JPH0867696A - Ｈｐｖ１６タンパク質ｅ１およびｅ２の血清反応性領域 - Google Patents
Ｈｐｖ１６タンパク質ｅ１およびｅ２の血清反応性領域Info
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- JPH0867696A JPH0867696A JP4214489A JP21448992A JPH0867696A JP H0867696 A JPH0867696 A JP H0867696A JP 4214489 A JP4214489 A JP 4214489A JP 21448992 A JP21448992 A JP 21448992A JP H0867696 A JPH0867696 A JP H0867696A
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ヒトにおけるヒトパピローマウィルス（ＨＰ
Ｖ）１６に依存する腫瘍性疾患の予防、診断および治療
における手段を提供する。 【構成】 ＨＰＶ１６のタンパク質Ｅ１およびＥ２上の
それぞれ式１および式２のアミノ酸配列を有する血清反
応性領域。これらの領域を含むかかるペプチドを含むワ
クチン。これらの血清反応性領域を有するペプチドを含
む診断用組成物。
Ｖ）１６に依存する腫瘍性疾患の予防、診断および治療
における手段を提供する。 【構成】 ＨＰＶ１６のタンパク質Ｅ１およびＥ２上の
それぞれ式１および式２のアミノ酸配列を有する血清反
応性領域。これらの領域を含むかかるペプチドを含むワ
クチン。これらの血清反応性領域を有するペプチドを含
む診断用組成物。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトパピローマウイル
ス（ＨＰＶ）１６のタンパク質Ｅ１およびＥ２上の血清
反応性領域に関する。本発明は、血清反応性領域を含む
これらのペプチドを含むワクチンにも関する。本発明
は、同様に、血清反応性領域を有するペプチドを含む診
断用組成物を包含する。
ス（ＨＰＶ）１６のタンパク質Ｅ１およびＥ２上の血清
反応性領域に関する。本発明は、血清反応性領域を含む
これらのペプチドを含むワクチンにも関する。本発明
は、同様に、血清反応性領域を有するペプチドを含む診
断用組成物を包含する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＰＶ１６はヒトパピローマウイルスの
一つである［プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス、ユーエスエイ(Proc. Nat
l. Acad. Sci.,USA, 80, 3813-3815 (1983))］。ＨＰＶ
１６のゲノムの構成は、ウィロロジー(Virology)、145,
181-185 (1985) に記載されている。ＨＰＶのゲノム配
列は前侵襲性(preinvasive) および侵襲性の頸部腫瘍の
大半に検出することができる。ＨＰＶ１６は、これらの
腫瘍に顕著なウイルス型として世界中で同定されてい
る。ＨＰＶ１６ゲノムは、頸部腫瘍の５０％を上回る割
合において検出可能であり、この場合にはそれは細胞の
ＤＮＡ中に一体化して存在することが多い。ＨＰＶ１６
または他のパピローマウイルスに感染した後の免疫応答
については、ほとんど知られていない。
一つである［プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス、ユーエスエイ(Proc. Nat
l. Acad. Sci.,USA, 80, 3813-3815 (1983))］。ＨＰＶ
１６のゲノムの構成は、ウィロロジー(Virology)、145,
181-185 (1985) に記載されている。ＨＰＶのゲノム配
列は前侵襲性(preinvasive) および侵襲性の頸部腫瘍の
大半に検出することができる。ＨＰＶ１６は、これらの
腫瘍に顕著なウイルス型として世界中で同定されてい
る。ＨＰＶ１６ゲノムは、頸部腫瘍の５０％を上回る割
合において検出可能であり、この場合にはそれは細胞の
ＤＮＡ中に一体化して存在することが多い。ＨＰＶ１６
または他のパピローマウイルスに感染した後の免疫応答
については、ほとんど知られていない。
【０００３】
初期データー：頸部腫瘍に侵されている患者を、ウイル
スタンパク質に対する抗体の存在に関して健常人と比較
した。次いで、これらのウイルスタンパク質を各種の原
核生物ペプチドとそのＮ末端において融合生成物として
連結した後、ウェスターンブロットにおける抗原として
使用した。本発明の目的は、ヒトにおけるＨＰＶ１６に
依存する腫瘍性疾患の予防、診断および治療における手
段として用いることができるＨＰＶ１６のウイルス構造
を更に確認することである。かかる構造の同定は、ＨＰ
Ｖ１６の存在について多量のヒト血清を試験することが
できるＥＬＩＳＡの開発に必要欠くべからざるものであ
る。
スタンパク質に対する抗体の存在に関して健常人と比較
した。次いで、これらのウイルスタンパク質を各種の原
核生物ペプチドとそのＮ末端において融合生成物として
連結した後、ウェスターンブロットにおける抗原として
使用した。本発明の目的は、ヒトにおけるＨＰＶ１６に
依存する腫瘍性疾患の予防、診断および治療における手
段として用いることができるＨＰＶ１６のウイルス構造
を更に確認することである。かかる構造の同定は、ＨＰ
Ｖ１６の存在について多量のヒト血清を試験することが
できるＥＬＩＳＡの開発に必要欠くべからざるものであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】それ故、本発明は、下記
のアミノ酸配列
のアミノ酸配列
【化３】 の一つを有するＨＰＶ１６のＥ１タンパク質の血清反応
性領域、および下記のアミノ酸配列
性領域、および下記のアミノ酸配列
【化４】 の一つを有するＨＰＶ１６のＥ２タンパク質の血清反応
性領域を包含する。本発明は更に、前記に定義された血
清反応性領域の一つ以上を有するペプチド、前記に定義
されたペプチドの１種類以上を含むワクチン、ＨＰＶの
Ｅ１および／またはＥ２タンパク質に対する特異抗体を
同定するための診断用の組成物であって同様に前記に定
義されたペプチドを含むもの、およびＨＰＶ１６のＥ１
またはＥ２タンパク質の血清反応性領域の一つ以上に対
して親和性を有する単クローン性抗体、およびこれらの
単クローン性抗体を含む診断用の組成物をも包含する。
性領域を包含する。本発明は更に、前記に定義された血
清反応性領域の一つ以上を有するペプチド、前記に定義
されたペプチドの１種類以上を含むワクチン、ＨＰＶの
Ｅ１および／またはＥ２タンパク質に対する特異抗体を
同定するための診断用の組成物であって同様に前記に定
義されたペプチドを含むもの、およびＨＰＶ１６のＥ１
またはＥ２タンパク質の血清反応性領域の一つ以上に対
して親和性を有する単クローン性抗体、およびこれらの
単クローン性抗体を含む診断用の組成物をも包含する。
【０００５】ＨＰＶのタンパク質Ｅ１およびＥ２におけ
る血清反応性領域を同定するために、サイエンス(Scien
ce) 、228, 1315-1317 (1985) に記載の実験を再度行っ
た。超音波処理および部分ＤＮＡアーゼＩ処理によって
無作為に生成したサブゲノムＨＰＶ１６のＤＮＡフラグ
メントをファージベクターヒューズ１（fuse 1）にクロ
ーニングした後、ファージコートタンパク質の部分とし
て発現した。血清反応性ファージ組換体をＥ１およびＥ
２に対して調整した血清を用いて同定し、精製して、Ｈ
ＰＶ１６部分を配列決定することによって血清反応性領
域を特性決定した。ＨＰＶ１６Ｅ１ＭＳ２ポリメラーゼ
融合タンパク質に対する、およびＨＰＶ１６Ｅ２のアミ
ノ−およびカルボキシル−末端部分（別個、同様にＭＳ
２融合タンパク質）に対する多クローン性ウサギ血清を
調製した。
る血清反応性領域を同定するために、サイエンス(Scien
ce) 、228, 1315-1317 (1985) に記載の実験を再度行っ
た。超音波処理および部分ＤＮＡアーゼＩ処理によって
無作為に生成したサブゲノムＨＰＶ１６のＤＮＡフラグ
メントをファージベクターヒューズ１（fuse 1）にクロ
ーニングした後、ファージコートタンパク質の部分とし
て発現した。血清反応性ファージ組換体をＥ１およびＥ
２に対して調整した血清を用いて同定し、精製して、Ｈ
ＰＶ１６部分を配列決定することによって血清反応性領
域を特性決定した。ＨＰＶ１６Ｅ１ＭＳ２ポリメラーゼ
融合タンパク質に対する、およびＨＰＶ１６Ｅ２のアミ
ノ−およびカルボキシル−末端部分（別個、同様にＭＳ
２融合タンパク質）に対する多クローン性ウサギ血清を
調製した。
【０００６】線状ファージは、３種類の群ｆ１、ｆｄお
よびＭ１３を包含する。ファージの結合および取り込み
は細菌のＦ繊毛を介して起こり、すなわちＦ＋株のみが
感染することができるということはこれら総てに共通し
ている。ｆｄ野生型ファージであって用いられるベクタ
ー系がこれに由来するものは、大きさが約９００×６nm
であり、特に主要なコートタンパク質の約２７００のサ
ブユニットから成る粒子を形成する。更に、それぞれの
場合に、微量のコートタンパク質ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐ
ＶＩＩおよびｐＩＸの５分子が、ビリオンの両端に配置
される。ｆｄ野生型の場合には、一本鎖の環状ファージ
ゲノムは、大きさが６４０８ｂｐであり、１０種類の異
なるタンパク質の全体に対する情報を持っている。
よびＭ１３を包含する。ファージの結合および取り込み
は細菌のＦ繊毛を介して起こり、すなわちＦ＋株のみが
感染することができるということはこれら総てに共通し
ている。ｆｄ野生型ファージであって用いられるベクタ
ー系がこれに由来するものは、大きさが約９００×６nm
であり、特に主要なコートタンパク質の約２７００のサ
ブユニットから成る粒子を形成する。更に、それぞれの
場合に、微量のコートタンパク質ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐ
ＶＩＩおよびｐＩＸの５分子が、ビリオンの両端に配置
される。ｆｄ野生型の場合には、一本鎖の環状ファージ
ゲノムは、大きさが６４０８ｂｐであり、１０種類の異
なるタンパク質の全体に対する情報を持っている。
【０００７】ｆｄ誘導体ヒューズ１、ヒューズ２（パー
ムレイ(Parmley) およびスミス(Smith) 、ジーン(Gen
e)、7, 305-318 (1988) ）およびヒューズｍｍにおい
て、テトラサイクリン耐性遺伝子を、Ｔｎ１０トランス
ポゾンの一部の挿入によってファージゲノムに組み込
み、それはこの方法によって約９．２ｋｂｐに拡大され
たものである。これは、複製ＤＮＡの二本鎖ファージゲ
ノムは、細菌中で選択可能なプラスミドのように挙動
し、したがって調製してクローニングに用いることがで
きることを意味する。野生型からのもう一つの修飾は、
発現可能なＤＮＡフラグメントをクローニングするため
の挿入制限部位と共に微量のコートタンパク質ｐＩＩＩ
に対する遺伝子におけるリーディングフレーム変異の存
在である。ｐＩＩＩに対する遺伝子は２つのほとんど完
全に独立なドメイン（クリスマン(Crissmann) およびス
ミス(Smith) 、1984）、すなわちファージの細菌の細胞
レセプター（Ｆ繊毛）への結合を媒介するＮ−末端ドメ
インおよびファージの形態形成にとって重要なＣ−末端
タンパク質ドメインから成っている。タンパク質のシグ
ナル配列の直ぐ後に配置されているリーディングフレー
ム変異によって、遺伝子が不活性化され、したがって感
染粒子の形成が防止される。これは、プラスミドとして
のこれらのファージ突然変異体の複製に重要であるが、
形態形成において不活性化されたｆｄゲノムは宿主細菌
を損なわないからである（スミス(Smith) 著：ベクタ
ー、分子クローニングベクターおよびそれらの使用の概
説、バターワース・パブリッシャーズ(Butterworth Pub
lishers)、ストーンハム、マサチューセッツ、６１〜８
５頁、１９８７年）。
ムレイ(Parmley) およびスミス(Smith) 、ジーン(Gen
e)、7, 305-318 (1988) ）およびヒューズｍｍにおい
て、テトラサイクリン耐性遺伝子を、Ｔｎ１０トランス
ポゾンの一部の挿入によってファージゲノムに組み込
み、それはこの方法によって約９．２ｋｂｐに拡大され
たものである。これは、複製ＤＮＡの二本鎖ファージゲ
ノムは、細菌中で選択可能なプラスミドのように挙動
し、したがって調製してクローニングに用いることがで
きることを意味する。野生型からのもう一つの修飾は、
発現可能なＤＮＡフラグメントをクローニングするため
の挿入制限部位と共に微量のコートタンパク質ｐＩＩＩ
に対する遺伝子におけるリーディングフレーム変異の存
在である。ｐＩＩＩに対する遺伝子は２つのほとんど完
全に独立なドメイン（クリスマン(Crissmann) およびス
ミス(Smith) 、1984）、すなわちファージの細菌の細胞
レセプター（Ｆ繊毛）への結合を媒介するＮ−末端ドメ
インおよびファージの形態形成にとって重要なＣ−末端
タンパク質ドメインから成っている。タンパク質のシグ
ナル配列の直ぐ後に配置されているリーディングフレー
ム変異によって、遺伝子が不活性化され、したがって感
染粒子の形成が防止される。これは、プラスミドとして
のこれらのファージ突然変異体の複製に重要であるが、
形態形成において不活性化されたｆｄゲノムは宿主細菌
を損なわないからである（スミス(Smith) 著：ベクタ
ー、分子クローニングベクターおよびそれらの使用の概
説、バターワース・パブリッシャーズ(Butterworth Pub
lishers)、ストーンハム、マサチューセッツ、６１〜８
５頁、１９８７年）。
【０００８】好適なＤＮＡフラグメントの挿入および遺
伝子ＩＩＩの修復により、感染性ファージ粒子であって
それらのコート上に追加のアミノ酸配列を有するものが
形成される。これらの配列は、天然の状態のファージで
は各種のリガンド、例えば抗体に接近することができ
る。
伝子ＩＩＩの修復により、感染性ファージ粒子であって
それらのコート上に追加のアミノ酸配列を有するものが
形成される。これらの配列は、天然の状態のファージで
は各種のリガンド、例えば抗体に接近することができ
る。
【０００９】本発明に用いられるｆｄ発現系は、本質的
には、遺伝子ＩＩＩ中へのＤＮＡ外来配列をクローニン
グし、血清反応性組換体に対する単クローン性または多
クローン性血清の助けによりこの遺伝子ＩＩＩを検討す
ることによってファージバンクを設定することに基づい
ている。増幅は、通常はこれらの発現バンクの調製時に
起こる。個々のクローンのこの複製の程度は、次に、挿
入されたＤＮＡ配列の性状および大きさによって変わ
る。このことは、異なるクローンは頻度が異なり、１０
の数十乗まで異なることがある。それ故、ｆｄ発現バン
クの下記の２つの特徴を前記した特性から誘導すること
ができる。免疫スクリーニングによって単離された同一
のファージクローンの反復クローニングを生じるバンク
の増幅。活性状態のファージを結合し且つ再度溶出する
ことができることによる、アフィニティクロマトグラフ
ィ（カラム）による血清反応性ファージの豊富化の可能
性。
には、遺伝子ＩＩＩ中へのＤＮＡ外来配列をクローニン
グし、血清反応性組換体に対する単クローン性または多
クローン性血清の助けによりこの遺伝子ＩＩＩを検討す
ることによってファージバンクを設定することに基づい
ている。増幅は、通常はこれらの発現バンクの調製時に
起こる。個々のクローンのこの複製の程度は、次に、挿
入されたＤＮＡ配列の性状および大きさによって変わ
る。このことは、異なるクローンは頻度が異なり、１０
の数十乗まで異なることがある。それ故、ｆｄ発現バン
クの下記の２つの特徴を前記した特性から誘導すること
ができる。免疫スクリーニングによって単離された同一
のファージクローンの反復クローニングを生じるバンク
の増幅。活性状態のファージを結合し且つ再度溶出する
ことができることによる、アフィニティクロマトグラフ
ィ（カラム）による血清反応性ファージの豊富化の可能
性。
【００１０】別々に設定したバンクを用いることによ
り、同一の組換体の反復単離がさけられ、同様に且つ平
行して調製されるＤＮＡフラグメントのクローニングの
確率或いはそこから誘導されるファージ組換体の確率が
極めて低くなった。
り、同一の組換体の反復単離がさけられ、同様に且つ平
行して調製されるＤＮＡフラグメントのクローニングの
確率或いはそこから誘導されるファージ組換体の確率が
極めて低くなった。
【００１１】本発明では、ヒューズ１におけるＨＰＶ１
６ＤＮＡに対して総数が１１個の異なる発現バンクを設
定した。主要なテトラサイクリン耐性で且つインサート
を有する組換体の数は、この場合にはバンク当たり２０
００〜９００００であった。剪断された形態での約４ｋ
ｂのベクター部分と８ｋｂのＨＰＶ部分とから成る完全
なプラスミドを常にクローニングに用いたので、ＨＰＶ
を含有するｆｄ組換体は約３０％減少した。次いで、ク
ローニングしたフラグメントを、前記のように遺伝子Ｉ
ＩＩコートタンパク質の融合タンパク質として発現させ
た。この場合の遺伝子ＩＩＩのクローニング部位は、タ
ンパク質輸送(protein export)のための翻訳シグナル配
列の直ぐ後ろである。遺伝子の機能を回復するには、イ
ンサートが画定された大きさ（３ｎ＋２；ｎ＝０、１、
２、３、・・・）を有する必要がある。画定されたタン
パク質配列を遺伝子ＩＩＩの融合タンパク質として発現
するには、更に３′および５′結合が正確なリーディン
グフレームにあり、対応するインサートが正確な配向で
存在している必要がある。それ故、これは、全体的にみ
て、ほぼ１８番目（３×３×２）のＨＰＶ ＤＮＡを含
む組換体に適合する。その小さな部分は、インサート中
に存在する翻訳停止コドンによってまたは折り畳みのた
めに機能しないタンパク質によって不活性化する。前記
のパラメーターのために、ファージバンクにおけるｆｄ
融合タンパク質としてＨＰＶゲノムの任意の必要な部分
を大きな確率で発現する必要がある組換体の最少限の数
を計算することは困難である。パピローマウイルスで
は、約１０ｋｂのゲノム（部分的にオープンリーディン
グフレームと重複することによる）がタンパク質をコー
ドする。２０００のテトラサイクリン耐性インサートを
有する組換体のうち、約１００（１／１８）のクローン
が好適なやり方でＨＰＶ配列を発現する。平均ＨＰＶフ
ラグメントの大きさが５０〜１５０ｂｐでは、発現され
たＨＰＶ配列は約５０００〜１５０００ｂｐに達する。
実際に、約２０００の組換体を有するｆｄバンクは、十
分に典型的であることが判っている。
６ＤＮＡに対して総数が１１個の異なる発現バンクを設
定した。主要なテトラサイクリン耐性で且つインサート
を有する組換体の数は、この場合にはバンク当たり２０
００〜９００００であった。剪断された形態での約４ｋ
ｂのベクター部分と８ｋｂのＨＰＶ部分とから成る完全
なプラスミドを常にクローニングに用いたので、ＨＰＶ
を含有するｆｄ組換体は約３０％減少した。次いで、ク
ローニングしたフラグメントを、前記のように遺伝子Ｉ
ＩＩコートタンパク質の融合タンパク質として発現させ
た。この場合の遺伝子ＩＩＩのクローニング部位は、タ
ンパク質輸送(protein export)のための翻訳シグナル配
列の直ぐ後ろである。遺伝子の機能を回復するには、イ
ンサートが画定された大きさ（３ｎ＋２；ｎ＝０、１、
２、３、・・・）を有する必要がある。画定されたタン
パク質配列を遺伝子ＩＩＩの融合タンパク質として発現
するには、更に３′および５′結合が正確なリーディン
グフレームにあり、対応するインサートが正確な配向で
存在している必要がある。それ故、これは、全体的にみ
て、ほぼ１８番目（３×３×２）のＨＰＶ ＤＮＡを含
む組換体に適合する。その小さな部分は、インサート中
に存在する翻訳停止コドンによってまたは折り畳みのた
めに機能しないタンパク質によって不活性化する。前記
のパラメーターのために、ファージバンクにおけるｆｄ
融合タンパク質としてＨＰＶゲノムの任意の必要な部分
を大きな確率で発現する必要がある組換体の最少限の数
を計算することは困難である。パピローマウイルスで
は、約１０ｋｂのゲノム（部分的にオープンリーディン
グフレームと重複することによる）がタンパク質をコー
ドする。２０００のテトラサイクリン耐性インサートを
有する組換体のうち、約１００（１／１８）のクローン
が好適なやり方でＨＰＶ配列を発現する。平均ＨＰＶフ
ラグメントの大きさが５０〜１５０ｂｐでは、発現され
たＨＰＶ配列は約５０００〜１５０００ｂｐに達する。
実際に、約２０００の組換体を有するｆｄバンクは、十
分に典型的であることが判っている。
【００１２】免疫スクリーニングの特異性を確保するた
めに、血清反応性領域の数種類の異なる組換体または少
なくとも数種類の同一であるが独立に単離されたファー
ジ組換体を常に単離した。
めに、血清反応性領域の数種類の異なる組換体または少
なくとも数種類の同一であるが独立に単離されたファー
ジ組換体を常に単離した。
【００１３】図２〜５におけるアミノ酸位置指標は、以
後Ｅ１およびＥ２タンパク質に関するものであり、オー
プンリーディングフレームの位置に関するものではな
い。第一のメチオニンを位置１に示した。
後Ｅ１およびＥ２タンパク質に関するものであり、オー
プンリーディングフレームの位置に関するものではな
い。第一のメチオニンを位置１に示した。
【００１４】
【実施例】例１ ＨＰＶ１６Ｅ１に対する多クローン性抗血清の調製 ＨＰＶ１６ｆｄ発現バンクから血清反応性のファージ組
換体を単離するために、最初にＨＰＶ１６Ｅ１ ＭＳ２
融合タンパク質に対する多クローン性ウサギ血清を調製
した。このために、ＨＰＶ１６のＰｓｔＩＡフラグメン
ト（ｂｐ８７５〜３６９３）を発現ベクターｐＥＸ１２
マー（mer ）のＰｓｔＩ開裂部位にクローニングし（シ
ードルフ(Seedorf) ら、エンボ・ジャーナル(EMBO J.)
、6, 139-144, 1987）、これによってＨＰＶ１６Ｅ１
ＯＲＦのアミノ酸５〜６４９を発現した（図１）。こ
のベクターは、ＭＳ２ポリメラーゼ部分の後ろのｐＵＣ
８ポリリンカーの挿入によって修飾されたプラスミドｐ
ＰＬＣ２４（レマウト(Remaut)ら、ジーン(Gene)、15,
81-93, 1981 ）の誘導体である。融合タンパク質は、温
度誘導可能ラムダｐＬプロモーターによってｐＥＸ１２
マーに転写される。ＭＳ２タンパク質のＮ−末端融合部
分は、１００個のアミノ酸に達する。元のＨＰＶ１６単
離物（シードルフ(Seedorf) ら、ウイロロジー(Virolog
y)、145, 181-185, 1985）はＥ１オープンリーディング
フレーム（ヌクレオチド位置１１３８）の領域にリーデ
ィングフレーム突然変異を有するので、完全なＥ１ＯＲ
Ｆを有する頸部腫瘍からのＨＰＶ１６単離物を用いた。
選択された制限開裂のために、ＨＰＶ１６Ｅ１オープン
リーディングフレーム (ｂｐ８６５〜２８１１）は、３
種類のＮ−末端アミノ酸とは別に完全に発現する。クロ
ーニングおよびプラスミド分析は、最初は、ラムダプロ
モーターのリプレッサーが構成的に発現する大腸菌Ｗ６
株を用いて行った。これによって、融合タンパク質の発
現が防止され、形質転換の後の逆選択が防止された。制
限分析によりクローニングを検討し、放射能標識したＨ
ＰＶ１６ＤＮＡ（ＰｓｔＩＡフラグメント）でのサザン
ブロットハイブリッド形成を行った後、構成体のプラス
ミドＤＮＡを用いて大腸菌Ｎ６０４５で形質転換を行っ
た。この株は、ラムダプロモーターのその温度感受性リ
プレッサーのために、ＭＳ２融合タンパク質を発現する
ことができる。ウェスターンブロットにおいて、融合タ
ンパク質のＭＳ２部分に対する単クローン性抗体を用い
て、誘発および非誘発細菌からの抽出物を比較すること
により、融合タンパク質の大きさおよび発現速度を検討
することができた。ＭＳ２Ｅ１融合タンパク質のバンド
は約９０ｋＤの予想した大きさに相当するので配列決定
によるクローニング結合の検討は行わなかった。ＨＰＶ
１６ＰｓｔＩＡフラグメントの２つの他のリーディング
フレームでは、より大きなタンパク質の発現は翻訳停止
コドンが存在するため不可能である。また、ベクター−
インサート結合の両方のＰｓｔＩ開裂部位は保持され
た。Ｅ１オープンリーディングフレームの正確な発現は
ＨＰＶ１６ｆｄ発現バンクの免疫スクリーニングの結果
によって確かめられ、このことは下記において説明され
る。次に、ＭＳ２−Ｅ１融合タンパク質を、分別抽出お
よびＳＤＳポリアクリルアミドゲルからの電気溶出によ
って、誘導大腸菌培養物から精製した後、２匹のウサギ
を免疫するのに用いた。
換体を単離するために、最初にＨＰＶ１６Ｅ１ ＭＳ２
融合タンパク質に対する多クローン性ウサギ血清を調製
した。このために、ＨＰＶ１６のＰｓｔＩＡフラグメン
ト（ｂｐ８７５〜３６９３）を発現ベクターｐＥＸ１２
マー（mer ）のＰｓｔＩ開裂部位にクローニングし（シ
ードルフ(Seedorf) ら、エンボ・ジャーナル(EMBO J.)
、6, 139-144, 1987）、これによってＨＰＶ１６Ｅ１
ＯＲＦのアミノ酸５〜６４９を発現した（図１）。こ
のベクターは、ＭＳ２ポリメラーゼ部分の後ろのｐＵＣ
８ポリリンカーの挿入によって修飾されたプラスミドｐ
ＰＬＣ２４（レマウト(Remaut)ら、ジーン(Gene)、15,
81-93, 1981 ）の誘導体である。融合タンパク質は、温
度誘導可能ラムダｐＬプロモーターによってｐＥＸ１２
マーに転写される。ＭＳ２タンパク質のＮ−末端融合部
分は、１００個のアミノ酸に達する。元のＨＰＶ１６単
離物（シードルフ(Seedorf) ら、ウイロロジー(Virolog
y)、145, 181-185, 1985）はＥ１オープンリーディング
フレーム（ヌクレオチド位置１１３８）の領域にリーデ
ィングフレーム突然変異を有するので、完全なＥ１ＯＲ
Ｆを有する頸部腫瘍からのＨＰＶ１６単離物を用いた。
選択された制限開裂のために、ＨＰＶ１６Ｅ１オープン
リーディングフレーム (ｂｐ８６５〜２８１１）は、３
種類のＮ−末端アミノ酸とは別に完全に発現する。クロ
ーニングおよびプラスミド分析は、最初は、ラムダプロ
モーターのリプレッサーが構成的に発現する大腸菌Ｗ６
株を用いて行った。これによって、融合タンパク質の発
現が防止され、形質転換の後の逆選択が防止された。制
限分析によりクローニングを検討し、放射能標識したＨ
ＰＶ１６ＤＮＡ（ＰｓｔＩＡフラグメント）でのサザン
ブロットハイブリッド形成を行った後、構成体のプラス
ミドＤＮＡを用いて大腸菌Ｎ６０４５で形質転換を行っ
た。この株は、ラムダプロモーターのその温度感受性リ
プレッサーのために、ＭＳ２融合タンパク質を発現する
ことができる。ウェスターンブロットにおいて、融合タ
ンパク質のＭＳ２部分に対する単クローン性抗体を用い
て、誘発および非誘発細菌からの抽出物を比較すること
により、融合タンパク質の大きさおよび発現速度を検討
することができた。ＭＳ２Ｅ１融合タンパク質のバンド
は約９０ｋＤの予想した大きさに相当するので配列決定
によるクローニング結合の検討は行わなかった。ＨＰＶ
１６ＰｓｔＩＡフラグメントの２つの他のリーディング
フレームでは、より大きなタンパク質の発現は翻訳停止
コドンが存在するため不可能である。また、ベクター−
インサート結合の両方のＰｓｔＩ開裂部位は保持され
た。Ｅ１オープンリーディングフレームの正確な発現は
ＨＰＶ１６ｆｄ発現バンクの免疫スクリーニングの結果
によって確かめられ、このことは下記において説明され
る。次に、ＭＳ２−Ｅ１融合タンパク質を、分別抽出お
よびＳＤＳポリアクリルアミドゲルからの電気溶出によ
って、誘導大腸菌培養物から精製した後、２匹のウサギ
を免疫するのに用いた。
【００１５】例２ ＨＰＶ１６Ｅ１タンパク質上の血清反応性領域の同定 ＨＰＶ１６Ｅ１に対して調製した多クローン性のウサギ
血清を両方とも用いて、反応性組換体に対する５種類の
異なるＨＰＶ１６ｆｄ発現バンクを検討した。この方法
で、非重複ファージクローンによって表わされる少なく
とも２種類の異なる抗体結合部位の総数を同定すること
が可能であった。全部で、１９の独立なファージクロー
ンであって７種類の異なる種類のＨＰＶ１６インサート
を含むものを単離した（図２）。６種類は、ＨＰＶ１６
Ｅ１特異的ペプチドＥＤＬＶＤＦＩＶＮＤをコードする
共通の重複領域を有する。Ｅ１タンパク質上の第二の同
定されたエピトープは、Ｅ１ペプチドＧＳＰＬＳＤＩＳ
をコードする組換えファージ( クローン１０５９）によ
って表わされる。元のＨＰＶ１６単離物は、Ｅ１オープ
ンリーディングフレーム（ヌクレオチド位置１１３８）
にリーディングフレーム変異を有する。このＨＰＶ１６
単離物のＤＮＡを用いて、ｆｄ発現バンクを調製した。
単離した血清反応性ｆｄ組換体の２つは、この領域を含
み、それ故リーディングフレーム変異も有する。クロー
ン１１４５では、これによってリーディングフレームが
変化し、これによって３個のＨＰＶ１６−Ｅ２非特異的
アミノ酸（・・・ＶａｌＶａｌＨｉｓ）がＣ−末端付着
物となる。クローン１０５９は誤ったフレームで始ま
り。用いたＨＰＶ１６単離物のリーディングフレーム変
異によって正しいＨＰＶ１６Ｅ１リーディングフレーム
に転換される。クローンはペプチドＳＴＧＳＫＴＫＶＦ
ＧＳＰＬＫＳＤＩＳをコードするがその内のＣ−末端ア
ミノ酸・・・ＧＳＰＬＳＤＩＳのみが実際のＨＰＶ１６
Ｅ１タンパク質に由来し、エピトープを形成しなければ
ならない。リーディングフレーム変異を含む両クローン
は、ファージベクターの遺伝子ＩＩＩのリーディングフ
レームを回復するための正確なインサートの大きさ（３
ｎ＋２塩基対）を有する。
血清を両方とも用いて、反応性組換体に対する５種類の
異なるＨＰＶ１６ｆｄ発現バンクを検討した。この方法
で、非重複ファージクローンによって表わされる少なく
とも２種類の異なる抗体結合部位の総数を同定すること
が可能であった。全部で、１９の独立なファージクロー
ンであって７種類の異なる種類のＨＰＶ１６インサート
を含むものを単離した（図２）。６種類は、ＨＰＶ１６
Ｅ１特異的ペプチドＥＤＬＶＤＦＩＶＮＤをコードする
共通の重複領域を有する。Ｅ１タンパク質上の第二の同
定されたエピトープは、Ｅ１ペプチドＧＳＰＬＳＤＩＳ
をコードする組換えファージ( クローン１０５９）によ
って表わされる。元のＨＰＶ１６単離物は、Ｅ１オープ
ンリーディングフレーム（ヌクレオチド位置１１３８）
にリーディングフレーム変異を有する。このＨＰＶ１６
単離物のＤＮＡを用いて、ｆｄ発現バンクを調製した。
単離した血清反応性ｆｄ組換体の２つは、この領域を含
み、それ故リーディングフレーム変異も有する。クロー
ン１１４５では、これによってリーディングフレームが
変化し、これによって３個のＨＰＶ１６−Ｅ２非特異的
アミノ酸（・・・ＶａｌＶａｌＨｉｓ）がＣ−末端付着
物となる。クローン１０５９は誤ったフレームで始ま
り。用いたＨＰＶ１６単離物のリーディングフレーム変
異によって正しいＨＰＶ１６Ｅ１リーディングフレーム
に転換される。クローンはペプチドＳＴＧＳＫＴＫＶＦ
ＧＳＰＬＫＳＤＩＳをコードするがその内のＣ−末端ア
ミノ酸・・・ＧＳＰＬＳＤＩＳのみが実際のＨＰＶ１６
Ｅ１タンパク質に由来し、エピトープを形成しなければ
ならない。リーディングフレーム変異を含む両クローン
は、ファージベクターの遺伝子ＩＩＩのリーディングフ
レームを回復するための正確なインサートの大きさ（３
ｎ＋２塩基対）を有する。
【００１６】例３ ＨＰＶ１６Ｅ２に対する多クローン性抗血清の調製 ＨＰＶ１６Ｅ１オープンリーディングフレームの場合と
同様に、いずれの抗血清もＨＰＶ１６Ｅ２タンパク質に
利用することができなかった。このため、ＨＰＶ１６Ｅ
２オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド位置２
７５６〜３８５０；ＡＡ１〜３６５）は、Ｅ１タンパク
質について既述のようにベクターｐＥＸ１２マーで発現
した。最初に、ＨＰＶ１６ＤＮＡフラグメントを、位置
２７６１におけるＨｉｎｆＩ開裂部位を介してｐＥＸ１
２マーのベクターにクローニングした。この場合に、出
発材料は、予めサブクローニングしたＨＰＶ１６フラグ
メント（ｂｐ２３６７〜４４６７）であった。このフラ
グメントを再度、付加的に挿入した非−ＨＰＶ１６特異
性制限部位ＸｂａＩ（５′末端）およびＢａｍＨＩ
（３′末端）を介してベクターから切断して、調製し
た。次いで、大きさが２．１ｋｂ（ＸｂａＩ／ＢａｍＨ
Ｉ）のこのＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｆＩで部分的
に切断した。これによって、中でも３′−末端のＢａｍ
ＨＩ開裂部位とｂｐ２７６１におけるＨｉｎｆＩ部位の
間の大きさが１７００ｂｐのフラグメントが生じる。こ
のフラグメントの内部ＨｉｎｆＩ開裂部位（ｂｐ３５３
９）は開裂せず、ＨＰＶ１６Ｅ２ＯＲＦは３つのアミノ
末端アミノ酸とは完全に離れて存在している。調製の
後、Ｈｉｎｆ／Ｂａｍフラグメントを、ＢａｍＨＩで開
裂したｐＥＸ１２マー発現ベクターにクローニングし
た。これによって、適合したＢａｍＨＩ部位を介して、
ベクターおよびインサートの線形生成物が生じた。これ
らの生成物の遊離末端には、クレノウポリメラーゼが充
填されており、次に連結によって閉じられた。これによ
り、充填された開裂部位ＢａｍＨＩ（ベクター）とＨｉ
ｎｆＩ（Ｅ２インサート）で２つの制限部位を失ってＭ
Ｓ２−Ｅ２結合を生じた。ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩの二
重制限開裂を用いて、ＨＰＶ１６Ｅ２フラグメントを正
確な配向で有する組換体を同定することが可能であっ
た。大腸菌発現株６０４５に形質転換した後、ＭＳ２ポ
リメラーゼに対する単クローン性抗体を用いて、如何な
るＭＳ２融合タンパク質の生産を見出すこともできなか
った。ＭＳ２−Ｅ２結合においてリーディングフレーム
の置換を除外するため、総数が１６種類の異なるＭＳ２
−Ｅ２組換体のプラスミドＤＮＡをサザンブロットにお
いて正確なＢａｍＨＩ／ＨｉｎｆＩ結合由来のオリゴヌ
クレオチドとハイブリッド形成した。明白なハイブリッ
ド形成シグナルが１５のクローンで同定可能であったの
で、クローニングは正確なリーディングフレームで起こ
っていると考えられ、完全なＥ２ ＯＲＦの発現はｐＥ
Ｘベクターでは不可能である。或いは、ＨＰＶ１６Ｅ２
タンパク質を、次にｐＥＸ１２マーのベクターの半分ず
つで発現させた。
同様に、いずれの抗血清もＨＰＶ１６Ｅ２タンパク質に
利用することができなかった。このため、ＨＰＶ１６Ｅ
２オープンリーディングフレーム（ヌクレオチド位置２
７５６〜３８５０；ＡＡ１〜３６５）は、Ｅ１タンパク
質について既述のようにベクターｐＥＸ１２マーで発現
した。最初に、ＨＰＶ１６ＤＮＡフラグメントを、位置
２７６１におけるＨｉｎｆＩ開裂部位を介してｐＥＸ１
２マーのベクターにクローニングした。この場合に、出
発材料は、予めサブクローニングしたＨＰＶ１６フラグ
メント（ｂｐ２３６７〜４４６７）であった。このフラ
グメントを再度、付加的に挿入した非−ＨＰＶ１６特異
性制限部位ＸｂａＩ（５′末端）およびＢａｍＨＩ
（３′末端）を介してベクターから切断して、調製し
た。次いで、大きさが２．１ｋｂ（ＸｂａＩ／ＢａｍＨ
Ｉ）のこのＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｆＩで部分的
に切断した。これによって、中でも３′−末端のＢａｍ
ＨＩ開裂部位とｂｐ２７６１におけるＨｉｎｆＩ部位の
間の大きさが１７００ｂｐのフラグメントが生じる。こ
のフラグメントの内部ＨｉｎｆＩ開裂部位（ｂｐ３５３
９）は開裂せず、ＨＰＶ１６Ｅ２ＯＲＦは３つのアミノ
末端アミノ酸とは完全に離れて存在している。調製の
後、Ｈｉｎｆ／Ｂａｍフラグメントを、ＢａｍＨＩで開
裂したｐＥＸ１２マー発現ベクターにクローニングし
た。これによって、適合したＢａｍＨＩ部位を介して、
ベクターおよびインサートの線形生成物が生じた。これ
らの生成物の遊離末端には、クレノウポリメラーゼが充
填されており、次に連結によって閉じられた。これによ
り、充填された開裂部位ＢａｍＨＩ（ベクター）とＨｉ
ｎｆＩ（Ｅ２インサート）で２つの制限部位を失ってＭ
Ｓ２−Ｅ２結合を生じた。ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩの二
重制限開裂を用いて、ＨＰＶ１６Ｅ２フラグメントを正
確な配向で有する組換体を同定することが可能であっ
た。大腸菌発現株６０４５に形質転換した後、ＭＳ２ポ
リメラーゼに対する単クローン性抗体を用いて、如何な
るＭＳ２融合タンパク質の生産を見出すこともできなか
った。ＭＳ２−Ｅ２結合においてリーディングフレーム
の置換を除外するため、総数が１６種類の異なるＭＳ２
−Ｅ２組換体のプラスミドＤＮＡをサザンブロットにお
いて正確なＢａｍＨＩ／ＨｉｎｆＩ結合由来のオリゴヌ
クレオチドとハイブリッド形成した。明白なハイブリッ
ド形成シグナルが１５のクローンで同定可能であったの
で、クローニングは正確なリーディングフレームで起こ
っていると考えられ、完全なＥ２ ＯＲＦの発現はｐＥ
Ｘベクターでは不可能である。或いは、ＨＰＶ１６Ｅ２
タンパク質を、次にｐＥＸ１２マーのベクターの半分ず
つで発現させた。
【００１７】例４ ＨＰＶ１６Ｅ２のアミノ−末端領域の発現 ヌクレオチド位置２７６１と３２０９との間のＥ２オー
プンリーディングフレームのアミノ−末端領域をｐＥＸ
１２マーのベクターにクローニングして、発現させた。
Ｅ２オープンリーディングフレームはヌクレオチド位置
２７５６で開始するので、ＭＳ２−Ｅ２融合タンパク質
はＥ２タンパク質（図４）の最初の２個のアミノ酸（Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｕ）を欠いている。前記のクローニングから
得られるｐＥＸ１２マーおよびＨＰＶ１６Ｅ２から成る
プラスミドＤＮＡのカルボニル末端を、ＨｉｎｃＩＩ
（ＨＰＶ１６、ｂｐ３２０９）／ＢａｍＨＩフラグメン
トを欠失し、再連結（ＨｉｎｃＩＩおよびＢａｍＨＩか
らのブラント／フラッシュ（flush ））により切りつめ
た。これによって、ヌクレオチド位置２７６１（Ｈｉｎ
ｆＩ）と３２０９（ＨｉｎｃＩＩ）との間のＨＰＶ１６
Ｅ２のＮ−末端部分が発現する。大きさが約３０ｋＤの
融合タンパク質は、誘導細菌において、ウェスターンブ
ロット中で抗−ＭＳ２分子抗体で検出可能であった。融
合タンパク質を、誘導細菌溶解物の分別抽出およびクマ
シーブルーで染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルか
らのタンパク質バンドの電気溶出によって精製し、ウサ
ギを免疫するのに用いた。
プンリーディングフレームのアミノ−末端領域をｐＥＸ
１２マーのベクターにクローニングして、発現させた。
Ｅ２オープンリーディングフレームはヌクレオチド位置
２７５６で開始するので、ＭＳ２−Ｅ２融合タンパク質
はＥ２タンパク質（図４）の最初の２個のアミノ酸（Ｍ
ｅｔ−Ｇｌｕ）を欠いている。前記のクローニングから
得られるｐＥＸ１２マーおよびＨＰＶ１６Ｅ２から成る
プラスミドＤＮＡのカルボニル末端を、ＨｉｎｃＩＩ
（ＨＰＶ１６、ｂｐ３２０９）／ＢａｍＨＩフラグメン
トを欠失し、再連結（ＨｉｎｃＩＩおよびＢａｍＨＩか
らのブラント／フラッシュ（flush ））により切りつめ
た。これによって、ヌクレオチド位置２７６１（Ｈｉｎ
ｆＩ）と３２０９（ＨｉｎｃＩＩ）との間のＨＰＶ１６
Ｅ２のＮ−末端部分が発現する。大きさが約３０ｋＤの
融合タンパク質は、誘導細菌において、ウェスターンブ
ロット中で抗−ＭＳ２分子抗体で検出可能であった。融
合タンパク質を、誘導細菌溶解物の分別抽出およびクマ
シーブルーで染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルか
らのタンパク質バンドの電気溶出によって精製し、ウサ
ギを免疫するのに用いた。
【００１８】例５ ＨＰＶ１６Ｅ２のカルボキシ−末端領域の発現 ヌクレオチド位置３２０９と３８５０との間のＨＰＶ１
６Ｅ２オープンリーディングフレームのＣ−末端領域
を、ｐＥＸ１２マーのベクター（図３）で発現した。こ
の領域を、ＨＰＶ１６Ｅ２オープンリーディングフレー
ムの前記の発現アミノ−末端部分に直接結合させた。こ
のために、前記し且つ完全なＨＰＶ１６Ｅ２リーディン
グフレームを含むＸｂａ／Ｂａｍフラグメントを用い
た。制限開裂の後に、ＨＰＶ１６Ｅ２のカルボキシル−
末端の半分を含むＨｉｎｃＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメン
ト（ヌクレオチド位置３２０９〜４４６７）を単離し
た。このフラグメントを、ｐＥＸ１２マー発現ベクター
のＢａｍＨＩ開裂部位（５′ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｃＩＩ
−−ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ３′）に挿入した。抗−Ｍ
Ｓ２単クローン性抗体の助けによって、誘導細菌の抽出
物中で約３０ｋＤの融合タンパク質を同定することが可
能であり、これを分別抽出およびＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルからの電気溶出によって精製し、ウサギを免疫
するのに用いた。
６Ｅ２オープンリーディングフレームのＣ−末端領域
を、ｐＥＸ１２マーのベクター（図３）で発現した。こ
の領域を、ＨＰＶ１６Ｅ２オープンリーディングフレー
ムの前記の発現アミノ−末端部分に直接結合させた。こ
のために、前記し且つ完全なＨＰＶ１６Ｅ２リーディン
グフレームを含むＸｂａ／Ｂａｍフラグメントを用い
た。制限開裂の後に、ＨＰＶ１６Ｅ２のカルボキシル−
末端の半分を含むＨｉｎｃＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメン
ト（ヌクレオチド位置３２０９〜４４６７）を単離し
た。このフラグメントを、ｐＥＸ１２マー発現ベクター
のＢａｍＨＩ開裂部位（５′ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｃＩＩ
−−ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ３′）に挿入した。抗−Ｍ
Ｓ２単クローン性抗体の助けによって、誘導細菌の抽出
物中で約３０ｋＤの融合タンパク質を同定することが可
能であり、これを分別抽出およびＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルからの電気溶出によって精製し、ウサギを免疫
するのに用いた。
【００１９】例６ ＨＰＶ１６Ｅ２タンパク質上の血清反応性領域の同定 ｆｄＨＰＶ１６発現バンクの免疫スクリーニングに利用
可能なものは、全部で４種類の異なる抗−ＨＰＶ１６Ｅ
２抗血清であり、それぞれの場合に、アミノ−末端部分
に対する２種類の血清（ｂｐ２７６１〜３２０９；ＡＡ
３〜１５２）およびＥ２（ｂｐ３２０９〜３８５０；Ａ
Ａ１５３〜３６５）オープンリーディングフレームのカ
ルボキシル−末端部分に対する２種類であった。これら
の血清を用いて、血清反応性組換体の５種類の異なる発
現バンクを検討した。これによって全部で３２個のクロ
ーンが単離され、そのうちの２６個がＥ２タンパク質の
アミノ−末端配列を含んでいた。これらの２６個のクロ
ーンは、総数が１１の異なる種類であって、４種類の異
なる重複しない領域を表わすものを形成する。（図５） 総てのエピトープは、ヌクレオチド位置２７９２（Ａｓ
ｐＬｙｓＩｌｅ・・・）および３０５５（・・・Ｓｅｒ
ＬｅｕＧｌｕ）の間に配置されているＥ２オープンリー
ディングフレームのアミノ末端の８８個のアミノ酸を含
む制限領域に配置されている。少なくとも２つの独立し
た非重複エピトープ（ＴＳＶＦＳＳＮＥＶＳＳＰＥＩＩ
およびＴＥＥＴＱＴＴＩＱＲＰＲＩＳＥＰＤＴＧＮ、図
５）をカルボキシル−末端領域に配置することが可能で
あった。これらは、６個の独立な単離物を有する総数が
４種類の組換体によって表わされる。これらのクローン
によってカバーされるＥ２オープンリーディングフレー
ムの領域は、ヌクレオチド位置３３４３（ＴｈｒＳｅｒ
Ｖａｌ・・・）と３５０２（・・・ＴｈｒＧｌｙＡｓ
ｎ）との間に配置され、５２個のアミノ酸を含んでい
る。５種類の組換体（１２個の単離物）は、ヌクレオチ
ド位置２９２６にまで拡がっている。総てのクローン
は、この場合に点変異（Ａ→Ｇトランジション）を有す
るが、これは対応するアミノ酸（グルタミン）には変化
を来さない。
可能なものは、全部で４種類の異なる抗−ＨＰＶ１６Ｅ
２抗血清であり、それぞれの場合に、アミノ−末端部分
に対する２種類の血清（ｂｐ２７６１〜３２０９；ＡＡ
３〜１５２）およびＥ２（ｂｐ３２０９〜３８５０；Ａ
Ａ１５３〜３６５）オープンリーディングフレームのカ
ルボキシル−末端部分に対する２種類であった。これら
の血清を用いて、血清反応性組換体の５種類の異なる発
現バンクを検討した。これによって全部で３２個のクロ
ーンが単離され、そのうちの２６個がＥ２タンパク質の
アミノ−末端配列を含んでいた。これらの２６個のクロ
ーンは、総数が１１の異なる種類であって、４種類の異
なる重複しない領域を表わすものを形成する。（図５） 総てのエピトープは、ヌクレオチド位置２７９２（Ａｓ
ｐＬｙｓＩｌｅ・・・）および３０５５（・・・Ｓｅｒ
ＬｅｕＧｌｕ）の間に配置されているＥ２オープンリー
ディングフレームのアミノ末端の８８個のアミノ酸を含
む制限領域に配置されている。少なくとも２つの独立し
た非重複エピトープ（ＴＳＶＦＳＳＮＥＶＳＳＰＥＩＩ
およびＴＥＥＴＱＴＴＩＱＲＰＲＩＳＥＰＤＴＧＮ、図
５）をカルボキシル−末端領域に配置することが可能で
あった。これらは、６個の独立な単離物を有する総数が
４種類の組換体によって表わされる。これらのクローン
によってカバーされるＥ２オープンリーディングフレー
ムの領域は、ヌクレオチド位置３３４３（ＴｈｒＳｅｒ
Ｖａｌ・・・）と３５０２（・・・ＴｈｒＧｌｙＡｓ
ｎ）との間に配置され、５２個のアミノ酸を含んでい
る。５種類の組換体（１２個の単離物）は、ヌクレオチ
ド位置２９２６にまで拡がっている。総てのクローン
は、この場合に点変異（Ａ→Ｇトランジション）を有す
るが、これは対応するアミノ酸（グルタミン）には変化
を来さない。
【００２０】例７ ｆｄファージ発現バンクの免疫スクリーニング １． プロテイン質Ａ−セファロースカラムでのファー
ジのアフィニティ濃縮 用いたｆｄファージ発現系で調製されたファージバンク
は、クローニング時に必然的に増幅した。元のクローン
のこの複製の程度も、個々の組換体の性状、例えばイン
サートの様々な大きさまたはコートタンパク質の構造、
感染された細菌および多くの他のものにおける生理学的
工程の抑制によって著しく影響され、それ故、総てのフ
ァージが均一に増幅されるとは予想されなかった。大き
なライブラリーから不十分に表示されたファージ組換体
を単離するために、血清反応性のファージ組換体を濃縮
した。このためにそれぞれの場合に発現される外来配列
が天然のファージ粒子のコート上のｆｄ遺伝子ＩＩＩ融
合タンパク質の部分として現れる環境を用いた。多量の
ファージ（１０９〜１０12個の粒子）を、この目的にプ
ロテインＡ抗体カラムに結合させて、再度溶出した。こ
のために、最初にプロテインＡ−セファロースをＰＢＳ
で３０分間膨潤させ、ＰＢＳで洗浄した。次いで、プロ
テインＡ−セファロースをエッペンドルフ反応管中で好
適な多クローン性血清（ウサギまたはヒト）約１〜２ml
または対応するプロテインＡ結合性単クローン性抗体と
共にロータリーシェーカーで４℃で１〜２日間インキュ
ベーションした。次いで、プロテインＡ−セファロース
をＰＢＳ１０mlに交互に再懸濁したセファロースによっ
て１０回洗浄し、遠心分離（２分、６０００ｒｐｍ）に
よって再度ペレット化した。形成したプロテインＡ−セ
ファロース−ＩｇＧ複合体を、次に前記と同様に適量の
ファージと共にインキュベーションした。次いで、セフ
ァロースを前記のようにＰＢＳで数回洗浄し、ガラスビ
ーズで閉じたパスツールピペットに充填し、その中を流
れる数リットル（２〜１５リットル）で洗浄した。カラ
ム材料を取り出し、同容量の溶出緩衝液（１mg/ml ＢＳ
Ａ、０．１ＭＨＣｌ、グリシン、ｐＨ２．２）中で１５
分間インキュベーションした。軽く遠心分離した後、遊
離のファージと抗体を含む上澄液をトリス塩基（０．５
Ｍ）の容積の１／５で中和した。組換体遺伝子を認識す
る抗体は、ファージを細菌細胞に結合するのを阻害する
ことができ、したがって感染のサイクルを阻害すること
ができる。このために、ファージを、中和の直後に溶出
物の１００〜２００μｌずつの分量を、指数的に成長す
る大腸菌Ｋ９１に加え、完全培地プレート上で培養し
た。この作業中に、これらのファージ培養物のリプリカ
フィルターが、恐らくは溶出物中に異物が混入したため
に免疫ブロットに不適であることが明らかになった。こ
のために、プレートを完全培地で再度洗浄することによ
って、生成するプラークを洗浄した後、この方法で得ら
れたファージ懸濁液からプレーティングし、これによっ
て再度増幅を行い、免疫ブロットを最少寒天プレートで
行った。
ジのアフィニティ濃縮 用いたｆｄファージ発現系で調製されたファージバンク
は、クローニング時に必然的に増幅した。元のクローン
のこの複製の程度も、個々の組換体の性状、例えばイン
サートの様々な大きさまたはコートタンパク質の構造、
感染された細菌および多くの他のものにおける生理学的
工程の抑制によって著しく影響され、それ故、総てのフ
ァージが均一に増幅されるとは予想されなかった。大き
なライブラリーから不十分に表示されたファージ組換体
を単離するために、血清反応性のファージ組換体を濃縮
した。このためにそれぞれの場合に発現される外来配列
が天然のファージ粒子のコート上のｆｄ遺伝子ＩＩＩ融
合タンパク質の部分として現れる環境を用いた。多量の
ファージ（１０９〜１０12個の粒子）を、この目的にプ
ロテインＡ抗体カラムに結合させて、再度溶出した。こ
のために、最初にプロテインＡ−セファロースをＰＢＳ
で３０分間膨潤させ、ＰＢＳで洗浄した。次いで、プロ
テインＡ−セファロースをエッペンドルフ反応管中で好
適な多クローン性血清（ウサギまたはヒト）約１〜２ml
または対応するプロテインＡ結合性単クローン性抗体と
共にロータリーシェーカーで４℃で１〜２日間インキュ
ベーションした。次いで、プロテインＡ−セファロース
をＰＢＳ１０mlに交互に再懸濁したセファロースによっ
て１０回洗浄し、遠心分離（２分、６０００ｒｐｍ）に
よって再度ペレット化した。形成したプロテインＡ−セ
ファロース−ＩｇＧ複合体を、次に前記と同様に適量の
ファージと共にインキュベーションした。次いで、セフ
ァロースを前記のようにＰＢＳで数回洗浄し、ガラスビ
ーズで閉じたパスツールピペットに充填し、その中を流
れる数リットル（２〜１５リットル）で洗浄した。カラ
ム材料を取り出し、同容量の溶出緩衝液（１mg/ml ＢＳ
Ａ、０．１ＭＨＣｌ、グリシン、ｐＨ２．２）中で１５
分間インキュベーションした。軽く遠心分離した後、遊
離のファージと抗体を含む上澄液をトリス塩基（０．５
Ｍ）の容積の１／５で中和した。組換体遺伝子を認識す
る抗体は、ファージを細菌細胞に結合するのを阻害する
ことができ、したがって感染のサイクルを阻害すること
ができる。このために、ファージを、中和の直後に溶出
物の１００〜２００μｌずつの分量を、指数的に成長す
る大腸菌Ｋ９１に加え、完全培地プレート上で培養し
た。この作業中に、これらのファージ培養物のリプリカ
フィルターが、恐らくは溶出物中に異物が混入したため
に免疫ブロットに不適であることが明らかになった。こ
のために、プレートを完全培地で再度洗浄することによ
って、生成するプラークを洗浄した後、この方法で得ら
れたファージ懸濁液からプレーティングし、これによっ
て再度増幅を行い、免疫ブロットを最少寒天プレートで
行った。
【００２１】２． ファージの培養および免疫ブロット
のためのニトロセルロースレプリカフィルターの調製 総てのｆｄファージ誘導体を、大腸菌Ｋ９１（リオンズ
(Lyons) とジンダー(Zinder)、ウィロロジー(Virolog
y)、49, 45-60, 1972 ）によって形成されたローン(law
n)上でプレーティングした。この株は、線状ファージの
取り込みに重要な多数のＦ繊毛（ほとんどのＦ＋株にお
ける細胞当たり約０．５と比較して、細胞当たり５）に
よって識別される。これは、組換体ヒューズファージ
が、Ｔｎ１０トランスポゾン（テトラサイクリン耐性）
の一部を取り込むため、野生型と比較して著しく拡大さ
れたゲノムを有するので、この研究に用いられるｆｄ発
現系に特に重要であり、そのため特に小さなプラークを
形成する。このファージを培養するため、Ｋ９１を一晩
培養したものを完全培地（２×ＹＴ）で１：１００に希
釈して、３７℃で３〜４時間インキュベーションした。
濃度がＥ600 ＝０．８〜１．２に達した後、細菌２００
μｌを適量のファージと共に、予備加温した細菌プレー
ト上でアガロース３．５ml（０．６％アガロース、１０
mMＭｇＳＯ４、５０℃）と共に培養した。最少寒天培地
を、免疫スクリーニング用のニトロセルロースレプリカ
に用いられるいずれのプレーティングにも常に用いた。
ファージタイターの決定またはＤＮＡハイブリッド形成
のための培養は、完全培地プレート上で行った。免疫ブ
ロットに完全培地プレートを用いると、フィルターが、
用いられる血清と極めて高い非特異的反応性を、常に有
するようになる。プレートを３７℃で一晩インキュベー
ションした。約１６時間後に、ニトロセルロースフィル
ターを１０〜１５分間配置し、針を用いた非対称な刺穴
で印をつけ、平らな末端のピンセットを用いて再度取り
出した。このフィルターを標識した後、新たに調製した
最少寒天プレートに反転させ、更に３７℃で５〜６時間
インキュベーションした。これにより、再インキュベー
ションを行うことにより細菌とファージがフィルターに
結合してプレートから拡散する栄養物によって更に成長
することができるので、フィルター上のファージ粒子
（タンパク質）の量が増加した。次いで、フィルターを
取り出して、１０％ミルク（ＰＢＳ中の脱脂粉乳）中で
３０〜６０分間飽和した。次いで、フィルターを、適当
な血清を５％ミルク中で適当に希釈したものと共に４℃
で一晩インキュベーションした。
のためのニトロセルロースレプリカフィルターの調製 総てのｆｄファージ誘導体を、大腸菌Ｋ９１（リオンズ
(Lyons) とジンダー(Zinder)、ウィロロジー(Virolog
y)、49, 45-60, 1972 ）によって形成されたローン(law
n)上でプレーティングした。この株は、線状ファージの
取り込みに重要な多数のＦ繊毛（ほとんどのＦ＋株にお
ける細胞当たり約０．５と比較して、細胞当たり５）に
よって識別される。これは、組換体ヒューズファージ
が、Ｔｎ１０トランスポゾン（テトラサイクリン耐性）
の一部を取り込むため、野生型と比較して著しく拡大さ
れたゲノムを有するので、この研究に用いられるｆｄ発
現系に特に重要であり、そのため特に小さなプラークを
形成する。このファージを培養するため、Ｋ９１を一晩
培養したものを完全培地（２×ＹＴ）で１：１００に希
釈して、３７℃で３〜４時間インキュベーションした。
濃度がＥ600 ＝０．８〜１．２に達した後、細菌２００
μｌを適量のファージと共に、予備加温した細菌プレー
ト上でアガロース３．５ml（０．６％アガロース、１０
mMＭｇＳＯ４、５０℃）と共に培養した。最少寒天培地
を、免疫スクリーニング用のニトロセルロースレプリカ
に用いられるいずれのプレーティングにも常に用いた。
ファージタイターの決定またはＤＮＡハイブリッド形成
のための培養は、完全培地プレート上で行った。免疫ブ
ロットに完全培地プレートを用いると、フィルターが、
用いられる血清と極めて高い非特異的反応性を、常に有
するようになる。プレートを３７℃で一晩インキュベー
ションした。約１６時間後に、ニトロセルロースフィル
ターを１０〜１５分間配置し、針を用いた非対称な刺穴
で印をつけ、平らな末端のピンセットを用いて再度取り
出した。このフィルターを標識した後、新たに調製した
最少寒天プレートに反転させ、更に３７℃で５〜６時間
インキュベーションした。これにより、再インキュベー
ションを行うことにより細菌とファージがフィルターに
結合してプレートから拡散する栄養物によって更に成長
することができるので、フィルター上のファージ粒子
（タンパク質）の量が増加した。次いで、フィルターを
取り出して、１０％ミルク（ＰＢＳ中の脱脂粉乳）中で
３０〜６０分間飽和した。次いで、フィルターを、適当
な血清を５％ミルク中で適当に希釈したものと共に４℃
で一晩インキュベーションした。
【００２２】３． レプリカフィルターの免疫染色およ
び反応性組換体のクローニング レプリカフィルターを取り出し、１０％ミルク（ＰＢＳ
中）で６０分間ブロッキングし、抗血清と共に一晩イン
キュベーションした後、ニトロセルロースフィルターを
ＰＢＳ、０．０５％ツイーン(Tween) ２０（洗浄緩衝液
を５回交換）で３０分間洗浄した。次に、フィルターを
５％ミルク中で中で適当な第二抗体（ペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗−ヒト、抗−ウサギまたは抗−マウス）を
１：１０００に希釈したもので室温で２時間インキュベ
ーションした。この後に再度洗浄し（前記を参照）、下
記の染色混合物中でインキュベーションを行った。 ジアミノベンジジン ４０mg ３０％Ｈ２Ｏ２ ３０μｌ ＰＢＳ５０ml中１％ＮｉＳＯ４ １．５ml 色が十分に展開した後、フィルターを溶液から取り出
し、水中に３０分間入れた後、３ＭＭペーパー上で乾燥
した。フィルター上の刺穴およびシグナルを、次に細菌
皿のシートまたは蓋にコピーした。これにより、位置ま
たはファージの希釈が十分大きいとき（約２以上）には
プラークをシグナルに割り当てることが可能となった。
無菌の楊子を位置またはプラークに突き刺し、楊子を完
全培地５００μｌ中に１０〜１５分間置いた。それ故、
このファージ懸濁液は通常は約１０６〜１０７感染性粒
子を含み、これはプラーク中のファージの約０．１〜１
％を含んでいる。次いで、ファージ懸濁液を６５℃で１
５〜２０分間インキュベーションして、持ち越された細
菌を殺した後、４℃で保存した。
び反応性組換体のクローニング レプリカフィルターを取り出し、１０％ミルク（ＰＢＳ
中）で６０分間ブロッキングし、抗血清と共に一晩イン
キュベーションした後、ニトロセルロースフィルターを
ＰＢＳ、０．０５％ツイーン(Tween) ２０（洗浄緩衝液
を５回交換）で３０分間洗浄した。次に、フィルターを
５％ミルク中で中で適当な第二抗体（ペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗−ヒト、抗−ウサギまたは抗−マウス）を
１：１０００に希釈したもので室温で２時間インキュベ
ーションした。この後に再度洗浄し（前記を参照）、下
記の染色混合物中でインキュベーションを行った。 ジアミノベンジジン ４０mg ３０％Ｈ２Ｏ２ ３０μｌ ＰＢＳ５０ml中１％ＮｉＳＯ４ １．５ml 色が十分に展開した後、フィルターを溶液から取り出
し、水中に３０分間入れた後、３ＭＭペーパー上で乾燥
した。フィルター上の刺穴およびシグナルを、次に細菌
皿のシートまたは蓋にコピーした。これにより、位置ま
たはファージの希釈が十分大きいとき（約２以上）には
プラークをシグナルに割り当てることが可能となった。
無菌の楊子を位置またはプラークに突き刺し、楊子を完
全培地５００μｌ中に１０〜１５分間置いた。それ故、
このファージ懸濁液は通常は約１０６〜１０７感染性粒
子を含み、これはプラーク中のファージの約０．１〜１
％を含んでいる。次いで、ファージ懸濁液を６５℃で１
５〜２０分間インキュベーションして、持ち越された細
菌を殺した後、４℃で保存した。
【００２３】
配列番号：Ｉ NGWFYVEAVVEKKTGDAISDDENENDSDTGEDLVDFIVNDNDYLT ヒトパピローマウイルス１６Ｅ１タンパク質 ペプチド 配列番号：ＩＩ NENDSDTGEDLVDFIVND ヒトパピローマウイルス１６Ｅ１タンパク質 ペプチド 配列番号：ＩＩＩ MADPAGTNGEEGTGCNGWFYVEAVVEKKTGDAISDDENENDSDTGEDLVDFIVNDNDYLT ヒトパピローマウイルス１６Ｅ１タンパク質 ペプチド 配列番号：ＩＶ EDLVDFIVNDNDYLT ヒトパピローマウイルス１６Ｅ１タンパク質 ペプチド 配列番号：Ｖ EDLVDFIVNDNDYLTQAETETAHALFTAQEAKQH ヒトパピローマウイルス１６Ｅ１タンパク質 ペプチド 配列番号：ＶＩ NENDSDTGEDLVDFIVNDNDYLTQAETETAHALFTAQEAKQHRDAVQVLKRKYL ヒトパピローマウイルス１６Ｅ１タンパク質 ペプチド 配列番号：ＶＩＩ GSPLSDIS ヒトパピローマウイルス１６Ｅ１タンパク質 ペプチド
【００２４】配列番号：Ｉ DKILTHYENDS ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＩＩ DKILTHYENDSTDLRDHI ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＩＩＩ DLRDHIDYWKH ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＩＶ AIYYKAREMGFKHINHQVVPTLA ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：Ｖ AIYYKAREMGFKHINHQVVPTLAVSKNKAL ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＶＩ YYKAREMGFKHINHQVVPTLAVSKN ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＶＩＩ INHQVVPTLAVSKNKALQAI ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＶＩＩＩ INHQVVPTLAVSKNKAL ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＩＸ TLAVSKNKALQAIELQLTLETIYNSQYSNEKWTLQDV ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：Ｘ QLTLETIYNSQYSNEKWTLQDVSLE ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＸＩ TLETIYNSQYSNEK ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＸＩＩ TSVFSSNEVSSPEII ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＸＩＩＩ VFSSNEVSSPEIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEET ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＸＩＶ EIIRQHLANHPAATHTKAVALGTEETQTTIQRPRSEP ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド 配列番号：ＸＶ TEETQTTIQRPRSEPDTGN ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパク質 ペプチド
【図１】Ｅ１オープンリーディングフレームの発現ベク
ターｐＥＸ１２mer へのクローニングを示す説明図。
ターｐＥＸ１２mer へのクローニングを示す説明図。
【図２】ＨＰＶ１６Ｅ１タンパク質上の血清反応性領域
を示す説明図。小文字は、ｆｄバンクをクローニングす
るのに用いたＨＰＶ１６単離物のリーディングフレーム
が変化するため、ＨＰＶ１６Ｅ１タンパク質に由来しな
いクローン１１４５および１０５９のアミノ酸を表わ
す。クローン１０９０、１０７９、１０８４、１０２
９、１０９９および１１４５上の他の抗体結合部位を除
外することができないが、これらのクローンは、おそら
くこれらのクローンの共通のエピトープを表わす１０個
のアミノ酸（ＥＤＬＶＤＦＩＶＮＤ）の共通の領域を有
する。クローン１０５９は、このクローンのインサート
はクローン１１４５のインサートと重複しているが、リ
ーディングフレームが変化するため、他のクローンと共
通なアミノ酸配列を持たない。この位置の表示は、ＨＰ
Ｖ１６Ｅ１オープンリーディングフレームに関係してい
る。Ｅ１に由来しないクローン１１４５および１０５９
のアミノ酸はこの場合には考慮されない。
を示す説明図。小文字は、ｆｄバンクをクローニングす
るのに用いたＨＰＶ１６単離物のリーディングフレーム
が変化するため、ＨＰＶ１６Ｅ１タンパク質に由来しな
いクローン１１４５および１０５９のアミノ酸を表わ
す。クローン１０９０、１０７９、１０８４、１０２
９、１０９９および１１４５上の他の抗体結合部位を除
外することができないが、これらのクローンは、おそら
くこれらのクローンの共通のエピトープを表わす１０個
のアミノ酸（ＥＤＬＶＤＦＩＶＮＤ）の共通の領域を有
する。クローン１０５９は、このクローンのインサート
はクローン１１４５のインサートと重複しているが、リ
ーディングフレームが変化するため、他のクローンと共
通なアミノ酸配列を持たない。この位置の表示は、ＨＰ
Ｖ１６Ｅ１オープンリーディングフレームに関係してい
る。Ｅ１に由来しないクローン１１４５および１０５９
のアミノ酸はこの場合には考慮されない。
【図３】発現ベクターｐＥＸ１２mer へのＨＰＶ１６Ｅ
２タンパク質のカルボキシル−末端の半分のクローニン
グを示す説明図。
２タンパク質のカルボキシル−末端の半分のクローニン
グを示す説明図。
【図４】発現ベクターｐＥＸ１２mer へのＨＰＶ１６Ｅ
２タンパク質のアミノ−末端の半分のクローニングを示
す説明図。
２タンパク質のアミノ−末端の半分のクローニングを示
す説明図。
【図５】ＨＰＶ１６Ｅ２タンパク質上の血清反応性領域
を示す説明図。ＨＰＶ１６Ｅ２のカルボキシル−末端の
半分上の領域（Ｅ２−１０６６、−１１７０、−１０７
４、−１１１２）は総て長さが８８個のアミノ酸の領域
に配置されており（ＡＡ１３および１００の間）、部分
的に重複している。カルボキシル−末端領域も隣接して
いる( ＡＡ１９７および２４９の間）。これらの２つの
領域はそれぞれの場合に、Ｅ２タンパク質上のそれらの
位置にほぼ比例して配列されている。
を示す説明図。ＨＰＶ１６Ｅ２のカルボキシル−末端の
半分上の領域（Ｅ２−１０６６、−１１７０、−１０７
４、−１１１２）は総て長さが８８個のアミノ酸の領域
に配置されており（ＡＡ１３および１００の間）、部分
的に重複している。カルボキシル−末端領域も隣接して
いる( ＡＡ１９７および２４９の間）。これらの２つの
領域はそれぞれの場合に、Ｅ２タンパク質上のそれらの
位置にほぼ比例して配列されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ
Claims (9)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する、ヒトパピロ
ーマウイルス（ＨＰＶ）１６のＥ１タンパク質における
血清反応性領域。 【化１】 - 【請求項２】下記のアミノ酸配列を有する、ヒトパピロ
ーマウイルス（ＨＰＶ）１６のＥ２タンパク質における
血清反応性領域。 【化２】 - 【請求項３】請求項１または２に記載の血清反応性領域
の１つ以上を含むペプチド。 - 【請求項４】請求項３に記載のペプチドの１つ以上を含
むワクチン。 - 【請求項５】請求項３に記載のペプチドを含む、ＨＰＶ
１６Ｅ１またはＥ２タンパク質に対する特異的抗体を同
定するための診断用組成物。 - 【請求項６】請求項１または２の血清反応性領域に親和
性を有する単クローン性抗体。 - 【請求項７】請求項６に記載の単クローン性抗体を含
む、診断用組成物。 - 【請求項８】ＨＰＶ１６特異的Ｅ１またはＥ２タンパク
質を同定するための請求項７に記載の診断用組成物。 - 【請求項９】請求項３に記載のペプチドのワクチン生産
または診断用組成物のための使用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4123760.9 | 1991-07-18 | ||
| DE4123760A DE4123760C2 (de) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | Seroreaktive Bereiche auf den HPV 16 Proteinen E1 und E2 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003088662A Division JP2003327598A (ja) | 1991-07-18 | 2003-03-27 | Ｈｐｖ１６タンパク質ｅ１およびｅ２の血清反応性領域 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=6436409
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4214489A Pending JPH0867696A (ja) | 1991-07-18 | 1992-07-20 | Ｈｐｖ１６タンパク質ｅ１およびｅ２の血清反応性領域 |
| JP2003088662A Pending JP2003327598A (ja) | 1991-07-18 | 2003-03-27 | Ｈｐｖ１６タンパク質ｅ１およびｅ２の血清反応性領域 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003088662A Pending JP2003327598A (ja) | 1991-07-18 | 2003-03-27 | Ｈｐｖ１６タンパク質ｅ１およびｅ２の血清反応性領域 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (2) | EP0523395B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0867696A (ja) |
| AT (1) | ATE206434T1 (ja) |
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| CA (1) | CA2074153C (ja) |
| DE (2) | DE4123760C2 (ja) |
| DK (1) | DK0523395T3 (ja) |
| ES (1) | ES2163394T3 (ja) |
| PT (1) | PT523395E (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| GB0017990D0 (en) | 2000-07-21 | 2000-09-13 | Glaxo Group Ltd | Papilloma virus sequences |
| WO2002008435A1 (en) * | 2000-07-21 | 2002-01-31 | Glaxo Group Limited | Codon-optimized papilloma virus sequences |
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| DE10137102A1 (de) * | 2001-07-30 | 2003-02-27 | Deutsches Krebsforsch | Polyvalente Vakzine gegen durch Papillomaviren verursachte Erkrankungen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
| US7027923B2 (en) * | 2003-12-12 | 2006-04-11 | Schlumberger Technology Corporation | Method for determining sonde error for an induction or propagation tool with transverse or triaxial arrays |
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| US20100003704A1 (en) * | 2008-06-13 | 2010-01-07 | Shuling Cheng | IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection |
| US8968995B2 (en) * | 2008-11-12 | 2015-03-03 | Oncohealth Corp. | Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers |
| WO2008092854A2 (en) | 2007-01-30 | 2008-08-07 | Transgene S.A. | Papillomavirus e2 polypeptide used for vaccination |
| NZ599777A (en) | 2007-11-07 | 2013-09-27 | Celldex Therapeutics Inc | Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (DEC-205) |
| EP2427763A4 (en) | 2009-05-07 | 2013-08-21 | Oncohealth Corp | IDENTIFICATION OF A HIGH CIN2 DEGREE FOR THE DETECTION OF EARLY AND LATE TADIES AND FOR THE SCREENING AND DIAGNOSIS OF HUMAN PAPILLOMA (HPV) AND ASSOCIATED CANCER DISORDERS |
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