JPH0880B2 - 修飾されたヌクレオチドおよびその調製法およびその使用 - Google Patents

修飾されたヌクレオチドおよびその調製法およびその使用

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JPH0880B2
JPH0880B2 JP4166268A JP16626892A JPH0880B2 JP H0880 B2 JPH0880 B2 JP H0880B2 JP 4166268 A JP4166268 A JP 4166268A JP 16626892 A JP16626892 A JP 16626892A JP H0880 B2 JPH0880 B2 JP H0880B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、天然ヌクレオチドの放
射性ラベル体の代替として有用な修飾ヌクレオチドおよ
びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物医学研究および組み換えDNA工学に
用いられる多くの方法は、水素（3H）、リン（32P）、
炭素（14C）あるいはヨード（125I）の同位元素により
放射活性でラベルされた、ヌクレオチド誘導体あるいは
ポリヌクレオチド誘導体の使用に大いに依存している。
そのような放射活性化合物は、使用者が核酸および、科
学的あるいは臨床的に目的とするその他の分子を、非常
に少量しか存在しない場合でも、検出、モニター、位置
決定、あるいは単離することを可能にする、有用な指標
プローブを提供する。今日まで、放射活性物質は、最も
感度が高く、そして多くの場合、多くの重要な実験ある
いは分析試験を行う唯一の手段を提供して来た。しか
し、放射活性化合物の使用には、重大な制限および障害
がある。第一に、放射活性物質を取り扱う人は、潜在的
に危険性のある照射レベルに曝され得るので、放射性同
位元素を調製、使用、および廃棄する期間、入念な安全
措置を維持しなければならない。第二に、放射性ヌクレ
オチドは、購入および使用するのに、非常に費用がかか
る。それは、大部分は、適当な安全装置、生産者/使用
者の健康監視サービス、および廃棄物処理作業を供給す
るのに必要な装置および人力にかかる費用である。第三
に、放射活性物質はしばしば、非常に不安定であり、限
られた保存期間を有し、それはさらに、使用経費を増加
させる。この不安定性は、放射性同位元素そのものの崩
壊に伴う破壊的効果による放射線分解の結果であり、そ
して多くの放射性同位元素（例えば32Pおよび125I）が
たった数日の半減期しか有さないという事実の結果であ
る。
【０００３】ハプテンは抗体に結合し得るが、担体に結
合した場合にのみ免疫反応を開始し得ることが知られて
いる。この性質は検出および同定試験に利用され得る。
【０００４】ビオチンおよびイミノビオチンが、卵白の
68,000ダルトンの糖タンパク質であるアビジンと強く相
互作用することも知られている。この相互作用は、自然
に見られる最も強い非共有結合定数（Kdis=10-15）の１
つを示す。もしアビジンが、例えばフルオレセインある
いはローダミンのような蛍光色素；フェリチン、ヘモシ
アニンあるいはコロイド状金のような高電子密度試薬；
あるいはパーオキシダーゼあるいはアルカリホスファタ
ーゼのような不溶性の反応生成物を沈澱させ得る酵素を
含む、潜在的に証明可能な指標分子に結合されると、ビ
オチンプローブの存在、位置、あるいは量が確立され得
る。イミノビオチンはビオチンよりも弱くアビジンに結
合するが、同様の反応がその検出に使用され得る。さら
に、溶液のpHを下げることによる、イミノビオチン-ア
ビジン相互作用の可逆性は、ある種の適用において、有
意な利点を提供する。
【０００５】ビオチン-アビジン複合体の特異性および
保持力は、近年、細胞上あるいは細胞内の特異的タンパ
ク質、脂質、あるいは糖質の位置を可視的に特定する方
法の開発に使用されて来た（E.A.BayerとM.WilchekのMe
thods of Biochemical Analysis, 26, 1, 1980に総説さ
れている）。染色体中のRNAの位置は、ハイブリダイゼ
ーションプローブ用のRNAに化学的に架橋されたビオチ
ン化タンパク質、チトクロームCを用いて、電子顕微鏡
により決定されてきた。ハイブリダイゼーションの位置
は、アビジン−ビオチン相互作用に仲介されるアビジン
−フェリチンあるいはアビジン-メタクリレート粒子の
結合を通して可視化された（J.E. Manning, N.D. Hersh
ey, T.R. Broker, M. Pellegrini, H.K. Mitchell, お
よびN. Davidson, Chromosoma, 53, 107, 1975； J.E.
Manning, M. PellegriniおよびN. Davidson, Biochemis
try, 61, 1364, 1977; T.R. Broker, L.M. Angerer, P.
H. Yen, N.D. HerseyおよびN. Davidson, Nucleic Acid
Res., 5, 363, 1978； A. SodjaおよびN. Davidoson,
Nucleic Acid Res., 5, 383, 1978）。ポリヌクレオチ
ド配列検出に対するこのアプローチは、高度に反復する
配列の特殊な場合には成功するが、１つ、あるいは少コ
ピー数しか存在しないポリヌクレオチドの分析への一般
的使用法ではない。
【０００６】さらに、ピリミジンおよびプリン環に化学
成分を結合させる方法は知られている。数年前に、簡単
で迅速なアセトキシ水銀化反応が、共有結合した水銀元
素をヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの両方のピリ
ミジン環の5位、プリン環のC-8位、あるいは7-デアザプ
リンのC-7位に導入するために開発された（R.M.K. Dal
e, D.C. LivingstonおよびD.C. Ward, Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A., 70, 2238, 1973; R.M.K. Dale, E. Ma
rtin, D.C. LivingstonおよびD.C. Ward, Biochemistr
y, 14, 2447, 1975）。有機水銀化合物が、パラジウム
触媒の存在下で、オレフィン化合物と反応し、炭素-炭
素結合を形成することも数年前に示された（R.F. Heck,
J. Am. Chem. Soc., 90, 5518, 1968; R.F. Heck, Ibi
d., 90, 5526, 1968; R.F. Heck, Ibid.,90, 5531, 196
8; R.F. Heck, Ibid., 90, 5535, 1968;およびR.F. Hec
k, J. Am. Chem. Soc., 91, 6707,1969）。Bergstromお
よびその共同研究者（J.L. RuthおよびD.E. Bergstrom,
J. Org. Chem., 43, 2870,1978;およびD.E. Bergstrom
およびM.K. Ogawa, J.Am. Chem. Soc., 100, 8106,197
8）およびBiggeら（C.F. Bigge, P. Kalaritis, J.R. D
eckおよびM.P. Mertes, J. Am. Chem. Soc., 102, 203
3, 1980）は、最近この反応工程をC-5が置換されたピリ
ミジンヌクレオチド化合物の合成に利用した。
【０００７】最後に、修飾されたヌクレオチドに特異的
な抗体が調製され得、修飾されたヌクレオチドの特異的
構成物質の単離および特徴付けに使用され得ることが知
られている（T.W. MunnsおよびM.K. Liszewski, Progre
ss in Nucleic Acid Research and Molecular Biology,
24, 109, 1980）。しかし、現在までに調製された、天
然のヌクレオチドに対するいかなる抗体も、ヌクレオチ
ドが二本鎖RNAあるいは二重鎖DNA、あるいはDNA-RNAハ
イブリッド分子中に存在するときにそのヌクレオチド決
定基と反応することが示されていない。
【０００８】放射性ラベルされたプローブあるいはこれ
までに使用されてきた化学的および生物学的プローブの
限界を避けるために、ピリミジンあるいはプリン環に共
有結合したビオチン、イミノビオチン、リポ酸およびそ
の他の決定基を含む、一連の新規なヌクレオチド誘導体
が合成されている。これらのヌクレオチド誘導体および
ポリヌクレオチドおよびそれらを含む補酵素は、アビジ
ンあるいは抗体のようなタンパク質と特異的に、そして
その１つずつと相互作用する。修飾されたヌクレオチド
と特異的タンパク質との相互作用は、生物医学的および
組み換えDNA工学に現在使用されている多くの方法の中
で、核酸成分の検出および位置特定のための放射性同位
元素に代わるものとして使用され得る。これらの、修飾
されたヌクレオチド-タンパク質相互作用を用いる方法
は、放射性同位元素を用いる方法と同等あるいはそれよ
り大きい検出能力を有し、それらはしばしば、より迅速
に、より良い分解能力で行なわれ得る。
【０００９】後に本文中にさらに詳細に述べるように、
これらの新しいヌクレオチド誘導体は、開発されている
標準化された化学的方法によって、比較的安価に調製さ
れ得る。さらに有意義なことには、本発明のどのヌクレ
オチドプローブおよびそれらとともに用いられるタンパ
ク質試薬も放射活性がないので、放射性同位元素を用い
る方法に必要とされる、手の込んだ安全な手順を用いず
にこれらの化合物を調製、使用および廃棄し得る。さら
に、これらのヌクレオチド誘導体は化学的に安定であ
り、数年あるいはそれ以上の使用保存期間を有すると考
えられる。最後に、これらの化合物はより安全で、より
経済的、より迅速そしてより再現性のある研究および診
断方法の開発を可能にする。
【００１０】
【発明の要旨】次の構造式を有する化合物であって；
【００１１】
【化１１１】
【００１２】ここで、Bは糖成分のＣ1'位に共有結合し
たプリン、７−デアザプリンあるいはピリミジン成分を
表し、Ｂがプリンあるいは７−デアザプリンの場合、Ｂ
はプリンあるいは７−デアザプリンのＮ9位において該
結合し、Ｂがピリミジンの場合、Ｎ1位において該結合
し；Ａは、少なくとも３個の炭素原子からなる成分であ
るハプテンあるいはリガンドを表し、該化合物が二本鎖
リボ核酸、二重鎖デオキシ核酸、あるいはDNA-RNAハイ
ブリッドに取り込まれた場合に、ポリペプチドと検出可
能な複合体を形成し得；点線は、ＢとＡをつなぐ化学結
合を表し、Ｂがプリンである場合、該結合はプリンの8
位に結合し、Ｂが7-デアザプリンである場合、該結合は
デアザプリンの7位において結合し、Ｂがピリミジンで
ある場合、該結合はピリミジンの5位において結合し；
そしてｘ，ｙおよびｚの各々は；
【００１３】
【化１１２】
【００１４】を表す、化合物が提供される。
【００１５】この化合物は、直接、あるいはオリゴヌク
レオチドおよびポリヌクレオチドに取り込まれた場合
に、広範囲に有用なプローブを提供する。
【００１６】適用には、染色体、固定された細胞、組織
切片および細胞抽出物中のポリヌクレオチド配列の検出
および位置決定が含まれる。特定の適用には、染色体の
核型決定、核酸を有する病原体、すなわち細菌、ウィル
スあるいは真菌類の臨床診断、および遺伝子疾患の診断
が含まれる。
【００１７】この化合物は、生物医学的研究および組み
換えDNA工学においてプローブとして広範囲に有用であ
る。
【００１８】１つあるいはそれ以上の次の特徴をさらに
有する、この構造に包含される化合物は特に有用であ
る：Ａは非芳香性であり；Ａは少なくともC5であり；Ｂ
とＡをつなぐ化学結合はα-オレフィン結合を含み；Ａ
はビオチンあるいはイミノビオチンであり；そして、Ｂ
はピリミジンあるいは7-デアザプリンである。
【００１９】これらの化合物は、次の工程を含むプロセ
スによって調製され得る： （ａ）次の構造、
【００２０】
【化１１３】
【００２１】を有する化合物を、水銀塩と、適当な条件
下、適当な溶媒中で反応させて次の構造、
【００２２】
【化１１４】
【００２３】を有する水銀化化合物を生成する工程； （ｂ）前記水銀化化合物を、前記水銀化化合物の-Hg+部
分と反応する構造式・・・Ｎで表される化学成分と反応
させる工程であって、この反応が水溶液中K2PdCl4の存
在下で、適当な条件下で行われて、次の構造、
【００２４】
【化１１５】
【００２５】を有する化合物を生成し、ここで、Ｎは反
応性の末端官能基あるいはＡである、工程；および （ｃ）ＮがＡの場合、該化合物を該修飾ヌクレオチドと
して回収する工程、またはＮが反応性末端基である場
合、Ｍが水溶液中で適当な条件下で前記修飾されたヌク
レオチドを生成する、Ｎとの反応性を有する官能基を表
す時、前記化合物をＭ-Ａ構造を有する化合物と反応さ
せて、次いでそれを回収する工程。
【００２６】本発明はまた、次の構造を有する化合物を
提供する：
【００２７】
【化１１６】
【００２８】ここで、Ｂ，Ｂ'およびＢ”の各々は、糖
成分のC1'位に共有結合しているプリン、7-デアザプリ
ンあるいはピリミジン成分を表し、Ｂ，Ｂ’あるいは
Ｂ”がプリンあるいは7-デアザプリンである場合はいつ
も、該プリンあるいは7-デアザプリンのN9位で結合し、
Ｂ、Ｂ’あるいはＢ”がピリミジンである場合はいつ
も、N1位で結合しており、Ａは、少なくとも３個からな
る成分を表し、該化合物が相補的リボ核酸あるいはデオ
キシリボ核酸分子と形成される２重鎖複合体に導入され
る場合にポリペプチドと検出可能な複合体を形成し得、
点線は、ＢとＡとをつなぐ化学結合を表し、Ｂがプリン
である場合、該結合は該プリンの8位で結合しており、
Ｂが7-デアザプリンである場合、該結合は該デアザプリ
ンの7位で結合しており、そしてＢがピリミジンである
場合、該結合は該ピリミジンの5位で結合しており；ｚ
はH-あるいはHO-を表し；そしてｍおよびｎは0から約10
0,000までの整数を表す。
【００２９】これらの化合物は、本発明の修飾されたヌ
クレオチドを含むヌクレオチドの混合物を酵素的に重合
させることにより、調製され得る。かわりに、オリゴヌ
クレオチドあるいはポリヌクレオチド中のヌクレオチド
を、化学的方法を用いて修飾させ得る。
【００３０】本発明の実施により修飾されたヌクレオチ
ドおよび修飾されたヌクレオチドが導入されているオリ
ゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、生物医学的
研究、臨床診断および組み換えDNA工学においてプロー
ブとして使用され得る。これらの多様な有用性は、これ
らの分子のポリペプチドとの安定な複合体を形成する能
力に基づく。このポリペプチドは、ポリペプチド固有の
性質によるか、あるいはポリペプチドと結合あるいは相
互作用する検出可能な成分によって検出され得る。
【００３１】ある種の使用法は、細菌およびウィルスの
ような病原体を含む核酸の検出および同定；抗生物質耐
性菌のスクリーニング；サラセミアおよび鎌状細胞貧血
症のような遺伝子疾患の診断；染色体核型の決定；およ
び腫瘍細胞の同定を含む。
【００３２】
【発明の構成】天然ヌクレオチドの放射性ラベル体の代
替として、概ね適当であるためには、修飾されたヌクレ
オチドが、いくつかの必須の規準を満たされねばならな
い。第一に、修飾された化合物は、独特の、すなわち、
通常、ヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドに付随し
ていない置換基あるいはプローブを有さなければならな
い。第二に、プローブは、鋭敏な検出系を提供するため
に、化学的あるいは生物学的試薬と特異的に反応しなけ
ればならない。第三に、アナログは、一般的に研究され
ている核酸酵素の、比較的効率的な基質でなければなら
ない。なぜならば、多くの実際の適用ではアナログが酵
素によって代謝されることを必要とする。たとえば、ア
ナログは核酸ポリメラーゼの基質として機能しなければ
ならない。この目的のために、プローブ成分は、塩基の
正常なワトソン-クリック水素結合能力を立体構造的に
妨げる、環位置に置かれるべきではない。そうでなけれ
ば、置換基は、ポリメラーゼの基質としての活性のない
化合物を産生する。正常な「アンチ」ヌクレオシド構造
を変化させる環位置における置換もまた、避けねばなら
ない。なぜならば、そのような構造的変化は、通常、ヌ
クレオチド誘導体をポリメラーゼの基質として受容不能
にするからである。通常、そのような配慮から置換位置
は、ピリミジンの5位および、プリンあるいは7-デアザ
プリンの7位に限定される。
【００３３】第四に、検出系は、核酸ハイブリダイゼー
ションの方法論に適合するために、一本鎖および二本鎖
ポリヌクレオチドの両方に導入されたプローブ置換基
と、相互作用することができるべきである。この規準を
満たすために、プローブ成分が、抗体、他の検出用タン
パク質あるいは化学試薬と容易に相互作用し得るよう
に、プリンあるいはピリミジンに、化学結合あるいは
「リンカーアーム」を介して結合させることが好まし
い。
【００３４】第五に、放射性ハイブリダイゼーションプ
ローブを使用する現在の方法を大幅に変更する必要のな
いように、少数のプローブ置換基を有するポリヌクレオ
チドの物理的および生物化学的性質を有意に変化させる
べきではない。この規準は、プローブが酵素によって導
入されても、あるいは直接的化学的手段によって導入さ
れても、満たされねばならない。
【００３５】最後に、プローブ成分を付加する結合は、
正常のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが日常的に
供されるすべての実験条件、たとえば高温での長時間の
ハイブリダイゼーション、フェノールおよび有機溶媒に
よる抽出、電気泳動などにに耐え得るべきである。
【００３６】本文に記載の修飾されたヌクレオチドは、
これらの規準のすべてを満たす。
【００３７】これらの修飾されたヌクレオチドは次の構
造を有する：
【００３８】
【化１１７】
【００３９】ここで、Ｂは、糖成分のC1'位に共有結合
したプリン、7-デアザプリンあるいはピリミジン成分を
表し、Ｂがプリンあるいは7-デアザプリンである場合、
それは該プリンあるいは該7-デアザプリンのN9位に付加
され、Ｂがピリミジンである場合、それはN1位に付加さ
れており；Ａは、少なくとも３個の炭素原子からなる成
分を表し、該化合物が二本鎖リボ核酸、デオキシリボ核
酸の２重鎖あるいはDNA-RNAハイブリッドに導入される
とポリペプチドと検出可能な複合体を形成し得；点線
は、ＢとＡをつなぐ結合基を表し、Ｂがプリンである場
合、該結合はプリンの8位において付加され、Ｂが7-ア
ザプリンである場合、該結合は該デアザプリンの7位に
おいて付加され、そしてＢがピリミジンである場合、該
結合は該ピリミジンの5位において付加されており；そ
してｘ，ｙおよびｚの各々は、
【００４０】
【化１１８】
【００４１】を表す。
【００４２】これらの化合物は、生物医学的研究および
組み換えDNA工学におけるプローブとして広範囲に有用
である。
【００４３】この構造式の範囲に包含されるすべての化
合物は本質的に本発明の実施によって調製および使用さ
れ得るが、ある種の化合物はより容易に調製されるか、
あるいは使用されるか、またはその両方であり、従っ
て、ここでは好ましい。
【００４４】従って、プリン、ピリミジンおよび7-デア
ザプリンが主に有用なものであるが、ピリミジンおよび
7-デアザプリンが好ましい。なぜならば、プリンの8位
における置換によって、ヌクレオチドがポリメラーゼの
基質として無効になるからである。従って、修飾された
プリンは、ある点においては有用であるが、それらは概
してピリミジンおよび7-デアザプリンほど有用ではな
い。さらに、本発明において有用なピリミジンおよび7-
デアザプリンは、当然、各々、5位あるいは7位で置換さ
れてはならない。その結果、チミン、5-メチルシトシン
および5-ヒドロキシメチルシトシンのようなある種の塩
基は有用でない。本発明で、好ましい塩基はシトシン、
ウラシル、デアザアデニンおよびデアザグアニンであ
る。
【００４５】Ａは、少なくとも３個の炭素原子を有する
任意の成分であり得、そして該修飾されたヌクレオチド
が、デオキシリボあるいはリボ核酸を有する２重鎖に導
入される場合に、ポリペプチドと、検出可能な複合体を
形成する能力がある。
【００４６】従って、Ａは、これらの性質を有するすべ
てのリガンドで有り得る。この中には適当な担体に付加
された場合のみ免疫原性があるが、適切な抗体と相互作
用して、複合体を形成できるハプテンを含む。有用な成
分の例は次のものを含む：
【００４７】
【化１１９】
【００４８】これらのうち、好ましいＡ成分は、ビオチ
ンおよびイミノビオチンである。
【００４９】さらに、芳香性成分は、塩基対ヘリックス
構造にインターカレイトする傾向があるので、Ａ成分は
非芳香性であることが好ましい。さらに、小さい成分
は、ポリペプチドとの分子相互作用が十分でないので、
安定な複合体の形成を可能にするに十分な相互作用が起
こるように、Ａは、少なくともC5であることが好まし
い。ビオチンおよびイミノビオチンはこれらの規準の両
方を満たす。
【００５０】ＡとＢをつなぐ結合あるいは基は、炭素-
炭素単結合、炭素-炭素二重結合、炭素-窒素単結合ある
いは炭素-酸素単結合を含む、全ての周知の結合であり
得る。しかし、Ｂのα位におけるオレフィン結合を含む
化学結合が、概して好まれる。そのようなα-オレフィ
ン結合の存在位は、塩基が、周知の二重ヘリックス構造
中の他の塩基と対をなす場合に、Ａ成分を該塩基から離
れたところに保持する役割を果たす。これは、ポリペプ
チドとの相互作用をより容易に起こすことを可能にし、
それによって、複合体の形成が促進される。さらに、よ
り自由に旋回できる単結合は、必ずしもヘリックスから
該成分を十分に離れたところに保持して、該成分がポリ
ペプチドに認識され、ポリペプチドと複合体を形成する
ことを可能にするとは限らない。
【００５１】さらに、第一級アミンから誘導され、-CH2
-NH-構造を有する化学結合基がより好ましい。なぜなら
ば、そのような結合は、どの周知のアミン修飾反応を用
いても容易に形成できるからである。アリルアミンおよ
びアリル-（3-アミノ-2-ヒドロキシ-1-プロピル）エー
テル基から誘導される、好ましい結合の例は、各々、構
造式、
【００５２】
【化１２０】
【００５３】を有する。
【００５４】これらの結合が好ましいが、チオール、カ
ルボン酸およびエポキシド官能基のような、他の修飾可
能な官能基とのオレフィン結合手を含む、他のものも使
用され得る。
【００５５】前記結合基は特異的位置、すなわち、ピリ
ミジンの5位、プリンの8位、デアザプリンの7位に付加
される。前述したように、プリンの8位における置換に
よって、本明細書で議論する全ての方法に有用な修飾さ
れたヌクレオチドは産生されない。窒素原子で占められ
ているプリンの7位が結合を付加できると考えられる位
置であり得る。しかし、現在まで用いられ、本明細書に
議論される化学的置換法はこの目的には適当でない。
【００５６】記号ｘ、ｙおよびｚは、糖成分の5'、3'お
よび2'位に付加された基を表す。それらは次のどれかで
ある。
【００５７】
【化１２１】
【００５８】考えられることではあるが、ｘ、ｙおよび
ｚの全てが同時に同じものであることは、ありにくい。
ｘ、ｙおよびｚの少なくとも１つが、一、二あるいは三
リン酸のどれかのリン酸含有基であり、少なくとも１つ
がHO-あるいはH-であることがより有り得る。容易に理
解されるように、ｚが、HO-あるいはH-であり、各々リ
ボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドを示
すことが最もあり得る。そのようなヌクレオチドの例に
は、5'-リボヌクレオシド一リン酸、5'-リボヌクレオシ
ド二リン酸、5'-リボヌクレオシド三リン酸、5'-デオキ
シリボヌクレオシド一リン酸、5'-デオキシヌクレオシ
ド二リン酸、5'-デオキシヌクレオシド三リン酸、5'p-
リボヌクレオシド-3'p、および5'p-デオキシリボヌクレ
オシド-3'pが含まれる。より特異的な例には、Ａがビオ
チンあるいはイミノビオチンであり、化学結合が、
【００５９】
【化１２２】
【００６０】であり、Ｂがウラシルあるいはシトシンで
ある、このタイプの修飾されたヌクレオチドが含まれ
る。
【００６１】リンカーアームおよびプローブ成分の塩基
への導入に採用される一般的合成方法は本明細書中前記
に述べられている（特に、J.L. RuthおよびD.E. Bergst
rom,J.Org. Chem., 43, 2870, 1978; D.E. Bergstromお
よびM.K.Ogawa, J. Amer. Chem. Soc. 100, 8106, 197
8;およびC.F. Bigge, P.Kalaritis, J.R.DeckおよびM.
P. Mertes, J. Amer. Chem. Soc. 102, 2033, 1980を参
照）。しかし、本明細書に用いられるオレフィン置換体
は以前には用いられてない。プローブ成分Ａの結合を促
進するために、オレフィンを、アリルアミン[AA]あるい
はアリル-（3-アミノ-2-ヒドロキシ-1-プロピル）エー
テル[NAGE]のような第１級アミンの官能基とともに用い
ることが特に望ましいことが知られている。これによっ
て、以下のような標準的なアミンの修飾反応によるプロ
ーブの付加が可能になる。
【００６２】
【化１２３】
【００６３】調製が容易であるために、プローブの付加
にはNHS-エステルを使用することが好ましいことが知ら
れている。しかし、チオール、カルボン酸、エポキシド
などのような、他の修飾可能な官能基とともにあるオレ
フィンリンカーアームもまた、使用され得る。さらに、
望ましいと思われる場合には、リンカーアームおよびプ
ローブの両方を１つの工程で付加し得る。
【００６４】特に、次の構造を有する修飾されたヌクレ
オチド；
【００６５】
【化１２４】
【００６６】ここで、Ｂは、糖成分のC1'位に共有結合
したプリン、7-デアザプリンあるいはピリミジン成分を
表し、Ｂがプリンあるいは7-デアザプリンである場合、
それは該プリンあるいは該デアザプリンのN9位に付加さ
れ、Ｂがピリミジンである場合、それはN1位に付加され
ており；Ａは、少なくとも３個の炭素原子からなる成分
を表し、該化合物が二本鎖リボ核酸、デオキシリボ核酸
の二重鎖あるいはDNA-RNAハイブリッドに導入されると
ポリペプチドと検出可能な複合体を形成し得；点線は、
ＢとＡをつなぐ結合基を表し、Ｂがプリンである場合、
該結合はプリンの8位において付加され、Ｂが7-アザプ
リンである場合、該結合は該デアザプリンの7位におい
て付加され、Ｂがピリミジンである場合、該結合は該ピ
リミジンの5位において付加されており；そしてｘ，ｙ
およびｚの各々は、
【００６７】
【化１２５】
【００６８】を表す、ヌクレオチドは、次の工程によっ
て調製され得る： （ａ）次の構造、
【００６９】
【化１２６】
【００７０】を有する化合物を、水銀塩と、適当な条件
下、適当な溶媒中で反応させて次の構造、
【００７１】
【化１２７】
【００７２】を有する水銀化化合物を生成する工程； （ｂ）前記水銀化化合物を、前記水銀化化合物の-Hg+部
分と反応する、構造式・・・Ｎで表される化学成分と反
応させる工程であって、前記反応が水溶液中K2PdCl4の
存在下で、適当な条件下で行われて、次の構造、
【００７３】
【化１２８】
【００７４】を有する化合物を生成し、ここで、Ｎは反
応性の末端官能基あるいはＡである工程；および （ｃ）ＮがＡの場合、該化合物を該修飾ヌクレオチドと
して回収する工程、またはＮが反応性末端基である場
合、Ｍが水溶液中で適当な条件下で前記修飾されたヌク
レオチドを生成する、Ｎとの反応性を有する官能基を表
す時、前記化合物をＭ-Ａ構造を有する化合物と反応さ
せて、次いでそれを回収する工程。
【００７５】次の図は実例である：
【００７６】
【化１２９】
【００７７】該反応は、水素イオン濃度がpH1ほど低く
ても、あるいはpH14ほど高くても行い得るが、約4から8
の範囲で操作するのが好ましい。このことは、特に、こ
のpH範囲外では加水分解される、ヌクレオシドポリホス
フェート、ポリヌクレオチドおよびヌクレオチド補酵素
のような不安定な化合物を取り扱う場合にそうである。
同様に、不安定な有機性基質の分解の可能性を避けるた
めに、約20℃から30℃の範囲で操作することが好まし
い。しかし、該反応は約5℃から100℃の間で行い得る。
化学反応では通常のことであるが、高温は反応速度を促
進し、低温は遅める。従って、5℃から100℃の温度範囲
では、至適反応時間は約10分から98時間の間で変化し得
る。好ましい温度範囲では、反応時間は通常約3から24
時間の間で変化する。
【００７８】pHを所望の範囲内に維持する好ましい方法
は、緩衝液の使用による。種々の緩衝液が使用され得
る。これらには、例えば、酢酸ナトリウムあるいは酢酸
カリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸カリウ
ム、クエン酸カリウム−リン酸、トリス-酢酸およびホ
ウ酸-水酸化ナトリウム緩衝液が含まれる。使用時の緩
衝液の濃度は最高約２Mまでの広い範囲で変化し得る。
【００７９】水銀化およびパラジウム触媒による付加反
応の特に有利な点は、水中で行えることであり、少量の
有機溶媒を、溶解性を補助するものとして有用に含み得
る。通常選択される有機溶媒は、水と混和可能なもので
ある。これらは、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、グリセリン、ジオキサン、アセトン、ピリミジンお
よびジメチルホルムアミドのようなエーテル、アルコー
ル、エステル、ケトン、アミドなどから選択され得る。
しかし、メタノールのようなアルコールの存在が、しば
しば、オレフィン２重結合にかかるアルコキシ付加を起
こすことが知られているので、溶解性を補助するのに使
用される有機溶媒は、注意深く選択するべきである。α
-あるいはβ-外環炭素原子へのアルコキシ置換体の導入
によってしばしば、酵素基質として非常に効率悪くしか
使用されない化合物が産生される。
【００８０】種々の水銀塩が使用され得るが、ここで好
まれる塩は、酢酸水銀である。さらに、前述したよう
に、化合物は、先ずリンカーアームを付加し、次いでＡ
成分を付加するか、あるいはＡがすでに結合しているリ
ンカーアームを付加することにより調製され得る。従っ
て、構造式・・・Ｎで表される化学成分は、最終的結果
として所望の化合物が生成されればいかなるものでも有
り得る。
【００８１】例には、次のものが含まれる；
【００８２】
【化１３０】
【００８３】これらの反応に用いられる反応物の量は広
く変化し得る。しかし、概して、非水銀化化合物、水銀
化化合物およびパラジウム含有化合物の量は実質的に化
学量論的であるが、一方、水銀塩および・・・Ｎ化合物
はモル濃度単位で過剰である。例えば、各々、１モルの
水銀化化合物あるいは非水銀化化合物当り5-20モルの・
・・Ｎあるいは水銀塩量が存在する。実際には、量は反
応条件の変化および反応物の厳密な性質に依って変化す
る。
【００８４】酵素基質として機能可能なヌクレオチド誘
導体に直接付加されたビオチンプローブを有すること
は、遂行し得る実験的方法および分析に使用し得る検出
方法（顕微鏡的および非顕微鏡的）の両方にかなりの多
用性を与える。例えば、ビオチンヌクレオチドは、細胞
あるいはクルードの細胞抽出物による合成過程にある、
ポリヌクレオチドに導入され得、従って、発生期（成長
中）のポリヌクレオチド鎖の検出および/あるいは単離
を可能にする。そのような方法は、どのような直接的化
学修飾によっても不可能である。さらに、酵素は、ビオ
チンのようなプローブをポリヌクレオチドの高度に選択
的あるいは部位特異的位置へ導入するための試薬として
使用され得る。
【００８５】同様のプローブで修飾された生成物の化学
合成では、最良の場合でも達成は非常に困難と考えられ
る。
【００８６】ビオチンあるいはイミノビオチンを含有す
るヌクレオチドの合成は、本明細書中これ以後に述べる
実施例に詳細に示されるようにして達成された。C-5位
の炭素原子に結合されたこれらのプローブのどれかを含
む、ピリミジンヌクレオシド三リン酸は、原核細胞ある
いは真核細胞に由来する、精製された、多様な核酸ポリ
メラーゼの優れた基質であった。これらには、E. coli
のDNAポリメラーゼI、バクテリオファージT4DNAポリメ
ラーゼ、ネズミ（A-9）およびヒト（HeLa）細胞のDNAポ
リメラーゼαおよびβ、および単純ヘルペスウィルスの
DNAポリメラーゼが含まれる。これを確認するデータ
を、Rigbyらのニックトランスレーションの条件（P.W.
J. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes およびP. Berg,
J. Mol. Biol.113, 237, 1977）あるいはBourguignonら
のギャップ修復反応（G.J. Bourguignon, P.J. Tatters
allおよびD.C. Ward, J. Virol. 20, 290, 1976）のど
ちらかを用いて、E.coliのDNAポリメラーゼ反応から得
た。Bio-dUTPもまた、Millerらの方法によるリゾレシチ
ンの処置（M.R. Miller, J.C. Castellot, Jr.およびA.
B. Pardee, Exp. Cell Res. 120, 421, 1979）により透
過性となったCHO細胞、および単純ヘルペスウィルスに
感染したBHK細胞から調製した核の複製系の両方で、ポ
リメラーゼの基質として機能することが見い出されてい
る。ビオチン化リボヌクレオシド三リン酸が、E. coli
およびバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼの基質
として機能することが見い出されているが、それらのデ
オキシリボヌクレオチド三リン酸相当物ほど効果的に使
用されない。実際、調査された真核細胞RNAポリメラー
ゼ（HeLa細胞RNAポリメラーゼIII、仔ウシ胸腺RNAポリ
メラーゼIIおよびマウス細胞RNAポリメラーゼII）によ
る、それらの導入は非常に悪い。この基質の機能の範囲
が限られていることは、ある種のインビボあるいはイン
ビトロでの転写の研究における使用を制限するが、ビオ
チンでラベルされたRNAプローブは、E. coliあるいはT7
RNAポリメラーゼを用いてDNA鋳型から酵素的に調製さ
れ得るか、あるいはRNAリガーゼをビオチン化-pCpのよ
うな化合物とともに用いる３’末端標識法より、調製さ
れ得る。しかし、UTPのAA誘導体およびNAGE誘導体は、
上述の真核細胞のRNAポリメラーゼの基質である。これ
らのアナログに対する抗体が入手可能であれば、免疫学
的あるいは親和性による方法で転写途中の転写物の単離
は実行可能である。
【００８７】ビオチンあるいはイミノビオチン置換体を
有するヌクレオチドの酵素的重合は直接モニターされな
かった。なぜならば、これらのプローブはいすれも放射
性ラベルされていなかったためである。しかし、２つの
実験系による証拠によって、ビオチン化−ヌクレオチド
が導入されたことが明かに示された。第一に、ビオチン
-ヌクレオチドの存在下で合成されたポリヌクレオチド
は、アビジンあるいはストレプトアビジンアフィニティ
ーカラムでのクロマトグラフによって選択的に保持され
る（表IおよびII）。例えば、ニックトランスレーショ
ン法により32P-dAMPを取り込ませた正常なDNAは、0.5M
のNaClを加えると定量的に溶出されるが、高濃度の塩、
尿素、グアニジン-塩酸、ホルムアミドあるいは50mMのN
aOHでよく洗浄した後でも、ビオチン化-DNAあるいはイ
ミノビオチン化-DNAの大部分は樹脂に結合したまま残
る。これらの洗浄条件で溶出される少量の放射性ラベル
のフラクションは、２度目に樹脂にかけても保持され
ず、このことは放射活性は、ビオチン置換のないDNA断
片にあることを提示する。第二の証拠は、精製した抗ビ
オチンIgGでの処理後、ホルマリン固定されたStaphyloc
occus aureusによる処理した場合、ビオチンラベルされ
たポリヌクレオチドのみが免疫沈澱されることである
（表III）。これらの表のデータから、この方法によっ
て、非常に少量のビオチンが検出され得ることは明かで
ある。これらの結果はまた、DNAはその天然の二本鎖の
形態のままで、ビオチン分子がアビジン、ストレプトア
ビジンあるいは特異的な抗体によって認識され得ること
を示す。これは、抗体結合あるいはアビジン親和性によ
る方法が、ハイブリダイゼーション法を用いるプローブ
の検出に有用であるために全く必須のものである。
【００８８】
【表１】
【００８９】
【表２】
【００９０】
【表３】
【００９１】従って、次の構造を有する、優れた化合物
の調製が可能である：
【００９２】
【化１３１】
【００９３】ここで、Ｂ，Ｂ'およびＢ”の各々は、糖
成分のC1'位に共有結合しているプリン、7-デアザプリ
ンあるいはピリミジン成分を表し、Ｂ，Ｂ’あるいは
Ｂ”がプリンあるいは7-デアザプリンである場合はいつ
も、該プリンあるいは7-デアザプリンのN9位で結合し、
そしてＢ、Ｂ’あるいはＢ”がピリミジンである場合は
いつも、N1位で結合しており、Ａは、少なくとも３個の
炭素からなる成分を表し、該化合物が相補的リボ核酸あ
るいはデオキシリボ核酸分子で形成される２重鎖複合体
に導入される場合にポリペプチドと検出可能な複合体を
形成し得、点線は、ＢとＡとをつなぐ化学結合を表し、
Ｂがプリンである場合、該結合は該プリンの8位で結合
しており、Ｂが7-デアザプリンである場合、該結合は該
デアザプリンの7位で結合しており、そしてＢがピリミ
ジンである場合、該結合は該ピリミジンの5位で結合し
ており；ｚはH-あるいはHO-を表し；そしてｍおよびｎ
は0から約100、000までの整数を表す。
【００９４】もちろん、概してｍおよびｎが同時に０で
あることはないということは、容易に理解されるべきで
ある。なぜならば、その場合には化合物は、前述の単な
る修飾されたヌクレオチドになるからである。概して、
Ｂ’およびＢ”は同じオリゴヌクレオチドあるいはポリ
ヌクレオチド内でも変化し、交互にウラシル、シトシ
ン、チミン、グアニン、アデニンなどとなる。さらに、
概して、その変化は、周知の遺伝コードのペプチド合成
をコードする順序のヌクレオチド配列に相当する。しか
し、示されている構造はまた、本発明による修飾するこ
とのみを目的とする、ポリC，ポリU、ポリr（A-U）、お
よびポリd(A-U)、および仔ウシ胸腺DNA、E. coliあるい
は酵母のリボゾームRNA、バクテリオファージRNAおよび
DNA（R17、fd）、動物ウィルス（SV40 DNA）、染色体DN
Aなどのようなポリヌクレオチドを包含することを意図
する。
【００９５】さらに、前記構造はオリゴマーあるいはポ
リマー中に存在する、１つ以上の修飾されたヌクレオチ
ド、例えば、2から30の修飾されたヌクレオチドを包含
することも理解されるべきである。この点に関する重要
な因子は、修飾箇所の数が多くないと目的とする使用に
は効果がなくなることである。
【００９６】最後に、末端基が適合可能あるいは反応性
である限り、修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリ
ヌクレオチドをつないで、同じ構造を有するより大きな
分子を形成できる。
【００９７】これらの化合物は適当なヌクレオチド、特
に、適当な条件下で合成を導く核酸鋳型の存在下での、
ヌクレオチド三リン酸の酵素的重合によって作成し得
る。そのような条件は、用いられる酵素、存在するヌク
レオチドの量、および他の変わり得る因子によって広く
変化し得る。酵素の実例には、E. coliのDNAポリメラー
ゼI、バクテリオファージT4のDNAポリメラーゼ、ネズミ
およびヒト（HeLa）細胞のDNAポリメラーゼαおよび
β、単純ヘルペスウィルスのDNAポリメラーゼ、E. coli
のRNAポリメラーゼ、バクテリオファージT7のRNAポリメ
ラーゼ、そしてHeLa細胞のRNAポリメラーゼIII、仔ウシ
胸腺RNAポリメラーゼII、およびマウス細胞RNAポリメラ
ーゼIIIを含む真核細胞RNAポリメラーゼが含まれる。
【００９８】さらに、オリゴヌクレオチドあるいはポリ
ヌクレオチドの末端に付加して、5'に付加されるか、あ
るいは3'に付加されるかによってｍあるいはｎが０であ
る化合物を調製し得る。さらに、塩基がビオチン化され
ているpCpあるいはpUpのような化合物は、酵素RNAリガ
ーゼを用いて、存在する分子に付加され得る。
【００９９】修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリ
ヌクレオチドはまた、各々のヌクレオチドの修飾のため
の前述した方法を用いて、存在するオリゴヌクレオチド
あるいはポリヌクレオチドの化学的修飾によって、調製
し得る。
【０１００】本発明の種々の修飾されたヌクレオチド、
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、複合体
を形成するのに適当な条件下で複合体を形成できるポリ
ペプチドに、化合物を接触させることにより検出され得
る。ここでポリペプチドは、複合体が形成されると、概
して従来の検出法で検出され得る、１つ、あるいはそれ
以上の成分を含む。
【０１０１】ビオチン化型プローブ用のポリペプチド検
出分子の１つはアビジンである。アビジン-ビオチン相
互作用は、自然界に見られる、最も強い非共有結合定数
の１つ（Kdis=10=15）を持つ。アビジンを潜在的に証明
可能な指標分子、例えば、蛍光色素（フルオロセン、ロ
ーダミン）、高電子密度試薬（フェリチン、ヘモシアニ
ン、コロイド金）あるいは不溶性の反応生成物を沈積で
きる酵素（パーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ）に結合させると、ビオチンプローブの存在、位置、
および/あるいは量を確立し得る。
【０１０２】あいにく、アビジンは核酸あるいは染色質
と共に使用される場合、望ましくない１つの性質を有す
る。アビジンが、濃縮した染色質あるいは大量の核酸を
含む細胞分画に、そのビオチン結合性とは無関係に固く
結合することが、報告されている（M.H.Heggeness, Sta
in Technol., 52, 165, 1977; M.H. Heggeness および
J.F. Ash, J.Cell. Biol., 73, 783, 1977; E.A. Bayer
およびM. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis
26, 1, 1980）。アビジンはpI10.5の塩基性の糖タンパ
ク質であるので、そのヒストン様特性あるいはその糖質
成分に、これらの観察されている非特異的相互作用の原
因が最もありそうである。
【０１０３】ビオチン含有ヌクレオチドおよび誘導体の
ための好ましいプローブは、土壌微生物Streptomyces a
vidiniiによって合成されるアビジン様タンパク質、ス
トレプトアビジンである。この調製および精製はHoffma
nら、Proc., Natl. Acad.Sci., 77, 4666 (1980)に記載
されている。ストレプトアビジンはアビジンより非常に
低いpI(5.0)を有し、糖鎖を持たず、アビジンより非常
に弱いDNAへの非特異的結合を示し、従って、核酸検出
法の適用に有力な利点を提供する。
【０１０４】ビオチン様プローブの検出に最も好ましい
タンパク質は、単特異性ウサギIgGの抗ビオチン免疫グ
ロブリンである。以前に報告されている方法に従って、
この化合物をウサギをビオチンを結合したウシ血清アル
ブミンで免疫して調製し（M.Berger, Methods in Enzym
ology, 62, 319 [1979]）、アフィニティークロマトグ
ラフィーで精製した。免疫グロブリン-ハプテンの親和
定数は、アビジン-ビオチン複合体のそれよりかなり低
いKassn値（106から1010）を有するが、アビジン-イミ
ノビオチン複合体のそれと実質的に同等である。さら
に、抗ビオチン抗体は、インサイチュハイブリダイゼー
ションによる染色体上の特異的ポリヌクレオチド配列の
検出に非常に有用であることが証明されている。なぜな
らば、抗体の染色質物質への非特異的結合は、もしあっ
ても、ごく僅かだからである。
【０１０５】本発明の修飾されたポリヌクレオチドは、
ハイブリダイゼーションプローブとしての使用に適合可
能な条件下で、変性および復元可能である。数種のビオ
チン置換DNAおよびRNAポリマーの温度変性の様相および
ハイブリダイゼーション特性分析はこのことを明かに示
す。例えば、ニックトランシレーション法により1キロ
ベース当り約10〜100のビオチン残基を導入させたpBR32
2 DNAあるいはλDNAは、ビオチンを含有しないコントロ
ールのDNAのTm値と基本的に同一のTm値を有する。さら
に、32Pラベルされ、ビオチン置換されたpBR322 DNA
は、プラスミドを有する細菌のコロニーの検出にハイブ
リダイゼーションプローブとして使用されると、チミジ
ン含有コントロールDNAと同程度の特異性およびオート
ラジオグラフのシグナル強度を示した。
【０１０６】一方のストランドのすべてのチミジン（5K
b当り全部で1250個）がビオチン化ヌクレオチドで置換
されている、MVM RF DNAのようなDNA二重鎖では、Tmは
置換されていないコントロールのそれより5℃低いのみ
である。各々の塩基対がビオチン化-dUMP残基を有する
ポリd(A-bioU)のTmはポリd(A-T)コントロールより15℃
低いが、変性および復元の両方の間に観察される協調性
の度合および吸光性の程度は２つのポリマーで同様であ
った。RNA二重鎖およびDNA/RNAハイブリッドの平行した
分析は、それらのTmもポリマーのビオチン含有量の増加
に従って低下することを示す。しかし、ポリマーのハイ
ブリダイゼーション特性を有意に変化させることなく、
十分な量のビオチン分子を導入させ得ることは明かであ
る。
【０１０７】これらの結果は、染色体、固定された細胞
あるいは組織切片中の特異的ポリヌクレオチドの検出お
よび/あるいは位置決定のためのプローブとして、ビオ
チン置換されたポリヌクレオチドを使用し得たことを強
く提言した。ビオチン置換されたプローブを検出する、
概括的プロトコールを以下に図説する：インサイチュコ
ロニーハイブリダイゼーション法あるいはノーザン/サ
ザンハイブリダイゼーション法によるプローブ検出の概
括的プロトコール
【０１０８】
【表４】
【０１０９】この概括的図解は、遺伝子マッピング（細
胞遺伝学）および組み換えDNA工学に使用される方法の
みを説明する。しかし、これは、臨床試料中の細菌、ウ
ィルス、真菌、あるいは寄生虫由来の核酸の検出に同等
に適用され得、放射性同位元素の使用に依らない臨床診
断への強力な新しい方法の基礎となる。
【０１１０】ビオチン検出の免疫学的および組織学的方
法は、迅速な遺伝子マッピングのためのインサイチュハ
イブリダイゼーション、およびブロットハイブリダイゼ
ーション法による特異的核酸配列の検出のための非放射
性方法にこの基本的方法が使用され得ることを示した。
この技術は、新しい臨床診断法の開発に使用され得る。
【０１１１】この方法を用いて、特異的デオキシリボ核
酸あるいはリボ核酸分子、特に、生存する生物、例えば
細菌、真菌、ウィルス、酵母、あるいは哺乳類のような
生存する生物に由来するような分子の存在を決定するこ
とが可能である。そして、このことは患者あるいはその
他の被験体中の核酸を有する病原体の診断を可能にす
る。
【０１１２】さらに、それは抗生物質耐性を調べるため
の細菌のスクリーニング法を提供する。従って、例え
ば、Streptococcus pyogenesあるいはNeisseria mening
itidisのペニシリン耐性；Staphylococcus aureus、Can
dida albicans、Pseudomonas aeruginosa、Streptococc
us pyogenes、あるいはNeisseria gonorrhoeaeのテトラ
サイクリン耐性；およびMycobacterium tuberculosisの
アミノグリコシド耐性を決定し得る。
【０１１３】これらの方法では、微生物あるいはその抗
生物質耐性を特徴付ける核酸配列に相補的で、そして本
発明による１つあるいはそれ以上の修飾されたヌクレオ
チドを付加的に含むポリヌクレオチドを調製する。この
ポリヌクレオチドを、該微生物から採取した核酸に精密
にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしないこと
は、前記微生物あるいは耐性特性が存在しないことを示
す。ハイブリダイズした核酸二重鎖は次に、該二重鎖
と、検出可能な成分を有する適当なポリペプチドとの複
合体を形成し、適当な検出技術を用いて複合体の存在を
検出することにより、同定される。陽性の検出は、この
複合体、二重鎖が存在し、従って、目的の核酸配列が存
在することを示す。
【０１１４】この方法は、サラセミアおよび鎌状赤血球
性貧血の様な遺伝子疾患の診断に応用され得る。その存
在あるいは欠失（サラセミアの場合）が疾患に関連する
デオキシリボ核酸遺伝子配列は、以下に述べる、適当な
検出可能なポリペプチドとの複合体形成に基づく、本発
明によるポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
によって検出され得る。
【０１１５】染色体上の特異的遺伝子座への遺伝子、あ
るいはそれらの転写物のマッピングは、細胞融合および
体細胞遺伝子学の技術を主に用いた、冗長で時間を浪費
する仕事であった。インサイチュハイブリダイゼーショ
ンは、ショウジョウバエのような染色体の多糸形成を行
う種の、単一コピーの遺伝子配列のマッピングに都合よ
く用いられてきたが、標準のハイブリダイゼーション法
を用いての、多くの高等真核細胞染色体中の特有の配列
遺伝子の検出は、不可能でなくとも、非常に困難であっ
た。ハイブリダイゼーション部位のオートラジオグラム
による位置決定を促進するための、非常に高い特異的放
射性を有するポリヌクレオチドプローブの必要性はま
た、プローブの急速な放射性分解とそれに伴う銀粒子沈
積による背景ノイズの増加という結果を生む。低度から
中度の特異的放射性を有するハイブリダイゼーションプ
ローブを使用した場合、リボゾームRNA遺伝子あるいは
サテライトDNAのような、複数のコピーが存在する配列
の検出でも、長い日数あるいは週におよぶ露出時間が必
要となる。組み換えDNA工学によって、真核細胞に見い
出される、実質上すべての単一コピーの配列の分子クロ
ーニングを実現可能になったため、そのようなクローン
化されたゲノムの断片の染色体上の元の位置をマッピン
グするための、迅速で感度の良い方法があることは非常
に有益と考えられる。
【０１１６】修飾されたヌクレオチドは、放射性同位元
素の使用を避けたインサイチュハイブリダイゼーション
による遺伝子のマッピング法に使用され得る。この方法
は、ニックトランスレーションによって酵素的にDNAプ
ローブに導入し得る、ビオチンを含有するチミジンアナ
ログの利点を利用する。インサイチュでのハイブリダイ
ゼーション後、ビオチン分子は、アフィニティー精製さ
れたウサギ抗ビオチン抗体に対する抗原として働く。フ
ルオレセインラベルされたヤギ抗ウサギIgGからなる免
疫蛍光抗体サンドイッチ法は、クローン化された遺伝子
配列の、緑黄色のバンドとして検出される細胞遺伝学的
位置の、迅速で特異的な決定を可能にする。この方法
は、インサイチュでの遺伝子の位置を決める通常のオー
トラジオグラム法に４つの主要な利点を提供する；背景
ノイズの減少、バンド間の解像能の増加；プローブがハ
イブリダイズした位置の決定に要する時間の減少；およ
び化学的に安定なハイブリダイゼーションプローブ。こ
の方法は、Drosophila melanogasterの多糸染色体中の
反復する配列および１つしかない配列の位置決定および
マウスの分裂中期染色体中のサテライトDNAの位置決定
にうまく適用されてきた。 従って、本発明による修飾
されたヌクレオチドを用いるインサイチュ遺伝子マッピ
ングのための間接免疫蛍光法によって、多糸染色体をプ
ローブの有効性を証明する実験系として使用し得ること
が、見い出されている。プローブには、約5から約22キ
ロベースの範囲の挿入物を有するプラスミドベクター中
にクローン化されたtRNA遺伝子のような、Otto Schmidt
およびDieter Sollから取得された種々のクローン化さ
れたショウジョウバエの配列が含まれる。多くのこれら
のクローンは、放射性同位元素を用いる通常のインサイ
チュハイブリダイゼーション法により、ショウジョウバ
エ染色体地図上の特異的なバンドにすでに割り当てられ
ている。
【０１１７】DNAプローブをBio-dUTPの存在下でニック
トランスレートした。時によって、3H dATPおよび/ある
いは3H dCTPをニックトランスレーション反応混合液に
加えた。これは、オートラジオグラフおよび免疫蛍光の
両方による、１個の染色体塗布試料中の配列の位置決定
を可能にした。インサイチュハイブリダイゼーション
は、M.L. PardueおよびJ.G. Gall, Methods in Cell Bi
ol., 10, 1 (1975)に記載のように行われた。2xSSCで最
後に洗浄してハイブリダイズしなかったプローブを除去
した後、スライドをPBS（リン酸緩衝化生理食塩水）で
すすぎ、PBS中のウサギ抗ビオチン抗体2.5μg/mlおよび
10mg/mlのBSAとともに37℃で2-16時間インキュベートし
た。次にスライドをFITCラベルしたヤギ抗ウサギIgG（M
iles Laboratories、10mg/ml BSA含有PBSで1:100に希釈
した）とともに1-4時間インキュベートした。蛍光発色
している染色体を見るため、エバンズブルーが、赤色に
対する対比染色として、しばしば必要とされた。
【０１１８】5Kbおよび22Kbの挿入物を各々有する、プ
ラスミドpBR17DおよびpPW539をこの方法でハイブリダイ
ズさせたところ、ハイブリダイゼーションのパターンは
各試料塗布毎に再現性があり、１枚のスライド上の90%
を超える染色体塗布に明白に観察された。
【０１１９】クローン化転移因子pAC104はショウジョウ
バエゲノムの多くの部位に位置することが知られてい
る。このプローブのインサイチュハイブリダイゼーショ
ンにより得られたオートラジオグラフおよび蛍光写真の
比較は、この方法の主要な利点、すなわち、オートラジ
オグラフに現れる銀粒子が拡散した部位に、免疫蛍光ラ
ベルによって２重あるいは一連のバンドが識別されるこ
とを説明する。
【０１２０】この方法の直ちに明かとなる他の利点は、
間接免疫蛍光法による遺伝子位置指定に要する時間の著
しい短縮である。6時間以内のハイブリダイゼーション
により、DNA断片を特異的バンドに指定し得る。これ
は、何日も、あるいは何週間も要するオートラジオグラ
フの露出法に比較される。解像能の増加とともにこの要
素は、間接免疫蛍光法により検出される修飾されたヌク
レオチドの使用を直ちに、古典的方法よりも好ましいも
のにする。
【０１２１】この免疫学的方法はまた、哺乳類の染色体
にも使用できることが示され、分裂中期のマウス染色体
のセントロメアの部位にサテライトDNAの位置が決定さ
れている。この結果は、ヒトおよびその他の哺乳類の染
色体の単一コピー（ただ１つの）配列のための簡単な遺
伝子マッピング法の開発の基盤を提供する。そのような
方法は、我々の染色体の遺伝学的機構の理解を深め、臨
床的細胞遺伝学的診断をより迅速にまた実用的にする。
【０１２２】ハイブリダイゼーション後、染色体塗布試
料をウサギ抗ビオチンIgGと作用させる１工程の「抗体
サンドイッチ」法は成功し得るが、この方法は明確な遺
伝子位置の決定に十分な蛍光を発色し得ない。しかし、
Lammら、(1972)；Wofsyら、(1974)によって記載された
「ハプテン-抗体サンドイッチ法」を用いて、非常に強
い蛍光定量性シグナルを達成し得る。この方法では、我
々の場合では単特異的ウサギ抗ビオチンIgGである一次
抗体を、好ましくはこの免疫グロブリンが抗原アフィニ
ティーカラム（ビオチン-セファロース TM）に結合して
いる間に、2,4-ジニトロフルオロベンゼンのようなハプ
テン化試薬で化学的に修飾する。その抗原結合親和性あ
るいは特異性を低下させることなく、15-20個のハプテ
ン（DNP）基を一次抗体に結合させ得る（Wallaceおよび
Wofsy、1979）。試験試料を一次抗体で処理した後、蛍
光ラベルした抗IgGではなく、蛍光ラベルした抗ハプテ
ンIgG抗体とともにインキュベートすると、蛍光シグナ
ルの5-7倍の増加が達成され得る。また、単特異的モル
モット抗DNP IgGをも入手できるので、我々はこの二次
抗体をハプテン化し得、従って、DNPラベルした抗ビオ
チンIgG、およびビオチンラベルした抗DNP IgGの２種類
の抗ハプテンIgGを作成する。これらを交互に使用し
て、数回繰り返すハプテン-抗体サンドイッチを作成
し、次に,多くの哺乳類のIgG分子に特異的に結合する、
蛍光ラベルしたStaphylococcus aureusプロテインＡを
作用させ得ると、それはそれに付随する有用性ととも
に、一次抗体シグナルを膨大に増幅させ得ると考えられ
る。
【０１２３】Streptomyces avidiniのタンパク質ストレ
プトアビジンは、結合された可視化システム（例えば、
蛍光プローブ(上述)あるいは組織化学的試薬(下述)）を
ハイブリダイズしたビオチン含有ポリヌクレオチドの部
位に特異的に結合させる担体として、抗ビオチンIgGに
代わり得る。抗ビオチンIgGより優れているストレプト
アビジンの利点の１つは、ハプテン-IgG相互作用の親和
定数が107から1010であるのに対し、ストレプトアビジ
ンのビオチンに対する親和性はKassn=1015である点であ
る。速い反応速度および非常に強い親和性は、ビオチン
化プローブの位置を決めるのに要する時間が、免疫学的
試薬の場合は数時間であるのに対し、ストレプトアビジ
ンの場合は数分であることを意味する。
【０１２４】ストレプトアビジン検出システムの初期の
評価は現在進行中である。ビオチン化DNAプローブにハ
イブリダイズした多糸染色体をストレプトアビジンとイ
ンキュベートし、次に、ビオチンおよびFITCで２重にラ
ベルしたウシ血清アルブミン（FITC,ビオチン化BSA）と
ともに引続きインキュベートする。４つのストレプトア
ビジンサブユニットのうちの１つだけが、各々のビオチ
ン化DNAの部位に結合するらしいので、ストレプトアビ
ジン-ビオチン化ヌクレオチド複合体の、残りの３つの
結合されていないサブユニットの各々に、ラベルしたBS
A分子１個が結合し得る可能性がある。このストレプト
アビジン+FITC,ビオチン化BSAの単層からの蛍光シグナ
ルを先に述べた基本的「抗体サンドイッチ法」を用いて
コントロールと比較する。
【０１２５】「抗体サンドイッチ法」およびストレプト
アビジン+FITC,ビオチン化BSAの検出強度が比較可能で
あれば、ストレプトアビジン+FITC,ビオチン化BSAシス
テムを、多重「ハプテン-抗体サンドイッチ」法に相当
する様式で１コピーを検出できる感度に増強することを
試みる。いくらかのBSA上のビオチン基は第一層のスト
レプトアビジンに結合しないので、十分なシグナルが得
られるまで第二層のストレプトアビジンを加え得る。例
えば、もし第二層で２個のストレプトアビジンプロトマ
ーのみが各々の第一層BSAに結合し、これらのストレプ
トアビジンプロトマーの各々が３つのFITC,ビオチン化B
SA分子に結合すると、第二層のシグナルの強度は第一層
のそれの２倍になる；第三層では、同様の結合化学量論
的に、蛍光強度は第一層の12倍になり、従って、総強度
は連続的に付加された層とともに急速に増加する。
【０１２６】付加する蛍光およびビオチンプローブの量
を最大にするために、サイログロブリンのような、BSA
より大きなタンパク質担体を使用する計画がある。ま
た、ビオチンプローブと担体タンパク質との間に長いリ
ンカーアームを使用することも必要であり得る。長いリ
ンカーアームは、ビオチン化蛍光担体分子を各々の結合
していないストレプトアビジンサブユニットへの理論上
の輸送を、立体的に最良にし、ビオチン化蛍光担体に結
合する次の層のストレプトアビジンプロトマーの数を最
大にする。蛍光プローブおよびビオチンの担体タンパク
質への置換が可溶性および/あるいは非特異的結合の問
題を起こさないことを確認するために、先のように、適
当なコントロールをとる。
【０１２７】ストレプトアビジン-担体タンパク質輸送
システムは、その輸送の速さに加えて、免疫蛍光法より
優れた２つの有意な利点を有する。第一に、層の形成に
は２つのタンパク質しか必要としない。第二に、修飾さ
れる必要があるのは担体タンパク質のみであり、ビオチ
ン基がストレプトアビジンに近付ける限り、機能的ある
いは構造的統合性でさえ必ずしも維持する必要はない。
【０１２８】ハイブリダイズしたプローブを可視化する
蛍光法に代わるものは、パーオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼあるいはβ-ガラクトシダーゼをハイブリ
ダイゼーション部位に送り、そこで可溶性基質を不溶性
の色素沈澱物に酵素的に転換して光学顕微鏡下で観察可
能にすることである。この技術の重要な利点は、組織学
的方法は蛍光検出より10から100倍感度が高いことであ
る。それに加えて、色素沈澱物は長く光に曝されても色
が薄れず、従って、蛍光顕微鏡の一般的欠点の１つを回
避できる。これらの酵素は蛍光プローブの代わりに「ハ
プテン-抗体サンドイッチ」法の最後の抗体に、グルタ
ルアルデヒドのような二機能性試薬を用いて、あるいは
パーオキシダーゼの場合はパーオキシダーゼの糖成分を
酸化してアルデヒドにしてこれらの残基を所望のタンパ
ク質のε-アミノ基に結合することによって結合し得
る。ストレプトアビジン-ビオチン化担体タンパク質法
用には、ビオチン化基を結合した酵素が蛍光的ビオチン
化担体システムに置き代わる。さらに、酵素は、ビオチ
ン化BSAあるいはサイログロブリンを用いて前の層に蓄
積されるストレプトアビジン部位の増幅を有する、スト
レプトアビジンの最後の層に、ビオチンを介して結合し
得る。我々は近い将来、インサイチュハイブリダイゼー
ションを背景の問題なく可視化するために、必要な組織
化学的試薬および適当な基質/不溶性生成物の組み合わ
せの開発を開始する。シグナル増幅のための組織化学的
方法は、従って、1981年夏に試験準備が完了する。
【０１２９】非常に低いレベルの蛍光の検出および/あ
るいは画像は、現在入手可能な画像増感剤あるいは、レ
ーザーおよび光電子増倍管からなる画像増感系を用いて
可能である。これらの方法は光の検出を個々の光量子の
レベルまで可能にする。適切なデジタル処理システムに
よって、画像の各々の点、すなわち、各々のピクセルが
物体の点によって放射される光量子の数に厳密に比例す
る画像が作成され得る。この種のシステムあるいは細胞
あるいは細胞の一部がレーザー光線を通って流れるフロ
ーシステムを用いて、蛍光物質の検出感度は100および
1,000の間の因数で高くし得、肉眼で検出可能となる。
この感度の増強は１コピーの遺伝子の蛍光を検出するに
十分である。
【０１３０】好ましい実施態様では、ピリミジン環のC-
5位にアリルアミンリンカーアームを介して共有結合し
たビオチン分子を有するdUTPおよびUTPのアナログを合
成した。これらのビオチン化ヌクレオチドはインビトロ
で種々のDNAおよびRNAポリメラーゼの有効な基質であ
る。低レベルのビオチン置換（1キロベースあたり50モ
ルあるいはそれより少ない）を有するDNAは、置換され
ていないコントロールDNAと区別のつかない、変性、再
親和性およびハイブリダイゼーション特性を有する。
【０１３１】従って、本発明はまた、染色体の核型分析
法をも提供する。この方法では、修飾されたポリヌクレ
オチドは既知の遺伝子に相当し、修飾されたヌクレオチ
ドを含むように調製される。これらのポリヌクレオチド
を染色体のデオキシリボ核酸にハイブリダイズさせ、そ
の結果生じた二重鎖を、複合体を形成するように、適当
な条件下で適切なポリペプチドと接触させる。このポリ
ペプチドは検出可能な成分を含むので、複合体の位置を
決定し得、従って、特異的遺伝子の位置を指定し得る。
【０１３２】本発明の他の実施態様は、いくつかのウラ
シル塩基がプローブを有するように修飾されたポリUを
使用するポリA含有配列の検出を含む。それとは別の実
施態様は、ｘ、ｙおよびｚのうちの２つが反応して環状
成分；
【０１３３】
【化１３２】
【０１３４】を形成する、環状の修飾されたヌクレオチ
ドを含む。そして、そのような環状の修飾されたヌクレ
オチドは、細胞表面上のホルモンレセプター部位の同定
に使用され得、従って、癌あるいは腫瘍細胞の検出法に
使用され得る。
【０１３５】最後に、本発明により修飾され、その存在
が特定の癌細胞の診断となる、α-胎児タンパク質ある
いは癌胎児性抗原のようなポリペプチドの産生に関与す
るデオキシリボ核酸遺伝子配列から合成されるメッセン
ジャーリボ核酸に相補する、ポリヌクレオチドを調製す
ることにより、腫瘍細胞を診断し得る。ハイブリダイゼ
ーションおよびハイブリッド２重鎖の検出は、従って、
腫瘍細胞の検出法を提供すると考えられる。
【０１３６】以下に示す実施例は、本発明を種々の観点
から説明するために述べられるが、いかなる場合にも本
発明の範囲を限定することを意図せず、請求の範囲によ
り特定して述べる。
【０１３７】
【実施例】
（実施例１および２） ビオチン化-UTPおよびビオチン化-dUTPの合成 ａ）水銀化ヌクレオチドの調製 UTP（570mg、1.0ミリモル）あるいはdUTP（554mg、1.0
ミリモル）を100mlの0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液 pH6.0
に溶かし、酢酸水銀（1.59gm、5.0ミリモル）を加え
た。溶液を50℃で4時間加熱し、次いで氷上で冷却し
た。塩化リチウム（392mg、9.0ミリモル）を加え、過剰
のHgCl2を除くために、溶液を同容量の酢酸エチルで6回
抽出した。抽出過程の効率を、4、4'-ビス（ジメチルア
ミノ）-チオベンゾフェノンを用いて有機層中の水銀イ
オン濃度を測定することにより、モニターした（A.N. C
hristoper, Analyst, 94, 392, 1969）。Daleらが記載
した方法（R.M.K. Dale, D.C. Ward, D.C. Livingston,
およびE. Martin, Nucleic Acid Res. 2, 915, [197
5]）で水溶液の一部をヨード化した後、分光光度計で測
定したヌクレオチドの水銀化の程度は常に90%と100%と
の間であった。水性層は酢酸エチルによる抽出の間にし
ばしば濁ったが、その水性層中のヌクレオチド生成物を
3容量の氷冷エタノールを加えて沈澱させ、遠心して集
めた。沈澱物を、冷やした純エタノールで2回、エチル
エーテルで1回洗浄し、次いで風乾した。そうして調製
したこれらの水銀化ヌクレオチドをこれ以上精製せず
に、アリルアミンヌクレオチドの合成に使用した。
【０１３８】ｂ）アリルアミン-dUTPおよびアリルアミ
ン-UTPの合成 （工程ａの）水銀化ヌクレオチドをpH5.0の0.1M 酢酸ナ
トリウム緩衝液に溶解し、20mMの濃度（267nm で200 OD
/ml）になるように調整した。水性酢酸溶液中の新鮮な
酢酸アリルアミン2.0Mを、1.5mlのアリルアミン（13.3
ミリモル）を8.5mlの氷冷4M 酢酸にゆっくりと加えるこ
とにより調整した。3ml（6.0ミリモル）の中和したアリ
ルアミンストックを25ml（0.5ミリモル）のヌクレオチ
ド溶液に加えた。4mlの水に溶解したK2PdCl4の1ヌクレ
オチド相当分（163mg、0.5ミリモル）を、反応を開始す
るために加えた。パラジウム塩（Alfa-Ventron）を添加
すると、反応容器の壁面にでてくる金属沈澱物（Hgおよ
びPd）によって溶液は次第に黒色に変化した。室温に18
-24時間放置後、残っている金属沈澱物の大部分を取り
除くために反応混合液を0.45mmの濾過膜（nalgene）に
通した。黄色の濾過液を5倍に希釈し、100mlのDEAE-Sep
hadex TM A-25（Pharmacia）のカラムにかけた。１カラ
ム容量の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0で洗浄後、pH
〜8-9の酢酸ナトリウムか、あるいはpH7.5の重炭酸トリ
エチルアンモニウム（TEAB）の、１リットルの直線濃度
勾配（0.1-0.6M）で生成物を溶出した。所望の生成物は
０．３０Ｍおよび０．３５Ｍの間の塩濃度で溶出された
主要なUV吸収画分にあった。スペクトル分析は、このピ
ークがいくつかの生成物を含むことを示し、最終的精製
は、pH3.3の0.5M NH4H2PO4緩衝液（分析用分離）か、あ
るいはpH4.3の0.5M酢酸トリエチルアンモニウム（調製
用分離）を溶出液として用いる、Partisil-ODS2カラム
の逆相HPLCクロマトグラフィーで達成した。5-（3-アミ
ノプロペン-1-イル）ウリジン（ウリジンのアリルアミ
ン付加物）の5'-３リン酸はHPLCカラムから溶出される
最後の画分であり、それらは、まだ特性を調べていな
い、３つの夾雑物から明確に分離された。これらのヌク
レオチドの特性を陽子NMR元素分析によってスペクトル
的におよびクロマトグラフ的に調べた[AA-dUTP(C12H16N
3O14P3Na4・1H2O):理論値、C,22.91; H,2.88; N,6.68;
P,14.77、 実測値、C,23.10; H,2.85; N,6.49; P,14.7
5. AA-UTP(C12H16N3O15P3Na4・4H20):理論値、C,20.61;
H,3,46;N,6.01; P,13.3、実測値、C,20.67; H,4.11;
N,5.39; P,13.54]。
【０１３９】ｃ）AA-dUTPあるいはAA-UTPのビオチン化 既述の方法（H. HeitzmannおよびF.M. Richards, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 71, 3537, [1974]）により、
ビオチン化-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS
B）を調整した。AA-dUTP・H2O（63mg、0.1ミリモル）あ
るいはAA-UTP・4H2O（70mg、0.1ミリモル）を20mlの0.1
Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5に溶解し、2mlのジメ
チルホルムアミドに溶解したNHSB（34.1mg、0.1ミリモ
ル）を加えた。反応液を室温に４時間放置し、次いで、
pH7.5の0.1M TEABで予め平衡化したDEAE-Sephadex TM A
-25の30mlのカラムに直接かけた。400mlのTEABの直線濃
度勾配（0.1-0.9M）でカラムを溶出した。ビオチン化-d
UTPあるいはビオチン化-UTPを含む画分は、TEAB濃度0.5
5Mと0.65Mとの間に溶出されるが、それをメタノールの
存在下で回転蒸発によって脱塩し、水に再溶解した。時
によって、わずかに濁った溶液が得られた：いくつかの
TEAB溶液中にあった夾雑物によるこの混濁を0.45mmのフ
ィルターで濾過して除去した。長期保存のために、Dowe
x TM 50（Na+型）の存在下で溶液を短時間攪拌すること
により、ヌクレオチドをナトリウム塩に転換した。濾過
後、ヌクレオチドを３容量の冷エタノールを加えて沈澱
させ、エチルエーテルで洗浄し、水酸化ナトリウムのペ
レット上で真空乾燥し、デシケーター内に-20℃で貯蔵
した。直接使用する場合には、pH7.5のtris-HClで20mM
ヌクレオチド溶液を調製し、ヌクレオチドの最終濃度を
5mMに調製した。ストック溶液は-20℃で凍結保存した。
【０１４０】bio-dUTPおよびbio-UTP生成物の元素分析
で次の結果を得た。bio-dUTP（C22H30N5O18P3S1Na4・1H
2O）：理論値、C,29.80; H,3.38; N,7.89; P,10.47; S,
3.61、実測値、C,30.14; H,3.22; N,7,63; P,10.31, S,
3.70。bio-UTP（C22H30N5O19P3S1Na4・3H20）：理論
値、C,29.15; H,3.19; N,7.45; P,9.89; S,3.41、実測
値、C,28.76; H,3.35; N,7.68; P,9.81; S,3.32。
【０１４１】pH7.5でのbio-dUTPおよびbio-UTPのスペク
トル特性[λmax,289nm(ε=7100);λmax,240nm(ε=10,70
0);λmin,262nm(ε=4300)]はピリミジン環との結合に外
環２重結合が存在することを反映する。ビオチンの定量
に使用される方法（D.B. McCormickおよびJ.A. Roth, A
nal. Biochem., 34, 326, 1970）である、エタノール性
硫酸中でのp-ジメチル-アミノシンナムアルデヒドによ
る処理で、これらのヌクレオチドはまた、強い陽性反応
（オレンジ-赤色）を示す。しかし、それらは、AA-dUTP
およびAA-UTP出発材料の特徴的反応であるニンヒドリン
に、もはや反応しない。
【０１４２】（実施例３および４） ビオチン化-CTPおよびビオチン化-dCTPの合成 CTPおよびdCTPを、基本的には実施例１で述べたよう
に、ａ）水銀化し、ｂ）アリルアミンと反応させ、およ
びｃ）NHS-ビオチンでビオチン化した。CTP（56.3mg、
0.1ミリモル）あるいはdCTP（59.1mg、0.1ミリモル）を
20mlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0に溶解し、酢
酸水銀（0.159gm、0.5ミリモル）を加えた。溶液を50℃
で4.5時間加熱し、次いで、氷上で冷却した。塩化リチ
ウム（39.2mg、0.9ミリモル）を加え、溶液を酢酸エチ
ルで６回抽出した。水性層中のヌクレオチド生成物を３
容量の冷エタノールを加えて沈澱させ、沈澱物を遠心に
よって集めた。沈澱物を純エタノール、エチルエーテル
で洗浄し、そして風乾した。これらの生成物をこれ以上
精製せずに、各々、AA-CTPおよびAA-dCTPの合成に使用
した。水銀化ヌクレオチドを0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝
液、pH5.0に溶解し、10mMの濃度（275nmで92 OD/ml）に
調整した。0.6ml（1.2ミリモル）の2.0M酢酸アリルアミ
ンストック（実施例１で記載のように調製）を10mlのヌ
クレオチド溶液（0.1ミリモル）に加え、次いで1.0mlの
H20に溶解したK2PdCl4（32.6mg、0.1ミリモル）を加え
た。室温に24時間放置後、溶液を0.45mMの膜で濾過して
金属沈澱物を取り除いた。濾過液を５倍に希釈し、予め
50mMのTEAB、pH 7.5で平衡化した、50mlのDEAEセファデ
ックスA-25のカラムにかけた。ヌクレオチド生成物を50
0mlのTEAB、pH 7.5の直線濃度勾配（0.05-0.6M）で分画
した。所望の生産物は0.28Mと0.38Mの塩濃度の間に溶出
される、主要なUV吸収部分にあった。次いで、プールし
た試料を回転蒸発により脱塩し、0.5Mの酢酸トリエチル
アンモニウム、pH 4.2に溶解し、0.5Mの酢酸トリエチル
アンモニウムを溶出液として用いて、Partisil ODS-2カ
ラムにおけるHPLCクロマトグラフィーによって最終精製
した。適当な画分をプールし、凍結乾燥し、その生成物
をH2Oに溶解した。Dowex TM 50（Na+型）の存在下で短
時間、攪拌することにより、ヌクレオチドをNa+塩に転
換した。濾過後、Dowex樹脂を取り除くために、3容量の
冷エタノールを加えてヌクレオチドを沈澱した。沈澱物
をエーテルで洗浄し、次いで風乾した。分析結果は以下
の通りであった：AA-dCTP(C12 H17 O13 N4 P3 Na4・2H2
O); 理論値、C,22.29; H,2.63; N,8.67; P,14.40. 実測
値、C,22.16; H,2.89; N,8.77; P,14.18。AA-CTP(C12 H
17 N4 O14 Na4・2H2O);理論値、C,21.75; H,2.57; N,8.
46; P,14.01.実測値、C,22.03; H,2.47; N,8.69; P,13.
81、0.1Mホウ酸緩衝液、pH8.0中でのスペクトル特性、
λmax 301nm（ε=6,400）、λmin 271nm（ε=3,950）λ
max 250nm（ε= 9,700）。AA-dCTPおよびAA-CTPはどち
らもニンヒドリン試験で陽性であった。AA-CTP（6.6m
g、0.01ミリモル）あるいはAA-dCTP（6.4mg、0.01ミリ
モル）を5mlの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5に溶
解し、0.2mlのジメチルホルムアミドに溶解したNHS-ビ
オチン（3.4mg、0.01ミリモル）を加えた。室温に4時間
放置後、150mlのTEABの直線濃度勾配（0.1-0.9M）、pH
7.5を溶出液として用いて、試料を10mlのDEAEセファデ
ックスA-25のカラムにかけてクロマトグラフィーを行っ
た。TEABの濃度0.50Mおよび0.60Mの間に溶出される、ビ
オチン化CTPあるいはビオチン化dCTPを含有する画分を
プールし、回転蒸発により脱塩し、最終濃度を、pH7.5
の0.02M Tris-HCl緩衝液中で5mMに合わせた後、-20℃に
保存した。生成物はエタノール性硫酸中で、p-ジメチル
アミノシンナムアルデヒドによって強い陽性ビオチン反
応を示すが、ニンヒドリンを噴霧すると、第１級アミン
に対する試験で陰性となる。これらの生成物のさらなる
構造的特徴付はただ今進行中である。
【０１４３】（実施例５および６） イミノビオチン化-UTPおよびイミノビオチン化-dUTPの
合成 イミノビオチン臭化水素を既述のようにビオチンから調
製した（K. Hofmann,D.B. MelvilleおよびV. du Vignea
ud, J. Biol. Chem., 141, 207-211, 1941; K. Hofmann
およびA.E. Axelrod, Ibid., 187, 29-33, 1950）。イ
ミノビオチンのN-ヒドロキシスクシンアミド（NHS）エ
ステルを、既述されているNHS-ビオチンの合成手順（H.
HeitzmannおよびF.M. Richards, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA,71, 5537, 1974）によって調製した。実施例１
（ｂ項目）に詳細に記載の通りに調製したAA-UTP（7.0m
g、0.01ミリモル）あるいはAA-dUTP（6.3mg、0.01ミリ
モル）を、5mlの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5に
溶解し、0.5mlのジメチルホルムアミドに溶解したNHS-
イミノビオチン（3.5mg、0.01ミリモル）を加えた。反
応混合液を室温に12時間放置後、予め0.05M TEAB,pH7.5
に平衡化した10mlのDEAEセファデックスA-25に直接かけ
た。150mlのTEABの直線濃度勾配（0.05-0.6M）でカラム
から溶出した。0.35Mおよび0.40Mの間のTEABの濃度で溶
出されたイミノビオチン-UTPあるいはイミノビオチン-d
UTP画分を、メタノール存在下で回転蒸発して脱塩し、H
2Oに溶解した。生成物はニンヒドリン試験で弱い陽性と
判定される、少量のアリルアミンヌクレオチド付加物の
不純物を含んでいた。最終精製はアビジンセファロース
によるアフィニティークロマトグラフィーによってなさ
れた。ホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.5で0.1Mに調製さ
れた不純物を含んでいる生成物の画分を5mlのアビジン
セファロースカラムにかけ、25mlの同緩衝液で洗浄し
た。次いでカラムを50mM酢酸アンモニウム緩衝液、pH4.
0で洗浄し、これは所望のイミノビオチン-ヌクレオチド
生成物を鋭いピーク中に溶出した。３容量の冷エタノー
ルを加えてヌクレオチドを沈澱させ、エチルエーテルで
洗浄し、水酸化ナトリウムのペレット上でin vacuoで乾
燥し、デシケーター中に-20℃で保存した。元素分析お
よび、スペクトルおよびクロマトグラフィーの特性によ
って、生成物の特徴付を行った。 （実施例７および８） NAGE-UTPおよびNAGE-dUTPの合成 アリル（3-アミノ-2-ヒドロキシ-）プロピルエーテル、
略してNAGE、をアリルグリシジルエーテル（Age）（Ald
rich Chemical Co.より入手）から調製した。10mlのAge
（84ミリモル）を、50mlの9M水酸化アンモニウムにゆっ
くりと加え（蒸発よけフード中で）、そして混合物を室
温に6時間放置した。過剰のアンモニアを減圧下で回転
蒸発させて除き、粘性の黄色油を生成した。プロトンNM
Rによるこの生成物の分析は、必要とする構造を有して
いることを示した。5-水銀-dUTP（0.1ミリモル）あるい
は5-水銀-UTP（0.2ミリモル）を2-4mlの0.2M酢酸ナトリ
ウム緩衝液、pH5.0に溶解し、使用前に酢酸でpH5.0に調
整した16倍過剰モル濃度のNAGEを加えた。最終反応量
（4.3および8.4ml）のヌクレオチド濃度は、各々、43mM
および42mMであった。１当量のK2PdCl4（0.1あるいは0.
2ミリモル）を加えて反応を開始した。室温に18時間放
置後、反応混合液を0.45μmの膜で濾過し、サンプルを5
倍に希釈し、酢酸ナトリウムの直線濃度勾配（0.1-0.6
M）を用いてDEAEセファデックス A-25のカラムでクロマ
トグラフを行った。そのUVスペクトルおよびPartisil O
DS-2によるHPLC溶出プロフィールの特徴によって判断さ
れた、所望の生成物を含む画分をプールし、希釈し、さ
らに重炭酸アンモニウム、pH8.5の浅い濃度勾配（0.1-
0.5M）を用いるDEAEセファデックスでの再クロマトグラ
フィーによって精製した。これらの条件下で、大部分の
NAGE-dUTP（あるいはNAGE-UTP）を不純物残査からきれ
いに分離した。この精製段階において、ヌクレオチドを
凍結乾燥し、D2Oに再溶解した後、プロトンNMRスペクト
ルを調べた。元素分析用に、生成物をそのナトリウム塩
の形態に転換した。典型的な分析結果は以下の通りであ
る：Nage-dUTP(C15 H22 N3 O16 P3 Na4・2H2O)、理論
値、C,24.99;H,3.63; N.5.83; P,12.88、実測値、C,25.
39; H,3.71; N,5.63; P,12.88。
【０１４４】（実施例９） 標識されたDNA配列の使用 Ｉ．核型分類 （ａ）ヒト遺伝子ライブラリーから約100から200個のク
ローンを選択する。それらを上述のように標識し、各々
のクローンの位置あるいはハイブリダイズした位置を、
肉眼で、あるいは低光レベルビデオシステムで決定す
る。独特の配列の遺伝子に相当するそれらのクローンに
対して、これは特定のヒト染色体上にあるクローン化DN
Aの位置を決定する。各々の染色体に対するいくつかの
クローンを得る。これらの標識されたクローンの各々
は、特定の染色体の同定に使用され得る。それらはま
た、組み合わせて、46個の染色体の各々を22個の常染色
体対の１つ、あるいはＸ，あるいはＹとして同定するの
に、使用され得る。１セットの標識されたクローンを染
色体にハイブリダイズさせ、次いで蛍光染色剤を加えて
標識することにより、クローンのセットおよびそれらの
位置を可視化させ得、それは特定の色の蛍光を発する。
２番目のセットの標識されたクローンを次いで、使用
し、２番目の蛍光色素と反応させ得る。同じ工程を数回
繰り返し得る。従って、所望するならば、いくつかのセ
ットの蛍光標識を細胞のDNAの、各々の染色体上の異な
る特異的な位置に結合させ得る。これらの標識を視覚的
にあるいはコンピューターによる自動核型分類に使用さ
れ得ると考えられる。
【０１４５】（ｂ）自動核型分類のためには、各々の染
色体上の標識の数に相当するスポットのセットを見い出
すことにより、46個の染色体の各々のおおよその位置を
同定するのに１セットのクローンを用い得ると考えられ
る。従って、デジタル化されたイメージをコンピュータ
ーで分析することにより、染色体がさらに分析するのに
適当に塗布されているかを決定できる。それらが適当に
塗布されているならば、次いで、各々の染色体上の標識
されたスポットの位置および分布によって、個々染色体
の各々をコンピューター分析で同定することが可能であ
る。
【０１４６】各々の染色体上の特異的な位置に蛍光スポ
ットを配置し得るという事実を利用することにより、手
動によって、あるいは自動的に、核型分類をそのような
ラベルがない場合よりも非常に効率的に遂行し得る。
【０１４７】ＩＩ．遺伝的疾患の診断 23番のような特定の染色体に特異的に結合するクローン
を選択することにより、染色体が分裂中期に濃縮されて
いない場合でも、特定の染色体のコピー数を数えること
が可能である。従って、21番の三染色体性の胎児期診断
用に胎児細胞の採取時に、染色体が濃縮していなくても
診断可能である。必要ならば、１セットは23番染色体に
特異的であり、もう一方は他の染色体に特異的であるよ
うな、２セットの標識を使用できる。異なる色であるか
もしれない、各々の細胞中の２つの標識の比を測ること
により、23番染色体数が異常である細胞を同定すること
が可能である。この手順は、低光量のビデオシステムを
使用するスライド上でか、あるいはレザーで励起される
フローサイトメーターの使用において使用され得ると考
える。これはどの染色体数の異常を決定するのに使用さ
れ得る。
【０１４８】ＩＩＩ．微生物の検出および同定 上記のようにDNAの特異的配列に標識することは個々の
細菌の同定および計数を可能にする。特定のDNA断片が
ハイブリダイズする、個々の細菌を同定するためには、
感度は１つの標識された構造を検出し得ねばならない。
これは、低光量ビデオシステムおよびイメージのコンピ
ューターによる総和を用いて、あるいは光像を強化する
他の装置を用いて行い得る。感度を十分に高くし得るな
らば、フローシステムもまた使用できる。細菌をスライ
ド上に固定すると、その位置を見い出すことができ、そ
のような蛍光スポットの数を数えることができるであろ
う。これは、使用される特異的クローンとハイブリダイ
ズするDNAを含有する、すべての細菌の計数法を提供す
る。特定の細菌株に特異的なクローンを選択すれば、そ
の株の微生物数を計数し得る。さらに、特定の遺伝子が
同定されている、いかなる抗生物質耐性も、プローブと
して抗生物質耐性遺伝子に含まれるDNA配列を用いて、
同様の方法で特徴付けできるであろう。さらに、１つあ
るいはそれ以上の抗生物質耐性遺伝子を含む、耐性プラ
スミドに特異的なプローブを使用でし得るであろう。個
々の細菌に加えて、特定の株の細菌細胞の集団を検出し
得、もしそれらが小さなスポットに位置し、そのためス
ポット内のハイブリダイズしたDNAに特異的な蛍光の総
和を測定し得るならば、それらの数を算出し得る。この
ようにして、細菌の混合物中の特異的DNA配列を含有す
る生物の数を測定し得る。

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の構造式を有する化合物を検出する方法
    であって、 【化１】 ここでＢ，Ｂ’、およびＢ”の各々は糖部分のＣ1'−位
    置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、または
    ピリミジン部分を表わし、Ｂ，Ｂ’、またはＢ”がプリ
    ンまたはデアザプリンの時、該結合は該プリンまたはデ
    アザプリンのＮ9−位置に存し、Ｂ，Ｂ’、またはＢ”
    がピリミジンの時、該結合はＮ1−位置に存し、 Ａは該化合物が相補的なリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子と共に形成する二本鎖分子の中に取入れられた
    時、ポリペプチドと共に検知され得る複合体を形成する
    ことの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表
    わし、 点線はＢとＡとを結合する化学結合または基を表わし、
    もしＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デ
    アザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジ
    ンであれば該結合はピリミジンの５−位置に存し、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、そして ｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表わす； 該化合物を該化合物と複合体を形成し得るポリペプチド
    と、該複合体を形成するような適当な条件下で接触させ
    る工程であって、該ポリペプチドが該化合物と該ポリペ
    プチドとの複合体が形成された時に検出され得る部分を
    含む、工程；および適当な検出手法を用いて、該複合体
    を検出する工程； を包含する、方法。
  2. 【請求項２】前記化合物の部分Ａがビオチンおよびイミ
    ノビオチンを包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記ポリペプチドがアヴィヂン、ストレプ
    トアヴィヂン、およびＩｇＧアンチ−Ａ−イムノグロブ
    リンを包含する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記化合物の部分Ａがハプテンであり、そ
    して前記ポリペプチドがそれに対する抗体である、請求
    項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記化合物の部分Ａがリガンドである、請
    求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記ポリペプチド中に含まれる検出され得
    る部分が蛍光染料、化学ルミネセンス試薬、高電子密度
    染料試薬、または酵素である、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】請求項１に記載の方法であって、前記化合
    物が、生物中の該化合物に相補的な標的の核酸とハイブ
    リダイズして二本鎖分子を形成し、そして該標的の核酸
    が、細菌性、あるいはウイルス性遺伝子である、方法。
  8. 【請求項８】請求項１に記載の方法であって、前記点線
    で表される化学結合が、Ｂに関してα位にあるオレフィ
    ン結合を含む部分、反応性のアミン基を持つ３炭素リン
    カー、−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＮＨ
    −、および 【化２】 でなる群から選択される、方法。
  9. 【請求項９】請求項７に記載の方法を用いる、生物中の
    抗生物質に対する耐性の存在を決定する試験方法。
  10. 【請求項１０】次の構造式を有する化合物を含む、二本
    鎖ポリヌクレオチド分子を検出する方法であって、 【化３】 ここでＢ，Ｂ’、およびＢ”の各々は糖部分のＣ1'−位
    置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、または
    ピリミジン部分を表わし、Ｂ，Ｂ’、またはＢ”がプリ
    ンまたはデアザプリンの時、該結合は該プリンまたはデ
    アザプリンのＮ9−位置に存し、Ｂ，Ｂ’、またはＢ”
    がピリミジンの時、該結合はＮ1−位置に存し、 Ａは該化合物が相補的なリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子と共に形成する二本鎖分子の中に取入れられた
    時、ポリペプチドと共に検知され得る複合体を形成する
    ことの出来る少なくとも３個の炭素原子からなる部分を
    表わし、 点線はＢとＡとを結合する化学結合または基を表わし、
    もしＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デ
    アザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジ
    ンであれば該結合はピリミジンの５−位置に存し、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、そして ｍとｎは０から約１００，０００までの整数を表わす； 該ポリヌクレオチド二重鎖を、該二重鎖と複合体を形成
    し得るポリペプチドと、該複合体を形成するような適当
    な条件下で接触させる工程であって、該ポリペプチド
    が、該ポリヌクレオチド二重鎖と該ポリペプチドとの複
    合体が形成された時に検出され得る部分を含む、工程；
    および該複合体を検出する工程； を包含する、方法。
  11. 【請求項１１】次の構造式を有する化合物： 【化４】 ここでＢ，Ｂ’、およびＢ”の各々は糖部分のＣ1'−位
    置に共有的に結合されたプリン、デアザプリン、または
    ピリミジン部分を表わし、Ｂ，Ｂ’、またはＢ”がプリ
    ンまたはデアザプリンの時、該結合は該プリンまたはデ
    アザプリンのＮ9−位置に存し、Ｂ，Ｂ’、またはＢ”
    がピリミジンの時、該結合はＮ1−位置に存し、 Ａは該化合物が相補的なリボ核酸またはデオキシリボ核
    酸分子と共に形成する二本鎖分子の中に取入れられた
    時、ポリペプチドと共に検知され得る複合体を形成する
    ことの出来る少くとも３個の炭素原子からなる部分を表
    わし、 点線はＢとＡとを結合する化学結合または基を表わし、
    もしＢがプリンであれば該結合は該プリンの８−位置に
    存し、もしＢが７−デアザプリンであれば該結合は該デ
    アザプリンの７−位置に存し、そしてもしＢがピリミジ
    ンであれば該結合はピリミジンの５−位置に存し、 ｚはＨ−またはＨＯ−を表わし、そしてｍとｎは０から
    約１００，０００までの整数を表わす。
  12. 【請求項１２】請求項１１に記載の化合物であって、生
    物中の相補的な標的の核酸にハイブリダイズし、そして
    該標的の核酸が細菌性、あるいはウイルス性遺伝子であ
    る、化合物。
  13. 【請求項１３】請求項１１に記載の化合物であって、前
    記点線で表される化学結合が、Ｂに関してα位にあるオ
    レフィン結合を含む部分、反応性のアミン基を持つ３炭
    素リンカー、−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−
    ＮＨ−、および 【化５】 でなる群から選択される、化合物。
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