JPS59210894A - リジンのラセミ化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はＬ−あるいはＤ−リジンのラセミ化方法に関
する。従来、Ｌ−あるいはＩ）−’Ｊリジン酵素的にラ
セミ化する方法は、いくつか知られている。その方法は
、シュードモナス属、プロテウス属およびエンエリヒア
属細菌の生産するリジンラセマーゼ（ＥＣ，５，１，１
，５）を使用する方法、シュードモナス属細菌の生産す
るアルギニンラセマーゼ（ＥＣ，ｉ、１．９）を使用す
る方法／ニードモナス属細菌の生産するアミノ酸ラセマ
ーゼ（Ｅ　Ｃ、ｓ、＋’Ｍｏ　）　　を使用する方法で
ある（朝食書店、酵素・・ンドブソク、丸尾文治、田宮
信雄監修、１９８２．Ｐ７２８〜７３０）。

本発明者らは、この様な従来のし−あるいはＤ−リジン
のラセミ化法に対し、より効率の良い方法を見い出すべ
く研究した結果、アルカリ土類金属、エアロモナス属、
アースロバフタ−属、アク斤 ロモバクター属、アグロバクψリウム属、アンネトバク
ター属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、コリネバ
クテリウム属、／トロバクター属、キャンディダム、デ
バリオミセス属、エンテロバクタ−属、エルビニア属、
フラボバクテリウム属、ジオトリクム属、ハフニア属、
クルイヘラ属、クレブシェラ属、リポミセス属、ミクロ
コンカス属、ミコプラナ属、ピヒア属、ザルチナ属、セ
ラチア属、サルモネラ属、トリコスポロン属、トリブノ
プソス属、トルロブンス属、ビブリオ属、キサントモナ
ス属に属する微生物が、Ｌ−あるいはＤ−’）ジンをラ
セミ化する事を見い出し、本研究を完成するに至った。

即ち本発明は、Ｌ−あるいはＤ−リジンなラセミ化せし
める能力を有する微生物を水性媒体中にてＬ−あるいは
Ｄ−’Ｊジ／に作用せしめ、Ｌ−リジンなラセミ化せし
めることを特徴とする、Ｌ−あるいはＤ−’Ｊリジンラ
セミ化方法に関する。

本発明の微生物は具体的には以下のものがあるアルカリ
ゲネス　メタル力リゲネス　ＡＪ　　　２５４３　　Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ”１０叫エアロモナス　サルモニシダ　　　
　　　　　ＡＴＣＣ１４１７４アースロバクター　グロ
ビホルミス　　　　　ＡＴＣＣ１３３４４アクロモバク
タ−フ゛チリ　　　　　　　　　　ＡＪ　　　２４３８
　　ＦＥＲＭ−ＰＱＯす１アグロバクテリウム　ノメフ
ァンエンス　　　ＩＦｏ　　３０５８アシネトバクタ−
ルオーフイ　　　　　　　　ＡＴＣＣ９０３６ブレビバ
クテリウム　ケトグルタミカム　　　ＡＴＣＣ１５５８
７バチルス　セレウス　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
３００１コリネバクテリウム　アクアティカム　　　　
ＡＴＣＣ１４６６５ントロバクター　プロインディ　　
　　　　　　　ＡＴＣＣ６７５１キヤンデイダ　アルビ
カンス　　　　　　　　　ＩＦＯ０１９７テハリオミセ
ス　クロニンｌ！Ｉ　　　　　　　　　　ＩＦＯ００３
６二ン蚤ロバクター　クロアカニ　　　　　　　ＡＴＣ
Ｃ７２５６ｚルビ＝７　７ミｃ＋ボー５　　　　　　　
　　　　ＡＪ　　　　２７５８　ＦＥＲＭ−Ｐ　ｑｏｒ
１３フラボバクテリウム　フカツム　　　　　　　　Ａ
Ｊ　　　　２４７Ｂ　ＦＥＲＩ士−ｐ　ＦｒｏＦ；Ｅジ
オトリダム　キャンディダム　　　　　　　　ＩＦＯ４
５９７ハフニア　アルベイ　　　　　　　　　　　　　
　Ｋ代℃　９７６０クルイヘラ　シトロフイラ　　　　
　　　　　　ＡＪ　　　　２６２８　ＦＥＲＪ＋Ｐ　　
３１４９９Ｖブシｘラ　＝５−ｔ−二７ｚ　　　　　　
　　ＡＴＣＣ１５２４７リポミセス　スタルケイ　　　
　　　　　　　　　ＩＦｏ　　　０６７８ミクロコアカ
ス　ローゼウス　　　　　　　　ＡＴＣＣ９８１５ミコ
プラナ　ディモルファ　　　　　　　　　ＡＴＣＣ４２
７９ピヒア　ファリノザ　　　　　　　　　　　　圧０
　　４１３４ザルチア　ルテア　　　　　　　　　　　
　　　ＡＪ　　　　１２］２　ＦＥＲＭ−Ｐ　　ＩＶＤ
Ｎセラチア　マルセノセンス　　　　　　　　　Ａｉ’
ＣＣ１４２２６ザルモネラ　ショートムエレリ　　　　
　　　　ＡＴＣＣ８７５９トリコスポロン　キャピタノ
ム　　　　　　　　ＩＦＯ１１９７トリゴノプンス　パ
リアビリス　　　　　　　　ＩＦＯ４８７６トルロブシ
ス　サケ　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ０６５０
ビブリオ　メチユニコピ　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ
７７０８キサントそナス　コンペストリス　　　　　　
ＡＴＣＣ７３８１等がある。

これらの微生物の菌体を得るには、通常の培地を用いて
、培養の初めから、あるいは培養の途中でＬあるいはＤ
−’Ｊリジン添加して培養すればよい。

源、無機イオンを含有する通常の培地である。

更をこビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加す
ると望ましい結果が得られる場合が多い。

炭素源としては、グルコ−Ｚ１シュクロース等の炭水化
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイオ
ン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。

培養は好気的条件下に、ｐＨ４ないし８、温度２５ない
し４０℃の適当な範囲に制御しつつ１ないし１０日培養
を行えば望ましい結果が得られる。

菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、培養液よ
り分離された菌体、洗浄された菌体など、いづれも使用
可能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体、トルエン、界面活性剤等と接触せしめた菌
体、リゾチームで処理した菌体、超音波にさらした菌体
、機械的に摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物か
ら得られた、ＬあるいはＤ−’）ジンをラセミ化せしめ
る酵素活性を有する酵素蛋白区分、更ンこは、これらの
菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、その他いずれ
も使用できる。

水溶性媒体としては、水、ハソファーおよびエタノール
等の有機溶媒を含むものが使用できる。更に必要に応じ
て、微生物の生育に必要な栄養素、抗酸化剤、界面活性
剤、補酵素、および金属イオン等を水性媒体に添加する
こともできる。

上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しながら、菌体
とＬあるいはＤ−リジンを接触せしめて作用せしめる場
合には、ＬあるいはＤ−リジンを含み、かつ微生物の生
育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を
含む水性媒体が用いられる。更にヒクミン、アミノ酸等
の有機微量栄養素を添加すると舅１ましい結果が得られ
る場合が多い。

炭素源としては、グルコース、シークロース等の炭水化
物、酢酸等の有１人酸、アルコール類、その他が適宜使
用される。窒素源としては、アンモニアガス、アノモニ
ア水、アンモニウム塩、ソの他が用いられる。

無機イオンとしては、マグネンウムイオン、燐酸イオン
、カリイオン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用
される。

培養は好気的条件下に、ｐＨ４ないし８、温度２５ない
し４０℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結果
が得られる。

かくして１ないし１０日間も培養を行えば、しあるいは
Ｄ−リジンは効率よくラセミ化される。

これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、培養菌体
あるいは菌体処理物をＬあるいはＤ−１ジンと接触せし
めて作用せしめる場合には、Ｌあるいは１）−リジンと
培養液、培養菌体あるいは菌体処理物を溶解またはけん
濁した水性媒体を１０℃ないし７０℃の適当な温度に調
節し、ｐＨを４ないし８に保ちつつ、暫時静置または攪
拌すればよい。かくして５ないし１００時間も経過すれ
ば水性媒体中に多量のしあるいはＤ−１ジンのラセミ化
物が生成蓄積される。

このようにして得られたしあるいはＤ−リジンのラセミ
化物を培養液又は水溶液より採取する方法は、イオン交
換樹脂を用いる方法、等電点にて沈澱せしめる方法等、
通常の方法が採用される。

生成したアミノ酸の定電は濾紙」二↑こ展開したアミノ
酸（溶媒　１〕−ブタノール’　酢酸８水＝　２　：１
：１）ニノヒＩ・リノて発色させ、発色部位を５０％エ
タノールで抽出して５７０　Ｉｎμで比色する方法およ
びバイオアッセイで測定する方法を用いた。

光学異性体は結晶の比旋光度を測定する事によってり、
Ｌを定めた。

（実施例１） グルコＺ　０　、５　ｆｊ　／　ｄｅ　ｚ硫安０．３’
／／ｄｌ。

Ｋ］１２　　　Ｐｏ、　　　０．１　　ｆｌ／ｄ１！　
、　　Ｋ、　　ＨＰＯ４０，３Ｗ／ｄｅＭＳ’ＳＯ，・
７Ｈ２ｏｏ、ｏｓｙ／ｄ１！、ＦｅＳＯ４’７Ｈ２００
，００＋　！Ｐ／ｄｅ９ＭｎＳＯ４４Ｈ２００゜ｏｏ＋
　ｙ／ｃｔｅ、　ＱＩＩＵ：ｘキスｏ、ｓ　ｙ／ｃｔｅ
、ポリペブト７０−５　Ｓ’　／　ｄｅ　＋　マル７　
エキスＯ−５ｙ／　ｄ１２　＋　Ｌ−リ７ン塩駿塩０．
３Ｙ／ｄ７！、ビリドキ７ノ塩酸塩＋ｏｍｇ／ｃｔｅお
よび炭酸カル／ラム４？／ｃＵ（別殺菌）（ｐＨ７，ｏ
）をｓｏｏｍｌ容フラスコニ５０ｍｔ入れ、１２０℃で
１５分間殺菌した。

これに」二記寒天培地で３０℃にて２４時間培養した表
−１に示す微生物を一白金耳接種し、３０℃で２４時間
振盪培養した。この培養液より菌体を遠心分動により採
取し、培養液と同量の生理食塩水で一回洗浄し、菌体を
集めた。

この菌体をＤ−リジン塩酸塩１　ｇ、’／ｄ１．および
ピリドキサール５１−リン酸２０ｍ９／ｄｌを含むＯ，
１Ｍ’Ｊン酸緩衝液（１）Ｈ８，０）（終末］　Ｑ　ｍ
ｌ　）　ニ５　？　／ｄｌになる様に添加し、３０℃に
２０時間保持反応した。Ｄ−リジンがラセミ化されて生
成したし一リジンの量なバイオアッセイで測定し、この
結果を表−１（Ｉこ示した。

表　　　−１ 実施例２ 実施例１（こ示したｌｉ′、地からＬ−リン／ｊ篇１峻
塩を除いた培地に実施例１と同様の寒天培地で培養した
アルカリゲイ・ス　メタルカリゲ不ス　ＡＪ２５４３　
　Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−ＰワＯＳ＜　　　を１白金耳後種し
、３０℃て１２時間振盪培養したのち、１０ｉｉ’　／
　ｄｐ　）ｏ　　！Ｊ　ノア　ｇａ酸塩（＋＜　Ｏｔｌ
てｐ　Ｈ７，０Ｅなく）様に中和）溶液を５　ｍｌ！加
えて更に１０時間培養した。Ｄ−リジンがラセミ化され
て生成したＬ−リノ／をバイオアンセイて１ｌｌ１１定
した結果０．３２？／ｄｅの１．−リッツ塩酸塩か生成
していた。

実施例３ 実施例］、、！：同様に培養し、洗浄したフラボバクテ
リ１クム　フカツム　Ａ　Ｊ　　２４７８　　ＦＥＲＭ
−１）１１Ｑテろ　の区１体を、Ｄ　−１）ノン塩ｔｇ
９塩あるいはＬ〜リッツ塩酸塩’　？　／　ｄｌ　＋ピ
リドキサールー５１−リン酸２０ｍ９７ｄｅを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ（８０）（終末！１１００ｍｅ
　）　ニ５　ｇ／ｄｅＥナル様に添加し、３０℃に２４
時間保持した。

この反応液中のリジン全ｍ（Ｄ体、Ｌ体の和）を前述の
比色法で測定し、Ｌ−リジンはパイオア７セイ法て測定
した。この結果を表−２（・こ示した。

表　　　−２ これらの反応液より菌体を遠心分離て除き、ダイヤイオ
ンｓ　＋＜　−Ｉ　Ｂ　（カチオン交換樹脂）を用いて
常広通り、処理した。この溶離液よりリジンを塩酸塩と
して結晶化し、Ｌ−’Ｊシンを基質にした時は、３．４
２＋Ｄ　　’）ジンを基質にした時は３．１７のりノン
塩酸塩を得た。これらの結晶の旋光度を測定したところ
、いづれの場合も旋光度〇て生成物はラセミ体である事
が判明した。

実施例４ 実施例３と同球に培養し、洗浄したアクロモ／・ククー
　ブチリ　ＡＪ　　２４３ｆ（ＦＥＲＭ−’−Ｐ１″Ｉ
Ｏｓ”１　　の菌体を生理食塩水に２（Ｊ？／ｄｅにな
る様に懸重した菌液５　ｍｌに４Ｌ？６アルキン酸す１
−ＩＪウム溶液５　ｍ１４を加え混合したのち、＋　５
　？／ｄｅ塩化カル／ウム溶液に、この混合液を徐４に
滴下し、ピース状の固定化菌体を作成した。この固定化
物金石をＤ−リジノ塩酸塩１？／ｄｅをイζむＯ６１Ｍ
　ｌ）／酸緩衝液（ｐＨ８，０）　２０ｍｅに投入し、
３０℃に５時間、保持反応させた。この結果Ｄ−１）ン
ンはラセミ化され、反応液中には０．３６　？／ｄｅ　
ｔ７）　Ｌ−リジノ塩酸塩か生成していた。

特許出願人　味の素株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. り一あるいはＤ　−ＩＪレジンラセミ化する能力を有す
   るアルカリ土類金属、エアロモナス属、アースロバフタ
   −属、アクロモバククー属、アグロバクテリウム属、ア
   ノ不ｌ・バクター属、ブレビバクテリウム属、バチルス
   属、コリネバクテリウム属、ントロバクター属、キャン
   デイダ属、デバリオミセス属、エノテロバククー属、エ
   ルビニア属、フラボバクテリウム１１’Ｊｉ’　、　　
   ジ第１・リクム属、ハフニア属、クルイヘラ属、クレプ
   ンエラ属、リポミセス属、ミクロコツカス属、ミコプラ
   ナ属、ピヒア属、ザルカカ属、セラチア属、サルモ不う
   属、トリコスポロンＸ’Ａ、トＪグノプ／スＪＬＩ・ル
   ロプシス属、ビブリオ属およびキザントモナス属に属し
   Ｌ−あるいはＤ−リジンをラセミ化せしめる能力を有す
   る微生物を水性媒体中にてＬ−あるいはＤ−’Ｊリジン
   作用せしめ、ＬあるいはＤ−リジンをラセミ化せしめる
   ことを特徴とする、Ｌ−あるいはＤ−リジンのラセミ化
   方法。