JPH0870851A

JPH0870851A - 希土類元素集積微生物

Info

Publication number: JPH0870851A
Application number: JP21101494A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Kawai; 啓一河合; Hironori Murase; 博宣村瀬; Toru Suzuki; 徹鈴木; Hiroaki Horitsu; 浩章堀津; Kazuhiro Takamizawa; 一裕高見澤
Original assignee: C C I KK; CCI KK
Current assignee: C C I KK; CCI KK
Priority date: 1994-09-05
Filing date: 1994-09-05
Publication date: 1996-03-19
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: JP3591886B2

Abstract

(57)【要約】【構成】希土類元素を集積しうるバリオボラックス属
（Variovorax）に属する希土類元素集積微生物。【効果】効率よく希土類元素を集積する能力を有する
希土類元素集積微生物を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な希土類元素集積
微生物に関するものである。詳しく述べると、本発明
は、効率よく希土類元素を集積する能力を有する希土類
元素集積微生物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】希土類元素は、周期表中では自然界に存
在する最大の元素グループであり、原子番号５７番のラ
ンタン（Ｌａ）から７１番のルテチウム（Ｌｕ）までの
１５元素（ランタノイド）にスカンジウム（Ｓｃ）とイ
ットリウム（Ｙ）を加えた１７個の元素群の総称であ
り、モナザイト(monazite)、バストネサイト(bastnaesi
te) 、ゼノタイム(zenotime)、ユウクセナイト(euxenit
e)及びガドリナイト(gadolinite)等の鉱物中に含まれて
いる。これらのうち、主に軽希土（ランタンからユウロ
ピウム）の資源としてモナザイト及びバストネサイト
を、また、重希土（ガドリウムからルテリウム）の資源
としてゼノタイムを工業的規模で分解精練することによ
って、それぞれの希土類元素が資源として得られる。

【０００３】また、希土類元素は、イオンの不完全充填
状態の４ｆ電子の挙動に基づく磁気的性質及び色などの
光学的性質、さらには希土類独特の化学的性質により様
々な広範囲な分野において使用されている。具体的に
は、４ｆ電子の性質を利用したものとしては、カラーテ
レビ受像機のブラウン管の赤色蛍光体（ユウロピウム）
やクォーツの腕時計やウォークマン等の小型電子機器に
おける磁石（サマリウムやネオジム）が、また、化学的
性質を利用したものとしては、ガソリンの製造に使用さ
れる触媒（ランタンやセリウム）、酸化物高温超伝導
体、水素吸蔵合金、セラミックスおよび原子炉の制御材
等がそれぞれ挙げられる。

【０００４】従来、希土類元素を捕集することができる
微生物としては、特開昭５９−１１８，８２５号に記載
されている微生物がある。しかしながら、特開昭５９−
１１８，８２５号は、活性汚泥を用いてイットリウムを
選択的に捕集する方法を開示しているのみであり、具体
的に微生物を特定するまでには至っていない。

【０００５】このため、希土類元素を効率的に集積する
特定された微生物については今日まで報告された例はな
かった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、希土類元素を効率的に集積することのできる微生物
を提供することを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記諸目的は、希土類元
素を集積しうるバリオボラックス属（Variovorax）に属
する希土類元素集積微生物によって達成される。

【０００８】本発明は、希土類元素のうち特にイットリ
ウム、ランタン、セリウム、プラセオジムおよびネオジ
ムを効率よく集積する希土類元素集積微生物を示すもの
である。本発明はさらに、受託番号がＦＥＲＭＰ−１
４４９２号である希土類元素集積微生物を示すものであ
る。

【０００９】

【作用】本発明による微生物は、バリオボラックス属
（Variovorax）に属し、希土類元素を効率的に集積する
ことができることを特徴とする微生物であり、この微生
物の具体例としては、バリオボラックスパラドクス
（Variovorax paradoxus）Ｒ−１株が挙げられ、この菌
株は、以下のスクリーニング方法によって得られたもの
である。なお、以下のスクリーニング方法では自然界で
最も多く存在するイットリウム（Ｙ）を希土類元素とし
て使用して、スクリーニングを行った。

【００１０】低栄養状態でも増殖できる微生物に希土類
を集積する能力を備えた目的とする菌株が存在する可能
性が高いとの推測から、スクリーニングは２回に分け
て、つまり、一次スクリーニングとして低栄養性細菌の
探索を行った後、二次スクリーニングとして培養液中の
イットリウム濃度を減少させる菌株の選抜を行った。本
発明によるスクリーニング方法を以下に具体的に記載す
る。

【００１１】谷汲神社（岐阜県谷汲村）の土壌から採取
した試料をそのままあるいは滅菌水で１０〜１０³倍に
希釈したものを１００μｌずつコンラージ棒で、以下の
方法で作製された一次スクリーニング用寒天培地（ｐ
Ｈ：７．２〜７．４）に塗抹し、この寒天培地を３０℃
で７〜１０日間培養した。次に、寒天培地上に形成され
たコロニーを釣菌し、滅菌水１０ｍｌに懸濁してさらに
これを１０²〜１０⁴倍に希釈した後、同様の寒天培地
に１００μｌずつ塗抹し、さらにこの操作を数回繰り返
して菌株を純化した。このような一次スクリーニングに
よって、栄養分の稀薄な状態においても増殖可能な細菌
が得られた。一次スクリーニング用寒天培地の作製方法：栄養分
１／１００の肉汁培地（ポリペプトン０．０１％、肉
エキス０．０１％、ＮａＣｌ０．００５％、ｐＨ
７．２〜７．４）（以下、１／１００希釈肉汁培地と称
する）を調製し、これに寒天１．５％（ｗｔ／ｖ）を添
加して高圧滅菌したものをシャーレに約２５ｍｌずつ分
注して平板培地とした。

【００１２】次に、以下の方法で作製された、無菌処理
済みの二次スクリーニング用液体培地（５ｍｌ）中に、
上記一次スクリーニングで純化した各単離菌を白金耳で
一白金耳ずつ接種し、３０℃で７日間振盪培養した。さ
らに、以下の方法にしたがって培養上清中に残存するイ
ットリウム（Ｙ）濃度を測定し、培養上清中のＹ濃度が
初濃度（５ｐｐｍ）の５０％未満となった菌を候補菌と
して選別した。この際、選別された菌株は再度二次スク
リーニング用培地（以下、Ｙ含有培地と称する）に接種
して同様の操作を繰り返し、Ｙ濃度減少に関する再現性
を確認した。このようにして希土類元素を効率的に集積
する菌株をスクリーニングした。二次スクリーニング用培地の作製方法：肉汁（ポリ
ペプトン１％、肉エキス１％、ＮａＣｌ０．５
％、ｐＨ７．２）を脱塩水で１／１００倍に希釈し、こ
の希釈培地に５％（ｖ／ｖ）の硝酸水溶液（１モル／リ
ットル）を中和するのに相当する量［０．１％（ｖ／
ｖ）］の５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を予め加え、この
溶液を攪拌しながらｐＨが約７．２になるように硝酸イ
ットリウム溶液を徐々に滴下し、これを脱塩水で１リッ
トルとし、０．２μｍの滅菌済フィルターで濾過滅菌
し、これを二次スクリーニング用培地（Ｙ濃度：５ｐｐ
ｍ）とした。なお、この二次スクリーニング用培地は表
１の組成を有する。

【００１３】

【表１】

【００１４】また、培養上清中に残存するイットリウム
（Ｙ）濃度の測定方法を以下に記載する。スクリーニン
グする菌株を接種、培養した後のＹ含有培地１．５ｍｌ
をエッペンドルフ遠心管に入れ、遠心分離（１２，００
０ｒｐｍ、４℃、１０分間）することによって得られた
培養上清１ｍｌに、０．５ｍｌ０．１％アルセナゾII
I(Arsenazo III)溶液、０．５ｍｌ塩酸・塩化カリウ
ム緩衝溶液（３０ｍｌ０．２ＭＫＣｌ、２０ｍｌ
０．２ＭＨＣｌ及び５０ｍｌ脱塩水を混合して１０
０ｍｌに定容し、ｐＨが約１．５となった溶液）および
１ｍｌ脱塩水を加え、この混合溶液の６５５ｎｍの吸
光度を測定することによって、標準直線に基づいてイッ
トリウム（Ｙ）の濃度を求めた。なお、この際、イット
リウムの標準直線は、原子吸光用の硝酸イットリウム溶
液［１モル／リットルの硝酸溶液におけるＹ（ＮＯ₃）
₃濃度＝１．０ｍｇＹ／ｍｌ］（和光純薬製）を使用す
る以外同様の操作を用いることによって作成した。

【００１５】上記スクリーニングによって得られた菌株
の菌学的性質を以下に示す。

【００１６】（ａ）形態１）細胞の形および大きさ：かん菌で（０．６〜
０．９）μｍ×（３．０〜４．０）μｍ２）細胞の多形性の有無：無し３）運動性の有無：無し４）胞子の有無：無し（ｂ）培養的性質１）肉汁寒天平板培養（３０℃、２４時間）：コロ
ニーは円形で表面は滑らかで光沢のある黄色を呈する。
コロニーの大きさは、３０℃で２日間培養した際、直径
約２ｍｍである。２）肉汁寒天培地（３７℃）： − 肉汁寒天培地（４５℃）： − （ｃ）生理学的性質（３０℃、７２時間）１）グラム染色： − ２）カタラーゼ：＋３）オキシダーゼ：＋４）Ｏ−Ｆテスト：＋（若干酸化発酵）５）硝酸塩の還元：＋６）インドールの生成： − ７）グルコースからの酸の生成： − ８）アルギニンデヒドロラーゼ： − ９）ウレアーゼ： − １０）エスクリン加水分解： − １１）ゼラチン加水分解： − １２） β−ガラクトシダーゼ： − １３）グルコース同化： − １４）アラビノース同化： − １５）マンノース同化： − １６）マンニトール同化： − １７）Ｎ−アセチルグリコサミン同化： − １８）マルトース同化： − １９）グルコネート同化：＋２０）カプレート同化：＋２１）アジペート同化：＋２２）マレート同化：＋２３）シトレート同化： − ２４）フェニルアセテート同化： − ２５）チトクロムオキシターゼ：＋（ｄ）生理的性質の補足（３０℃、７日）１）Ｔｗｅｅｎ８０加水分解：＋２）グルコースＯＦからの酸の生成：＋（僅かに）３）フルクトースＯＦからの酸の生成：＋４）キシロースＯＦからの酸の生成： − ５）３．５％ＮａＣｌ中での生育： − ６）ＮＯ₂−Ｎ₂： − ７）アセトアミドのアルカリ化：＋８）アラントインのアルカリ化：＋９）酒石酸のアルカリ化：＋１０）ウレアーゼ：＋（僅かに）１１）ゼラチン分解： − １２）デオキシリボヌクレアーゼ： − １３）リシンデカルボキシラーゼ： − １４）シトレートの利用：＋１５）グルコースの利用：＋（僅かに）本菌は、バージーズマニュアルオブシステマティ
ックバクテリオロジー（Bergey´s Manual of System
atic Bacteriology 8th ）による分類が不可能であった
ため、本菌の同定をザインターナショナルコレクシ
ョンオブインダストリアルアンドマリーンバ
クテリアリミテッド（ＮＣＩＭＢ）(The Ntional Col
lection of Industrial and Marine Bacteria Limited)
に依頼（参照番号：ＩＤ２５９１／ＮＣＩＤ３４１
５、日付：１９９４年７月１８日の報告書類における菌
株Ｆ）したところ、バリオボラックスパラドクス（Va
riovorax paradoxus）に近似していることが分かった
（参考文献：インターナショナルジャーナルオブ
システマティックバクテリオロジー（International
Journal of systematic Bacteriology）１９９１年４１
（３）、４４５〜４５０頁、インターナショナルジャ
ーナルオブシステマティックバイオテクノロジー
（International Journal of systematic Bacteriolog
y）１９９１年４１（３）、４２７〜４４４頁、ジャー
ナルオブクリニカルマイクロバイオロジー（Jour
nal of Clinical MicroBaiology ）１９８６年２３巻、
９２０〜９２３頁）。

【００１７】従来まで、バリオボラックスパラドクス
（Variovorax paradoxus）が希土類元素を集積するとい
う報告はなく、本菌は明らかに公知の菌種と区別される
ため、本発明の微生物を新規な微生物であると判断し、
本菌株をバリオボラックスパラドクスＲ−１（Variov
orax paradoxus R-1）（以下、単にＲ−１株と称する）
と命名した。また、このＲ−１株は、平成６年８月２６
日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、
その受託番号はＦＥＲＭＰ−１４４９２号である。

【００１８】本発明の菌株の培養に使用する培地は、固
体または液体培地のいずれでもよく、また、本細菌が資
化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄
養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地
のいずれでもよい。

【００１９】本発明の菌株の培養において使用できる炭
素源としては、本菌株が資化できる炭素源であれば特に
制限されない。具体的には、微生物の資化性を考慮し
て、グルコース、フラクトース、マルトース、ガラクト
ース、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜な
どの糖類、肉エキス、ペプトン、麦、米などの天然物、
グルセロール、メタノール、エタノール等のアルコール
類、酢酸、グルコン酸、ピルピン酸、クエン酸等の脂肪
酸類、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のア
ミノ酸などを１種または２種以上選択して使用すること
ができる。

【００２０】本発明の菌株の培養において使用できる窒
素源としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵
母エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイ
ン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカ
ー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機
窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝
酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物よ
り使用する微生物の資化性を考慮して、１種または２種
以上選択して使用する。

【００２１】本発明において使用できる無機塩として
は、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウ
ム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸
塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以
上を使用することができる。また、培地中に、必要に応
じて、植物油、界面活性剤等を添加してもよい。

【００２２】本発明の微生物に効率よく希土類元素を集
積させるために、培地中に希土類元素、より好ましくは
イットリウム、ランタン、セリウム、プラセオジムおよ
びネオジムを、１〜２０ｐｐｍ、より好ましくは２〜１
０ｐｐｍの濃度で、添加することが好ましい。この際、
添加する希土類元素は２種以上の混合物またはミッシュ
メタル等の合金であってもよい。

【００２３】本発明において、培養は、本発明の細菌は
好気性であるため、好気的条件下で行われ、その際の培
養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、
本菌株が増殖できる条件であれば特に制限されない。通
常は、培養温度が、２０〜７０℃、好ましくは２５〜４
０℃であり、また、培養に適当な培地のｐＨは、５〜
９、好ましくは６〜８である。

【００２４】また、本発明において、希土類元素の微生
物からの分離、精製方法としては、上記培養条件下で培
養を行った後、菌体を瀘過あるいは遠心分離等によって
集め、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、
浸透圧差処理、磨砕処理等の物理的手段またはリゾチー
ム等の細胞壁溶解酵素処理若しくは界面活性剤との接触
処理等の化学的処理を単独または組み合わせて行うこと
により菌体を破砕し、破砕した菌体から目的とする希土
類元素を、分別結晶法、分別沈殿法、イオン交換クロマ
トグラフィー法および溶媒抽出法等の既知の方法を単独
若しくは組み合わせて用いて精製する方法が挙げられ
る。破砕した菌体からの希土類元素の精製法としては、
手間、時間および費用の点から、溶媒抽出法、特に溶媒
抽出操作を連続して行う向流多段抽出法が好ましく用い
られる。

【００２５】本発明の微生物は、希土類元素を効率よく
集積する特性を有するが、従来、バリオボラックス属
（Variovorax）に属し、上記特性を有する微生物に関す
る報告はなかった。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。

【００２７】実施例１０．２μｍのポリサルホン製滅菌済フィルターで濾過滅
菌したＹ含有培地（Ｙ濃度：５ｐｐｍ）５ｍｌに斜面培
地よりＲ−１株を一白金耳接種して、３０℃で２４時間
振盪培養することによって前培養を行った。このように
して得られた培養液５ｍｌを、同様にして瀘過滅菌した
Ｙ含有培地１００ｍｌの入った５００ｍｌの枝付き坂口
フラスコに入れ、３０℃で１５日間本培養を行った。こ
の培養期間中、２４あるいは４８時間おきに培養液を５
ｍｌずつ採取し、採取した培養液について、作用におい
て記載した測定方法にしたがってＹ濃度を測定すると同
時に、６６０ｎｍの波長での濁度（ＯＤ₆₆₀）および培
養液のｐＨを測定した。なお、濁度については、フラス
コの側面にある試験管状部分に培養液を流し込み、ここ
に測定器を差し込んで計測を行った。

【００２８】このようして得られた培養時間に対するＲ
−１株の培養液のＹ濃度の変化および濁度及びｐＨの変
化を図１に示す。図１に示されるように、Ｒ−１株の培
養によるＹ濃度は、培養開始後、短時間（６日間）で濃
度が０付近に到達し、その後はほぼ一定を保つことか
ら、Ｙ濃度の変化が指数曲線に近い形を描いていること
が分かる。また、細菌は指数関数状に増殖し、Ｒ−１株
によるＹ濃度の減少曲線が上記増殖曲線と対称的である
ことから、Ｙ濃度の減少はＲ−１株の生物学的活動によ
るものであると考えられる。

【００２９】実施例２０．２μｍのポリサルホン製滅菌済フィルターで濾過滅
菌したＹ含有培地（Ｙ濃度：５ｐｐｍ）５ｍｌにＲ−１
株を斜面培地より一白金耳接種し、３０℃で７日間振盪
培養する。７日間培養した後のＹ含有培養液１．５ｍｌ
をエッペンドルフ遠心管に入れ、遠心分離（１２，００
０ｒｐｍ、４℃、１０分間）することによって培養上清
液を得た。続いて、上記遠心分離によって得られた沈殿
（菌体）に１５０ｍＭのＮａＣｌを１ｍｌを加えて懸濁
させ、これを再度遠心分離にかけ、上清液を得た。この
操作を計３回繰り返し、上清液を合わせて洗浄液とし
た。

【００３０】このようにして洗浄された沈殿（菌体）に
１５０ｍＭのＮａＣｌを１ｍｌを加えて懸濁させた。こ
の懸濁液を超音波破砕機（ブランソン製（ＢＲＡＮＳＯ
Ｎ）、デューティ（Ｄｕｔｙ）：３０、出力：３、３０
秒×５回）を用いて破砕処理を行なうことによって菌体
を破砕し、０．５ｍｌの１５０ｍＭＮａＣｌをさらに
加えて遠心分離し、細胞抽出液を得た。そして遠心後の
菌体の残渣に０．５ｍｌの濃硫酸、０．５ｍｌの濃硝酸
を加え加熱し酸分解させ、これに１５０ｍＭのＮａＣｌ
を１ｍｌ加え、菌体の残渣液を得た。

【００３１】なお、比較として、大腸菌（Escherichia
coli ＩＦＯ１０４１）を用いて同様の評価を行なっ
た。

【００３２】得られた各画分に含まれるＹ濃度を誘導結
合プラズマＩＣＰを用い測定した。その結果を図２に示
す。

【００３３】この結果より明らかなように、大腸菌では
全く集積されていなかったＹが、Ｒ−１株では初期濃度
の約７０％近く菌体に集積されていることがわかる。

【００３４】実施例３図３に記載の各希土類元素［ランタノイド（Ｌａ〜Ｌ
ｕ）及びイットリウム（Ｙ）］の硝酸塩溶液を硝酸イッ
トリウム溶液の代わりに用いる以外は表１と同様の培地
組成を有する希土類元素含有液体培地を孔径０．２μｍ
のポリサルホン製滅菌済フィルターで瀘過滅菌した。こ
の希土類元素含有液体培地（各希土類元素濃度：５ｐｐ
ｍ）５ｍｌに、斜面培地よりＲ−１株を一白金耳ずつ接
種して、３０℃で７日間振盪培養し、培養液中に含まれ
る各希土類元素濃度を測定し、初濃度に対する減少率を
算出した。なお、各希土類元素の濃度の測定方法は、使
用する希土類元素が異なる以外は作用において記載され
たイットリウム濃度の測定方法と同様であるが、６５５
ｎｍの波長における感度が元素ごとに異なるため、標準
曲線を各元素ごとに作成した。

【００３５】結果を図３に示す。図３に示されるよう
に、原子量の小さい方（図３の左側）に減少率の高い物
質が偏っており、プラセオジム（Ｐｒ）がやや低い（２
２％）が、イットリウムからネオジムまでが４０％前後
の比較的高い減少率を示している。また、高い減少率を
示すランタンからネオジムの元素はすべて原子価が３以
上に限定されることから、イットリウムおよび軽希土の
うち原子価が３以上に限定される元素を用いた場合に減
少率が高くなっていると考えられる。

【００３６】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によるバリオ
ボラックス属（Variovorax）に属する微生物は新規な微
生物であり、希土類元素、特にイットリウム、ランタ
ン、セリウム、プラセオジムおよびネオジムを効率よく
集積できるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の微生物による希土類元素集積
能を説明するための培養時間に対する培養液中のイット
リウム（Ｙ）濃度の変化、および培養液の濁度及びｐＨ
の変化を示すものである。

【図２】図４は、Ｙの分布状況を示す図である。

【図３】図３は、本発明の微生物によるランタノイドに
対する選択性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】希土類元素を集積しうるバリオボラック
ス属（Variovorax）に属する希土類元素集積微生物。
【請求項２】希土類元素のうち特にイットリウム、ラ
ンタン、セリウム、プラセオジムおよびネオジムを効率
よく集積する、請求項１に記載の希土類元素集積微生
物。
【請求項３】受託番号がＦＥＲＭＰ−１４４９２号
である、請求項１から３のいずれかに記載の希土類元素
集積微生物。