JPH09154591A - フェルラ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】オイゲノールを原料としてフェルラ酸を効率よ
く蓄積し得る菌株および、この菌株を用いてフェルラ酸
を効率よく製造する方法を提供すること。 【解決手段】 オイゲノールのフェルラ酸への変換能を
有する菌株を用いて、オイゲノールを基質とする休止菌
体反応を行い、反応液中のオイゲノールを効率的にフェ
ルラ酸に変換させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オイゲノールを資
化する菌株をオイゲノールが含まれた休止菌体反応液中
で、接触させ、オイゲノールをフェルラ酸に変換させ、
休止菌体反応液からフェルラ酸を得ることを特徴とする
フェルラ酸の製造法に関する。

【０００２】

【背景技術】フェルラ酸は植物の細胞壁の構成成分であ
り、医薬品、化粧品、農薬、食品添加物、飼料添加物、
液晶等の原料として広範な用途が期待されている物質で
ある。フェルラ酸はバニリンとマロン酸の縮合反応によ
ってできることが知られている（ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサエティ７４巻５３４６頁（１
９５２年））が、この方法は製造に３週間程かかるので
工業的な方法ではない。米糠廃油等をアルカリ加水分解
してフェルラ酸を得る方法も知られているが（特告平７
−７８０３２号公報）、この製法もコストが高くつき、
実用的ではない。一方、安価なオイゲノールを微生物に
作用させてバニリン関連物質を製造する試みがなされて
いるが、（特開平５−２２７９８０号公報、特開平３−
３０６８３号公報、特開昭６２−１９００９２号公報、
アグリカリチュラル・バイオロジカル・ケミストリー４
１巻９２５−９２９頁（１９７７年）及び同誌４７巻２
６３９−２６４０頁（１９８３年））いずれもバニリン
またはバニリン酸は生成するものの、フェルラ酸の効率
的な製造には成功していない。また、これらの方法は、
微生物を培養した後の培養液からフェルラ酸を精製して
得るもので、コストと時間を要し実用的ではない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】フェルラ酸には広範な
用途が期待できるものの、フェルラ酸の実用的な製造方
法が見いだされていなかったため、その利用が妨げられ
ていた。本発明者らは、かかる課題を解決するために鋭
意検討した結果、オイゲノールを資化する微生物を土壌
より探索し、得られた菌株を用いてオイゲノールを基質
とする休止菌体反応を行い、反応液中のオイゲノールを
効率的にフェルラ酸に変換させる方法を見いだした。す
なわち、本発明は、オイゲノールを原料としてフェルラ
酸を効率よく蓄積し得る菌株および、この菌株を用いて
フェルラ酸を効率よく製造する方法を提供することを目
的としている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】

（１）オイゲノールのフェルラ酸への変換能を有する菌
株を、オイゲノールが含まれた休止菌体反応液中でオイ
ゲノールと接触させて該オイゲノールをフェルラ酸に変
換させ、これを採取することを特徴とするフェルラ酸の
製造法。 （２）オイゲノールのフェルラ酸への変換能を有する菌
株がシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas f
luorescens) Ｅ118(FERM P-15185)である前記第１項記
載のフェルラ酸の製造法。 （３）オイゲノールが含まれた休止菌体反応液が水不溶
性有機溶媒を１種以上含んだものである前記第１項記載
のフェルラ酸の製造法。 （４）水不溶性有機溶媒が、炭素数が６から２０までの
飽和炭化水素またはトルエンである前記第３項記載のフ
ェルラ酸の製造法。 （５）オイゲノールが含まれた休止菌体反応液が界面活
性剤を１種以上含んだものである前記第１項、第３項ま
たは第４項のいずれか１項記載のフェルラ酸の製造法。 （６）オイゲノールのフェルラ酸への変換能を有するシ
ュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluores
cens) Ｅ118(FERM P-15185)。

【０００５】土壌よりオイゲノールのフェルラ酸への変
換能を有する菌を得る方法としては、オイゲノールを単
一炭素源とした培養液で公知の方法により集積培養を行
うのがよい。たとえば、集積培養液５０ｍＬに土壌試料
２ｇを入れ２８℃で７ないし１０日間培養し、得られた
培養液一滴をさらに新たに調製した同一組成の培養液に
移し７ないし１０日間培養する。同じ操作をさらに３回
繰り返し、最終の培養液中のフェルラ酸を薄層クロマト
グラフィー等の方法で測定する。該培養液から、フェル
ラ酸を検出できた菌、すなわち、オイゲノールのフェル
ラ酸への変換能を有する菌を得る。

【０００６】オイゲノールのフェルラ酸への変換能を有
する菌であればいかなる微生物でも本発明に利用できる
が、特に活性の高いＥ118株が好ましい。Ｅ118株は、グ
ラム陰性のかん菌で運動性があり芽胞を生成しない。普
通ブイヨン寒天平板培地で３０℃、７２時間培養した時
のコロニーの性状は３乃至４ｍｍの直径で鈍黄色、円
形、全縁状、半透明、低い凸状であり、蛍光色素を産生
した。３７及び４１℃で生育せず、カタラーゼ、オキシ
ダーゼ活性がともに陽性、ブドウ糖ＯＦ試験では陰性で
あった。これらの結果から、Ｅ118株はシュードモナス
・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)と同定
し、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。寄
託番号はFERM P-15185である。

【０００７】本発明において、フェルラ酸は以下のよう
にして製造される。まず、休止菌体反応に用いる菌体を
得るために、オイゲノール資化菌をオイゲノールを含ん
だ培養液で好気的に培養する。培養液は、オイゲノール
を含んでいて本菌が生育するものであればいかなるもの
でも良いが、好ましくは、オイゲノールを０．１から
０．４％（ｖ／ｖ）、しょ糖０．５から３％（ｗ／
ｖ）、ペプトン０．０５から０．２％（ｗ／ｖ）、硫酸
マグネシウム７水塩０．０１から０．１％（ｗ／ｖ）、
酵母エキス０．１から１％（ｗ／ｖ）及び金属塩混液
０．０５から０．２％（ｖ／ｖ）からなり、ｐＨ６．５
から８．０の培養液が用いられる。金属塩混液は脱イオ
ン水１Ｌ中に塩化カルシウム２水塩０．４ｇ、ほう酸
０．３ｇ，硫酸銅５水塩０．０４ｇ，よう化カリウム
０．１ｇ，硫酸第一鉄７水塩０．２ｇ，硫酸マンガン７
水塩０．４ｇ，モリブデン酸ナトリウム２水塩０．２ｇ
を溶かした溶液からなるものが好ましい。培養は３０℃
で１８から４８ないし７２時間通気攪拌培養する。培養
後、培養液を遠心分離またはろ過などして菌体を得、得
られた菌体０．５ｇ（湿重量）に対して、１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬの割合で懸濁し、菌
体懸濁液を調製する。休止菌体反応のための反応液は、
菌体懸濁液と中性付近の緩衝液および反応基質であるオ
イゲノールが含まれるものであればいかなる組成のもの
でも良い。反応液中のオイゲノールの濃度は、菌体に対
して毒性を現さない５から１０ｍＭ程度のものが好まし
い。オイゲノールが反応液から消費されて無くなる場合
は逐次、反応液に添加しても良い。

【０００８】界面活性剤あるいは水不溶性有機溶媒を反
応液中に添加すると休止菌体反応が促進され、２０から
８０ｍＭのさらに高濃度のオイゲノールをフェルラ酸に
転換することができる。界面活性剤は菌体に対して毒性
を持たず休止菌体反応を活性化するものであればいかな
るものでも良いが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪
酸エステル、デオキシコール酸、ドデシル硫酸ナトリウ
ム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシル
トリメチルアンモニウム、３−［（３−コラミドプロピ
ル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、
ｎ−オクチルグルコピラノシド、ポリオキシエチレンア
ルキルフェニルエーテル、アルコキシポリオキシエチレ
ンリン酸エステルの内のいずれかを反応液中に０．１か
ら５％（ｗ／ｗ）の間の濃度で添加するのが好ましい。
水不溶性有機溶媒は炭素数が６から２０までの直鎖状飽
和炭化水素あるいはトルエンのいずれかを反応液中に２
から３０％（ｗ／ｗ）の間の濃度で添加するのが好まし
い。

【０００９】休止菌体反応は２５から３５℃の間の温度
でオイゲノールをもはや消費しなくなるまでの時間、反
応液を振とうあるいは攪拌して行う。この時間は反応器
の容積、反応液中の菌体の量、オイゲノールの量によっ
ても異なるが、好ましくは２から１８時間の間、振とう
あるいは攪拌する。反応液と等量のメタノールを反応液
に加えて休止菌体反応を停止する。炭化水素を添加した
場合は静置してデカンテーション等により炭化水素を取
り除く。その後、遠心分離またはろ過にて反応液から菌
体を除去し上清を得る。次に、公知の方法により上清か
らフェルラ酸を分離し精製する。すなわち、上清に塩酸
を滴加してフェルラ酸の粗結晶を得る。粗結晶を少量の
熱水に溶かし、冷却して再結晶を得る。再結晶を繰り返
して精製フェルラ酸を得る。本願発明の、休止菌体反応
からのフェルラ酸の精製は、先願の培養上清からの精製
と異なり、培地成分や代謝物が極めて少なく、カラム・
クロマトグラフィーが不要であり、非常に容易である。

【００１０】

【実施例】つぎに、実施例により本発明を具体的に説明
する。本発明はこれらの実施例にのみ限定されるもので
はない。

【００１１】フェルラ酸は以下の方法により同定した。 １）薄層クロマトグラフィーによる同定 実施例で調製した上清のベンゼン−ジオキサン−酢酸
（９０：２５：４、ｖ／ｖ）で展開した薄層クロマトグ
ラフィーのスポットのＲｆ値を測定し、標準のフェルラ
酸のＲｆ値である０．５２と比較した。 ２）核磁気共鳴スペクトルによる同定 実施例で得られた試料をジメチルスルホキシドに溶かし
たものをトリメチルシリル化したのち核磁気共鳴スペク
トル法で測定し、標準のフェルラ酸のδ値である３．８
０、６．２８（Ｊ＝１６Ｈｚ）、６．７３（Ｊ＝８Ｈ
ｚ）、７．２０、７．４４（Ｊ＝１６Ｈｚ）及び９．４
６ｐｐｍと比較した。 ３）質量分析スペクトルによる同定 試料の質量分析スペクトルの親ピークを測定し、標準の
フェルラ酸の親ピーク、１９４ｍ／ｚと比較した。 ４）赤外吸収スペクトルによる同定 試料の赤外吸収スペクトルと標準のフェルラ酸の赤外吸
収スペクトルと比較した。

【００１２】実施例１ シュードモナス・フルオレッセンスＥ118 FERM P-15185
をオイゲノール０．１５％（Ｖ／Ｖ）、しょ糖１％（Ｗ
／Ｖ）、ペプトン０．１％（Ｗ／Ｖ）、りん酸２カリウ
ム０．２％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム７水塩０．０
５％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．０３％（Ｗ／Ｖ）及び
金属塩混合液０．１％（Ｖ／Ｖ）からなるｐＨを７．０
に調製した培養液１Ｌで２４時間、通気攪拌培養した。
金属塩混合液として脱イオン水１Ｌ中に塩化カルシウム
２水塩０．４ｇ、ほう酸０．３ｇ，硫酸銅５水塩０．０
４ｇ，よう化カリウム０．１ｇ，硫酸第一鉄７水塩０．
２ｇ，硫酸マンガン７水塩０．４ｇ，モリブデン酸ナト
リウム２水塩０．２ｇを溶かした溶液を用いた。培養後
の培養液を遠心分離して得た菌体を生理食塩水で洗浄
し、生理食塩水に懸濁し、菌体懸濁液を得た。得られた
菌体懸濁液の濃度は０．５ｇ（湿重量）／ｍＬであっ
た。この菌体懸濁液１ｍＬに、１Ｍりん酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬとオイゲノールを１０ｍＭ
となるよう添加し、脱イオン水で２ｍＬにした反応液
を、３０℃で２時間振とうした。その後、２ｍＬのメタ
ノールをこの反応液に加えて反応を停止した後、遠心分
離して菌体を除去し、上清について上記の方法でフェル
ラ酸の同定を行い、また、高速液体クロマトグラフィー
でフェルラ酸の定量分析を行った。高速液体クロマトグ
ラフィーは、サイズが４．６×１５０ｍｍのＯＤＳ Ｃ
１８カラムを用い、メタノール：脱イオン水：酢酸＝４
５：５２：３の成分比の溶出液を毎分１．０ｍＬの流速
で流して展開し、２８０ｎｍでの吸光度を検出した。標
準のフェルラ酸の保持時間である３．４分付近のピーク
をフェルラ酸とした。この結果、９．８ｍＭのフェルラ
酸が検出され、変換率は９８％であった。

【００１３】実施例２ 実施例１に準拠して得た菌体懸濁液１ｍＬ，１Ｍりん酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬに、オイゲノ
ール及び各種の界面活性剤のうち１種を添加し、オイゲ
ノールを４０ｍＭ及び界面活性剤を２％（Ｗ／Ｗ）とな
るよう脱イオン水で２ｍＬにした反応液を、３０℃で３
時間振とうした。ただし塩化ドデシルトリメチルアンモ
ニウムは０．２５％（ｗ／ｗ）を添加した。界面活性剤
を含まない休止菌体反応液についても、同時に並行して
行った。２ｍＬのメタノールを加えて反応を停止した
後、遠心分離して菌体を除去し、上清について実施例１
に準拠して、高速液体クロマトグラフィーで分析した。
その結果、表１に示すように、実験に用いた各種界面活
性剤の、休止菌体によるフェルラ産の生成促進効果が認
められた。

【００１４】

【表１】

【００１５】実施例３ 実施例１に準拠して得た菌体懸濁液１ｍＬに、１Ｍりん
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍＬと、オイゲ
ノール及び各種水不溶性有機溶媒を添加し、オイゲノー
ルが４０ｍＭ及び各種水不溶性有機溶媒が２０％（Ｗ／
Ｗ）となるよう脱イオン水で２ｍＬにした反応液を３０
℃で２０分間振とうした。有機溶媒を含まない休止菌体
反応液についても、同時に並行して行った。２ｍＬのメ
タノールを加えて反応を停止した後、５分間静置した。
休止菌体反応液の下層を取り出して、それを遠心分離し
て菌体を除去し、上清について実施例１に準拠して、高
速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、表２
に示すように実験に用いた各種の水不溶性有機溶媒によ
る休止菌体のフェルラ酸生成反応の促進効果が認められ
た。

【００１６】

【表２】

【００１７】実施例４ 実施例１に準拠して得た菌体懸濁液１０ｍＬに、１Ｍり
ん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍＬとオイゲノー
ル及びツィーン２０を添加し、オイゲノールが２０ｍＭ
及びツィーン２０が２％（Ｗ／Ｗ）となるよう脱イオン
水で２０ｍＬにした反応液を３０℃で振とうした。２時
間後、反応液中のオイゲノール濃度を測定したところ、
オイゲノールががなくなっていたので、２０ｍＭとなる
ようオイゲノールを反応液に添加した。反応開始から４
時間後および７時間後にも同様に反応液中にオイゲノー
ルがなくなっていたので、２０ｍＭとなるようにオイゲ
ノールを逐次添加した。１２時間反応後、２０ｍＬのメ
タノールを加えて反応を停止した後、遠心分離して菌体
を除去し、上清を得た。上清に塩酸を滴加してｐＨを４
とし、１夜静置してフェルラ酸の粗結晶を得た。粗結晶
を１ｍＬの熱水に溶かし、塩酸を滴加してｐＨを４と
し、冷却して再び結晶を得た。同じ操作をもう一度繰り
返して精製フェルラ酸０．２ｇを得た。フェルラ酸の同
定は上記の方法により行った。

【００１８】

【発明の効果】本願発明によって、オイゲノールを原料
としてフェルラ酸を効率よく多量に製造できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:39）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】オイゲノールのフェルラ酸への変換能を有
   する菌株を、オイゲノールが含まれた休止菌体反応液中
   でオイゲノールと接触させて該オイゲノールをフェルラ
   酸に変換させ、これを採取することを特徴とするフェル
   ラ酸の製造法。
2. 【請求項２】オイゲノールのフェルラ酸への変換能を有
   する菌株がシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudom
   onas fluorescens) Ｅ118(FERM P-15185)である請求項
   １記載のフェルラ酸の製造法。
3. 【請求項３】オイゲノールが含まれた休止菌体反応液が
   水不溶性有機溶媒を１種以上含んだものである請求項１
   記載のフェルラ酸の製造法。
4. 【請求項４】水不溶性有機溶媒が、炭素数が６から２０
   までの飽和炭化水素またはトルエンである請求項３記載
   のフェルラ酸の製造法。
5. 【請求項５】オイゲノールが含まれた休止菌体反応液が
   界面活性剤を１種以上含んだものである請求項１、請求
   項３または請求項４のいずれか１項記載のフェルラ酸の
   製造法。
6. 【請求項６】オイゲノールのフェルラ酸への変換能を有
   するシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas f
   luorescens) Ｅ118(FERM P-15185)。