JPH0867700A

JPH0867700A - ヒト肺癌細胞と反応するモノクローナル抗体および肺癌検出方法

Info

Publication number: JPH0867700A
Application number: JP6204956A
Authority: JP
Inventors: Ikuo Yamashina; 郁男山科; Takeji Shibatani; 武爾柴谷; Miki Aoki; 幹青木
Original assignee: BIO CHIBA KK; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: BIO CHIBA KK; Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1994-08-30
Filing date: 1994-08-30
Publication date: 1996-03-12

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト肺癌の検出に有用なモノクローナル抗体
および該抗体を産生するハイブリドーマを提供する。【構成】ヒト肺癌細胞から得られるムチン型糖タンパ
ク質由来の糖ペプチドと反応し、アスパラギン結合型糖
ペプチドとは反応せず、かつヒト肺癌組織に反応し正常
組織には反応しないモノクローナル抗体ならびに該抗体
を産生しうるハイブリドーマ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、肺癌細胞のムチン型糖
タンパク質の糖鎖を認識し、肺癌組織と反応するモノク
ローナル抗体、その製法および該モノクローナル抗体を
利用する肺癌の検出法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】細胞表面の糖タンパク質の糖鎖は、細胞
の癌化に伴い、その構造が変化することが知られてお
り、癌関連抗原として注目されている。これまでに得ら
れている各種癌細胞に対するモノクローナル抗体は、癌
細胞を免疫原とし、生成する抗体と癌細胞との結合性を
指標にして選別するか、あるいは癌細胞から抽出した糖
脂質を適当な免疫助剤と混合して免疫原として作製する
のが通常であった。前記癌化細胞表面の糖タンパク質糖
鎖を認識するモノクローナル抗体が得られれば、より適
切な癌化細胞の検出が可能となり、癌の早期発見に役立
つものと考えられる。しかしながら、かかる糖タンパク
質との結合性を指標として抗体を選別する場合、糖タン
パク質に対する抗体の多くはペプチド部分を認識するた
め、癌細胞表面に存在し、さらに一部は分泌されている
糖タンパク質の糖鎖を認識する抗体を作製するには、偶
然に期待する以外には無かった。

【０００３】本発明者らは先に、糖タンパク質糖鎖に対
する抗体の力価測定のための、固相化糖ペプチドを用い
る方法を発明した(特開昭６２−２１２５６８)。この方
法を用いることにより、癌細胞を免疫原として作成され
る多数のモノクローナル抗体のうちから糖タンパク質の
糖鎖を識別するものを効率的に選別することができる。
本発明者らは、この方法によって、シアリルＴｎ抗原を
認識し、ヒト大腸癌に対して高い反応性を有するモノク
ローナル抗体ＭＬＳ１０２(特開昭６３−３３３９８)、
また、Ｔｎ抗原を認識し、同じくヒト大腸癌に対して高
い反応性を有するモノクローナル抗体ＮＮＹ１２８(特
開平２−２５５０９７)を作成することに成功してい
る。

【０００４】糖鎖抗原のうち、ムチン型糖タンパク質糖
鎖は、糖脂質の糖鎖に見られない多様でユニークな構造
を持ち、癌性変化の担い手として有力視されており、癌
関連抗原として有用である。上述のＴｎ抗原およびシア
リルＴｎ抗原は、代表的なムチン型糖タンパク質糖鎖と
して例示される。

【０００５】本発明者らは、肺癌組織においても、細胞
表面のムチン型糖タンパク質糖鎖が癌化に伴い正常組織
とは異なる特徴的な構造的変化を示しているものと考
え、肺癌細胞株ＳＫ−ＬＵ−１から調製したムチン型糖
ペプチドに反応するモノクローナル抗体を選出作製した
ところ、肺癌組織に反応し、正常組織には反応しない抗
体が得られたものである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】肺癌は早期発見が難し
い癌であり、現在、日本の男子の癌の死亡率において第
一位となっている。したがって、肺癌に特異的に反応す
るモノクローナル抗体が得られれば、肺癌の診断に有用
である。これまでに、肺癌のモノクローナル抗体は知ら
れているが、さらに優れた抗体の開発が望まれている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは種々検討の
結果、ヒト肺癌細胞で免疫したマウスの脾臓細胞とマウ
スミエローマ細胞とを細胞融合させて得られるハイブリ
ドーマが産生する抗体について、ヒト肺癌細胞から得ら
れるムチン型糖タンパク質由来の糖ペプチドとの反応性
を指標として選別することにより、ヒト肺癌に対して特
異性の高いモノクローナル抗体、およびこのモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを創製することに成
功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】以下に本発明のハイブリドーマおよびモノ
クローナル抗体の調製法について詳述する。なお、以下
の説明において、抗体産生ハイブリドーマの製造のため
に免疫原として使用する癌細胞、本発明のモノクローナ
ル抗体の各細胞との反応性を調べるために用いる各種細
胞は、全てヒトの細胞である。本発明のモノクローナル
抗体を製造するには、ヒト肺癌細胞(免疫原)で適当な哺
乳動物を免疫し、当該免疫動物の脾臓細胞と、前記動物
と同種または異種の哺乳動物のリンパ球様細胞とを融合
し、次いでこの融合細胞をクローン化することにより製
造することができる。具体的製造方法は次のとおりであ
る。 (ヒト肺癌細胞による哺乳動物の免疫)哺乳動物の免疫に
際して免疫原として使用する肺癌細胞としては、例え
ば、ヒト肺癌細胞ＳＫ−ＬＵ−１(ＡＴＣＣＮo．ＨＴ
Ｂ５７)、Ａ４２Ｔ(ＡＴＣＣＮo．ＨＴＢ５３)、ＣＡＬ
Ｕ−３(ＡＴＣＣＮo．ＨＴＢ５５)、ＳＫ−ＭＥＳ−
１（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＴＢ５８）等の株化肺癌細胞を
使用することができ、このうちムチン型糖タンパク質含
量が多い細胞が好ましい。ヒト肺癌細胞で免疫するため
の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモッ
ト、羊、山羊等があげられ、このうちマウスまたはラッ
トが好ましい。免疫に際しての免疫原の投与経路は特に
限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内等の
いずれの経路でも投与することができる。具体的には、
例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに肺癌の細胞又はそのホモジ
ネート又はそこから採取された抗原(ムチン型糖ペプチ
ドまたはその糖鎖領域含有フラグメント)を数日〜数週
間おきに数回接種する。接種量は一匹当たり、一回につ
き１０⁵〜１０⁷個の細胞を使うのが好ましい。

【０００９】上記癌細胞で免疫されたマウスより脾臓を
摘出し、遠心分離により抗体産生細胞(脾臓細胞)を得
る。この細胞は増殖能が無いので、自己増殖能を有する
細胞と融合させる。自己増殖能を有する細胞としてはミ
エローマ細胞等のリンパ球様細胞が特に好ましい。ミエ
ローマ細胞としては、抗体産生細胞を得た動物と同種の
動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体を分泌し
ないものを選択するのが好ましい。かかるミエローマ細
胞としては、例えばマウスミエローマ細胞Ｓp２／０−
Ａg１４、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａg４−１、Ｐ３Ｘ６３Ａ
g８Ｕ.１などがあげられる。抗体産生細胞とミエローマ
細胞等との融合は、常法に従い、例えばこれら細胞をポ
リエチレングリコール等の細胞融合剤を含む溶液(又は
懸濁液)で処理することにより実施できる。抗体産生細
胞とミエローマ細胞の使用割合は、細胞数比で約３：１
〜１０：１とするのが好ましい。

【００１０】(ハイブリドーマのクローン化)得られた融
合細胞を限界希釈法により分離し、分離した融合細胞を
増殖させ、各ウェルにおいて産生される抗体を、癌細胞
より調製したムチン型糖ペプチド固相化プレートを使用
するエライザ法において試験し、さらに、免疫組織染色
法によって、肺癌組織との反応性を調べ、その結果から
所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択することが
できる。すなわち、ヒト肺癌細胞から常法によりムチン
型糖タンパク質を単離し、プロテアーゼ等による消化を
徹底的に行ってペプチド部分をできる限り除去して糖ペ
プチドを調製して、これをアルキレンジアルデヒドおよ
び塩基性ポリペプチドまたは塩基性合成ポリマーの存在
下に固相化させて、ムチン型糖ペプチド糖鎖特異抗体ア
ッセイプレートを調製する(特開昭６２−２１２５６８
号公報を参照)。また上記ヒト肺癌細胞からのムチン型
糖タンパク質の単離の際に得られる他のフラクションか
ら得られるアスパラギン結合型糖タンパク質に由来する
アスパラギン結合型糖ペプチドを高級脂肪酸でアシル化
して固相化させて、アスパラギン結合型糖ペプチド糖鎖
特異抗体アッセイプレートを調製する(同上特許公開公
報参照)。これらのアッセイプレートを用い、上記融合
細胞の産生する抗体をエライザ法で試験し、ムチン型糖
ペプチドに反応し、アスパラギン結合型糖ペプチドに反
応しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する。

【００１１】(モノクローナル抗体の調製)本発明のモノ
クローナル抗体は、上記の如くして選択されたハイブリ
ドーマを適当な培地を用いて培養して得られる培養上清
から常法(例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラ
フィー、プロティンＡを用いるアフィニティークロマト
グラフィー等)により容易に取得することができる。ま
た、上記ハイブリドーマを適当な哺乳動物(例えば、マ
ウス等)の腹腔内に接種し、ハイブリドーマ細胞を増殖
させた後、当該哺乳動物の腹水、血清等から所望のモノ
クローナル抗体を採取することもできる。

【００１２】このようにして得られたモノクローナル抗
体はＩgＧのクラスに属するものであり、分子量は、約
１５万である。本発明者らは、このモノクローナル抗体
をＭＡ５１と命名した。

【００１３】後述する実施例に示したように、本発明の
モノクローナル抗体ＭＡ５１は、ヒト肺癌細胞、各種肺
癌組織に反応したが、肺癌以外の癌組織とはほとんど反
応せず、成人及び胎児の正常組織に対しても全く反応を
示さなかった。従って、本発明のモノクローナル抗体Ｍ
Ａ５１産生ハイブリドーマは、肺癌のムチン型糖タンパ
クに存在する抗原に対するモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマである。

【００１４】本発明のモノクローナル抗体は、一種類で
数種類の肺癌を証明できるから、臨床応用を考える場
合、極めて有用な抗体であると言える。即ち、本発明の
ＭＡ５１は、ラジオイムノアッセイあるいはエライザ等
の方法で体液中の抗原濃度を測定したり、また、免疫組
織染色あるいは細胞質蛍光抗体法によって喀痰や生検試
料中の肺癌細胞を検出するなど、診断の目的に用いるこ
とができる。このモノクローナル抗体ＭＡ５１を用いる
と、各種肺癌に対して非常に精度の高い診断を行うこと
ができる。又、本発明のモノクローナル抗体は対応する
抗原を保有する癌組織を標的としたモノクローナル抗体
単独使用による治療、又はモノクローナル抗体を抗癌剤
の癌組織への特異的な運搬手段として用いるモノクロー
ナル抗体−抗癌剤複合体によるミサイル療法に用いるこ
ともできる。

【００１５】本発明のモノクローナル抗体を用いるエラ
イザ法、免疫組織染色法、細胞質蛍光抗体法による診断
法の詳細は以下のとおりである。

【００１６】エライザ法９６ウェルＥＩＡ用プレートに、第一抗体１０〜１００
μｇ／ｍｌを５０〜２００μｌ／ウェルずつ分注し、４
℃で１〜２晩あるいは、室温で２〜４時間放置する。Ｐ
ＢＳで洗浄後、各ウェルに血清検体を１〜１００倍希釈
で、５０〜１００μｌを加える。４℃で一晩あるいは室
温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次にビオチ
ン化した第二抗体(１０〜１００μｇ／ｍｌ)を５０〜１
００μｌ／ウェル加え、さらに、４℃で一晩あるいは室
温で２〜４時間放置する。第二抗体として、ビオチン化
抗体を使用した場合には、プレートをＰＢＳでよく洗浄
した後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ(１０
μｇ／ｍｌ)を５０〜１００μｌ／ウェル加え、室温で
３０分間放置後、ＰＢＳで洗浄する。次いで、基質液
(ＡＢＴＳ基質)を５０〜１００μｌ／ウェル加え、室温
で３０分間放置し、０.２％アジ化ナトリウムを含むＰ
ＢＳ溶液１０μｌ／ウェルを加え反応を停止する。各ウ
ェルのＯＤ₄₀₅値を測定し、その発色度より、血清検体
中の抗原量を算出する。このようにして得られた肺癌患
者血清中の抗原量を標準(健常人)血清中の抗原量と比較
することにより正常値を決定し、その正常値を超えるも
のを肺癌陽性とする。

【００１７】免疫組織染色法組織染色は、ＶｅｃｔｓｔａｉｎＡＢＣキット(Ｖｅ
ｃｔｏｒ社、ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅＣＡ、米国)を使
用する。染色手順は、組織切片の載ったプレートを内因
性ペルオキシダーゼをブロックするため、３０％Ｈ₂Ｏ₂
とメチルアルコールを１対１００の割合で混合させたも
ので２０分間処理する。次いで、ＰＢＳにて３回洗浄
し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０倍に希釈した正常馬
血清を加え、非特異的反応をブロックする。２０分間室
温でインキュベートした後、モノクローナル抗体を加え
る。モノクローナル抗体は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで
２μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌに希釈したものを使用
する。室温にて１時間あるいは、４℃で一晩放置した
後、ＰＢＳにて３回洗浄する。ＰＢＳにて３回洗浄後、
ビオチン化した馬抗マウス抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓで１０００倍に希釈して加える。３０分間室温で放置
した後、ＰＢＳで３回洗浄する。次いで、ペルオキシダ
ーゼが結合したアビジン−ビオチン結合物を加える。濃
度はＰＢＳにて１０００倍に希釈したものを加える少な
くとも３０分前に調製する。室温で３０分間反応させた
後、ＰＢＳで洗浄を３回行う。発色は、０.２Ｍトリス
アミノメタン２５ｍｌ、０.２Ｎ塩酸１９.２ｍｌに蒸留
水を加え１００ｍｌとしたものに、ジアミノベンチジン
塩酸塩２０ｍｇを溶解させる。更にＨ₂Ｏ₂を０.０３ｍ
ｌ程の割合で加える。以上の液にプレートを７分間反応
させる。その後、発色を停止させる。核染色はヘマトキ
シリンで行う。

【００１８】細胞質蛍光抗体法１〜５×１０⁴の標的細胞を、スライドグラス上に９５
％アセトンで１０分間固定し、−７０℃に保存しておい
たものを標的細胞として用いる。第一次抗体としてハ
イブリドーマ培養上清２５μｌを用いて４℃または２５
℃にて３０分間反応させる。ＰＢＳで洗浄後、２次抗体
として２０〜４０倍希釈蛍光標識抗マウスウサギ抗体を
２５℃にて３０分間反応させる。反応は蛍光顕微鏡下で
蛍光の有無によって判定する。

【００１９】

【実施例】以下、調製例および実施例により本発明をさ
らに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定
されるものではない。

【００２０】調製例１ムチン型糖ペプチドＧ−５０−Ｉおよび血清型糖ペプチ
ドＧ−５０−ＩＩの調製：本発明のモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマを選別するのに使用するムチン型糖
ペプチドＧ−５０−Ｉはヒト肺癌細胞ＳＫ−ＬＵ−１
(ＡＴＣＣＮｏ．ＨＴＢ５７)の細胞膜(原形質膜)を構
成し、同時に細胞外にも分泌されるムチン型糖タンパク
質より調製した糖ペプチドであり、以下の方法によって
調製した。米国ＡＴＣＣより入手したヒト肺癌細胞ＳＫ
−ＬＵ−１(ＡＴＣＣＮｏ．ＨＴＢ５７)を１０％牛胎
児血清を含むイーグル培地で７日間培養した後採集し、
ＰＢＳで繰り返し洗浄した後、１％トリトンＸ−１００
を含むＰＢＳを加え、氷冷下に撹拌し、遠心分離により
得た上清を透析の後、凍結乾燥した。これをクロロホル
ム／メタノール(２：１、Ｖ／Ｖ)で脱脂し、０.０１Ｍ
の酢酸カルシウムを含む酢酸緩衝液に懸濁して、プロナ
ーゼ(アクチナーゼＥ、科研製薬社製)を上記凍結乾燥物
に対し１／５０重量部および少量のトルエンを加えて３
７℃で３日間放置した後充分なタンパク質分解を行っ
た。ほぼ、透明になった可溶化細胞消化液に等容の１０
％トリクロロ酢酸水溶液を加えて撹拌した後、放置して
生成する不溶物を遠心分離し、得られた上清に等容のエ
ーテルを加えてよく混和した後、遠心分離して上清を除
いた。水層にさらにエーテルを加えて、トリクロロ酢酸
を抽出・除去する操作を３回繰り返し、水層がｐＨ５に
なったことを確かめた後、予め０.５Ｍピリジン−酢酸
緩衝液(ｐＨ５.０)で平衡化したセファデックスＧ−２
５カラム(２.６×９０ｃｍ)に注入し、同じ緩衝液によ
り展開して流出液をフラクションコレクターで採取し
た。オルシノール−硫酸反応に陽性の画分を集めて凍結
乾燥した。得られた乾燥粉末は０.５Ｍピリジン−酢酸
緩衝液(ｐＨ５.０)に溶解した後、セファデックスＧ−
５０を用いて上記同様にゲル濾過し、フラクションコレ
クターで５ｍｌずつに分画した。このとき素通りした画
分(Ｇ−５０−I)はムチン型(Ｏ−グリコシド型)糖タン
パク質由来の糖ペプチドを主成分とする。フラクション
番号２４〜３０までの画分を凍結乾燥により溶媒を除い
て、ムチン型糖ペプチドＧ−５０−Iを得た。因みにフ
ラクション番号３１〜５８までの画分(Ｇ−５０−ＩＩ)
はアスパラギン結合型(Ｎ−グリコシド型)糖タンパク質
に由来する糖ペプチド画分で、これをアスパラギン結合
型糖ペプチドＧ−５０−ＩＩとした。

【００２１】上記各糖ペプチドの糖組成をＤionex陰イ
オン交換クロマトグラフィーを用いて分析した。分析結
果を下記表１に示す。

【表１】表中の略号は次の意味を表す。Ｆuc：フコースＧalＮＡc：Ｎ−アセチルガラクトサミンＧal：ガラクトースＧlcＮＡc：Ｎ−アセチルグルコサミンＸyl：キシロースＭan：マンノース表１に示すように、Ｇ−５０−ＩはＧal、ＧlcＮＡc、
ＧalＮＡcの割合が高く、ムチン型糖ペプチドの存在が
示された。また、マンノース(Ｍan)が検出されなかった
ことから、アスパラギン結合型の糖鎖はＧ−５０−Ｉに
含まれていないことが示された。Ｇ−５０−ＩＩは、Ｍ
an、ＧlcＮＡcの割合が高いことから、Ａsn型糖鎖が主
に存在していることが示された。以上より、Ｇ−５０−
Ｉはムチン型糖ペプチド、Ｇ−５０−ＩＩは主にアスパ
ラギン結合型糖ペプチドであることが確認された。

【００２２】調製例２ムチン型糖ペプチドＧ−５０−Ｉのプレートへの固相
化：１ｍｇ／ｍｌのムチン型糖ペプチド(Ｇ−５０−I)
１００μｌに、ＰＢＳ溶液１.９ｍｌと０.２５％グルタ
ルアルデヒド溶液３３μｌを加え、９６ウェルプレート
に２０μｌ宛分注した後、室温で約１時間反応させた。
反応後、０.２５ｍｇ／ｍｌのポリリシン(シグマ社製)
を含むＰＢＳ溶液１０μｌと混和後、４℃で２４時間静
置した。この条件下において、使用した糖ペプチドの５
０％が固相化される。

【００２３】調製例３アスパラギン結合型ペプチドＧ−５０−ＩＩのプレート
への固相化：１７ｍｇ／ｍｌのアスパラギン結合型ペプ
チド(Ｇ−５０−ＩＩ)６０μｌに、１０ｍｇ／ｍｌ無水
パルミチン酸を含むピリジン溶液０.５ｍｌを加え、３
７℃で６時間アシル化反応を行った。反応終了液を乾固
後、ジエチルエーテルを用いて抽出を６回行い、残渣を
風乾した。乾燥物を８％のピリジン溶液で１００ｕｇ／
ｍｌとした後、９６ウェルプレートに２０μｌ宛分注
し、室温で乾固した。この条件下において、使用した糖
ペプチドの１０％が固相化される。

【００２４】実施例１ハイブリドーマの作製：免疫原には細胞表面に多量のム
チンを産生しているヒト肺癌細胞ＳＫ−ＬＵ−１(ＡＴ
ＣＣＮｏ.ＨＴＢ５７)を用いた。６週令のＢＡＬＢ／
ｃマウス(雌、チャールズリバー)の腹腔内に１０％牛胎
児血清を含むイーグル培地中で培養されたＳＫ−ＬＵ−
１細胞を１回につき一匹あたり１〜２×１０⁶個の細胞
を０.５ｍｌの生理食塩水に懸濁して３週間毎に４回注
入し、３カ月後、免疫処理したマウスから脾臓を摘出し
た。

【００２５】細胞融合の方法は、渡辺等の方法(免疫実
験操作法ＶＩＩ, 2963-2967,1978)に準じて行った。即
ち、摘出した免疫マウスの脾臓を細切したのち、ステン
レスメッシュを通し、１５００ｒｐｍで遠沈して得た沈
渣に０.７％ＮＨ₄Ｃl １０ｍｌを加えて赤血球を除き、
ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、得られた生細胞浮遊
液３.９×１０⁷個／２２ｍｌにＲＰＭＩ−１６４０で２
回洗浄して得たマウスミエローマ細胞Ｓp２／０−Ａg１
４(以下ＳＰ２という)７.８×１０⁶個／２.５ｍｌ(５：
１)を混合し、２０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。沈
殿細胞をよくときほぐした後、４２.５％(Ｗ／Ｖ)のポ
リエチレングリコール(ＰＥＧ１０００、シグマ社製)を
含有した３７℃、ｐＨ７.４のＲＰＭＩ−１６４０、１
ｍｌを回転しながら１分間かけて徐々に加え、細胞融合
を行った。反応１分後からＲＰＭＩ−１６４０を徐々に
加え、細胞融合を終了した。２０００rpmで遠沈後、１
０％牛胎児血清を含むＨＴ(ヒポキサンチン−チミジン)
培地５０ｍｌを加えて９６ウェルマイクロプレートの１
ウェルあたり０.１ｍｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ₂
培養器中で培養した。２４時間後から２日毎に上清の半
量をＨＡＴ培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジン、１０％牛胎児血清)と入れ換えた。１０日目に
上清を取り出して前述のムチン型糖ペプチドを固相化し
たプレート(調製例２)およびアスパラギン結合型糖ペプ
チドを固相化したプレート(調製例３)を使用するエライ
ザ法によって、抗体産生の有無を確かめ、限界希釈法に
より、抗体産生が陽性を示したウェルの中のハイブリド
ーマを１ウェルあたり０.３〜０.６個となるように調節
した。培地はＨＴ(ヒポキサンチン、チミジン、１０％
牛胎児血清)培地を用い、フィーダー層(feeder layer)
としてＢalb／cマウスの脾臓細胞５×１０⁵／ウェルを
加えた。このような限界希釈法によるクローニングを２
回ずつ行い、Ｇ−５０−Iと強く反応し、Ｇ−５０−Ｉ
Ｉとは全く反応しない抗体を産生するクローンを複数株
選択した。さらに、これらのクローンの培養上清を用い
て、前記した免疫組織染色法および細胞質蛍光抗体法に
より、肺癌組織に反応し正常組織とは反応しないクロー
ンを最終的に選択し、その抗体をＭＡ５１と命名した。

【００２６】実施例３ (１)モノクローナル抗体の作製と精製法：実施例２で得
られたハイブリドーマを通常の動物細胞の培養と同様に
して培養した。即ち、ストレプトマイシン (５０〜１０
０μｇ／ｄｌ)、ペニシリン(５０〜１００単位)、グル
タミン(３.５〜４.０ｇ／ｌ)、牛胎児血清(１０〜２０
％)を含むＲＰＭＩ１６４０培地１０〜２０ｍｌを用
い、フラスコ内で５％ＣＯ₂存在下、３５〜３７℃、３
〜７日間培養した。あるいは、マウス腹腔内にプリスタ
ン０.５〜１.０ｍｌ注射し、その一ヶ月後、ハイブリド
ーマ５〜１０×１０⁶個を腹腔内に移植した。

【００２７】ハイブリドーマの培養物の上清液またはプ
リスタン処理したマウスの腹腔内に貯留した腹水を１２
００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心分離した。上清を採取
し、ＰＢＳで１０倍に希釈し、スターラーで撹拌しなが
ら硫酸アンモニウムを２０分程で５０％飽和になるまで
加えた。その後、３０分間撹拌し、ファルコン社２０５
９チューブに移し、４℃で９５００ｒｐｍ、１０分間遠
心した。沈殿物に０.０２５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)
を最初の腹水または培養物の上清液と同量加え、溶解さ
せた。これを０.０２５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８.０)で透
析した。ＤＥＡＥセルロースカラムをワットマン(Ｗhat
man)ＤＥ５２を用いて作成し、まず、０.０２５Ｍリン
酸緩衝液(ｐＨ８.０)、４℃でカラムを洗い、次いで、
硫酸アンモニウムで半精製した抗体を流した。次いで、
１Ｍ塩化ナトリウム−０.０２５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ
８.０)溶出分画を集め、これを透析膜に入れ、ＰＥＧ２
００００により濃縮した。ＰＥＧを除去後、ＰＢＳにて
透析することにより精製モノクローナル抗体ＭＡ５１を
得た。

【００２８】(２)モノクローナル抗体ＭＡ５１認識抗原
の解析：モノクローナル抗体ＭＡ５１が認識する抗原を
解析するために、固相化ＳＫ−ＬＵ−１細胞を下記の各
種酵素および試薬で処理した後、ＭＡ５１との反応性を
調べた。酵素および試薬 (１)シアリダーゼ(生化学工業社製、ノイラミニダーゼ) ５０ｍＭ塩化カリシウムを含む０.２５Ｍ酢酸緩衝液(ｐ
Ｈ４.５)中２０ｍＵ／ｍｌ (２)α−Ｌ−フコシダーゼ(ＴＡＫＡＲＡ社製) ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６.０)中０.２ｍＵ
／ｍｌ (３)トリプシン(ＧＩＢＣＯ社製) ＰＢＳ中０.２５％ (４)プロナーゼ(科研製薬社製アクチナーゼＥ) １０ｍＭ酢酸カリシウムを含む０.１Ｍホウ酸緩衝液(ｐ
Ｈ８.０)中１０μｇ／ｍｌ (５)過ヨウ素酸(和光純薬社製) ＰＢＳ中５０ｍＭＳＫ−ＬＵ−１細胞を９６ウェルマイクロプレートの１
ウェルあたり２×１０⁴個ずつ分注し、２日間培養した
後、０.１％グルタルアルデヒド溶液を用いて固相化し
た。０.２％ゼラチン、０.１％ＢＳＡ、１００ｍＭグリ
シン、０.０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液で
ブロッキングした後、ＰＢＳ−Ｔ(０.１％Ｔween２０を
含むＰＢＳ溶液)で３回洗浄し、上記酵素液または試薬
液(１)〜(５)を５０μｌ／ウェル分注し、３７℃で１時
間反応させた。ついでＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、モノク
ローナル抗体ＭＡ５１(２.５μｇ／ｍｌ)を５０μｌ／
ウェル分注し、３７℃で１時間反応した。ＰＢＳ−Ｔで
３回洗浄した後、ビオチン標識抗マウスＩgＧ(４０００
倍希釈液)を５０μｌ／ウェル分注し、３７℃で３０分
間反応した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、アビジン−
ビオチン−ペルオキシダーゼ(ＡＢＣキット、Ｖector社
製)を５０μｌ／ウェル分注し、３７℃で３０分間反応
した。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を１
００μｌ分注し、３０分間反応後に４０５ｎｍにおける
吸光度を測定した。この結果、ＳＫ−ＬＵ−１細胞に対
するＭＡ５１の反応性は、トリプシン、プロナーゼおけ
る過ヨウ素酸処理により完全に消失したことから、モノ
クローナル抗体ＭＡ５１は、ムチン型糖タンパク質の糖
鎖部分を認識していると考えられる。

【００２９】実施例４モノクローナル抗体ＭＡ５１の各種肺癌培養株に対する
反応性：表２に示す各種細胞株をプレートに固相化し、
エライザ法によって、ＭＡ５１の該細胞株への結合性を
検討した。その結果を表３に示す。表３から明らかなよ
うに、ＭＡ５１は８種の肺癌細胞株のうち７種の細胞株
に結合能を示したのに対し、肺癌以外の細胞株に対して
は、一株も結合能を示さなかった。このことから、ＭＡ
５１は、肺癌細胞に特異的な抗体であることが明らかで
ある。

【００３０】

【表２】

【００３１】

【表３】

【００３２】実施例５モノクローナル抗体ＭＡ５１の各種肺癌組織に対する反
応性：モノクローナル抗体ＭＡ５１を用いて、肺癌組織
の免疫組織化学的染色を行った。すなわち、表４に示す
１０例の各種肺癌患者摘出各種肺癌パラフィン包埋ブロ
ック切片および１６例の肺癌以外の組織（肺癌以外の癌
７例、肺繊維症４例、正常肺５例）のパラフィン包埋ブ
ロック切片を用いて前記の免疫組織染色法によって試験
した。表４に示した結果から明らかなように、肺癌組織
では１０例中８例で癌細胞が強く染まった。一方、肺癌
以外の組織では、１６例中１例のみ弱く染まった。以上
の結果より、ＭＡ５１を用いる免疫組織化学染色によ
り、肺癌の病理診断が可能であることがわかる。

【００３３】

【表４】

【００３４】

【発明の効果】本発明によれば、ヒト肺癌組織には反応
するが肺癌以外の癌組織にはほとんど反応せずかつ正常
組織には全く反応しないモノクローナル抗体およびそれ
を生産するハイブリドーマ細胞が提供される。したがっ
て、かかるモノクローナル抗体を用いることによりヒト
肺癌が特異的に検出され、肺癌の早期発見に有用であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/574 Ｄ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者柴谷武爾兵庫県神戸市東灘区渦森台３丁目18−５ (72)発明者青木幹兵庫県神戸市垂水区塩屋３丁目25−２− 304

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト肺癌細胞と反応するモノクローナル
抗体。
【請求項２】ヒト肺癌細胞由来のムチン型糖ペプチド
と反応する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】ムチン型糖ペプチドの糖鎖領域に結合す
る請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】免疫グロブリンクラスがＩgＧである請
求項３記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】ヒト肺癌細胞で免疫した哺乳動物の脾臓
細胞と、前記哺乳動物と同種または異種の動物由来の自
己増殖能を有する細胞とを融合し、当該融合細胞をクロ
ーン化することにより得られる、請求項１記載のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項６】哺乳動物がマウスである請求項５記載の
ハイブリドーマ。
【請求項７】ヒト肺癌細胞が株化肺癌細胞ＳＫ−ＬＵ
−１(ＡＴＣＣＮo．ＨＴＢ５７)であり、自己増殖能
を有する細胞がマウスミエローマ細胞である請求項５記
載のハイブリドーマ。
【請求項８】請求項５記載のハイブリドーマを培養
し、培養上清から請求項１記載のモノクローナル抗体を
採取することを特徴とするモノクローナル抗体の製法。
【請求項９】ハイブリドーマを哺乳動物に接種して培
養した後、当該哺乳動物体内に蓄積したモノクローナル
抗体を採取する請求項８記載の製法。
【請求項１０】請求項１記載のモノクローナル抗体を
用いることを特徴とするヒト肺癌細胞の検出方法。
【請求項１１】ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ
法、免疫組織染色法または蛍光抗体法によりヒト肺癌細
胞を検出する請求項１０記載の検出方法。