JPH0870878A - トロポロニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は（１）トロポロン並びに（２）
（ａ）β−クロロアラニン、（ｂ）ピルビン酸及びアン
モニア叉は（ｃ）セリンからなる基質にチロシンフェノ
ールリアーゼを水性媒体中で作用させることにより、目
的とするＬ−トロポロニルアラニンを製造する方法であ
る。 【効果】 本発明によると抗菌剤として期待できる目的
とするＬ−トロポロニルアラニンのみを製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＬ−トロポロニルアラニ
ンの製造法に関し、詳しくはチロシンフェノールリアー
ゼ（別名β−チロシナ−ゼともいう）の作用により、Ｌ
−トロポロニルアラニンを製造する方法に関する。この
Ｌ−トロポロニルアラニンは抗菌剤や抗虫剤として、ま
たアミノ酸アナログとしての代謝拮抗剤としての利用が
考えられている。

【０００２】

【従来の技術】従来、トロポロニルアラニンは合成法で
の製造は報告されているが（The Bul-letin of the Che
mical Society of Japan, Vol 33, No8, pp 1084-1086,
(1960)）、ＤＬ体の製造が主たるものである。従っ
て、Ｌ体のみを得る為には製造したＤＬ体を光学分割す
るか、叉はＬ体のみを不斉合成するかのいずれかの方法
を取らなければならなかった。しかしながら、現時点で
は技術的な理由からいずれも成功していない。

【０００３】さて、チロシンフェノールリアーゼの利用
法としてはＬ−ド−パやＬ−チロシンの製造法が知られ
ている（特公昭４８−１６１９４、特公昭５１−５４７
５、特公昭５３−４３５９４）のみで、Ｌ−トロポロニ
ルアラニンの製造法については報告されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はチロシ
ンフェノールリアーゼを利用して、これまで反応基質と
考えられていなかったトロポロンからＬ−トロポロニル
アラニンのみを効率よく製造する方法を提供することに
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の課題
を解決するために、種々検討を行った結果、チロシンフ
ェノールリアーゼの作用により（１）トロポロン並びに
（２）（ａ）β−クロロアラニン、（ｂ）ピルビン酸及
びアンモニア叉は（ｃ）セリンからＬ−トロポロニルア
ラニンのみが効率良く生成されることを見出し、本発明
を完成に至らしめた。即ち、本発明は（１）トロポロン
並びに（２）（ａ）β−クロロアラニン、（ｂ）ピルビ
ン酸及びアンモニア叉は（ｃ）セリンからなる基質にチ
ロシンフェノールリアーゼを水性媒体中で作用させ、該
水性媒体中にＬ−トロポロニルアラニンを生成せしめ、
Ｌ−トロポロニルアラニンを採取することを特徴とする
Ｌ−トロポロニルアラニンの製造法である。以下に本発
明を詳細に説明する。

【０００６】本発明において使用されるチロシンフェノ
ールリアーゼに特に制限はないが、微生物由来のものが
好ましい。チロシンフェノールリアーゼを産生する能力
を有する微生物としては、具体的には以下に示すような
ものがある。 エルビニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola) ATCC 2
1433, ATCC21434 シトロバクター・フロインデイー(Citrobacter freundi
i) ATCC 6750 エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) ATCC 15289 プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis) ATCC 152
90 エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)
ATCC 7256 フラボバクテリウム・フラベッセンス(Flavobacterium
flavescens) ATCC 8315 アクロモバクター・キャンデイカンス(Achromobacter c
andicans) OUT 8005シンビオバクテリウム・サーモフィラム (Symbiobacterium thermophilum) 尚、上記微生物は一例に過ぎず、チロシンフェノールリ
アーゼを産生する能力を有する微生物であれば如何なる
微生物でも使用できる。

【０００７】（１）トロポロン並びに（２）（ａ）β−
クロロアラニン、（ｂ）ピルビン酸及びアンモニア叉は
（ｃ）セリンからなる基質にこれらの微生物を作用させ
る方法は、液体培地中に本微生物を培養する際に（１）
トロポロン並びに（２）（ａ）β−クロロアラニン、
（ｂ）ピルビン酸及びアンモニア叉は（ｃ）セリンから
なる基質を添加し、培養しながら反応させてもよいし、
叉は本微生物を培養した後、微生物の培養物、菌体、菌
体処理物、菌体の蛋白質画分または種々の精製段階の酵
素等を上記基質に作用させてもよい。

【０００８】上記微生物を培養するための培地としては
通常の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培
地が用いられる。さらに高い酵素活性を得る為にはビタ
ミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加することが望
ましい。特にチロシンフェノールリアーゼを誘導する為
にＬ−チロシンの添加は有効である。尚、必要なＬ−チ
ロシンの量は使用する微生物菌株によっても多少相違す
るが、通常０．０１％以上であり、０．１％〜０．５％
程度が好ましい。また一般に反応活性を高めるために培
地中にビタミンＢ６類を添加することも有効で、その添
加量は培地中０．５ｍｇ／ｄｌ以上である。

【０００９】炭素源としては、グルコースやシュクロー
ス等の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その
他が適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガ
ス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が用いられ
る。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イ
オン、カリウムイオン、鉄イオン、その他が必要に応じ
適宜使用できる。また、培養は好気条件下に通常、ｐＨ
５．０〜８．５、温度１５〜４０℃の適当な範囲に制御
しつつ、１ないし３日間培養を行なえば良い。即ち、上
記微生物を用いて培養中に目的とするＬ−トロポロニル
アラニンを生成させる為には、基質である（１）トロポ
ロン並びに（２）（ａ）β−クロロアラニン、（ｂ）ピ
ルビン酸及びアンモニア叉は（ｃ）セリンを添加し、上
記のｐＨ，温度にて培養すれば良い。尚、基質となるト
ロポロンやβ−クロロアラニン等は培養の開始時に添加
してもよいし、培養途中に添加してもよい。

【００１０】また、上記微生物を上記培地で、かつ上記
培養条件で培養した培養物は高いチロシンフェノールリ
アーゼ活性を含むので菌体を未分離のまま酵素源として
用いても良く、また菌体を一旦培養液より分離して洗浄
叉は洗浄せずに使用してもよい。また、菌体処理物を酵
素源として用いることもでき、このような菌体処理物と
しては、機械的摩砕菌体、超音波にて処理した菌体、凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、リゾチウム等の酵素で
処理した菌体、界面活性剤、トルエン等で処理した菌
体、菌体の蛋白質画分、これらの固定化物叉はその他が
適宜用いられる。要は酵素活性が維持されている限り使
用できるわけである。さて、該酵素源を水性媒体中にて
基質である（１）トロポロン並びに（２）（ａ）β−ク
ロロアラニン、（ｂ）ピルビン酸とアンモニア叉は
（ｃ）セリンから選ばれたものに作用させるには、該酵
素源を上記基質を含む水性媒体に溶解または懸濁させ、
各水性媒体をｐＨ５〜１０、温度を０〜６０℃の適当な
条件に調節しつつ暫時静置または攪拌すればよい。

【００１１】尚、Ｌ−トロポロニルアラニンを生成せし
める反応において、トロポロンの使用量は特に制限され
ないが、通常バッチ法で行う場合には０．０１から０．
２Ｍ、好ましくは０．０５から０．１５Ｍ程度である。
また、他方の反応基質としては（ａ）β−クロロアラニ
ン、（ｂ）ピルビン酸とアンモニア、及び（ｃ）セリン
のいずれかを使用すればよく、その使用量は上記トロポ
ロンの１から６倍モル程度を用いればよい。これらは反
応開始時に全量加えても良く、また反応の進行に伴い、
逐次分割添加しても良い。

【００１２】使用されるβ−クロロアラニンはβ−クロ
ロ−Ｌーアラニン、β−クロロ−Ｄーアラニン、β−ク
ロロ−ＤＬーアラニンのいずれでもよく、またセリンも
Ｌーセリン、Ｄーセリン、ＤＬ−セリンのいずれでもよ
い。また、β−クロロアラニン等に代えて、Ｏ−エチル
セリン、Ｏ−ｎ−プロピルセリン、Ｏ−イソプロピルセ
リン、Ｏ−ｎ−ブチルセリン、Ｏ−ｓｅｃ−ブチルセリ
ン、Ｏ−ｎ−アミルセリン、Ｏ−イソアミルセリン、Ｏ
−シクロペンチルセリン、Ｏ−２−プロペニルセリン、
Ｏ−２−プロピニルセリン、Ｏ−２−ブテニルセリン、
Ｏ−３−メチル−２−ブテニルセリンなどのセリン誘導
体も基質として使用可能である。しかし好ましくは、
（ａ）β−クロロアラニン、（ｂ）ピルビン酸とアンモ
ニア叉は（ｃ）セリンが好ましい。尚、Ｌ−トロポロニ
ルアラニンの確認、定量は薄層クロマトグラフィーおよ
び高速液体クロマトグラフィーを用いる通常の方法によ
り行える。

【００１３】

【実施例】以下に本発明を実施例に従って具体的に説明
する。尚、本発明は実施例に限定されるものでは無い。

【００１４】（実施例１）ブイヨン寒天培地（スラン
ト）で３０℃、一晩培養した菌株Erwinia herbicola AT
CC21434 の１スラント分を、同じブイヨン培地５００ｍ
ｌを含む３Ｌ容フラスコに接種し、３０℃で一晩振盪培
養した。このシード培養液をマンニット０．５ｇ／ｄ
ｌ、グリセロール０．６ｇ／ｄｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０
５ｇ／ｄｌ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５ｇ／ｄｌ、
大豆蛋白質酸加水分解物１．０ｇ／ｄｌ、Ｌ−アラニン
０．４ｇ／ｄｌ、グリシン０．３ｇ／ｄｌ、ＤＬ−メチ
オニン０．１ｇ／ｄｌ、Ｌ−グルタミン酸０．４ｇ／ｄ
ｌ、Ｌ−チロシン０．１ｇ／ｄｌ、Ｌ−フェニルアラニ
ン０．２ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．００５ｇ
／ｄｌ、ＺｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．００１ｇ／ｄｌ、塩
酸ピリドキシン０．０２５ｇ／ｄｌを含む培地（ｐＨ
７．５）の３０Ｌ張り込みのジャーに接種し、３０℃で
一晩、通気攪拌培養を行った。

【００１５】これらの培養液３０Ｌより、遠心分離（１
０，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）により菌体を採取
し、生理食塩水で１回洗浄し、同じ遠心分離条件で菌体
を集めた。この菌体の１／４量を０．２ｍＭピリドキサ
ールリン酸（ＰＬＰ）、５ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルと４ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含
む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４００ｍｌ
を加えて懸濁し、氷冷中でトータル２０分間、超音波処
理を行い、細胞を破壊後、４℃で１０，０００ｒｐｍ、
２０分間遠心分離を行い、その上清液を得た。こうして
得た上清液を上述のリン酸バッファーで一晩、透析を行
い、再度、遠心分離により、その上清液を得た。これを
無細胞抽出画分とした。

【００１６】この無細胞抽出液より硫酸アンモニウム処
理で３０−８０％の沈澱画分を調製し、透析後、ＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社製）カラムクロマトグラフィーを、さらにＢｕｔ
ｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ（東ソー社製）カラ
ムクロマトグラフィーを行い、精製酵素標品を得た。こ
のチロシンフェノールリアーゼの精製標品２ｍｇを、１
０ｍＭトロポロン、１０ｍＭβ−クロロ−Ｌ−アラニ
ン、０．０５ｍＭピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、１
００ｍＭ水酸化ナトリウム及び１００ｍＭリン酸バッフ
ァー（ｐＨ８．０）を含む反応液２ｍｌに添加し、３０
℃、９０分間反応した。上記の反応系において、対照区
として酵素を除いたもの、基質のトロポロンを除いた区
もそれぞれ設定した。

【００１７】反応後、濃塩酸０．４ｍｌを加えて反応を
停止させ、遠心分離により酵素を除去し、上清液を得
た。これらの３つのサンプルにつき薄層クロマトグラフ
ィーを行い、ニンヒドリンにて生成アミノ酸の分析を行
った結果、反応系の区では２つの対照区にはない、新た
なニンヒドリン発色スポットが認められた。さらにアミ
ノ酸分析をした場合にも、反応系の区ではβ−クロロ−
Ｌ−アラニンとは異なる新たなアミノ酸のピークが認め
られたことから、トロポロニルアラニンの酵素合成が明
らかになった。尚、トロポロンとβ−クロロ−Ｌ−アラ
ニンからトロポロニルアラニンの生成スキームは図１に
示す。

【００１８】（実施例２）実施例１で得たチロシンフェ
ノールリアーゼの無細胞抽出画分１．６ｇを１００ｍＭ
トロポロン、１００ｍＭβ−クロロ−Ｌ−アラニン、
０．０５ｍＭピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、１００
ｍＭ水酸化ナトリウム及び１００ｍＭリン酸バッファー
（ｐＨ８．０）を含む反応液５００ｍｌに添加し、３０
℃、１６時間反応した。なお反応中は２Ｎ水酸化ナトリ
ウムを用いて、ｐＨを８．０に調整した。反応後、濃塩
酸１００ｍｌを加えて反応を停止させ、遠心分離により
酵素を除去し、上清液を濃縮乾固した。エーテルにより
未反応のトロポロンを除去した後、メタノールによりト
ロポロニルアラニンを抽出し、濃縮乾固した。これを１
２０ｍｌの水に溶解し、Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ
（Ｈ⁺）により、目的画分を溶出させたものを濃縮乾固
し、エタノールで抽出した。濃縮乾固後、水−エタノー
ルにより結晶化を行った。収量は約１５ｍｇであった。
結晶標品のアミノ酸分析、紫外線吸収スペクトル、赤外
線吸収スペクトル、ＮＭＲを測定した結果、トロポロニ
ルアラニンであることが確認された。

【００１９】得られた結晶は赤色で、トロポロニルアラ
ニンに鉄イオンがキレートしていると思われたので、
０．２ｍｌの水に溶解し、１ＭＮａＨＳ溶液によって鉄
イオンを取り除いた。しかし、これらの一連の操作によ
り、かなり収率が低下した。また酵素合成された精製ト
ロポロニルアラニンをＬ体特異的及びＤ体特異的アミノ
酸酸化酵素で処理を行い、その分解性を検討した。Ｌ体
特異的アミノ酸酸化酵素で分解され、Ｄ体特異的アミノ
酸酸化酵素で分解されなかったことから、本トロポロニ
ルアラニンはＬ−トロポロニルアラニンであることが確
認された。

【００２０】（実施例３）マンニット０．５ｇ／ｄｌ、
グリセロール０．６ｇ／ｄｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０５ｇ
／ｄｌ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５ｇ／ｄｌ、大豆
蛋白質酸加水分解物１．０ｇ／ｄｌ、Ｌ−アラニン０．
４ｇ／ｄｌ、グリシン０．３ｇ／ｄｌ、ＤＬ−メチオニ
ン０．１ｇ／ｄｌ、Ｌ−グルタミン酸０．４ｇ／ｄｌ、
Ｌ−チロシン０．１ｇ／ｄｌ、Ｌ−フェニルアラニン
０．２ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００５ｇ／ｄ
ｌ、ＺｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．００１ｇ／ｄｌ、塩酸ピ
リドキシン０．０２５ｇ／ｄｌを含む培地（ｐＨ７．
５）を５００ｍｌ容フラスコに５０ｍｌ入れ、１１５゜
Ｃで１５分間殺菌した。これに別殺菌した炭酸カルシウ
ム２ｇを添加し、ブイヨン寒天培地で３０゜Ｃで一晩培
養したErwinia herbicola ATCC21433 を１白金耳接種
し、３０℃、一晩振盪培養した。このフラスコ２０本分
の培養液１Ｌより遠心分離により菌体を集め、生理食塩
水で１回洗浄した菌体を得た。

【００２１】この菌体約１０ｇを１００ｍＭトロポロ
ン、１００ｍＭβ−クロロ−Ｌ−アラニン、０．０５ｍ
Ｍピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、１００ｍＭ水酸化
ナトリウム及び１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．
０）を含む反応液５００ｍｌに添加し、３０℃、１６時
間反応した。なお反応中は２Ｎ水酸化ナトリウムを用い
て、ｐＨを８．０に調整した。反応後、遠心分離により
菌体を除去し、さらに濃塩酸１００ｍｌを加えて反応を
停止させ、遠心分離により蛋白質を除去し、上清液を濃
縮乾固した。エーテルにより未反応のトロポロンを除去
した後、メタノールによりトロポロニルアラニンを抽出
し、濃縮乾固した。それを５０ｍｌの水に溶解し、Ｄｏ
ｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ（Ｈ⁺）により、目的画分を溶出さ
せたものを濃縮乾固し、エタノールで抽出した。濃縮乾
固後、水−エタノールにより結晶化を行った。収量は約
４ｍｇであった。結晶化したトロポロニルアラニンを用
いて、アミノ酸分析、紫外線吸収スペクトル、赤外線吸
収スペクトル、ＮＭＲを測定した結果、トロポロニルア
ラニンであることが確認された。

【００２２】

【本発明の効果】

（１）トロポロン並びに（２）（ａ）β−クロロアラニ
ン、（ｂ）ピルビン酸及びアンモニア叉は（ｃ）セリン
からなる基質にチロシンフェノールリアーゼを水性媒体
中で作用させることにより、目的とするＬ−トロポロニ
ルアラニンのみを取得できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】はトロポロンとβ−クロロ−Ｌーアラニンから
チロシンフェノールリアーゼの作用により、Ｌ−トロポ
ロニルアラニンが生成される機構を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）トロポロン並びに（２）（ａ）β
   −クロロアラニン、（ｂ）ピルビン酸及びアンモニア叉
   は（ｃ）セリンからなる基質にチロシンフェノールリア
   ーゼを水性媒体中で作用させ、該水性媒体中にＬ−トロ
   ポロニルアラニンを生成せしめ、Ｌ−トロポロニルアラ
   ニンを採取することを特徴とするＬ−トロポロニルアラ
   ニンの製造法。
2. 【請求項２】 チロシンフェノールリアーゼがエルビニ
   ア・ヘルビコーラ由来である請求項１記載のＬ−トロポ
   ロニルアラニンの製造法。