JPH0868749A - バイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 サンプル中のリガンドを検出する方法及びこ
の方法に使用するバイオセンサーを提供する。 【構成】 有機ポリマーの薄層を有する光学構造体を具
備し、前記有機ポリマーの薄層が、溶剤を用いて液体表
面上に有機ポリマーの薄膜を形成し、次いで光学構造体
と液体表面上の前記有機ポリマーの薄膜とを相対的に移
動させ接触させることを含む溶剤流延法により形成さ
れ、検出を望むリガンドの特異的結合パートナーが前記
有機ポリマーに直接もしくは間接的に吸着もしくは結合
しているバイオセンサー、並びにこのバイオセンサーを
サンプルと接触させる、サンプル中のリガンドを検出す
る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、有機ポリマーの薄層を有する光
学構造体を具備するバイオセンサー及びこのバイオセン
サーを用いるサンプル中のリガンドを検出する方法に関
する。簡単な光学構造体の性質は、長年周知であり、例
えば回折格子のような構造体は電磁線の波の特性の理解
および分析だけでなく、最近ではサンプル中の化学、生
化学あるいは生物種の検出のためのバイオセンサーとし
て広く用いられている。

【０００２】ＵＳ−３９２６５６４およびＵＳ−３９７
９１８４は共に補足的成分の結合が、肉眼により検出で
きる方法で表面の光学特性を変化させるような粗金属面
への免疫的に反応性の蛋白質の吸着を延べている。ＥＰ
−０１１２７２１は、検出すべき種（今後「リガンド」
と呼ぶ）と結合し、錯体を形成できる物質（今後「特異
的結合パートナー」と呼ぶ）を塗布した回折格子のバイ
オセンサーとしての製造と使用を延べている。そのよう
な回折格子の光学特性は、特異的結合パートナーとリガ
ンドとの間の錯体形成の結果変化し、この現象は検出シ
ステムの基礎を形成する。

【０００３】バイオセンサーとしての塗布した光学構造
体の使用だけでなく実験物理学者による標準光学構造体
の使用に共通する問題は、その表面特性を調節すること
が困難なことである。そのような光学構造体の支持体
は、しばしばガラス板あるいはプラスチック材料製であ
るが、その構造体の表面は、例えば真空めっきにより形
成される薄金属層を含んでいてもよい。金属層の結合性
を破壊してしまうような腐蝕性環境における金属塗布表
面材の使用について問題が生じる。他の無機層、例えば
酸化珪素も回折格子表面材として述べられてきた（例え
ばＥＰ−０１１２７２１およびＥＰ−０１７８０８３参
照）。光学構造体の光学特性、例えば反射および／また
は透過特性および表われるプラズマ共鳴効果は、その表
面層の組成、厚さ、および均一性により異なり、表面層
の組成も、その化学特性を支配している。しかし、周知
の無機層の化学的および物理的特性の範囲は限定されて
いる。さらにバイオセンサーとしてそのような光学構造
体を用いた場合、生ずるであろう問題は、生物的に活性
な分子、例えば蛋白質が金属あるいはある種の無機表面
材に直接接触することにより、少なくとも部分的に不活
性化されるであろうということである。

【０００４】対照的にかなり広い範囲の化学的および物
理的特性が適当な有機ポリマーを用いることにより得ら
れ、化学的、生化学的および生物的物質をそこに結合さ
せ、あるいは吸着させるため多くの技術が知られてい
る。不幸にも、ポリマー塗布回折格子を製造しようとす
る従来の試みは、格子の固有の物理的特性を大きくゆが
めることにより、格子の表面浮上り面に十分適合するよ
うなポリマーの塗布は失敗におわった。

【０００５】我々は今や「溶剤流延」として周知の特定
の技術を用いることによって、光学構造体の表面浮上り
面によく適合する均一に分布した有機ポリマーの表面層
を有する光学構造体を製造することが可能であることを
発見した。従って、その広い面において、本発明は溶剤
流延法を用いて前記表面に有機ポリマーの薄層を形成す
ることからなる光学構造体の表面を処理する方法を提供
する。

【０００６】通常、格子の表面に塗布されたポリマーの
層は、５nm〜１００nm、好ましくは１５〜２０nmの厚さ
を有している。このポリマーは溶剤流延法を用いて薄層
に流延できるようなどんな適当な材料でもよい。ポリマ
ー層として例えば硝酸セルロースのようなセルロース誘
導体の使用は特に好ましいが、他のポリマー、例えばこ
の後述べるようなものを用いてもよい。

【０００７】前述したように、光学表面の光学特性は、
その物理的浮上り面だけでなく、層の表面層の組成によ
り異なる。従って、本発明のプロセスは、実験物理学者
等のための有用な道具となることが判明するであろう新
規塗布光学構造体を製造するために用いられてもよい。
さらに、例えば表面プラズマ共鳴を支持できるもの、例
えば銀のようなある種の好ましい表面層は、例えば水性
環境により腐蝕されやすく、本発明は実際の使用状態に
おいてその結合性を維持するように、そのような層を不
動態にする方法を提供する。

【０００８】しかし、本発明は特に光学構造体が従来の
提案（例えばＥＰ−０１１２７２１参照）と同様の方法
でバイオセンサーとして用いようとする回折格子である
点で有利である。生物的に活性な物質、例えば抗体ある
いは抗原と金属面の間の直接の接触は、その生物活性の
汚染あるいは破壊となるであろう。この状態において、
ポリマー層は都合のよいことにバリヤーとして働く。さ
らに、種々のポリマー表面の広い範囲の化学特性（例え
ば、共有結合への遊離基の利用可能性、親水性あるいは
疎水性、表面変化および誘電特性）は、あらゆる特定の
結合パートナー、例えば抗体あるいは抗原の結合あるい
は吸着を効果的にするための誘通性および範囲を与え
る。あらゆる非特異的結合あるいは立体障害を最小にし
て、望ましい結合パートナーの本来の構造および生物活
性を維持し、光学構造体の表面に十分固定するようにす
ることは重要である。

【０００９】本発明の方法は、特にバイオセンサーの製
造における用途を有しており、従って本発明の実施態様
の１つにより、溶剤流延法により光学構造体の表面に有
機ポリマーの薄層を塗布することを含む、リガンドを検
出するための装置を製造し、前記有機ポリマーに直接あ
るいは間接的に、検出を望むリガンドのための特定の結
合パートナーを吸着あるいは結合する方法を提供する。

【００１０】本発明に従って製造されたバイオセンサー
は特に抗体あるいは抗原の検出に有用であり（その場
合、特定の結合パートナーは抗原あるいは抗体であり、
それぞれモノクローナルあるいはポリクローナルであ
る）しかし他のリガンドも、この後述べるようにして他
の結合パートナーを用いることにより検出されるであろ
う。

【００１１】特定の結合パートナーを塗布した光学構造
体の光学特性は、特定の結合パートナーと補足的リガン
ドの間の錯体形成により変化し、本発明の実施態様の１
つにおいて標準（未処理）部分と表面の処理した試験部
分との光学特性を比較により、結合反応が試験部分でお
こっているかどうかを定性的に調べることが可能であ
る。例えば特定の結合パートナーが抗体であるような他
の実施態様においては、試験される抗原に対する特定の
抗体が、光学構造物の表面の少なくとも１つの分離した
試験域に吸着あるいは結合し、試験されるサンプル中に
存在するような、どのリガンドに対する特定の結合パー
トナーでない蛋白質（ここでは「非特異的蛋白質」とす
る）が前記表面の少なくとも１つの分離した対照領域に
吸着あるいは結合する。この非特異的蛋白質は、例えば
不活性化抗体あるいは試験されるサンプル中に存在しな
いリガンドに対し生じた抗体である。つまり試験される
サンプルが人の血清であり、非特異的蛋白質が抗ネズミ
抗体であるようなものである。例えば特定の抗体あるい
は非特異的蛋白質への試験サンプル中に存在する蛋白質
の非特異的結合の間のあらゆる違いは、試験される抗原
を含まないサンプルに暴露した後、対照領域と試験域の
光学特性を比較することにより、必要ならば、適当な補
正を行ない調べられる。試験されるサンプルに暴露する
間およびその後、同じバイオセンサーの試験および標準
領域の光学特性の比較は、試験される抗原とその特異的
抗体との間の錯体形成の目安となる。各部分は特定の結
合パートナーの連続層を含んでおり、あるいは各結合パ
ートナーは、不連続層を形成するよう、与えられた部分
で一定間隔で離れて存在する。

【００１２】本発明に従い製造されるバイオセンサー
は、例えばＥＰ−０１１２７２１およびＥＰ−０１７８
０８３に述べられているようなものと同じ方法の分析に
用いてよい。従って本発明のその他の特徴により、サン
プルと前記規定の方法により製造されたバイオセンサー
が接触し、リガンドと特異的結合パートナーとの間の錯
体形成により、このバイオセンサーの光学特性が変化す
るかどうか、および所望によりその程度および／または
その速度を測定することを含む、サンプル中のリガンド
を検出する方法が提供される。

【００１３】さらに本発明は、溶剤流延法により、光学
構造体の表面に塗布された、有機ポリマーの薄層を有す
る光学構造体を具備するリガンドを検出するためのバイ
オセンサーを提供し、前記有機層には検出することを望
むリガンドに対する特異的結合パートナーが直接あるい
は間接的に吸着あるいは結合している。固体あるいは液
体表面へのポリマーの溶剤流延は、マノおよびデュラオ
（Ｍａｎｏ ａｎｄ Ｄｕｒａｏ）のJournal of Chemi
cal Education 50巻 228頁1973年に示された周知の技術
である。Journal of Scientific Instruments. 3巻．40
0 〜404 頁のジェームステーラー（Ｊａｍｅｓ Ｔａｙ
ｌａｒ）による「薄セルロイド製造技術」という論文は
５０nmのオーダーの厚さを有するセルロイドフィルムの
水面の形成を述べる。

【００１４】好ましくは本発明に従って用いられる溶剤
流延法は、溶剤を用いた液体表面に薄ポリマーフィルム
を形成し、そしてその後フィルムが形成されている光学
構造体の表面と液体表面上の薄ポリマーフィルムの間を
相対的に移動させ接触させることを含む。液体表面上の
フィルムの厚さは、大部分は光学構造体の表面上のフィ
ルムの厚さを決定し、さらに液体表面上のフィルムの厚
さはそれ自身用いたポリマーの量および性質、表面積、
および流延法の性質（ここで用いた「流延液体」という
語は、ポリマーフィルムが流延される液体のことを言
う）により左右される。従って、例えば１００mlのアル
ミアセテート中の３ｇの硝酸セルロースの混合物の毛管
からの１滴は、十分多い水の表面に広がり、たった数ナ
ノメーターの厚さの硝酸セルロースのフィルムとなる。

【００１５】流延液体を含む溶剤流延法にかわるものと
して、ある状況においては、光学構造体の表面上に直接
フィルムを流延するか、あるいは他の固体表面上に流延
し、その後光学構造体の表面に移すことが可能である。
ここでさらに詳細に、この光学構造体が回折格子である
好ましい実施態様について述べる。しかし、例えば光導
波管、光ファイバーおよび表面プラズマ共鳴を示す正確
な形状の金属塗布プリズムのような他の光学構造体がす
べて本発明の範囲に含まれることは理解される。

【００１６】前述したように、回折格子の支持体はガラ
スあるいはプラスチック材料を含んでいてよく、ポリカ
ーボネートが特に好ましい。回折格子は、例えば銀、
金、銅、ニッケルあるいはアルミニウムのような金属フ
ィルムで被覆され、蒸着、電気めっき、スパッター、塗
布、塗装、噴霧あるいはその他の方法により形成された
支持体の表面に形成されてもよい。好ましくは、この金
属表面において表面プラズマ共鳴が可能であり、さら
に、銀製であり、真空めっきにより金属フィルムがめっ
きされることである。

【００１７】光透過性モードで回折格子が用いられると
ころでは、金属フィルムは十分薄くなければならない。
例えば銀の場合、最大５０nmであり、光の透過をあまり
妨がないほどである。反射モードで回折格子が用いられ
るところでは、金属層は厚くてもよく、例えば銀の場
合、最大５００nm、好ましくは１００nm付近であり、プ
ラスチックやガラスのような支持体の表面の回折格子パ
ターンに良好な反射面を与えるよう十分密であることが
好ましい。

【００１８】金属化回折格子の表面にポリマーフィルム
を塗布する特に好ましい方法は、以下の工程を含む。 １．金属化ポリカーボネート回折格子を流延液体、好ま
しくは脱イオン蒸留水を含む槽の中へ入れること、 ２．流延液体の表面上に望むポリマーの薄フィルムを形
成すること、 ３．流延液体を通し回折格子をもち上げ、液体表面上の
ポリマーフィルムを付着させるか、あるいは流延液体を
この槽から排水し、液体レベルが下がるとともに液体の
表面のポリマーフィルムを低下させ、金属化回折格子の
表面全体に付着させること、このどちらのケースにおい
ても回折格子の表面から容易に流延液体を除くことがで
きるように、この回折格子は水平面に対し、わずかな角
度をもって配置されている。

【００１９】上述したように、バイオセンサーとして回
折格子を用いようとするところでは、特異的結合パート
ナーの溶液は、温度、圧力、湿度等の調節された状態
で、調節されている間ポリマーと接触したままでいるこ
とが好ましい。このプロセスは通常「クリーンルーム」
条件下で行なわれるべきであり、特に結合パートナーが
生物的に活性な物質である場合、汚染および変性あるい
は不活性化を避けるため、そのような物質の取り扱いに
はあらゆる通常の用心をはらわなければならない。

【００２０】余分な溶液はポリマー表面から除くことが
好ましく、吸引あるいは洗浄により回収してもよく、お
よび循環してもよく、あるいは洗い流してもよい。最終
塗布回折格子は乾燥させてもよく、あるいは、「クリー
ンルーム」条件下で他の処理および組合せをしてもよ
い。特異的結合パートナーを固体相支持体に結合させる
技術は文献に述べられている。この結合パートナーは、
ポリマーに直接、あるいは間接的のどちらでも結合して
よい。間接的結合は、例えば特異的結合パートナーで与
えられる薬剤Ｚと選択的に相互作用する薬剤Ｙのポリマ
ーへの結合により行なわれてもよい。そのような場合、
この薬剤Ｚは、例えば特異的結合パートナー抗原が薬剤
Ｙとすれば、抗体はＺに相当するようなものである。Ｚ
は例えばイソチオシアン酸フルオレセイン、イソチオシ
アン酸ローダミン、２，４−ジニトロフルオロベンゼ
ン、イソチオシアン酸フェニル、あるいは塩化ダンシル
である。これとは別に薬剤ＹおよびＺは特異的結合蛋白
質であり、例えばアビジンおよびビオチンのようなリガ
ンドに相当する。

【００２１】本発明の本質的特徴ではないが、ポリマー
へ結合パートナーの共有結合を与えることも望ましい。
直接あるいは間接のいずれかによるポリマーへのこの特
異的結合パートナーの結合はポリマー層を活性化するこ
とにより容易になり、結合に遊離反応性基を与える。従
って、例えば硝酸セルロースは、pH１０〜１１の水溶液
中で臭化シアンによって活性化される。典型的には、セ
ルロース表面は調節された時間、典型的には数分間、上
記の限界内にpHを調節して臭化シアンと接触している。
この反応の後、回折格子を臭化シアン溶液からとり出
し、冷蒸留水で洗い、その後所望により乾燥し、抗体あ
るいは抗原蛋白質のような結合パートナーに適用するま
で保存する。

【００２２】活性化ポリマー表面への特異的結合パート
ナーの結合は、都合のよいことに、上述したような反応
性基が与えられることによってポリマーが活性化された
ポリマー表面に特異的結合パートナーの溶液が接触し、
結合パートナーがポリマー表面の反応性基に付き、ある
いは結合することにより行なわれる。典型的には、この
溶液の小滴をポリマー表面につけ、調節環境下（特に乾
燥を防ぐため湿気を調節した環境下）、およびクリーン
ルーム条件下で調節時間（典型的には数時間のオーダ
ー）そのままにしておくと、十分な量の結合パートナー
がポリマーの表面に結合する。

【００２３】しかし、臭化シアンの使用は、ポリマーに
結合する物質が蛋白質以外、例えば抗原性多糖である場
合適当でない。本発明は広い用途を有し、単に１つの例
として小供の病気におけるＡ群の連鎖球菌性バクテリア
あるいはバクテリア抗原の検出に用いられてもよい。し
かし塗布した回折格子および本発明により製造されるバ
イオセンサーは、その用途に制限はなく、回折格子の表
面に適当な結合パートナーが結合するような、どんな診
断試験に用いてもよい。

【００２４】本発明は特にこの後、特異的結合パートナ
ーあるいはリガンドとして抗体あるいは抗原に関して述
べる。しかし、本発明は抗体あるいは抗原の検定に用い
るに適当なバイオセンサーの製造方法を限定しようとす
るものではなく、サンプル中のあらゆる化学的生化学
的、あるいは生物的種を検出するため用いてよい、本発
明の方法により製造されるバイオセンサーの範囲内に含
まれる。本発明の方法により製造される光学構造物に固
定される適当な結合パートナーと本発明の方法により検
出されるリガンドの例を以下の表Ｉに示す。

【００２５】 表Ｉ ───────────────────────────────── リガンド 特異的結合パートナー ───────────────────────────────── 抗原 特異的抗体 抗体 抗原 ホルモン ホルモン受容体 ホルモン受容体 ホルモン ポリヌクレオチド鎖 補足ポリヌクレオチド鎖 アビジン ビオチン ビオチン アビジン Ａ蛋白質 免疫グロブリン 免疫グロブリン Ａ蛋白質 酵素 酵素助因子（基質） あるいは阻害因子 酵素助因子（基質） 酵素 あるいは阻害因子 レクチン 特異的カルボヒドラーゼ レクチンの特異的カルボヒドラーゼ レクチン ───────────────────────────────── 本発明の方法は広く適用できるが、特に以下のものの検
出に適したバイオセンサーを提供するため用いられる。
それは、ペプチドホルモン（例えば甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性
腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）、インシュリンおよびプロラクチン）および非ペプ
チドホルモン（例えばコルチゾール、エストラジオー
ル、プロゲステロンおよびテストステロンのようなステ
ロイドホルモンあるいはチロキシン（Ｔ４）およびトリ
ヨードチロニンのような甲状腺ホルモン）を含むホルモ
ン蛋白質（例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびアルフ
ァフェト蛋白（ＡＦＰ））、薬剤（例えばジゴキシ
ン）、糖、毒素、ビタミン、ビールス、バクテリア、あ
るいは微生物である。

【００２６】ここで用いられた「抗原」という語は、以
下の範囲を含む。 ａ）あらゆる種類の綱あるいは亜綱の免疫グロブリン、
例えばＩｇＧ，ＩｇＭ、であり、従来用いられたあらゆ
る動物、例えば羊、ウサギ、ヤギあるいはマウスより誘
導されたもの、 ｂ）モノクローナル抗体、 ｃ）モノクローナルあるいはポリクローナル抗体の完全
な分子あるいは「フラグメント」であり、そのフラグメ
ントは抗体結合部位を含み、すなわち、Ｆｃ部分（例え
ばＦａｂ，Ｆａｂ′，Ｆ（ａｂ′）_Z ）が全くないフラ
グメントであり、あるいはジスルフィドの還元開裂によ
り得られる「半分子」フラグメントが抗体中の重鎖成分
と結合する。

【００２７】抗体のフラグメントの調整方法は技術的に
周知であり、ここでは述べない。ここで用いた「抗原」
という語は不変の抗原種（例えば、蛋白質、バクテリ
ア、バクテリアフラグメント、細胞、細胞フラグメント
およびビールス）および適当な条件下で抗原になるヘプ
タンの両方を含む。以下の実施例は硝酸セルロースフィ
ルムの製造およびその後回折格子にうつし、そのような
ポリマー塗布格子の表面への生物物質の結合あるいは吸
着を述べたものである。硝酸セルロースフィルムの製造および回折格子上への転
移 ポリマーフィルムの製造およびその回折格子上への転移
に用いるすべての溶液および流延液を濾過し不純物を除
き、すべての操作はクリーンルーム中で行なう。

【００２８】好ましい方法において、流延タンクは、水
面の面積が覆うべき格子の面積より大きい（５倍あるい
はそれ以上）ように選ばれる。これは回折格子が流延ポ
リマーフィルムの端で覆われないことを確かにする。と
ても薄いポリマー層が必要なところでは、流延タンクの
表面は、あらゆる端作用を避けるため流延フィルムの面
積より十分大きい、例えば５倍以上、ことが好ましい。
しかし、厚いフィルムに関しては、流延液の表面の環内
にこのポリマーを流延することが好ましく、その面積
は、ポリマー層の厚さを調節して容易に合わせることが
できる。

【００２９】タンクはきれいにし、特にグリース、界面
活性剤あるいは他の汚染物を除き、回折格子支持体をタ
ンクの底におく。この支持体は、例えば流延フィルムと
回折格子が接触し、間から排水するよう水平に対し少し
の角度で配置されたワイヤーグリッドを含む。タンクに
蒸留水を満たす。ポリマーフィルムを回折格子によく接
着させるため、この水のpHあるいはイオン強度を調節す
ることは有利ではあるが必須ではない。水のレベルは、
この支持体にのっている回折格子の表面より上にしなけ
ればならない。

【００３０】回折格子は、格子側を上にして水を入れる
前あるいは後に支持体の上におく。回折格子は流延タン
クに入れる前に清潔にしておき、界面活性剤あるいは他
の汚染物がないようにしておく。水面が静置したら、硝
酸セルロース溶液、例えば酢酸アルミ中の硝酸セルロー
ス、を１滴水面の中央に落とす。水面に界面活性剤がな
いと、硝酸セルロース溶液は円形面に広がり、数秒でこ
の液体フィルムは乾燥する。このフィルムの乾燥速度
は、流延タンクに、中央に小さな穴のあいたふたをし、
そこからセルロース溶液を加えることによって調節して
よい。均一のフィルム層で、反射した光の干渉色が、フ
ィルムが乾燥しうすくなるにつれて観察される。

【００３１】約１６nmの厚さのポリマーフィルムは１０
μｌの９％硝酸セルロース溶液（１００mlの酢酸アルミ
中９ｇの硝酸セルロース）を加えることにより製造され
る。このフィルムが乾燥したら、タンクの底の栓より水
を排水し、乾燥したポリマーフィルムを回折格子の表面
へおろす。回折格子と支持体をタンクから静かに除き、
数分間乾燥するよう放置する。

【００３２】硝酸セルロースの銀塗布ポリカーボネート
回折格子への接着は、pHが、例えばＮａＯＨの添加によ
って９に調節された蒸留水上でのポリマーフィルムの流
延により増す。その他のどの溶剤流延性ポリマーの使用
も、正しい溶剤および流延面の選択により可能である。
従って、例えば酢酸セルロースフィルムは酢酸アルミよ
り、ポリスチレンはキシレンより、ポリイソブチレンは
石油エーテルおよび塩化ポリビニルより流延してもよ
く、酢酸コポリマーフィルムは水面上でシクロヘキサン
より流延することができる。ある環境下では、従来の技
術を用いて、流延液上の溶液の広がりを増すことが必要
である。

【００３３】フィルムの厚さは、以下のことの注意深い
選択によって調節される。 −ポリマー溶液濃度 −流延液表面に用いる材料の容積 −溶剤のタイプ 例えば酢酸アルミは両親媒性であり、きれいな水の表面
上に急速に広がる。他の溶剤はフィルム厚の増加を伴な
い、急速には広がらない。

【００３４】この技術は水面上での流延に限定されず、
他の液体も流延面に用いてよく、用いられる溶剤はかな
り不混和性で、ポリマー含有溶液は流延液より密度が低
い。従って、例えばエチルセルロースは水銀上に流延す
ることができ、ジイソシアネートはポリオールと共に水
銀上に流延することができ、ゼラチンは四塩化炭素上に
水から流延することができる。また、固体表面にポリマ
ーを流延する、溶剤流延法を用いて、薄ポリマー層を製
造することが可能である。従って例えば、ポリエチレン
テレフタレートはトリフルオロ酢酸より、ポリカーボネ
ートはジクロロメタン、ポリビニルホルマールはジオキ
サンより、ポリスルホンはクロロホルムより、酢酸セル
ロースはアセトンより、ポリプロピレンはキシレンより
流延することができ、各ケースにおいて適当な支持体上
でおこなわれる。ポリマーが流延液上で流延される場
合、この流延液は、その中に入れた回折格子の材料と相
溶性でなければならず、ポリマーが固体表面に流延され
る場合、流延の前に溶液中にポリマーを入れるために用
いられる溶剤は、固体表面の材料と相溶性でなければな
らないことは理解できる。ポリマー表面への生物物質の結合 回折格子上の硝酸セルロースポリマー面への生物分子の
３種類の異なる結合方法は、以下のように考えられる。

【００３５】ａ）共有結合 ｂ）非共有吸着 ｃ）硝酸セルロース内に閉じ込められたポリマーへの生
物分子の共有結合 ａ）共有結合 セルロース材料への蛋白質のような生物物質の共有結合
のため確立した方法が存在する。公表された方法は、ポ
リマーユニットを修飾し、例えば遊離アミノ基のような
典型的な蛋白質基に共有結合する反応性基を形成するよ
うな化学薬剤の使用を含む。

【００３６】通常用いられる化学薬剤は以下のものを含
む。 −臭化シアン −塩化トシル −チタン錯体 −カルボジイミド −塩化シアヌル −オキシラン −過沃素酸塩 ｂ）非共有吸着 生物分子、例えば羊の血清蛋白質、リボヌクレアーゼお
よび免疫グロブリンはとても有効に硝酸セルロースに結
合することがわかった。単に室温あるいはそれ以下で水
性蛋白質溶液を加えるだけで、水、緩衝液、あるいは洗
浄液で洗っただけでは容易に除去できないような結合し
た蛋白質となる。

【００３７】例えば、硝酸セルロースを塗布した格子
を、室温で２時間、１０mg／mlの羊γ−グロブリン、５
０mMのＮａＨＣＯ₃ 、pH９中でインキュベーションする
と、回折格子に蛋白質が広く付着する。種々の処理、例
えば緩洗浄液（５％ツイーン２０）、緩衝液（５０mM
ＮａＨＣＯ₃ ）、ｎ−ヘプタン、およびpH２からpH１
０．６の間のpH循環も蛋白の結合に影響を与えなかっ
た。より強い洗浄液処理（例えば２％ＳＤＳ）は硝酸セ
ルロースフィルムに害を与えることがわかった。

【００３８】ｃ）反応性ポリマー閉じ込め この方法は回折格子層の２つの重要な機能を分けてい
る。それは −格子表面に接合および配位 −蛋白質あるいは他の生物物質あるいは結合パートナー
への反応性、 そして各要求を分離ポリマーにみたす。

【００３９】モノマー材料を、回折格子にはったポリマ
ー中に拡散させる。そしてモノマーを重合させ、第１の
付着したポリマー中に第２のポリマーの網状構造を巻き
込む。第２のポリマーは、蛋白質あるいは他の生物分子
と反応性の化学基を有するよう選ばれる。従って、例え
ば、ここで述べた方法に従って硝酸セルロースを塗布し
た回折格子を室温で３０分間、１％水性グルタルアルデ
ヒドモノマー溶液pH５．５とインキュベートする。次い
でpHを１０に合わせ、回折格子を３０分間放置し、グル
タルアルデヒドを重合させる。重合は２３５nmの光吸収
測定で調べる。このような技術は以前に述べられている
（ＵＳ−４００１５８３参照）。ポリグルタルアルデヒ
ド中の遊離反応性カルボニル基をポリマー層の表面で暴
露する。

【００４０】これらの回折格子を蛋白溶液、例えば５mg
／mlの牛γ−グロブリンあるいは５mg／mlのリボヌクレ
アーゼ、を５０mMのＮａＨＣＯ₃ 、pH９中で１晩４℃で
処理すると、蛋白質とポリグルタルアルデヒドの強力な
結合となり、これはポリグルタルアルデヒドのカルボニ
ル基と蛋白質のアミノ基の間の強力な結合の結果である
と考えられる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 有機ポリマーの薄層を有する光学構造体
   を具備する、リガンドを検出するためのバイオセンサー
   であって、前記有機ポリマーの薄層が、溶剤を用いて液
   体表面上に有機ポリマーの薄膜を形成し、次いで光学構
   造体と液体表面上の前記有機ポリマーの薄膜とを相対的
   に移動させ接触させることを含む溶剤流延法により形成
   され、検出を望むリガンドの特異的結合パートナーが前
   記有機ポリマーに直接もしくは間接的に吸着もしくは結
   合しているバイオセンサー。
2. 【請求項２】 前記光学構造体が回折格子である、請求
   項１記載のバイオセンサー。
3. 【請求項３】 サンプル中のリガンドを検出する方法で
   あって、このサンプルを、有機ポリマーの薄層を有する
   光学構造体を具備し、前記有機ポリマーの薄層が、溶剤
   を用いて液体表面上に有機ポリマーの薄膜を形成し、次
   いで光学構造体と液体表面上の前記有機ポリマーの薄膜
   とを相対的に移動させ接触させることを含む溶剤流延法
   により形成され、検出を望むリガンドの特異的結合パー
   トナーが前記有機ポリマーに直接もしくは間接的に吸着
   もしくは結合しているバイオセンサーと接触させ、そし
   てリガンドと特異的結合パートナーの間の錯体の形成に
   よりバイオセンサーの光学特性が変化するかどうかを測
   定し、かつ所望によりその変化の程度及び／又は速度を
   測定することを含む方法。