
より脱塩させた。この透析生成物を凍結乾燥させた。
【００２７】モノシアロガングリオシド フラクション
は、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（Ａｃ- ）にお
いて、溶出剤としてＭｅＯＨ中の０．０２Ｍ ＮａＡｃ
を用いる、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（Ａ
ｃ- ）におけるイオン交換クロマトグラフイによって得
た。このフラクションを透析により脱塩させた後に、凍
結乾燥させ、ＣＣｌ3 Ｈ：ＭｅＯＨ：２．５Ｍ ＮＨ3
（６５：２５：４）中に再溶解し、次いで３５ｇのシリ
カゲル６０のカラムに適用した。このカラムをＣＣｌ3
Ｈ：ＭｅＯＨ：２．５Ｍ ＮＨ3 （６５：２５：４）の
混合物により溶出して、相当するガングリオシド フラ
クションを得た。
は、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（Ａｃ- ）にお
いて、溶出剤としてＭｅＯＨ中の０．０２Ｍ ＮａＡｃ
を用いる、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（Ａ
ｃ- ）におけるイオン交換クロマトグラフイによって得
た。このフラクションを透析により脱塩させた後に、凍
結乾燥させ、ＣＣｌ3 Ｈ：ＭｅＯＨ：２．５Ｍ ＮＨ3
（６５：２５：４）中に再溶解し、次いで３５ｇのシリ
カゲル６０のカラムに適用した。このカラムをＣＣｌ3
Ｈ：ＭｅＯＨ：２．５Ｍ ＮＨ3 （６５：２５：４）の
混合物により溶出して、相当するガングリオシド フラ
クションを得た。
【００２８】ＧＭ3 およびＭＧｃｇＭ3 をそれぞれ単独
で含有するフラクションを混合し、次いで回転蒸発器を
用いて乾燥させた。シリカゲル分離からの相違するフラ
クション中のガングリオシド含有量の測定は、ＣＣｌ3
Ｈ／ＭｅＯＨ／０．２５％ＫＣｌ中２．５ＭのＮＨ
3 （５０：４０：１０）溶剤系およびレゾルシノールに
よる染色を使用して、シリカゲル６０プレートにおける
高速薄層クロマトグラフイ（ＨＰＴＬＣ）により行っ
た。、ＧＭ3 ３０ｍｇおよびＮＧｃＧＭ3 ２４ｍｇが得
られた。
で含有するフラクションを混合し、次いで回転蒸発器を
用いて乾燥させた。シリカゲル分離からの相違するフラ
クション中のガングリオシド含有量の測定は、ＣＣｌ3
Ｈ／ＭｅＯＨ／０．２５％ＫＣｌ中２．５ＭのＮＨ
3 （５０：４０：１０）溶剤系およびレゾルシノールに
よる染色を使用して、シリカゲル６０プレートにおける
高速薄層クロマトグラフイ（ＨＰＴＬＣ）により行っ
た。、ＧＭ3 ３０ｍｇおよびＮＧｃＧＭ3 ２４ｍｇが得
られた。
【００２９】例 ２：Ｎ．メニンギチジスの外膜複合蛋
白質（ＯＭＰＣ）に対するガングリオシドＮＧｃＧＭ3
の非共有カプリングに基づく免疫原の調製 Ｃａｒｌｏｓ Ｊ．Ｆｉｎｌａｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
から入手したＮ．メニンギチジスのＯＭＰＣを使用した
（Ｃ．ＣａｍｐａらによるＥＰ３０１９９２）。このＯ
ＭＰＣ１０ｍｇを、超音波浴中で１０分間、ナトリウム
デオキシコレートの０．３％溶液中に分散させた。次い
で、ＮＧｃＧＭ3 ガングリオシド２０ｍｇを含有する溶
液を添加した。生成する分散液を再度、５分間超音波に
さらし、次いで３０分間放置した。
白質（ＯＭＰＣ）に対するガングリオシドＮＧｃＧＭ3
の非共有カプリングに基づく免疫原の調製 Ｃａｒｌｏｓ Ｊ．Ｆｉｎｌａｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
から入手したＮ．メニンギチジスのＯＭＰＣを使用した
（Ｃ．ＣａｍｐａらによるＥＰ３０１９９２）。このＯ
ＭＰＣ１０ｍｇを、超音波浴中で１０分間、ナトリウム
デオキシコレートの０．３％溶液中に分散させた。次い
で、ＮＧｃＧＭ3 ガングリオシド２０ｍｇを含有する溶
液を添加した。生成する分散液を再度、５分間超音波に
さらし、次いで３０分間放置した。
【００３０】デタージェントからの可溶性複合ＯＭＰＣ
−ＮＧｃＧＭ3 の分離は、１００ＫＤ膜を使用する５日
間の透析により行った。ガングリオシドの蛋白質への結
合の度合いを蛋白質用のＢｉｏ−Ｒａｄ試薬およびシア
ル酸用のレゾルシノールを使用して測定した。ＮＧｃＧ
Ｍ3 ２ｍｇ／ＯＭＰＣ １ｍｇの結合が得られた。
−ＮＧｃＧＭ3 の分離は、１００ＫＤ膜を使用する５日
間の透析により行った。ガングリオシドの蛋白質への結
合の度合いを蛋白質用のＢｉｏ−Ｒａｄ試薬およびシア
ル酸用のレゾルシノールを使用して測定した。ＮＧｃＧ
Ｍ3 ２ｍｇ／ＯＭＰＣ １ｍｇの結合が得られた。
【００３１】例 ３：ＮＧｃＧＭ3 ガングリオシドのオ
リゴサッカリド部分のＰ３ネズミｍＡｂへの共有結合に
基ずく、免疫原（ネオグリコプロテイン）の調製 ａ）ＮＧｃＧＭ3 のオリゴサッカリド成分（ＮＧｃＧＭ
3 ＯＳ）の単離 ＮＧｃＧＭ3 １０ｍｇを、超音波器の補助の下に、Ｍｅ
ＯＨ４ｍＬ中に溶解し、次いで１０分間、オゾンにより
処理した（Ｗｅｉｇａｎｄｔ Ｈ．およびＢａｓｃｈａ
ｎｇ Ｇ．Ｚ．によるＮａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．、２０
ｂ：１６４−１６６、１９６５）。この溶液を、蒸発乾
燥させ、残留物を一夜にわたり撹拌することによって、
０．１Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 １０ｍＬ中に分散させ、ＤＯＷ
ＥＸ５０Ｗ−Ｘ８により中性にし、次いで焼結ガラスロ
ートに通して濾過した。
リゴサッカリド部分のＰ３ネズミｍＡｂへの共有結合に
基ずく、免疫原（ネオグリコプロテイン）の調製 ａ）ＮＧｃＧＭ3 のオリゴサッカリド成分（ＮＧｃＧＭ
3 ＯＳ）の単離 ＮＧｃＧＭ3 １０ｍｇを、超音波器の補助の下に、Ｍｅ
ＯＨ４ｍＬ中に溶解し、次いで１０分間、オゾンにより
処理した（Ｗｅｉｇａｎｄｔ Ｈ．およびＢａｓｃｈａ
ｎｇ Ｇ．Ｚ．によるＮａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．、２０
ｂ：１６４−１６６、１９６５）。この溶液を、蒸発乾
燥させ、残留物を一夜にわたり撹拌することによって、
０．１Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 １０ｍＬ中に分散させ、ＤＯＷ
ＥＸ５０Ｗ−Ｘ８により中性にし、次いで焼結ガラスロ
ートに通して濾過した。
【００３２】生成する溶液を、ＨＣＣｌ3 により抽出
し、その水性相をＨＰＴＬＣにより試験して、その反応
の完了を測定した。オリゴサッカリドの存在は、適用時
点における陽性のレゾルシノール染色により評価した。
ＮＧｃＧＭ3 ＯＳの最終精製を、溶出剤として０．１Ｍ
ＨＡｃを使用して、セファデックスＧ−２５カラムで
行った。最後に、ＮＧｃＧＭ3 ＯＳの構造を、Ｈ1 核磁
気共鳴および質量分析（ＦＡＢスペクトル）により決定
した。
し、その水性相をＨＰＴＬＣにより試験して、その反応
の完了を測定した。オリゴサッカリドの存在は、適用時
点における陽性のレゾルシノール染色により評価した。
ＮＧｃＧＭ3 ＯＳの最終精製を、溶出剤として０．１Ｍ
ＨＡｃを使用して、セファデックスＧ−２５カラムで
行った。最後に、ＮＧｃＧＭ3 ＯＳの構造を、Ｈ1 核磁
気共鳴および質量分析（ＦＡＢスペクトル）により決定
した。
【００３３】ｂ）ＮＧｃＧＭ3 ＯＳの還元的アミノ化 ＮＧｃＧＭ3 ＯＳ ３ｍｇを、１，８−ジアミン３，６
−ジオキソオクタン５００μｍｏｌ含有メタノール５ｍ
Ｌ中に溶解し、アルゴンにより浄化し、次いで５０℃で
２時間反応させ、その後にＮａＢＨ3 ＣＮ １０ｍｇを
加え、反応を５０℃で４０時間継続させた。この反応混
合物を、アルゴン雰囲気の下に乾燥させ、次いでＡｃＨ
を添加して、過剰のＮａＢＨ3 ＣＮを除去した。この修
飾されたオリゴサッカリドを、ＢｉｏｇｅｌＰ−２カラ
ム内で脱塩処理し、次いでＣＭ−セルロースカラムで精
製した（ＺｏｐｆらによるＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．５０：１７１−１７５、１９７８）。このアミノ
化誘導体の同定は、ピリジン−酢酸エチル−酢酸−水
（６：３：１：３）またはクロロホルム−メタノール−
０．２％塩化カルシウム（６０：３５：８）溶剤中で、
シリカゲル６０プレートを使用するＨＰＴＬＣにより行
い、オルシノールまたはレゾルシノール試薬により検出
した。
−ジオキソオクタン５００μｍｏｌ含有メタノール５ｍ
Ｌ中に溶解し、アルゴンにより浄化し、次いで５０℃で
２時間反応させ、その後にＮａＢＨ3 ＣＮ １０ｍｇを
加え、反応を５０℃で４０時間継続させた。この反応混
合物を、アルゴン雰囲気の下に乾燥させ、次いでＡｃＨ
を添加して、過剰のＮａＢＨ3 ＣＮを除去した。この修
飾されたオリゴサッカリドを、ＢｉｏｇｅｌＰ−２カラ
ム内で脱塩処理し、次いでＣＭ−セルロースカラムで精
製した（ＺｏｐｆらによるＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．５０：１７１−１７５、１９７８）。このアミノ
化誘導体の同定は、ピリジン−酢酸エチル−酢酸−水
（６：３：１：３）またはクロロホルム−メタノール−
０．２％塩化カルシウム（６０：３５：８）溶剤中で、
シリカゲル６０プレートを使用するＨＰＴＬＣにより行
い、オルシノールまたはレゾルシノール試薬により検出
した。
【００３４】ｃ）アミノ化ＮＧｃＧＭ3 ＯＳとカプリン
グ試薬Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応 当該オリゴサッカリド１０μｍｏｌを、１００ｍＭリン
酸塩緩衝溶液、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中に溶
解し、次いでＳＰＤＰ３０−５０μｍｏｌを添加し、室
温で６時間反応させた。得られた誘導体を、Ｂｉｏｇｅ
ｌＰ２カラムを使用して精製した。得られた誘導体の同
定は、工程ｂと同一プレートを用いるＨＰＴＬＣおよび
検出系により行った。
グ試薬Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応 当該オリゴサッカリド１０μｍｏｌを、１００ｍＭリン
酸塩緩衝溶液、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中に溶
解し、次いでＳＰＤＰ３０−５０μｍｏｌを添加し、室
温で６時間反応させた。得られた誘導体を、Ｂｉｏｇｅ
ｌＰ２カラムを使用して精製した。得られた誘導体の同
定は、工程ｂと同一プレートを用いるＨＰＴＬＣおよび
検出系により行った。
【００３５】ｄ）モノクローナル抗体Ｐ３とＳＰＤＰと
の反応 Ｐ３モノクローナル抗体（これは、脂質に結合した高特
異性Ｎ−グリコリルノイラミン酸により認識されるＩｇ
Ｍ ｍＡｂである）１０ｍｇを、室温で１００ｎＭリン
酸塩緩衝溶液、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中に溶
解した。この溶液に、ＳＰＤＰ５ｍｇを加え、反応を８
時間継続させた。セファデックスＧ−５０カラムにおい
て、０．１Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．５）、５ｍＭ
ＥＤＴＡ溶剤系を用いて、Ｐ３−ＳＰＤＰの分離を行
った。該当蛋白質を含有するフラクションを混合し、引
き続く工程で使用した。
の反応 Ｐ３モノクローナル抗体（これは、脂質に結合した高特
異性Ｎ−グリコリルノイラミン酸により認識されるＩｇ
Ｍ ｍＡｂである）１０ｍｇを、室温で１００ｎＭリン
酸塩緩衝溶液、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中に溶
解した。この溶液に、ＳＰＤＰ５ｍｇを加え、反応を８
時間継続させた。セファデックスＧ−５０カラムにおい
て、０．１Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．５）、５ｍＭ
ＥＤＴＡ溶剤系を用いて、Ｐ３−ＳＰＤＰの分離を行
った。該当蛋白質を含有するフラクションを混合し、引
き続く工程で使用した。
【００３６】ｅ）Ｐ３−ＳＰＤＰ誘導体のジチオスレイ
トールによる還元 新たに生成されたジスルフィド架橋を還元するために、
０．１Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．５）、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ中の２５ｍＭジチオスレイトール溶液を添加し、
次いで室温で２時間反応させた。得られた誘導体を、セ
ファデックスＧ−５０カラムにおいて、前記と同一の溶
剤系を使用して分離した。Ｐ３にカプリングしたＳＰＤ
Ｐの数の計算は、この反応中に生成された遊離チオピリ
ジンを計算することによって推定した。この数の計算
は、分光光度計による３４３ｎｍの波長における吸光の
増加の測定およびランバート−ビール（Ｌａｍｂｅｒｔ
−Ｂｅｅｒ）の法則の適用に基いている。７．０６×１
０-9×Ｍ-1×ｃｍ-1のモル吸光係数を使用した。
トールによる還元 新たに生成されたジスルフィド架橋を還元するために、
０．１Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．５）、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ中の２５ｍＭジチオスレイトール溶液を添加し、
次いで室温で２時間反応させた。得られた誘導体を、セ
ファデックスＧ−５０カラムにおいて、前記と同一の溶
剤系を使用して分離した。Ｐ３にカプリングしたＳＰＤ
Ｐの数の計算は、この反応中に生成された遊離チオピリ
ジンを計算することによって推定した。この数の計算
は、分光光度計による３４３ｎｍの波長における吸光の
増加の測定およびランバート−ビール（Ｌａｍｂｅｒｔ
−Ｂｅｅｒ）の法則の適用に基いている。７．０６×１
０-9×Ｍ-1×ｃｍ-1のモル吸光係数を使用した。
【００３７】ｆ）蛋白質への糖質のカプリング 工程ｃで得られた糖質誘導体を、４８時間、工程ｅで得
られた蛋白質と反応させた。得られたネオグリコプロテ
インを、セファデックスＧ−５０カラムを使用して、反
応生成物から分離した。蛋白質にカプリングした糖質の
量の測定は、糖質用のレゾルシノール試薬および蛋白質
用のＢｉｏ−Ｒａｄ試薬を使用して、シアル酸含有量を
計算することによって行った。これらの条件の下に、Ｐ
３ １モルあたりＮＧｃＧＭ3 ＯＳ ２５モルの結合度
が得られた。蛋白質にカプリングした糖質はまた、非還
元条件下でのポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）における電気泳動により試験し、次いでウェスター
ン法および抗ガングリオシド特異性ｍＡｂとの反応によ
り試験した。
られた蛋白質と反応させた。得られたネオグリコプロテ
インを、セファデックスＧ−５０カラムを使用して、反
応生成物から分離した。蛋白質にカプリングした糖質の
量の測定は、糖質用のレゾルシノール試薬および蛋白質
用のＢｉｏ−Ｒａｄ試薬を使用して、シアル酸含有量を
計算することによって行った。これらの条件の下に、Ｐ
３ １モルあたりＮＧｃＧＭ3 ＯＳ ２５モルの結合度
が得られた。蛋白質にカプリングした糖質はまた、非還
元条件下でのポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）における電気泳動により試験し、次いでウェスター
ン法および抗ガングリオシド特異性ｍＡｂとの反応によ
り試験した。
【００３８】例 ４：Ｎ．メニンギチジスのＯＭＰＣ使
用による免疫原（ネオグリコプロテイン）の調製、この
ガングリオシドＮＧｃＧＭ3 による予備可溶化、引き続
くＮＧｃＧＭ3 ＯＳへの共有結合によるカプリング ａ）ＯＭＰＣの可溶化 ＯＭＰＣの可溶化は、例２にしたがい行った。 ｂ）ＯＭＰＣ−ＮＧｃＧＭ3 可溶性複合体へのＮＧｃＧ
Ｍ3 ＯＳのカプリング オリゴサッカリドＮＧｃＧＭ3 ＯＳは、例３の工程ａに
記載のとおりにして得、例３の工程ｂに記載の還元的ア
ミノ化に付し、次いで例３の工程ｃに記載のとおりにＳ
ＰＤＰにカプリングさせた。
用による免疫原（ネオグリコプロテイン）の調製、この
ガングリオシドＮＧｃＧＭ3 による予備可溶化、引き続
くＮＧｃＧＭ3 ＯＳへの共有結合によるカプリング ａ）ＯＭＰＣの可溶化 ＯＭＰＣの可溶化は、例２にしたがい行った。 ｂ）ＯＭＰＣ−ＮＧｃＧＭ3 可溶性複合体へのＮＧｃＧ
Ｍ3 ＯＳのカプリング オリゴサッカリドＮＧｃＧＭ3 ＯＳは、例３の工程ａに
記載のとおりにして得、例３の工程ｂに記載の還元的ア
ミノ化に付し、次いで例３の工程ｃに記載のとおりにＳ
ＰＤＰにカプリングさせた。
【００３９】これと平行して、この可溶性複合体ＯＭＰ
Ｃ−ＮＧｃＧＭ3 を、例３の工程ｄに記載のとおりにＳ
ＰＤＰ試薬にカプリングさせ、例３の工程ｅに記載のと
おりにジチオスレイトールにより還元し、次いで例３の
工程ｆに記載のとおりに適当な糖質にカプリングさせ
た。これら全ての場合に、試薬の量および反応条件は、
例３に詳述されているとおりであった。各種ＮＧｃＧＭ
3 誘導体の特徴確認に使用された分析方法およびまたＯ
ＭＰＣおよびその誘導体の特徴確認に使用された分析方
法もまた、例３に記載の方法と同一であった。ＮＧｃＧ
Ｍ3 ＯＳ １ｍｇ／ＯＭＰＣプロテオリポソーム １ｍ
ｇの結合度が得られた。
Ｃ−ＮＧｃＧＭ3 を、例３の工程ｄに記載のとおりにＳ
ＰＤＰ試薬にカプリングさせ、例３の工程ｅに記載のと
おりにジチオスレイトールにより還元し、次いで例３の
工程ｆに記載のとおりに適当な糖質にカプリングさせ
た。これら全ての場合に、試薬の量および反応条件は、
例３に詳述されているとおりであった。各種ＮＧｃＧＭ
3 誘導体の特徴確認に使用された分析方法およびまたＯ
ＭＰＣおよびその誘導体の特徴確認に使用された分析方
法もまた、例３に記載の方法と同一であった。ＮＧｃＧ
Ｍ3 ＯＳ １ｍｇ／ＯＭＰＣプロテオリポソーム １ｍ
ｇの結合度が得られた。
【００４０】例 ５：ワクチン組成物の免疫学的性質、
ニワトリの免疫感作 前記の種々のワクチン組成物を、ニワトリの免疫感作に
使用し、得られた特異的体液免疫応答を試験した。対照
として、フロイント完全アジュバントを用いて、ＰＢＳ
０．６ｍＬ中のＮＧｃＧＭ3 １ｍｇにより１ヶ月間、
弱く免疫感作した１群のニワトリを使用した。４回の投
与の後の２週間の時点で、ブースターを適用し、４日後
に動物から採血した。
ニワトリの免疫感作 前記の種々のワクチン組成物を、ニワトリの免疫感作に
使用し、得られた特異的体液免疫応答を試験した。対照
として、フロイント完全アジュバントを用いて、ＰＢＳ
０．６ｍＬ中のＮＧｃＧＭ3 １ｍｇにより１ヶ月間、
弱く免疫感作した１群のニワトリを使用した。４回の投
与の後の２週間の時点で、ブースターを適用し、４日後
に動物から採血した。
【００４１】同一の免疫感作プロトコールを、各ワクチ
ン調製物で処置したニワトリのグループに使用した。こ
れらの抗体応答は、ＥＬＩＳＡおよびＴＬＣ−免疫染色
法（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）によって、抗原と
してガングリオシドＮＧｃＧＭ3 を使用して評価した。
ワクチン組成物により免疫感作されたニワトリのグルー
プでは全部の場合に、ＮＧｃＧＭ3 ガングリオシドに対
する特異抗体のレベルは、対照の前免疫血清（ｐｒｅ−
ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒｕｍ）に比較して増大していた。
対照群はまた、抗体応答の増加を示したが、この応答は
ＩｇＭタイプの応答であった。これに対して、本発明に
係わるワクチン調製物はいづれも、免疫感作された動物
の大部分において、特異的ＩｇＧ応答を示した。
ン調製物で処置したニワトリのグループに使用した。こ
れらの抗体応答は、ＥＬＩＳＡおよびＴＬＣ−免疫染色
法（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）によって、抗原と
してガングリオシドＮＧｃＧＭ3 を使用して評価した。
ワクチン組成物により免疫感作されたニワトリのグルー
プでは全部の場合に、ＮＧｃＧＭ3 ガングリオシドに対
する特異抗体のレベルは、対照の前免疫血清（ｐｒｅ−
ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｒｕｍ）に比較して増大していた。
対照群はまた、抗体応答の増加を示したが、この応答は
ＩｇＭタイプの応答であった。これに対して、本発明に
係わるワクチン調製物はいづれも、免疫感作された動物
の大部分において、特異的ＩｇＧ応答を示した。
【００４２】例 ６：乳房腫瘍におけるガングリオシド
の発現 手術中に、１０個の乳房腫瘍の生検試料を得た。これら
の試料を組織学的に分類し、使用時点まで−７０℃で保
存した。これらの腫瘍は、以下に簡単に記載する方法に
それぞれ従い処理した：含水状態の、重量測定した腫瘍
に、蒸留水３容量を加え、冷却状態（４℃）で均質にし
た。この均質化した試料中の総蛋白質含有量を、ローリ
イ（Ｌｏｗｒｙ）の方法により測定した。各試料の残り
の部分に、ＣＣｌ3 Ｈ−ＣＨ3 ＯＨ（２：１）混合物５
容量を加え、３７℃で１時間撹拌した。次いでＣＨ3 Ｏ
Ｈを添加して、ＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ3 ＯＨを１：１にし、
抽出操作を反復した。最終混合物を遠心分離し、上澄液
を分離した。
の発現 手術中に、１０個の乳房腫瘍の生検試料を得た。これら
の試料を組織学的に分類し、使用時点まで−７０℃で保
存した。これらの腫瘍は、以下に簡単に記載する方法に
それぞれ従い処理した：含水状態の、重量測定した腫瘍
に、蒸留水３容量を加え、冷却状態（４℃）で均質にし
た。この均質化した試料中の総蛋白質含有量を、ローリ
イ（Ｌｏｗｒｙ）の方法により測定した。各試料の残り
の部分に、ＣＣｌ3 Ｈ−ＣＨ3 ＯＨ（２：１）混合物５
容量を加え、３７℃で１時間撹拌した。次いでＣＨ3 Ｏ
Ｈを添加して、ＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ3 ＯＨを１：１にし、
抽出操作を反復した。最終混合物を遠心分離し、上澄液
を分離した。
【００４３】沈殿を再度、ＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ3 ＯＨ：Ｈ
2 Ｏ（１：２：０．８）混合物を使用して３７℃で２時
間撹拌することによって、抽出した。次いで再度遠心分
離し、上澄液を分離した。上記両方の上澄液を混合し、
次いで濃縮乾燥させて、各腫瘍の総脂質混合物を得た。
この総脂質混合物を、ＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ3 ＯＨ（９：
１）５ｍＬ中に溶解し、フェニル−セファロース カラ
ム（２ｍＬ）に通し、同一溶剤混合物３容量により、次
いでＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ3 ＯＨ（８５：１５）により洗浄
した。その後に、ガングリオシドを、ＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ
3 ＯＨ（１：１）５容量およびＣＨ3 ＯＨ５容量により
溶出した。
2 Ｏ（１：２：０．８）混合物を使用して３７℃で２時
間撹拌することによって、抽出した。次いで再度遠心分
離し、上澄液を分離した。上記両方の上澄液を混合し、
次いで濃縮乾燥させて、各腫瘍の総脂質混合物を得た。
この総脂質混合物を、ＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ3 ＯＨ（９：
１）５ｍＬ中に溶解し、フェニル−セファロース カラ
ム（２ｍＬ）に通し、同一溶剤混合物３容量により、次
いでＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ3 ＯＨ（８５：１５）により洗浄
した。その後に、ガングリオシドを、ＣＣｌ3 Ｈ：ＣＨ
3 ＯＨ（１：１）５容量およびＣＨ3 ＯＨ５容量により
溶出した。
【００４４】この腫瘍ガングリオシド混合物の各試料を
Ｓｏｎｎｉｎｏらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、１２８（１９８３）１０４−１１４）によりＨＰ
ＴＬＣおよび２ｄ−ＨＰＴＬＣによって試験した。主要
ガングリオシドの相対量は、デンシトメーターにより評
価した。得られた結果は、乳房腫瘍に存在する主要ガン
グリオシドは、ＧＭ3 （平均：３５６．４ｎｇ／ｍｇ蛋
白質）およびＧＤ3 （平均：１３３．１ｎｇ／ｍｇ蛋白
質）であり、ＧＤ1aおよびＧＴ1bがこれに続くことを示
した。正常乳房組織におけるＧＭ3 およびＧＤ3 の発現
は、乳房腫瘍における発現に比較して、低い（それぞれ
平均：１８３．５ｎｇ／ｍｇ蛋白質および４８．６ｎｇ
／ｍｇ蛋白質）。
Ｓｏｎｎｉｎｏらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、１２８（１９８３）１０４−１１４）によりＨＰ
ＴＬＣおよび２ｄ−ＨＰＴＬＣによって試験した。主要
ガングリオシドの相対量は、デンシトメーターにより評
価した。得られた結果は、乳房腫瘍に存在する主要ガン
グリオシドは、ＧＭ3 （平均：３５６．４ｎｇ／ｍｇ蛋
白質）およびＧＤ3 （平均：１３３．１ｎｇ／ｍｇ蛋白
質）であり、ＧＤ1aおよびＧＴ1bがこれに続くことを示
した。正常乳房組織におけるＧＭ3 およびＧＤ3 の発現
は、乳房腫瘍における発現に比較して、低い（それぞれ
平均：１８３．５ｎｇ／ｍｇ蛋白質および４８．６ｎｇ
／ｍｇ蛋白質）。
【００４５】乳房腫瘍に存在する微量ガングリオシドの
８３ｇの塊を集め、その特徴をまた試験した。この腫瘍
塊は、前記と同様に処理し、そして抽出した。ガングリ
オシドの総混合物を、ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌで
イオン交換クロマトグラフイに付し、そして総酸フラク
ションは、勾配溶剤系を用いてＱ−セファロースカラム
におけるクロマトグラフイに再度、付し、９フラクショ
ンを得た。２ｄ−ＨＰＴＬＣによるクロマトグラフイ試
験を、ＦＡＢ−ＭＳおよびＯ−アセチル化ガングリオシ
ドに対して特異性のモノクローナル抗体を用いるＴＬＣ
免疫染色試験と組み合わせると、被験試料中のＯＡｃＧ
Ｄ3 およびＯＡｃＧＴ 3 の存在を検出することができ
る。
８３ｇの塊を集め、その特徴をまた試験した。この腫瘍
塊は、前記と同様に処理し、そして抽出した。ガングリ
オシドの総混合物を、ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌで
イオン交換クロマトグラフイに付し、そして総酸フラク
ションは、勾配溶剤系を用いてＱ−セファロースカラム
におけるクロマトグラフイに再度、付し、９フラクショ
ンを得た。２ｄ−ＨＰＴＬＣによるクロマトグラフイ試
験を、ＦＡＢ−ＭＳおよびＯ−アセチル化ガングリオシ
ドに対して特異性のモノクローナル抗体を用いるＴＬＣ
免疫染色試験と組み合わせると、被験試料中のＯＡｃＧ
Ｄ3 およびＯＡｃＧＴ 3 の存在を検出することができ
る。
【００４６】乳房腫瘍のガングリオシド混合物中のＮＧ
ｃＧＭ3 以外の同一のＲｆを有するバンドの存在もまた
検出することができた。Ｈ−Ｄ抗原と反応する抗体を使
用するＴＬＣ免疫染色試験は、さらに別の２種のグリコ
リル化ガングリオシドの存在を示した。このＴＬＣ免疫
染色試験は、Ｈ−Ｄおよび１０個の各腫瘍から得たガン
グリオシドの混合物に対する抗−ＯＡｃガングリオシド
ｍＡｂの両方を使用して行った。結果を表Ｉに示す。乳
癌における、各種タイプの脂質結合シアル酸の相対量
を、４つの腫瘍で試験した。
ｃＧＭ3 以外の同一のＲｆを有するバンドの存在もまた
検出することができた。Ｈ−Ｄ抗原と反応する抗体を使
用するＴＬＣ免疫染色試験は、さらに別の２種のグリコ
リル化ガングリオシドの存在を示した。このＴＬＣ免疫
染色試験は、Ｈ−Ｄおよび１０個の各腫瘍から得たガン
グリオシドの混合物に対する抗−ＯＡｃガングリオシド
ｍＡｂの両方を使用して行った。結果を表Ｉに示す。乳
癌における、各種タイプの脂質結合シアル酸の相対量
を、４つの腫瘍で試験した。
【００４７】この目的には、各ガングリオシドの混合物
を、１００℃において、 ０．５％ＨＣｌ／ＭｅＯＨ中
でメタノール分解に付した。試料を、Ｎ2 雰囲気の下に
乾燥させ、フェニル−α−Ｎ−アセチルグルコースアミ
ニド０．５μｇを内部標準として添加した。試料は次い
で、無水酢酸：ピリジン（１：１）の混合物中で、１０
０℃において３０分間アセチル化した。過剰の無水酢酸
をＭｅＯＨとの蒸発により除去した後に、試料をＣＣｌ
3 Ｈ中に溶解し、次いでＯＶ−１７カラム（０．２５ｍ
ｍ×５ｍ）を供えたＪｅｏｌＤＸ−３０４装置で、電子
衝撃モードを用いて、ＧＣ／ＭＳに付した。このカラム
の温度は２２８℃であり、そしてインジェクターの温度
は２６０℃であった。使用したキャリア気体は、０．５
ｍＬ／分のＨｅであった。この結果を表ＩＩに示す。
を、１００℃において、 ０．５％ＨＣｌ／ＭｅＯＨ中
でメタノール分解に付した。試料を、Ｎ2 雰囲気の下に
乾燥させ、フェニル−α−Ｎ−アセチルグルコースアミ
ニド０．５μｇを内部標準として添加した。試料は次い
で、無水酢酸：ピリジン（１：１）の混合物中で、１０
０℃において３０分間アセチル化した。過剰の無水酢酸
をＭｅＯＨとの蒸発により除去した後に、試料をＣＣｌ
3 Ｈ中に溶解し、次いでＯＶ−１７カラム（０．２５ｍ
ｍ×５ｍ）を供えたＪｅｏｌＤＸ−３０４装置で、電子
衝撃モードを用いて、ＧＣ／ＭＳに付した。このカラム
の温度は２２８℃であり、そしてインジェクターの温度
は２６０℃であった。使用したキャリア気体は、０．５
ｍＬ／分のＨｅであった。この結果を表ＩＩに示す。
【００４８】
【表１】ヒト乳房腫瘍から単離された総ガングリオシド
フラクション中のＨ−Ｄ抗原の存在
フラクション中のＨ−Ｄ抗原の存在
【００４９】表Ｉの注： （ａ）Ｈ−Ｄ抗体によるＴＬＣ−免疫染色。 （ｂ）７３０５、３７３５、３７８２等が各ヒト乳房腫
瘍試料である。 （ｃ）ＮＧＮＡ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎ−グ
リコリル）。 （ｄ）Ｕ１およびＵ２：未知のＮ−グリコリル化ガング
リオシド（Ｎ−グリコリル化）。 （ｅ）＋：低反応性；＋＋＋：中程度の反応性；＋＋＋
＋：高反応性；−：非反応性。
瘍試料である。 （ｃ）ＮＧＮＡ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎ−グ
リコリル）。 （ｄ）Ｕ１およびＵ２：未知のＮ−グリコリル化ガング
リオシド（Ｎ−グリコリル化）。 （ｅ）＋：低反応性；＋＋＋：中程度の反応性；＋＋＋
＋：高反応性；−：非反応性。
【００５０】
【表２】表ＩＩ：シアル酸種の分析（組成）
【００５１】表ＩＩの注： （ａ）３８４９、３４６４、３９３１、３８０６等が各
腫瘍試料である（表Ｉ参照）。 （ｂ）ＮＡＮＡ：Ｎ−アセチルノイラミン酸 ＮＧＮＡ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸 ＯＡｃＮＡＮＡ：Ｏ−アセチルＮ−アセチルノイラミン
酸 （ｃ）これらの数値は、総脂質結合シアル酸のパーセン
トである。
腫瘍試料である（表Ｉ参照）。 （ｂ）ＮＡＮＡ：Ｎ−アセチルノイラミン酸 ＮＧＮＡ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸 ＯＡｃＮＡＮＡ：Ｏ−アセチルＮ−アセチルノイラミン
酸 （ｃ）これらの数値は、総脂質結合シアル酸のパーセン
トである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ルイス エンリケ フェルナンデツ モリ ナ キューバ国シウダッド デ ラ ハバナ, グアナバコア，ルプト．シバス，イー／ 10 ワイ 11，アベニュー テルセラ ナ ンバー 17 (72)発明者 ギルダ マルクィナ ロドリゲツ キューバ国シウダッド デ ラ ハバナ, プラザ，ヌエボ ベダド，アルトス，イー ／ 28 ワイ 30，アベニュー 25，ナン バー 1656 (72)発明者 アドリアナ カー ペレツ キューバ国シウダッド デ ラ ハバナ, 10 デ オクツブル，サントス スアレ ツ，イー／ ヘレディア ワイ アルカル デ オファリール，ラクレット ナンバー 155 (72)発明者 オスカー ゴンザロ バリエンテ ヘルナ ンデツ キューバ国シウダッド デ ラ ハバナ, プラヤ，イー／ １ラ． ワイ ５タ．, アプト 13，カルレ 172 ナンバー シ ー２
Claims (26)
- 【請求項１】 Ｎ−グリコリル化ガングリオシドに対す
る抗体免疫応答を刺激または増大させるためのワクチン
組成物であって、場合に応じて、適当な蛋白質または複
合蛋白質からなる担体に、非共有結合あるいは共有結合
によりカプリングさせた、Ｎ−グリコリル化ガングリオ
シド、および（または）その誘導体、および（または）
その相当するオリゴサッカリドの適量およびさらにいず
れか適当なアジュバントを含有するワクチン組成物。 - 【請求項２】 Ｎ−グリコリル化ガングリオシドが、Ｎ
−グリコリルＧＭ3（ＮＧｃＧＭ3 ）であることを特徴
とする、請求項１に記載のワクチン組成物。 - 【請求項３】 ＮＧｃＧＭ3 ガングリオシドおよび（ま
たは）その誘導体および（または）ＮＧｃＧＭ3 オリゴ
サッカリドの有効量が１０−４００μｇであることを特
徴とする、請求項１または２に記載のワクチン組成物。 - 【請求項４】 複合蛋白質として、ナイゼリア メニン
ギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ
ｉｓ）の外膜複合蛋白質（ＯＭＰＣ）を含有する、請求
項１ー３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。 - 【請求項５】 Ｎ．メニンギチジスのＯＭＰＣを、Ｎ−
グリコリル化ガングリオシドにより可溶化し、次いでス
ペーサー アームを使用して、これをＮ−グリコリル化
ガングリオシドオリゴサッカリドに共有結合によりカプ
リングさせることを特徴とする、請求項１ー４のいずれ
か１項に記載のワクチン組成物。 - 【請求項６】 担体蛋白質として、モノクローナル抗体
を含有することを特徴とする、請求項１または２に記載
のワクチン組成物。 - 【請求項７】 スペーサー アームを使用して、Ｎ−グ
リコリル化ガングリオシドオリゴサッカリドに共有結合
によって、モノクローナル抗体がカプリングされている
ことを特徴とする、請求項６に記載のワクチン組成物。 - 【請求項８】 スペーサー アームが、炭素原子３−１
０個を有する、飽和または不飽和ジアミンであることを
特徴とする、請求項５ー７のいずれか１項に記載のワク
チン組成物。 - 【請求項９】 アジュバントが、天然由来のアジュバン
ト、またはモノクローナル抗体であることを特徴とす
る、請求項４または５に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１０】 天然由来のアジュバントが、アルミニ
ウム塩からなることを特徴とする、請求項９に記載のワ
クチン組成物。 - 【請求項１１】 モノクローナル抗体が、Ｐ３であるこ
とを特徴とする、請求項９に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１２】 アジュバントが、天然由来のアジュバ
ント、またはモノクローナル抗体であることを特徴とす
る、請求項６ー８のいずれか１項に記載のワクチン組成
物。 - 【請求項１３】 天然由来のアジュバントが、ＱＳ２１
またはＤＥＴＯＸであることを特徴とする、請求項１２
に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１４】 天然由来のアジュバントが、アルミニ
ウム塩であることを特徴とする、請求項１２に記載のワ
クチン組成物。 - 【請求項１５】 精製ＧＭ3 ガングリオシドおよび（ま
たは）このガングリオシドの誘導体および（または）そ
の相当するオリゴサッカリドをさらに含有することを特
徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１６】 精製ＧＤ3 ガングリオシドおよび（ま
たは）このガングリオシドの誘導体および（または）そ
の相当するオリゴサッカリドをさらに含有することを特
徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１７】 ガングリオシドが、生物学的供給源か
ら精製されたものである、請求項１−１６のいずれか１
項に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１８】 生物学的供給源が、モノクローナル抗
体の工業的産生に使用されるハイブリドーマ バイオマ
スであることを特徴とする、請求項１７に記載のワクチ
ン組成物。 - 【請求項１９】 癌の予防および処置における、請求項
１−１４のいずれか１項に記載のワクチン組成物の使
用。 - 【請求項２０】 乳癌の予防および処置における、請求
項１９に記載のワクチン組成物の使用。 - 【請求項２１】 ＧＭ3 ガングリオシド、その誘導体お
よび（または）その相当するオリゴサッカリドに対する
免疫応答の刺激あるいは増大における、請求項１５に記
載のワクチン組成物の使用。 - 【請求項２２】 ＧＤ3 ガングリオシド、その誘導体お
よび（または）その相当するオリゴサッカリドに対する
免疫応答の刺激あるいは増大における、請求項１６に記
載のワクチン組成物の使用。 - 【請求項２３】 Ｎ−グリコリル化ガングリオシドある
いはそのオリゴサッカリドまたはその誘導体の有効量
を、適当なアジュバントとともに哺乳動物に投与するこ
とからなる、乳癌の処置方法。 - 【請求項２４】 ガングリオシドが、Ｎ−グリコリル−
ＧＭ3 である、請求項２３に記載の処置方法。 - 【請求項２５】 ガングリオシドを、１０−４００μｇ
／投与単位の量で投与する、請求項２４に記載の処置方
法。 - 【請求項２６】 ガングリオシドの製造方法であって、 ａ）ハイブリドーマを培養し、 ｂ）このハイブリドーマ バイオマスを単離し、 ｃ）ガングリオシド フラクションを抽出、および（ま
たは）単離する、工程からなる製造方法。
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