DK164407B - Modificerede nucleotider og fremgangsmaader til deres fremstilling, fremgangsmaade til paavisning af et dobbeltstrenget polynucleotidduplex indeholdende et modificeret nucleotid, fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelsen af et deoxyribonucleinsyremolekyle eller et ribonucleinsyremolekyle, fremgangsmaade til test af en bakterie, fremgangsmaade til diagnosticering af en genetisk forstyrrelse, fre - Google Patents

Description

i

DK 164407 B

Den foreliggende opfindelse angår modificerede nucleotider og fremgangsmåder til deres fremstilling, en fremgangsmåde til påvisning af et dobbeltstrenget polynucleotidduplex indeholdende et modificeret nucleotid, en fremgangsmåde til bestem-5 · melse af tilstedeværelsen af et deoxyribonucleinsysremolekyle eller et ribonucleinsyremolekyle, en fremgangsmåde til test af en bakterie, en fremgangsmåde til diagnosticering af en genetisk forstyrrelse, en fremgangsmåde til kromosomal karyotype-dannelse, en fremgangsmåde til diagnosticering af en tumorcel-10 le, et diagnostisk udstyr til bestemmelse af en nucleinsyre og et mellemprodukt til anvendelse ved fremstilling af et modificeret nucleotid.

Mange fremgangsmåder, der anvendes i biomedicinsk forskning 15 og rekombinant DNA-teknologi, er i høj grad baseret på anvendelse af nucleotid eller polynucleotidderivater, som er 3 radioaktivt mærket med isotoper af hydrogen ( H), phosphor (J^P), carbon (C) eller jod ( I). Sådanne radioaktive forbindelser giver nyttige indikatorsonder, som gør det 20 muligt for brugeren at påvise,uundersøge, lokalisere eller isolere nucleinsyrer og andre molekyler af videnskabelig eller klinisk interesse, selv når de kun er til stede i yderst små mængder. Til dato har radioaktive materialer været det mest følsomme og i mange tilfælde det eneste mid-25 del til at udføre mange vigtige eksperimentelle eller analytiske prøver. Der er imidlertid alvorlige begrænsninger og ulemper forbundet med anvendelsen af radioaktive forbindelser. For det første, fordi personalet, som har at gøre med radioaktivt materiale, kan blive udsat for poten-30 tielt farlige strålingsniveauer, må def opretholdes detaljerede sikkerhedsforanstaltninger under fremstillingen, anvendelsen og bortskaffelsen af radioisotoperne. For det andet er radioaktive nucleotider meget kostbare at købe og anvende i stor udstrækning på grund af omkostningerne til 35 udstyr og arbejdskraft, som er nødvendig til at give de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger, sundhedsundersøgende tjenester for producent og bruger og programmer til bort-

DK 164407 B

2 skaffelse af affald. For det tredje er radioaktive materialer ofte meget ustabile og har en begrænset holdbarhed, som yderligere forøger omkostningerne ved brugen. Denne ustabilitet er resultatet af radiolytisk dekomponering, som skyl-5 des de destruktive virkninger, der står i forbindelse med henfaldet af radioisotopen selv, og den omstændighed, at ΤΛ I ΛΓ mange isotoper (f.eks. P og I) har halveringstider på kun nogle få dage.

10 Det er kendt, at haptener kan gå i forbindelse med antistoffer, men kun kan igangsætte en immunreaktion, hvis de er bundet til en bærer. Denne egenskab kan udnyttes til påvisning og identifikationsprøver.

I5 Det er også kendt, at biotin og iminobiotin reagerer stærkt med avidin, et 68.000 dalton glycoprotein fra æggehvide.

Denne reaktion udviser en af de fasteste ikke-kovalente -15 bindingskonstanter (K^^g=10 ) , der findes i naturen. Hvis avidin kobles til potentielt påviselige indikatormolekyler, 20 herunder fluorescerende farvestoffer, f.eks. fluorescein eller rhodamin, elektrontætte reagenser, f.eks. ferritin, hæmocyanin eller kolloidt guld, eller enzymer, som er i stand til at aflejre uopløselige reaktionsprodukter, f.eks. peroxidase eller alkalisk phosphatase, kan tilstedeværelsen, 25 beliggenheden eller mængden af en biotinsonde konstateres.

Selv om iminobiotin binder avidin mindre fast end biotin, kan lignende reaktioner anvendes til dets påvisning. Reversibiliteten af iminobiotin-avidinreaktionen frembyder endvidere ved at nedsætte opløsningens pH-værdi betydelige for-30 dele til visse anvendelser.

Specificiteten og fastheden af biotin-avidinkomplekset har været anvendt i de senere år til at udvikle fremgangsmåder til visuelt at lokalisere specifikke proteiner, lipider el-35 ler kulhydrater på eller inden i celler (omtalt af E.A.

Bayer og M. Wilchek i Methods of Biochemical Analysis, 26, 1, 1980). Kromosomal lokalisering af RNA er blevet bestemt 3

DK 164407 B

ved elektronmikroskopi under anvendelse af biotiniseret protein , cytokrom C, kemisk tværbundet til RNA som hybridise-ringssonde. Stedet for hybridiseringen blev visualiseret gennem bindingen af avidin-ferritin eller avidin-methacry= 5 latkugler formidlet af reaktionen avidin-biotin. (J.E. Man ning, N.D. Hershey, T.R. Broker, M. Pellegrini, H.K. Mit-chell og N. Davidson, Chromosoma, 53, 107, 1975, J.E. Manning, M. Pellegrini og N. Davidson, Biochemistry, 61, 1364, 1977, T.R. Broker, L.M. Angerer, P.H. Yen, N.D. Hersey og 10 N. Davidson, Nucleic Acid Research, 5, 363, 1978, A Sodja og N. Davidson, Nucleic Acid Research, 5, 383, 1978). Selv om dette forsøg på at påvise polynucleotidsekvenser var vellykket i de specialiserede tilfælde, som blev undersøgt og som var meget gentagne sekvenser, har den ikke generel 15 anvendelighed til analyse af polynucleotider, der er til stede i en enkelt kopi eller i et lavt antal kopier.

Der kendes endvidere fremgangsmåder til at binde kemiske molekyIdele til pyrimidin og purinringe. For flere år siden 20 blev udviklet en simpel og hurtig acetoxymerkureringsreak-tion til indføring af kovalent bundne kviksølvatomer i 5-stillingen i pyrimidinringen, C-8-stillingen i purinringen eller C-7-stillingen i en 7-deazapurinring, begge i nucleo= tider og polynucleotider. (R.M.K. Dale, D.C. Livingston og 25 D.C. Ward, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 2238, 1973, R.M.K. Dale, E. Martin, D.C. Livingston og D.C. Ward, Biochemistry, 14, 2447, 1975). Det var også kendt for flere år siden, at organomerkuriske forbindelser kunne reagere med olefiniske forbindelser i nærværelse af palladiumkata-30 lysatorer til dannelse af carbon-carbonbindinger (R.F. Heck, J. Am. Chem. Soc., 90, 5518, 1968, R.F. Heck, Ibid., 90, 5526, 1968, R.F. Heck, Ibid, 90, 5531, 1968, R.F. Heck,

Ibid., 90, 5535, 1968 og R.F. Heck, J. Am. Chem. Soc. 91, 6707, 1969) Bergstrom og medarbejdere (J.L. Ruth og D.E.

35 Bergstrom, J. Org. Chem., 43, 2870, 1978 og D.E. Bergstrom og M.K. Ogawa, J. Am. Chem. Soc., 100, 8106, 1978) og Bigge med flere (C.F. Bigge, P. Kalaritis, J.R. Deck og M.P. Mer- 4

DK 164407 B

tes, J. Am. Chem. Soc., 102, 2033, 1980) har nyligt anvendt dette reaktionsskema ved syntesen af C-5 substitueret pyri= midinnucleotidforbindelser.

5 Tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.618.511 beskriver specifikke bindingsanalyser, der benytter ligandsystemer, hvilke analyser udføres i flydende medier (dvs. i opløsning), og den omtalte ligand skal være et frit molekyle i opløsning.

Den foreliggende opfindelse er ikke behæftet med en sådan 10 begrænsning. Endvidere er det i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.618.511 omhandlede ligandsystem en konkurrerende reaktion, hvori ligander konkurrerer med henblik på indfangning. Dette står i kontrast til den foreliggende opfindelse, ved hvilken sonden og målet binder via komplementaritet.

15

Endelig er det kendt, at antistoffer, der er specifikke for modificerede nucleotider, kan fremstilles og anvendes til isolering og karakterisering af specifikke bestanddele af de modificerede nucleotider. (T.W. Munns og M.K. Liszewski, 20 Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 24, 109, 1980). Ingen af de hidtil fremstillede antistoffer mod naturligt forekommende nucleotider har dog vist sig at reagere med deres nucleotiddeterminant, når den eksisterer i et dobbeltstrenget RNA eller DNA dobbeltspiral eller når den er i 25 DNA-RNA hybridmolekyler.

For at omgå begrænsningerne ved radioaktivt mærkede sonder eller tidligere anvendte kemiske og biologiske sonder, er der blevet syntetiseret en række hidtil ukendte nucleotidderiva-30 ter, som indeholder biotin, iminobiotin, lipoinsyre og andre determinanter bundet kovalent til pyrimidin eller purinringen og er beskrevet i beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 1605/91. Disse nucleotidderivater samt polynucleotider og co-enzymer, som indeholder dem, vil reagere specifikt og unikt 35 med proteiner, såsom avidin eller antistoffer. Reaktionen mellem modificerende nucleotider og specifikke proteiner kan ud- 5

DK 164407 B

hyttes som et alternativ til radioisotoper til påvisning og lokalisering af nucleinsyrekomponenter i mange af de for tiden anvendte fremgangsmåder inden for biomedicinsk og rekombinant-DNA-teknologien. Fremgangsmåder, der anvender disse reaktioner 5 mellem modificeret nucleotid og protein har påvisningskapaciteter, der er lig med eller større end fremgangsmåder, der udnytter radioisotoper, og de kan ofte udføres hurtigere og med større opløsningskraft. Disse hidtil ukendte nucleotidderivater kan fremstilles forholdsvis billigt ved kemiske fremgangs-10 måder, der er blevet udviklet og standardiseret som diskuteret nærmere i beskrivelsen til den ovenfor nævnte danske patentansøgning .

Eftersom hverken nucleotidsonderne ifølge opfindelsen eller 15 proteinreagenserne, der anvendes sammen med dem, er radioaktive, kan forbindelserne fremstilles, anvendes og kasseres, uden de detaljerede sikkerhedsforanstaltninger, der kræves til arbejde med radioisotoper. Disse nucleotidderivater er endvidere kemisk stabile og kan forventes at have funktionelle 20 levetider på flere år eller mere. Endelig muliggør disse forbindelser udvikling af sikrere, mere økonomiske, hurtigere og mere reproducerbare forskningsmetoder og diagnostiske metoder.

Den foreliggende opfindelse angår forbindelser med strukturen: 25 1 35

DK 164407 B

6 0 B1 HO-P----°"CH2 0

5 °H

H \ ** B---A

z 0 " 0-^ 0-P--O-CH,^' • H > 10 OH /

Η ^ 1 H

_ m z 0 Γ B" il 0-P—0-CH„

1 iX

IS OH JX^H H/

H i H

0

o-P--l-OH

L ^ 20 hvor hvert af B, B’ og B" er en purin, 7-deazapurin eller py-rimidinmolekyldel kovalent bundet til cl *-sti 11 i ngen i sukkermolekylet forudsat, at når B, B1 eller B" er purin eller 7-de-azapurin, er den bundet til N9-stillingen i purinen eller 25 7-deazapur i nen, og når B, B’ eller B" er pyrimidin, er den bundet til N^-sti11 ingen, hvor A er en molekyldel bestående af mindst tre carbonatomer, som er i stand til at danne et påviseligt kompleks med et 30 polypeptid, når forbindelsen er inkorporeret i en dobbelt- strenget dobbeltspiral dannet med et komplementært ribonu-cleinsyre eller deoxyribonucleinsyremolekyle, hvor den punkterede linie repræsenterer en kemisk binding, som 35 forbinder B og A, forudsat, at hvis B er purin, er bindingen bundet til 8-stillingen i purinen, hvis B er 7-deazapurin, er bindingen bundet til 7-stillingen i deazapurinen, og hvis B er pyrimidin, er bindingen bundet til 5-stillingen i pyrimidinen,

DK 164407 B

7 hvor z er H- eller H0-, og hvor tn og n er tal fra 0 op til ca. 100.000.

5 Disse forbindelser kan fremstilles ved enzymatisk polymerisation af en blanding af nucleotider, der indbefatter de modificerede nucleotider, som er beskrevet i beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 1605/91. Alternativt kan nucleotider, der forefindes i oligo- eller polynucleotider, modificeres ved an-10 vendelse af kemiske metoder.

Oligo- og polynucleotider, der er modificeret i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og oligo- og polynucleotider, hvori de modi fi cerede nucleotider er blevet 15 inkorporeret, kan anvendes som sonder i biomedicinsk forsk ning, klinisk diagnose og rekombinant DNA-teknologi. Disse forskellige anvendelser er baseret på molekylernes evne til at danne stabile komplekser med polypeptider, som igen kan påvises, enten ved hjælp af iboende egenskaber i polypeptidet eller 20 ved hjælp af påviselige molekyldele, som er bundet til eller som reagerer med polypeptidet.

Nogle anvendelser indbefatter påvisning og identificering af nucleinsyreholdige etiologiske midler, f.eks. bakterier og 25 vira, sortering af bakterier efter antibiotisk resistens, diagnostisering af genetiske forstyrrelser, f.eks. thalassemi og seglcel leanæmi, kromosomal karyotypedannelse og identificering af svulstceller. 1 2 3 4 5 6

Flere væsentlige kriterier må tilfredsstilles for, at et modi 2 ficeret nucleotid kan være generelt egnet som erstatning for 3 en radioaktivt mærket form af et naturligt forekommende nu 4 cleotid. For det første skal den modificerede forbindelse 5 indeholde en substituent eller sonde, som er unik, dvs., som 6 normalt ikke findes forbundet med nucleotider eller polynucleotider. For det andet skal sonden reagere specifikt med kemiske eller biologiske reagenser til skabelse af et følsomt påvisningssystem.

DK 164407 B

8

For det tredje skal påvisningssystemet være i stand til at reagere med sondesubstituenter inkorporeret i både enkeltstrengede og dobbeltstrengede polynucleotider for at være forenelig med nucleinsyrehybridiseringsmetodik. For at tilfreds-5 stille dette kriterium foretrækkes det, at sondemolekyldelen er bundet til purinen eller pyrimidinen gennem en kemisk binding eller "bi nd i ngsarm", således at den let kan reagere med antistoffer, andre detektorproteiner eller kemiske reagenser.

10 For det fjerde må de fysiske og biokemiske egenskaber af polynucleotider indeholdende et lille antal sondesubstituenter ikke ændres væsentligt, således at eksisterende fremgangsmåder under anvendelse af radioaktive hybridiseringssonder ikke behøver at ændres i omfattende grad. Dette kriterium skal til-15 fredsstilles, hvadenten sonden indføres ved enzymatiske eller direkte kemiske midler.

Endelig skal bindingen, soro binder sondemolekyldelen kunne tåle alle forsøgsbetingelser som normale nucleotider og poly-20 nucleotider rutinemæssigt udsættes for, f.eks. længere hybri-diseringstider ved forhøjede temperaturer, phenol og ekstraktion med organisk opløsningsmiddel, elektroforese osv.

Alle disse kriterier tilfredsstilles af de modificerede oligo-25 nucleotider og polynucleotider, der er beskrevet heri.

De i dansk patentansøgning nr. 1605/91 beskrevne modificerede nucleotider er i stand til at fungere som enzymsubstrater. Disse nucleotider kan derfor indføres i polynucleotider og 30 ol igonucleotider, som er i færd med at blive syntetiseret ved hjælp af celler, i rå celleekstrakter eller in vitro til fremstilling af forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse. To rækker af eksperimentelt bevis viste klart, at bio-tinylnucleotiderne blev inkorporeret. Den første er, at i nær-35 værelse af biotin-nucleotider syntetiserede polynucleotider selektivt blev tilbageholdt, når de blev kromatograferet over avi din- eller streptavidinaffinitetssøjler. Den anden bevis-

DK 164407 B

9 række var, at kun bi otin-mærkede polynucleotider blev i mmuno-udfældet ved behandling med renset anti-biotin IgG efterfulgt af formalin-fikseret Staphylococcus aureus. Dataene viser, at ekstremt små bioti nmængder kan påvises ved hjælp af denne 5 metode. Resultaterne viser også, at biotinmolekylet kan genkendes af avidin, streptavidin eller specifikke antistoffer, medens DNA stadig foreligger i sin naturlige, dobbelt-strenge-de form, hvilket er en betingelse, som er absolut afgørende, hvis anti stof-bindi ngen eller avidin-affiniteten skal være 10 anvendelige metoder til sondepåvisning, der benytter hybridi-séringsteknik.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte forbindelser med strukturen: 15 _ 0 B1 HO-P----O-CH- 0.

OH

Η I (b

20 0 B* * *A

O-f-r-0-CH2 0 °H \|Γ

H fH

m z — — 25 L “* 0 B" O-P—-0-CH0 “ <*_> B |h

30 O

fl

O--P OH

in n L j 35 hvor hvert af B, B' og B" repræsenterer en purin, 7-deazapurin eller pyrimidinmolekyldel kovalent bundet til '-sti 11 i ngen i sukkermolekylet forudsat, at når B, B' eller B" er purin eller

DK 164407 B

10 7-deazapurin, er den bundet til N9-sti 11 i ngen i purinen eller 7-deazapurinen, og når B, B' eller B” er pyrimidin, er den bundet til Nl-stti11 ingen, 5 hvor A er en molekyldel bestående af mindst 3 carbonatomer, som er i stand til at danne et påviseligt kompleks med et polypeptid, når forbindelsen er inkorporeret i en dobbeltstrenget dobbeltspiral dannet med et komplementært ribonu= cleinsyremolekyle eller desoxyribonucleinsyremolekyle, 10 hvor den punkterede linie repræsenterer en bindingsgruppe, som forbinder B og A, forudsat, at hvis B er purin, er bindingen bundet til 8-stillingen i purinen, hvis B er 7-deazapurin, er bindingen bundet til 7-stillingen i deaza- 15 purinen, og hvis B er pyrimidin, er bindingen bundet til 5-stillingen i pyrimidinen, hvor z er H- eller H0-, og 20 hvor m og n repræsenterer tal fra 0 op til ca. 100.000.

Det vil naturligvis let forstås, at i almindelighed vil m og n ikke samtidigt være 0, for i så tilfælde bliver forbindelsen blot et modificeret nucleotid som beskrevet i 25 beskrivelsen til dansk patentansøgning nr........ I almin delighed vil B' og B" variere inden for samme oligo- eller polynucleotid og er alternativt uracil, cytosin, thymin," guanin, adenin eller lignende. I almindelighed vil variationen svare til den ordnede rækkefølge af nUcléotider som koder for syntesen af peptider i overensstemmelse med velkendt genetisk kode. Det er dog meningen, at den viste struktur også omfatter polynucleotider, såsom poly C, poly U, poly r(A-U) og poly d(A-U) samt kalvethymus DNA, ribosomal RNA af E. coli eller gær, bacteriophag RNA og DNA (R17, fd),.dyriske vira SV40 DNA), kromosomal DNA og lignende, blot forudsat, at ilynucleotiderne er modificeret i overensstemmelse med opfindelsen.

DK 164407 B

11

Det må også forstås, at strukturen omfatter mere end ét modificeret nucleotid, der findes i den oligomere eller polymere, f.eks. fra to til tredive modificerede nucleo= tider. Den afgørende faktor i denne henseende er, at antal-5 let af modifikationer ikke er så stort, at polynucleotidet gøres ineffektivt til den tilsigtede anvendelse.

Endelig må det forstås, at modificerede oligo- og poly= nucleotider kan være forbundet til dannelse af store en-10 heder, der har samme struktur, når blot endestillede grupper gøres forenelige eller reaktionsdygtige.

Disse forbindelser kan fremstilles ved enzymatisk polymerisation af passende nucleotider, især nucleotidtriphosphater 15 i nærværelse af en nucleinsyreskabelon, som dirigerer syntesen under passende betingelser. Disse betingelser kan variere meget afhængende af det anvendte enzym, de tilstedeværende mængder nucleotider og andre variable. Eksempler på enzymer er DNA polymerase I af E. coli, bacteriophag T4 20 DNA polymerase, DNA polymeraser α og β fra murin og humane (HeLa) celler, DNA polymerase fra Herpes simplex virus, RNA polymerase fra E. coli, RNA polymerase af bacteriophag T7, eukaryotisk RNA polymerase inklusive HeLa-celle RNA polymerase III, kalvethymus RNA polymerase II og musecelle RNA 25 polymerase II.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af de omhandlede forbindelser ved enzymatisk polymer i sation er karakteriseret ved enzymatisk polymerisation af nucleotidtriphos-30 phater med strukturen:

Q

x-CH2 . (k Λ h"> 35 hI I h y z

DK 164407 B

12 hvor Q er Β···Α, B' eller B", og én af x og y er 0 0 0 II II II Η0-Ρ-0-Ρ-0-Ρ-0-,

5 III

OH OH OH

og den anden af x og y er H0-, i nærværelse af en nucleinsyre-skabelon under egnede beti ngel ser til dannelse af forbindelsen .

10

Forbindelserne kan også fremstilles ved terminal addition til oligo- eller polynucleotider til fremstilling af forbindelser, hvori m eller n er 0, afhængende af, om additionen er i 5 1 eller 3'-stilling. Forbindelser såsom pCp eller 15 pUp, hvori basen er biotiniseret, kan endvidere adderes til eksisterende molekyler under anvendelse af enzymet RNA ligase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af de om- 20 handlede forbindelser ved terminal addition til oligo- eller polynucleotider er karakteriseret ved (a) omsætning af en forbindelse med strukturen: 25 30 1

DK 164407 B

13 0 B' OH-P----O-CHL.O·^ . - kf >

I H

z B

O

O-f—3-CE

OH ivH H

» n—r* _jn Δ O B" OH <ζΗ H^>

15 Η \ H

O

0-P-----OH

OH

n 2° _ med et merkurisalt i et egnet opløsningsmiddel under egnede betingelser til dannelse af et merkureret derivat med strukturen: „ „ + B-Hg 25

• · . —......0 CH„ O

kOH

h r h.

o 30 ..........h 0-P-'·. .

OH

(b) omsætning af den merkurerede forbindelse med en kemisk molekyldel, som er reaktionsdygtig med -Hg+-delen af den 35 merkurerede forbindelse og repræsenteret ved formlen ·*·Ν, hvilken reaktion udføres i et vandigt opløsningsmiddel og i nærværelse af K2PdCl^ under stabile betingelser til dannelse af en forbindelse med strukturen:

DK 164407 B

14

B---N

----o—CH- o

H t H

5 z

O

II

o-P----

OH

jø hvor N er en reaktionsdygtig endestillet funktionel gruppe eller Af og (c) udvinding af forbindelsen ifølge opfindelsen, hvor N er A, eller når N er en reaktionsdygtig endestillet gruppe, omsæt-15 ning af forbindelsen med en forbindelse med strukturen M-A, hvor M repræsenterer en funktionel gruppe, der er reaktionsdygtig med N i et vandigt opløsningsmiddel under egnede betingelser til dannelse af forbindelsen ifølge opfindelsen, som så udvindes.

20

Modificerede oligo- og polynucleotider kan også fremstilles ved kemisk modifikation af eksisterende oligo- eller polynucleotider under anvendelse af den metode, der er beskrevet tidligere til modifikation af individuelle nucleo= 2 5 tider.

De forskellige modificerede ol igonucleotider og polynucleotider ifølge opfindelsen kan påvises ved at bringe forbindelserne i kontakt med polypeptider, som er i stand til at danne 30 komplekser dermed under egnede betingelser til dannelse af komplekserne, forudsat at polypeptiderne indeholder en eller flere molekyldele, som kan påvises, når komplekset eller komplekserne dannes, i almindelighed ved hjælp af sædvanlig på-vi sni ngstekni k.

35

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af en dobbeltstrenget polynucleotiddobbeltspiral indeholdende en for-

DK 164407 B

15 b i ndel se ifølge opfindelsen er karakteriseret ved, at poly-nucleotiddobbeltspi ral en bringes i kontakt med et polypept i d, som er i stand til at danne et kompleks dermed under egnede betingelser til dannelse af komplekset, hvilket polypeptid in-5 deholder en molekyldel, som kan påvises, når komplekset af po-lynucleotiddobbeltspiralen og polypept i det er dannet, og påvisning af dette kompleks.

En polypeptiddetektor til sonden af biotinyltypen er avidin.

10 Avidin-biotin-reaktionen udviser en af de fasteste ikke-kova-lente bindingskonstanter (K^s=10 15)r der er set i naturen.

Hvis avidin kobles til potentielt påviselige indikatormolekyler, f.eks. fluorescerende farvestoffer (fluoroscein, rhodamin), elektrontætte reagenser (ferritin, hæmocyanin, 15 kolloidalt guld) eller enzymer, som er i stand til at aflejre uopløselige reaktionsprodukter (peroxidase, alkalisk phosphatase), kan tilstedeværelsen, beliggenheden og/eller mængden af biotinsonden konstateres.

20 Avidin har uheldigvis en egenskab, som gør det mindre ønskeligt som biotinindikatorprotein, når det anvendes sammen med nucleinsyrer eller kromatinmateriale. Det er blevet oplyst (M.H. Heggeness, Stain Technol., 52, 165, 1977} M.H. Heggeness og J.F. Ash, J. Cell. Biol., 73, 783, 25 1977} E.A. Bayer og M. Wilchek, Methods of Biochemical

Analysis 26, 1, 1980), at avidin binder sig fast til kondenseret kromatin eller til subcellulære fraktioner, der indeholder store mængder nucleinsyre på en måde, som er uafhængig af dets biotinbindingsegenskab. Da avidin er et 30 basisk glycoprotein med en pi på 10,5, er dens histonag- tige karakter eller dens kulhydratmolekyler sandsynligvis ansvarlige for disse iagttagne ikke-specifikke reaktioner.

En foretrukken sonde til biotinholdige nucleotider og 35 derivater er streptavidin, som er et avidinlignende pro tein syntetiseret af jordbundsorganismen Streptomyces avidinii. Dets fremstilling og rensning er beskrevet af

DK 164407 B

16

Hoffman m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4666 (1980). Streptavidin har et meget lavere pX (5,01, er ikke-glycosy= leret og udviser meget lavere uspecifik binding til DNA end avidin og frembyder derfor potentielle fordele til an- 5 vendelser, der indebærer metodik til påvisning af nuclein= syre.

Et meget foretrukket protein til biotinlignende sondepåvisning er monospecifik kanin IgG, antibiotin immunoglobulin.

10 Denne forbindelse blev fremstillet ved at immunisere kaniner med okseserumalbumin konjugeret biotin som tidligere beskrevet (M. Berger, Methods in Enzymology, 62, 319 (1979)) og renset ved affinitetskromatografi. Selv om associationskonstanten af immunoglobulin-haptener har værdier af K _ 6 10 3-Ssn 15 (10 til 10 ) , der er betydeligt lavere end for avidin- biotin-komplekser, er de i hovedsagen ækvivalente med de, der er iagttaget med avidin-iminobiotin-komplekset. Anti-biotinantistofferne har endvidere vist sig yderst nyttige til påvisning af specifikke polynucleotidsekvenser på kro-20 mosomer ved in situ hybridisering, da der sker ringe eller ingen uspecifik binding af antistoffet til kromatinmateria-le.

De modificerede polynucleotider ifølge opfindelsen kan de-25 natureres og renatureres under betingelser, som er forenelige med deres anvendelse som hybridiseringssonder. En analyse af varmedenatureringsprofilerne og hybridiseringsegen-skaberne af flere biotinsubstituerede DNA og RNA polymere viser klart dette. pBR 322 DNA eller λ DNA, der er hak-30 translateret til indføring af ca. 10-100 biotinrester pr. kilobase, har f.eks. Tm-værdier, der er i det væsentlige identiske med værdien af kontrollen, biotinfrie DNA. End-32 videre udviste P-mærket, biotinsubstitueret, pBR 322 DNA samme grad af specificitet og autoradiografisk signalinten-35 sitet som kontrollen, thymidinholdig DNA, når den blev anvendt som hybridiseringssonde til påvisning af bakteriekolonier indeholdende plasmidet.

DK 164407 B

17 I DNA-dobbeltspiraler, såsom MVM RF DNA, hvori hver thymi= dinrest i én streng (1250 in toto pr. 5 Kb) er erstattet med et biotinylnucleotid, er Tm kun 5°C lavere end af den usubstituerede kontrol. Selv om Tm af poly d(A-bioU) , hvori 5 hvert basepar indeholder en bio-dUMP-rest er 15°C lavere end af poly d(A-T)-kontrollen, var graden af samvirke og omfanget af hyperkromicitet iagttaget, både under denaturering og renaturering den samme for de to polymere. En parallel analyse af RNA dobbeltspiraler og DNA/RNA hybrider 10 viste, at deres Tm også faldt, når biotinindholdet af den polymere voksede. Det er dog klart, at et væsentligt antal biotinmolekyler kan indføres uden betydeligt at ændre hy-bridiseringsegenskaberne af de polymere.

I5 Disse resultater antyder stærkt, at biotinsubstituerede polynucleotider kan anvendes som sonder til påvisning og/ eller lokalisering af specifikke polynucleotidsekvenser i kromosomer, fikserede celler eller vævssnit. Den generelle fremgangsmåde til påvisning af den biotinsubstituerede sonde 20 er illustreret skematisk som følger:

GENERAL FREMGANGSMÅDE TIL SONDEPÅVISNING VIA IN SITU METODER, KOLONIMETODER ELLER NORD/SYD HYBRIDISERINGSMETODER

Antisonde . sekvens .

25 -mmmmmmmmmmm- 1) mål hybridiser med biotiniseret udlevering eller hapteniseret sonde (med eller uden at klone bærersekvenser) - _ 30 /‘6 ό 6 ' 6 ' 6 \ "°= biotin — 2) signalforstærk- 1) avidin-peroxidase 35 ning 2) IgG-peroxidase

3) primær α-determinant IgG

......

V

DK 164407 B

18

Æ, i i i A X

(i) (2) or Jgx 3) påvisning; 1) uopløselig peroxidaseprodukter;DAB 2) antistof sandwichteknik.

10

Dette generelle skema illustrerer kun fremgangsmåder anvendt til genkortlægning (cytogenetik) og rekombinant DNA-teknologi. Det kan imidlertid lige så godt anvendes til påvisning af nucleinsyresekvenser af bakteriel, viral, fungal IB eller parasitoprindelse i kliniske prøver, og dette danner grundlag for en virkningsfuld ny metode til klinisk diagnostik, som ikke er baseret på brug af radioisotoper.

Immunologiske og histokemiske metoder til påvisning af 20 biotin har vist, at den grundlæggende metode er anvendelig til en hurtig fremgangsmåde til genkortlægning af in situ hybridisering og ikke-radioaktive fremgangsmåder til påvisning af specifikke nucleinsyresekvenser ved udslettende hybridiseringsmetoder. Denne teknologi kan anvendes til 25 udvikling af nye kliniske diagnostiske metoder.

Ved anvendelse af denne idé er det muligt at bestemme tilstedeværelsen af et specifikt desoxyribonucleinsyre- eller ribonucleinsyremolekyle, især et sådant molekyle afledt af 30 en levende organisme, f.eks. bakterier, svampe, virus, gær eller et pattedyr. Dette muliggør igen diagnose af nuclein= syreholdige etiologiske midler i en patient eller et andet individ. 1

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af tilstedeværelsen af et desoxyribonucleinsyremolekyle eller et ribonucleinsyremolekyle er karakteriseret ved dannelse af en dob-

DK 164407 B

19 bel tstrenget hybridpolynucleotiddobbeltspiral, som indeholder en enkelt streng af desoxyribonucleinsyre eller ribonuclein-syre svarende til eller afledt af desoxyribonucleinsyremoleky-let eller ribonucleinsyremolekylet og en forbindelse ifølge 5 opfindelsen, og påvisning af den dobbeltstrengede hybridpoly-nucleotiddobbeltspiral ved at bringe polynucleotiddobbeltspi-ralen i kontakt med et polypeptid, der kan et et kompleks dermed under egnede betingelser til dannelse af komplekset, hvilket polypeptid indeholder en molekyldel, som kan påvises, når 10 komplekset af polynucleotiddobbeltspiralen og polypeptidet er dannet, og påvisning af dette kompleks.

Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til at sortere bakterier for at bestemme antibiotisk resistens. F.eks. kan 15 bestemmes penicillinresistens i Streptococcus pyogenes eller Neisseria meningitidis; tetracykli nresi stens i Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa,

Streptococcus pyogenes eller Neisseria gonorrhoea og amino= glycosidresistens i Mycobacterium tuberculosis.

20

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til undersøgelse af en bakterie for at bestemme tilstedeværelsen af resistens mod et antibiotikum er karakterisert ved fremstilling af et polynucleo-tid komplementært til den desoxyribonucleinsyregensekvens i 25 bakterien, som bibringer resistens mod antibiotikummet deri, og at dette polynucleotid bringes i kontakt med fra bakterien opnået desoxyribonucleinsyre under egnede betingelser til dannelse af en dobbeltstrenget hybrid dobbeltspiral, og denne dobbeltspiral bringes i kontakt med et polypeptid, som er i 30 stand til at danne et kompleks med hybriddobbeltspiralen under egnede betingelser, hvilket polypeptid indeholder en molekyldel, som kan påvises, hvis komplekset er dannet, og påvisning af ti 1stedeværelsen af komplekset under anvendelse af passende påvi sni ngstekni k, idet ti 1stedeværelsen af komplekset viser 35 resistens over for antibiotikumet, og fravær af komplekset viser følsomhed over for antibiotikumet.

DK 164407 B

20 I disse fremgangsmåder fremstilles et polynucleotid, som er komplementært til nucleinsyresekvensen, som karakteriserer organismen eller dens antibiotiske resistens, og som desuden indeholder et eller flere modificerede nucleotider 5 ifølge opfindelsen. Dette polynucleotid hybridiseres med nucleinsyre fremkommet af organismen, som er under undersøgelse. Manglende evne til at hybridisere viser fravær af organismen eller af resistensegenskaben. Hybridiserede nucleinsyredobbeltspiraler identificeres så ved at danne 10 et kompleks mellem dobbeltspiralen og et egnet polypeptid, som bærer en påviselig molekyldel, og påvise tilstedeværelsen af komplekset under anvendelse af en passende påvisningsteknik. Positiv påvisning viser, at komplekset dobbeltspiralen og derfor nucleinsyresekvensen, som har interesse, 15 er til stede.

Denne metode kan udstrækkes til diagnose af genetiske forstyrrelser, såsom thalassemi og seglcelleanæmi. Den des= oxyribonucleotidgensekvens, hvis tilstedeværelse eller fra-20 vær (hvis det drejer sig om thalassemi) står i forbindelse med sygdommen, kan påvises efter hybridisering med en poly= nucleotidsonde ifølge opfindelsen baseret på kompleksdannelse med et egnet påviseligt polypeptid. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til diagnosticering af en 2 genetisk forstyrrelse i et individ er karakteriseret ved, at 3 der fremstilles et polynucleotid komplementært til desoxyribo- 4 nucleinsyregensekvensen i individet, der er forbundet med den 5 genetiske forstyrrelse og indeholder forbindelsen ifølge op- 6 findelsen inkorporeret deri, hvilket polynucleotid bringes i 7 kontakt med desoxyribonucleinsyre fremkommet af individet un 8 der egnede betingelser til dannelse af en dobbeltstrenget hy 9 brid dobbeltspiral, og denne dobbeltspiral bringes i kontakt 10 med et polypeptid, som er i stand til at danne et kompleks med 11 hybriddobbeltspiralen, hvilket polypeptid indeholder en molekyldel, der kan påvises, når komplekset er dannet, og påvisning af tilstedeværelsen af komplekset under anvendelse af

DK 164407 B

21 ningsteknik, idet tilstedeværelse eller fravær af komplekset viser tilstedeværelse eller fravær af den genetiske forstyrrelse.

5 Kortlægning af gener og deres transskripter til specifikke steder på kromosomer har været et kedeligt og tidsrøvende arbejde, der hovedsagelig indebærer cellefusionsteknik og somatisk cellegenetik. Selv om in situ hybridisering har været anvendt med godt resultat til kortlægning af gensek-10 venser af enkeltkopi i arter, som undergår kromosompolyteni= sering, såsom Drosophila, har påvisning af gener med uniksekvens i de fleste højere eukaryotiske kromosomer været yderst vanskelig eller umulig ved anvendelse af standard-hybridiseringsmetoder. Nødvendigheden af polynucleotid-15 sonder med meget høj specifik radioaktivitet for at lette autoradiografisk lokalisering af hybridiseringsstedet resulterer også i hurtig radiodekomponering af sonden og en ledsagende forøgelse i baggrundsstøjen af sølvkornaflejring. Brugen af hybridiseringssonder med lave til moderate 20 specifikke radioaktiviteter kræver eksponeringstider på mange dage eller uger, selv for at påvise sekvenser i flere kopier, såsom ribosomale RNA-gener eller satellit DNA. Da rekombinant DNA-teknologi har muliggjort den molekulære kloning af praktisk taget enhver sekvens i enkeltkopi, der 25 findes i eukaryotiske celler, ville det være yderst gavnligt at have en hurtig og følsom metode til kortlægning af den kromosomale oprindelse af sådanne klonede genomiske fragmenter. 1 2 3 4 5 6

Modificerede nucleotider kan anvendes i en fremgangsmåde 2 til genkortlægning ved in situ hybridisering, som omgår 3 brugen af radioisotoper. Denne fremgangsmåde drager fordel 4 af en thymidinanalogholdig biotin, som kan inkorporeres 5 enzymatisk i DNA-sonder ved haktranslation. Efter hybridi= 6 sering in situ tjener biotinmolekylerne som antigener for affinitetsrensede kanin anti-biotin antistoffer. Immuno= fluorescente antistofsandwicher fremstillet med fluoresce=

DK 164407 B

22 inmærket gede anti-kanin IgG muliggør hurtig og specifik cytogenetisk lokalisering af klonede gensekvenser som grøngule bånd. Denne metode giver fire hovedfordele frem for sædvanlige autoradiografiske metoder til in situ genlokali= 5 sering, nemlig baggrundsstøj, en forøgelse i opløsningskraft mellem båndene, et fald i den tid, der kræves til at bestemme stedet for sondehybridisering og kemisk stabile hybridiseringssonder. Denne metode er med godt resultat blevet anvendt til at lokalisere gentagne og unike DNA·’· 10 sekvenser i polytenkromosomet i Drosophila milanogaster og satellit DNA på musemetaphasekromosomer.

Det har således vist sig, at polytenkromosomer kunne anvendes som et prøvesystem til at konstatere virkningsgraden af 15 sonder under anvendelse af de modificerede nucleotider ifølge den foreliggende opfindelse, som påvist ved indirekte immunofluorescens for in situ genkortlægning. Sonderne indeholdt en varietet af klonede Drosophila sekvenser fra Otto Schmidt og Dieter Soli, såsom tRNA-gener klonet i 20 plasmidvektorer med indsætninger af størrelser liggende fra ca. 5 til ca. 22 kilobaser. Mange af disse kloner er allerede blevet tillagt specifikke bånd på Drosophila kromosomkortet ved sædvanlig in situ hybridiseringsmetoder under anvendelse af radioisotoper.

25

DNA-sonder blev haktranslateret i nærværelse af Bio^dUTP. Lejlighedsvis blev 3H dATP og/eller 3H dCTP inkluderet i haktranslationsreaktionsblandingen. Dette muliggjorde både autoradiografisk og immunofluorescent lokalisering af en 30 sekvens på en enkelt kromosomudspredning. In situ hybridi-sering som beskrevet i M.L. Pardue og J.G. Gall, Methods in Cell Biol., 10, 1 (1975). Efter den endelige 2 x SSC vask for at fjerne ikke-hybridiseret sonde, blev glassene skyllet med PBS (saltopløsning med phosphatstødpude) og 35 inkuberet ved 37°C med 2,5 yg/ml kanin anti-biotin i PBS og 10 mg/ml BSA i 2-16 timer. Dette blev efterfulgt af inkubation af glassene med FITC mærket gede anti-kanin IgG

DK 164407 B

23 (Miles Laboratories, fortyndet 1:100 i PBS og 10 mg/ml BSA) i 1-4 timer. Evans-blåt blev ofte krævet som rød modfarvning for at se kromosomerne med fluorescerende belysning.

5 Når plasmider pBR 17D og pPW 539 indeholdende henholdsvis 5Kb og 22 Kb indsætninger blev hybridiseret på denne måde, viste det sig, at hybridiseringsmønsteret er reproducerbart fra den ene udspredning til den anden og iagttages 10 utvetydigt på mere end 90% af kromosomudspredningerne på et givet glas.

Det klonede transponerbare element pAC 104 vides at kortlægge på mange steder langs Drosophila genomet. Sammen-15 ligning af det autoradiografiske og det fluorescerende billede fremkommet ved in situ hybridisering af denne sonde illustrerer en større fordel ved denne fremgangsmåde, dvs., at hvor der fremkommer diffuse områder af sølvkorn på en autoradiograf, kan der skelnes dubletter eller en 20 række bånd ved immunofluorescerende mærkning.

Den anden umiddelbart indlysende fordel ved denne fremgangsmåde er det kolossale fald i tid, der kræves til at genudpegelser kan ske ved indirekte immunofluorescens. En 25 udpegelse af et DNA fragment til et givet bånd kan ske inden for 6 timer fra hybridiseringen. Dette er i sammenligning med dage eller uger, der kræves til radiografiske eksponeringsmetoder. Denne faktor i kombination med forøget opløsning gør brug af modificerede nucleotider påvist ved 30 indirekte immunofluorescens umiddelbart at foretrække frem for mere klassiske metoder.

Det er blevet vist, at denne immunologiske metode også virker med pattedyrkromosomer, hvori satellit DNA er blevet 35 kortlagt til de centromere områder af musernetaphasekromo= somer. Resultatet giver et grundlag for udvikling af en simpel genkortlægningsmetode for enkeltkopi (unike) sekvens-

DK 164407 B

24 er i kromosomer fra mennesket og andre pattedyr. En sådan fremgangsmåde vil meget lette vor forståelse af den genetiske organisation af kromosomet og gøre klinisk cytogenetisk diagnose meget hurtigere og praktisk.

5 Påvisning og/eller billeddannelse af meget lave niveauer af fluorescerende lys er mulig ved anvendelse af i øjeblikket tilgængelige bi 1 ledforstærkere eller systemer sammensat af lasere og fotomultiplikatorer. Disse metoder muliggør påvis-10 ning af lys ned til individuelle fotoners niveau. Med egnede digitale behandlingssystemer kan billeder produceres, hvori hvert punkt, dvs. hvert billedelement i billedet, er strengt proportionalt med antallet af fotoner, som er emitteret af et punkt på genstanden. Ved anvendelse af systemer af denne art 15 eller strømsystemer, hvori cellerne eller dele af celler strømmer forbi en laserstråle, kan man opnå stigninger i påvisningsf øl somhed for fluorescerende materiale eller faktorer mellem 100 og 1000 udover den.som kan påvises med øjet. Denne stigning er tilstrækkelig til påvisning af fluorescensen af 20 enkeltkopi-gener.

Selv om en enkelttrins "antistofsandwich"-metode, ved hvilken kromosomudspredningen angribes, efter-hybridisering, med kanin anti-biotin IgG kan være vellykket, kan denne frem-25 gangsmåde muligvis ikke udvikle tilstrækkelig fluorescens til utvetydig genudpegelse. Et meget stærkere fluo= rometrisk signal kan derimod opnås ved at anvende den af Lamm, m.fl. (1972), Wofsy, m.fl., (1974) beskrevne "hap= ten-antistof sandwichteknik". Ved denne fremgangsmåde 30 bliver det primære antistof i det foreliggende tilfælde monospecifikt kanin anti-biotin IgG, kemisk modificeret med et hapteniseringsreagens, såsom 2,4-dinitrofluorbenzen, fortrinsvis medens immunoglobulinet er bundet til en anti= genaffinitetssøjle (biotin-sepharose TM). Så mange som 35 15-20 hapten (DNP) grupper kan kobles til det primære anti stof uden at nedsætte dets antigenbindende affinitet eller specificitet (Wallace og Wofsy, 1979). Hvis den primære

DK 164407 B

25 antistofbehandling af forsøgsprøven efterfølges af en inkubation med et fluorescerende mærket anti-hapten IgG-antistof i stedet for et fluorescerende mærket anti-IgG, kan der opnås en 5-7 dobbelt forøgelse i fluorescenssignal.

5 Da man også har tilgængeligt monospecifikt marsvineanti-DNP IgG, kan man også haptenisere dette sekundære antistof med biotin og derved udvikle to anti-hapten IgG populationer, DNP-mærket anti-biotin IgG og biotin-mærket anti-DNP IgG. Hvis disse kan anvendes skiftevis til at opnå flere 10 omgange hapten-antistofsandwichdannelse og så følges af fluorescerende mærket protein A fra Staphylococcus aureus, som binder specifikt til IgG molekyler fra mange pattedyrarter, kunne det resultere i en enorm forstærkelse af det primære antistofsignal med deraf følgende anvendelighed.

15

Proteinet streptavidin fra Streptomyces avidini er et potentielt alternativ til anti-biotin IgG som en bærer til specifikt at rette et koblet visualiseringssystem [f.eks. fluorescerende sonder (ovenfor) eller histokemiske 20 reagenser (nedenfor)] mod stedet for det hybridiserede biotinholdige polynucleotid. En af streptavidins fordele frem for anti-biotin IgG er, at dets affinitet til biotin 15 er K =10 , hvorimod associationskonstanterne for aSSIl 7 10 25 hapten-IgG reaktioner er 10 til 10 . Den store reak tionshastighed og ekstreme affinitet betyder, at den tid, der kræves til at lokalisere den biotiniserede sonde, vil være minutter med streptavidin til forskel fra timer med immunologiske reagenser.

30

Indledende bedømmelser af et streptavidinpåvisningssystem er i gang for tiden. Polytenkromosomer hybridiseret med biotiniserede DNA-sonder vil blive inkuberet med strept= avidin efterfulgt af en inkubation med okseserumalbumin, 35 som er blevet dobbelt mærket med biotin og FITC (FITC, biotinyl-BSA). Da sandsynligvis kun en af de fire strept= avidinunderenheder vil indgå i binding ved hvert biotini= seret DNA-sted, kan et mærket BSA molekyle potentielt

DK 164407 B

26 binde til hver af de resterende tre ikke-konjugerede underenheder af komplekset af streptavidin og biotinylnucleotid. Fluorescenssignalet fra dette enkelte streptavidin + FITC, biotinylBSA-lag vil blive sammenlignet med en kontrol under 5 anvendelse af den tidligere beskrevne grundlæggende "antistofs andwichme tode " .

Hvis "antistofsandwich" og streptavidin + FITC, biotinyl-BSA-påvisningsintensiteterne er sammenlignelige kan man 10 forsøge at forstærke streptavidin + FITC, biotinyl-BSA- systemet til enkeltkopi-kopieringsfølsomhed på en måde, som er parallel med den multiple "hapten-antistofsandwich"-metode. Da nogle biotingrupper på BSA ikke vil bindes til det første lag streptavidin, kan der tilføjes et andet 15 lag streptavidin, indtil der opnås tilstrækkeligt signal.

Hvis f.eks. i det andet lag kun to streptavidinprotomere binder til hvert første lag BSA og hver af disse strept= avidinprotomere binder tre FITC-biotinyl BSA-molekyler, så vil intensiteten af det andet lag være dobbelt så stor 20 som den af det første lag. For det tredje lag vil/^naloge bindingsstøkiometrier den fluorescerende intensitet være 12 gange intensiteten af det første lag, således at den totale intensitet hurtigt vil vokse med successivt tilføjede lag.

25

Der er planer om at anvende et større bærerprotein, såsom thyroglobulin i stedet for BSA for at maksimere mængder af bundet fluorescens og biotinsonder. Det kan også være nødvendigt at anvende en større bindingsarm mellem biotin-30 sonden og bærerproteinet. En længere bindingsarm skulle sterisk optimere den teoretiske afgivelse af et biotinise-ret fluorescerende bærermolekyle til hver ikke-konjugeret streptavidinunderenhed og maksimere antallet af streptavidinprotomere i det følgende lag, som vil binde til den 35 biotiniserede fluorescerende bærer. Som før vil der blive udført passende kontrol for at sikre, at substitution af bærerproteinet med fluorescerende sonder og biotin ikke

DK 164407 B

27 giver anledning til opløselighedsproblemer og/eller uspecifikke bindingsproblemer.

Afgivelsessystemet streptavidin-bærerprotein har to væsent-5 lige fordele frem for den immunofluorescerende metode foruden hastigheden i afgivelsen. For det første kræves kun to proteinkomponenter til at danne lagene. For det andet behøver kun ét bærerprotein at blive modificeret, og det er ikke nødvendigt at opretholde funktionel eller endog 10 total strukturel integritet, når blot biotingrupperne er tilgængelige for streptavidin.

Et alternativ til fluorescensmetoden til visualisering af hybridiserede sonder er at rette enzymer, såsom peroxidase, 15 alkalisk phosphatase af β-galactosidase mod hybridiserings-stedet, hvor enzymatisk omdannelse af opløselige substrater til uopløselige farvede bundfald muliggør visualisering med lysmikroskop. Den vigtige fordel ved denne teknik er, at de histokemiske metoder er 10 til 100 gange mere følsom-20 me end fluorescenspåvisning. Desuden bleges de farvede bundfald ikke ved omfattende eksponering i lys, således at man undgår én af de generelle ulemper ved fluorescerende lysmikroskopi. Disse enzymer kan kobles til det endelige antistof i stedet for fluorescerende sonder ved "hapten-25 antistofsandwich"-teknikken under anvendelse af bifunktionelle reagenser, såsom glutaraldehyd,eller hvis det drejer sig om peroxidase via oxidation af peroxidase carbo= hydratmolekyldelene til aldehyder og kobling af disse rester med ε-aminogrupper i det ønskede protein. Til metoden 30 med streptavidin-biotiniseret bærerprotein kunne et enzym med biotinylgrupper koblet dertil erstatte et fluorescerende biotiniseret bærersystem. Alternativt kunne enzymet kobles via biotin til det sidste lag streptavidin, idet der opbygges forstærkelse af streptavidinsteder i foregående lag 35 under anvendelse af biotiniseret BSA eller thyroglobulin.

I den nærmeste fremtid vil blive påbegyndt udvikling af de nødvendige histokemiske reagenser og de egnede kombination-

DK 164407 B

23 er af substrat og uopløseligt produkt til visualisering af in situ hyb ridi seringer uden baggrundsproblemer. De histo= kemiske metoder til signalforstærkelse skulle derfor være parat til afprøvning i sommeren 1981.

5

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til kromosomal karyo-typedannelse. Denne fremgangsmåde er karakteriseret ved fremstilling af en række modificerede polynucleotider svarende til en række definerede genetiske sekvenser lokaliseret på kromo-10 somer, hvilke polynucleotider indeholder forbindelser ifølge opfindelsen, og at disse polynucleotider bringes i kontakt med fra kromosomer opnået desoxyribonucleinsyre til dannelse af hybriddobbeltspi raler, og hver af disse dobbeltspi raler bringes i kontakt med et polypeptid, som er i stand til at danne 15 et kompleks med hver sådan dobbeltspiral, hvilke polypeptider indeholder molekyldele, der kan påvises, når komplekserne er dannet, og bestemmelse af lokaliseringen af hvert kompleks på kromosomerne for derved at bestemme lokaliseringen af de genetiske sekvenser på kromosomerne.

20

En anden udførelsesform for opfindelsen indebærer påvisning af poly A-holdige sekvenser under anvendelse af poly U, Hvori nogle af uracilbaserne er blevet modificeret til at indeholde en sonde.

25

Endelig kan svulstceller diagnostiseres ved at fremstille polynucleotider, som er modificeret ifølge opfindelsen, og er komplementære til den messenger ribonucleinsyre, der syntetiseres af en desoxyribonucleinsyregensekvens, der er 30 forbundet med produktionen af polypeptiderne, såsom a-fos-terprotein eller carcinoembryonisk antigen, hvis tilstedeværelse er diagnostisk for specifikke tumorceller. Hybri-disering og påvisning af hybriddobbeltspiraler ville således give en metode til påvisning af tumorcellerne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til diagnosticering af en tumorcelle er karakter i seret ved fremstilling af et polynu- 35

DK 164407 B

29 cleotid, som er komplementært til en messenger ribonucleinsyre syntetiseret af en desoxyribonucleinsyregensekvens, der er forbundet med produktion af et polypeptid, som er diagnostisk for tumorcellen og indeholder en forbindelse ifølge opfinde!-5 sen, indføring af dette polynucleotid i cellen under egnede betingelser for at muliggøre, at polynucleotidet hybridiserer med desoxyri bonuelei nsyregensekvensen , kontaktering af det hy-bridiserede polynucleotid med et polypeptid, som kan danne et kompleks med det hybridiserede polynucleotid, hvilket polypep-10 tid indeholder en molekyldel, som kan påvises, når hybriderne er dannet, og påvisning af komplekset.

Fremdeles angår opfindelsen et diagnostisk udstyr, der er eg-‘ net til bestemmelse af tilstedeværelsen af en nucleinsyre, 15 hvilket udstyr er karakteriseret ved, at det omfatter en forbindelse ifølge opfindelsen, som er komplementær til al eller en unik del af nucleinsyren, og et polypeptid, som er i stand til at danne et påviseligt kompleks dermed.

20 Endelig angår opfindelsen også et mellemprodukt til brug ved fremgangsmåden til fremst illing af de omhandlede forbindelser ved enzymatisk polymerisation, hvilket mellemprodukt er karakteriseret ved, at det har strukturen:

B· · -A

25 X-CHo^O.

H^>

Η H

y z 30 hvor B er en purin, 7-deazapurin eller pyrimidinmolekyldel

i I

kovalent bundet-til C -stillingen i sukkermolekylet, forudsat, at når B er purin eller 7-deazapurin, er den bundet til N^-stillingen i purinen eller deazapurinen, og når B 35 er pyrimidin, er den bundet til N^-stillingen, hvor A er en molekyldel bestående af mindst 3 carbonatomer, som er i stand til at danne et påviseligt kompleks med et

DK 164407 B

30 polypeptid, når forbindelsen inkorporeres i en dobbeltstrenget ribonucleinsyre, desoxyribonucleinsyredobbeltspiral eller DNA-RNA hybrid, 5 hvor den punkterede linie repræsenterer en binding eller gruppe, som forbinder B og A, forudsat, at hvis B.er pur in, -er bindingen bundet til 8-stillingen af purinen> hvis B er 7-deazapurin, er bindingen bundet til 7-stillingen af -deazapurinen, og hvis B er pyrimidin, er bindingen bundet 10 til 5-stillingen i pyrimidinen, og

0 0 0 1! II II

H eller OH, og én af x og y er H0-P-0-P-0-P-0- og OH OH OH 15 den anden er H0-.

De følgende eksempler I - III er anført til illustration af forskellige aspekter ved den foreliggende opfindelse.

20

Eksempler

Anvendelser af mærkede DNA-sekvenser.

25 I. Karyotypedannelse.

(a) Af en human gensamling udvælges 100 til 200 kloner. De mærkes som ovenfor beskrevet, og for hver klon lokaliseres dens hybridiseringssted eller steder visuelt eller med et 3 0 videosystem med lavt lysniveau. For de kloner, som svarer til et gen med unik-sekvens, bestemmer dette lokaliseringen af det klonede DNA på et givet humant kromosom. Der tages flere kloner for hvert kromosom. Hver af disse mærkede kloner kan anvendes til at identificere specielle kromosomer.

3 5

De kan også anvendes i kombination for at identificere hver af de 46 kromosomer som værende et af de 22 autosomale par eller X eller Y. Ved at lade et sæt mærkede kloner hybri=

DK 164407 B

31 disere til kromosomerne og derefter tilsætte en fluorescerende farve til mærket, kan sættet af kloner og deres lokaliseringer visualiseres og vil fluorescere med en bestemt farve. Et andet sæt mærkede kloner kunne så anvendes og 5 bringes til at reagere med et andet fluorescerende farvestof. Samme proces kan gentages et antal gange. Man kan således, hvis det ønskes, have flere sæt fluorescerende mærker bundet til det cellulære DNA på forskellige, men specifikke lokaliseringer på hvert af kromosomerne. Disse mærker 10 kunne anvendes til visuel eller computeriseret automatisk karyotypedanneIse.

(b) Til automatisk karyotypedannelse kunne man anvpnde et sæt kloner til at identificere den tilnærmede beliggenhed 15 af hver af de 46 kromosomer ved at finde sæt af pletter svarende til antallet af mærkende steder på hvert kromosom.

Det er således muligt ved computeranalyse af de cifrede billeder at bestemme, om kromosomerne er passende udspredt til yderligere analyse. Hvis de er passende udspredt, kan 20 man anvende computeranalyse til at identificere hver af de individuelle kromosomer ved lokaliseringen og fordelingen af de mærkede pletter på hver.

Ved at benytte den omstændighed, at de fluorescerende plet-25 ter kan placeres på specifikke steder på hvert kromosom, kan man udføre enten manuel eller automatisk karyotypedannelse meget mere effektivt end uden sådanne mærker.

II. Diagnose af genetiske forstyrrelser.

30

Ved at vælge klonerne, som binder specifikt til et givet kromosom, såsom nr. 23, er det muligt at tælle antallet af kopier af det særlige kromosom i en celle, selv hvis kromosomerne ikke er kondenseret i metafase. Når der således 35 haves fosterceller til prenatal diagnose af trisomi 21, kan diagnosen udføres, selv hvis kromosomerne ikke er kondenseret i metafase. Om nødvendigt kan der anvendes to sæt

DK 164407 B

32 mærker, ét som ville være specifikt for kromosom 23 og ét for et andet kromosom. Ved at måle i hver celle forholdet mellem de to mærker, som kunne være af forskellige farver, er det muligt at identificere cellerne, som viser et unor-5 malt antal kromosomer nr. 23. Denne fremgangsmåde kan anvendes enten på mikroskopglas med et videosystem med lavt lysniveau eller i et strømningscytometersystem under anvendelse af laserstimulering. Den kan anvendes til at bestemme ethvert unormalt kromosomtal.

10 III. Mikroorgahismepåvishing og identifikation.

Mærkningen af specifikke sekvenser af DNA,som ovenfor beskrevet, muliggør identificering og tælling af individuelle 15 bakterier. For at identificere de individuelle bakterier, hvortil et givet fragment af DNA hybridiserér, må følsomheden være således, at der kan påvises en enkelt mærket struktur. Dette kan gøres ved anvendelse af et videosystem med lavt lysniveau og computeropsummering af billeder, el-20 ler ved at anvende et andet apparat til at forstærke lysbilledet. Et strømningssystem kan også anvendes, hvis følsomheden kan gøres tilstrækkelig stor. Hvis man immobili-serede bakterierne på et mikroskopglas, kunne deres lokalisering findes, og antallet af sådanne fluorescerende 25 pletter tælles. Dette ville give en tælling af alle de bakterier, som indeholder DNA, der kan hybridisere med den anvendte givne klon. Hvis klonen vælges som værende specifik for en given stamme eller bakterier, kan man tælle antallet af organismer af den stamme. Enhver antibiotisk re-30 sistens, i:'for hvilken et givet gen er blevet identificeret, kunne desuden karakteriseres på lignende måde under anvendelse som sonde af DNA sekvensen, der er indeholdt i det antibiotisk-resistente gen. Desuden kunne anvendes en sonde, som er specifik for et resistent plasmid indeholdene 35 de et eller flere gener med antibiotikaresistens. Foruden individuelle bakterier kan grupper eller bakterieceller af en given stamme påvises, og deres antal bedømmes, hvis de

Claims (11)

1. 0 B' HOP----0“CH„ 0 . OH ^ 'h>

   15 Jrj-|Xh
2. 2. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge krav 1,kendetegnet ved enzymatisk polymerisa-20 tion af nucleotidtriphosphater med strukturen: Q x-CH2 0^^ <H H> 25 ηΊ I H y z hvor Q er Β···Α, B* eller B", og én af x og y er 30 0 0 0 H0-P-0-P-0-P-0-, OH OH OH og den anden af x og y er H0-, i nærværelse af en nuclein= syreskabelon under egnede betingelser til dannelse af for- 3 5 bindeisen.

   2 B * * * A 0 O-P-o-ch2 O OH |<H lT> 20 Γ)-Γη ® * r- i i —* Dll i o B i I - n · O--p--O-CH, .0^. OH (4l h"> 25 ηΊ—ri i z I S ! 0 i i O-P----1—OH OH I 30. n . -J hvor hvert B, B' og B" er en purin, deazapurin eller pyrimi= i · dinmolekyldel kovalent bundet til C -stillingen i sukker- 1 molekylet, forudsat, at når B, B' eller B" er purin eller 9 deazapurin, er den bundet til N -stillingen i purinen eller deazapurinen, og når B, B" eller B" er pyrimidin, er den bundet til N^-stillingen, DK 164407 B 34 hvor A er en molekyldel bestående af mindst 3 carbonatomer, som er i stand til at danne et påviseligt kompleks med et polypeptid, når forbindelsen inkorporeres i en dobbeltstrenget dobbeltspiral dannet med et komplementært ribo= 5 nucleinsyre eller desoxyribonucleinsyremolekyle, hvor den punkterede linie er en kemisk binding eller gruppe, som forbinder B og A, forudsat, at hvis B er purin, er bindingen bundet til 8-stillingen i purinen, hvis B er 7-deaza= 10 purin, er bindingen bundet til 7-stillingen i deazapurinen, og hvis B er pyrimidin, er bindingen bundet til 5-stillingen i pyrimidinen, · hvor z er H- eller H0-, og 15 hvor m og n er tal fra 0 op til ca. 100.000.
3. 3. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved DK 164407 B 35 (a) omsætning af en forbindelse med strukturen: 5

   0 B’ OH-P----Q-CH„ OH kil H> 10 ]-i H H 2 H B o o-P—d-ch7 q-v. oh ζΗ u Η I l H

   15 Z O B" j —i-°’CH2/°\ i 0H <H j on H I H I 20 z O 1« O--P----—OH OH n

   25 L — med et merkurisalt i et egnet opløsningsmiddel under egnede betingelser til dannelse af et merkureret derivat med strukturen: „ + B-Hg 30 .. .-0-CH0 r>l H IH z 0

   35 O-P---- OH DK 164407 B 36 (b) omsætning af den merkurerede forbindelse med en kemisk + molekyldel, som er reaktionsdygtig med -Hg -delen af den merkurerede forbindelse og repræsenteret ved formlen ·*·Ν, hvilken reaktion udføres i et vandigt opløsningsmiddel og 5 i nærværelse af I^PdCl^ under stabile betingelser til dannelse af en forbindelse med strukturen: B· · ·Ν ----0—CH2 o
4. 4. Fremgangsmåde til påvisning af en dobbeltstrenget poly= nucleotiddobbeltspiral, som indeholder en forbindelse ifølge 30 krav 1, kendetegnet ved, at polynucleo= tiddobbeltspiralen bringes i kontakt med et polypeptid, som er i stand til at danne et kompleks dermed under egnede betingelser til dannelse af komplekset, hvilket polypeptid indeholder en molekyldel, som kan påvises, når komplekset 35 af polynucleotiddobbeltspiralen og polypeptidet er dannet, og påvisning af dette kompleks. DK 164407 B 37
5. 5. Fremgangsmåde til at bestemme tilstedeværelsen af et desoxyribonucleinsyremolekyle eller ribonucleinsyremolekyle, kendetegnet ved dannelse af en dobbeltstrenget hy-bridpolynuc1eotiddobbeltspi ral, som indeholder en enkelt 5 streng af desoxyribonucleinsyre eller ribonuc1ei nsyre svarende til eller afledt af desoxyribonucleinsyremolekylet eller ribo-nuc1einsyremo1eky1 et og en forbindelse ifølge krav 1, og påvisning af den dobbeltstrengede hybridpolynucleotiddobbeltspiral ved at bringe polynucleotiddobbeltspiralen i kontakt med 10 et polypeptid, der kan et et kompleks dermed under egnede betingelser til dannelse af komplekset, hvilket polypeptid indeholder en molekyldel, som kan påvises, når komplekset af polynucleotiddobbeltspiralen og polypeptidet er dannet, og påvisning af dette kompleks. 15
6. 6. Fremgangsmåde til undersøgelse af en bakterie for at bestemme tilstedeværelsen af resistens rood et antibiotikum, kendetegnet ved fremstilling af et polynucleotid komplementært til den desoxyribonucleinsyregensekvens i bak- 20 terien, som bibringer resistens mod antibiotikummet deri, og at dette polynucleotid bringes i kontakt med fra bakterien opnået desoxyribonucleinsyre under egnede betingelser til dannelse af en dobbeltstrenget hybrid dobbeltspiral, og denne dobbeltspiral bringes i kontakt med et polypeptid, som er i 25 stand til at danne et kompleks med hybriddobbeltspiralen under egnede betingelser, hvilket polypeptid indeholder en molekyldel, som kan påvises, hvis komplekset er dannet, og påvisning af tilstedeværelsen af komplekset under anvendelse af passende påvisningsteknik, idet tilstedeværelsen af komplekset viser 30 resistens over for antibiotikumet, og fravær af komplekset viser følsomhed over for antibiotikumet.
7. 7. Fremgangsmåde til at diagnosticere en genetisk forstyrrelse i et individ, kendetegnet ved, at der fremstil- 35 les et polynucleotid komplementært til desoxyribonucleinsyre-gensekvensen i individet, der er forbundet med den genetiske forstyrrelse og indeholder forbindelsen ifølge krav 1 inkorpo- DK 164407B 38 reret deri, hvilket polynucleotid bringes i kontakt med des-oxyribonucleinsyre fremkommet af individet under egnede betingelser til dannelse af en dobbeltstrenget hybrid dobbeltspiral, og denne dobbeltspiral bringes i kontakt med et polypep-5 tid, som er i stand til at danne et kompleks med hybriddobbeltspiralen, hvilket polypeptid indeholder en molekyldel, der kan påvises, når komplekset er dannet, og påvisn i ng af tilstedeværelsen af komplekset under anvendelse af passende påvisningsteknik, idet tilstedeværelse eller fravær af komplek-10 set viser tilstedeværelse eller fravær af den genetiske forstyrrelse .
8. 8. Fremgangsmåde til kromosomal karyotypedannelse, kendetegnet ved fremstilling af en række modificerede 15 polynucleotider svarende til en række definerede genetiske sekvenser lokaliseret på kromosomer, hvilke polynucleotider indeholder forbindelser ifølge krav 1, og at disse polynucleotider bringes i kontakt med fra kromosomer opnået desoxyribo-nucleinsyre til dannelse af hybriddobbeltspiraler, og hver af 20 disse dobbeltspiraler bringes i kontakt med et polypeptid, som er i stand til at danne et kompleks med hver sådan dobbeltspiral, hvilke polypeptider indeholder molekyldele, der kan påvises, når komplekserne er dannet, og bestemmelse af lokali- seringen af hvert kompleks på kromosomerne for derved at be-25 stemme lokaliseringen af de genetiske sekvenser på kromoso merne .
9. 9. Fremgangsmåde til at diagnostisere en tumorcelle, kendetegnet ved fremstilling af et polynucleotid, som er 30 komplementært til en messenger ribonucleinsyre syntetiseret af en desoxyribonucleinsyregensekvens, der er forbundet med produktion af et polypeptid, som er diagnostisk for tumorcellen og indeholder en forbindelse ifølge krav 1, indføring af dette polynucleotid i cellen under egnede betingelser for at mulig-35 gøre, at polynucleotidet hybridiserer med desoxyribonuclein- syregensekvensen, kontaktering af det hybridi serede polynucleotid med et polypeptid, som kan danne et kompleks med det hybridi serede po1ynuc 1 eotid , hvilket polypeptid indeholder en molekyldel, som kan påvises, når hybriderne er dannet, og på visning af komplekset. DK 164407 B 39
10. 10. Diagnostisk udstyr egnet til bestemme Ise af ti 1stedevære1- sen af en nucleinsyre, kendetegnet ved, at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1, som er komplementær til al eller en unik del af nuc1einsyren, og et polypeptid, som er i stand til at danne et påviseligt kompleks dermed. 10

    10 H^> H ' [ H z 0 ... II

    0-P--- ·

    15 OH hvor N er en reaktionsdygtig endestillet funktionel gruppe eller A, og 2o (c) udvinding af forbindelsen ifølge krav l,hvor N er A, eller når N er en reaktionsdygtig endestillet gruppe, reaktion af forbindelsen med en forbindelse med strukturen M-A, hvor M repræsenterer en funktionel gruppe, der er reaktionsdygtig med N i et vandigt opløsningsmiddel under egnede 25 betingelser til dannelse af forbindelsen ifølge krav 1, som så udvindes.
11. 11. Mellemprodukt til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det har strukturen: . . I B · · *A X”CH0 ^0.. <f > H y z 20 hvor B er en purin, 7-deazapurin eller pyrimidinmolekyldel i · kovalent bundet til C -stillingen i sukkermolekylet, forudsat, at når B er purin eller 7-deazapurin, er den bundet 9 . til N -stillingen i purinen eller deazapurinen, og nar B 25 er pyrimidin, er den bundet til N^-stillingen, hvor A er en molekyldel bestående af mindst 3 carbonatomer, som er i stand til at danne et påviseligt kompleks med et polypeptid, når forbindelsen inkorporeres i en dobbelt-30 strenget ribonucleinsyre, desoxyribonucleinsyredobbeltspiral eller DNA-RNA hybrid, hvor den punkterede linie repræsenterer en binding eller gruppe, som forbinder B og A, forudsat, at hvis B er purin, 35 er bindingen bundet til 8-stillingen af purinen, hvis B er 7-deazapurin, er bindingen bundet til 7-stillingen af DK 164407 B 40 deazapurinen, og hvis B er pyri mi din, er bindingen bundet til 5-stillingen i pyrimidinen, og 0 0 0 5 'I '1 'i hvor z er H eller OH, og én af x og y er HQ-P-0-P-0-P-0- og II! 0H OH OH den anden er H0-. 10 15 20 25 1 35