JPH088867B2

JPH088867B2 - 新規ウレアーゼ及びその製造方法

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Publication number: JPH088867B2
Application number: JP62289994A
Authority: JP
Inventors: 亨中山; 肇吉栖; 博山本; 淑吉澤
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1987-11-17
Filing date: 1987-11-17
Publication date: 1996-01-31
Anticipated expiration: 2011-01-31
Also published as: ES2055728T3; DE3880793T2; DE3880793D1; EP0316906A3; JPH01132379A; GR3007792T3; AU627157B2; CA1309678C; EP0316906B1; AU2564888A; US5006468A; EP0316906A2; ATE89032T1

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、酒類又は酒類発酵もろみ中に含まれ、酒類
の酒質劣化の原因となる尿素を分解することのできる新
規なウレアーゼ及びその製造法、更に詳しくは、アルス
ロバクター（Arthrobacter）属に属する新規微生物の生
産する酸性領域に反応至適pHを持ち耐酸耐アルコール性
を有する新規なウレアーゼ及びその製造法に関する。

従来の技術及び本発明の解決しようとする問題点清酒、ビール、ブドウ酒、醤油などの発酵食品中には
尿素が含まれている。この尿素は発酵に関与する酵母、
カビの生産するアルギナーゼという酵素により、アミノ
酸の１種であるアルギニンから発酵中に生成する。通
常、酒類中には２〜80ppm含まれるが、かす歩合をへら
し、収得歩合を高めることを目的としてもろみを長時間
発酵させた場合は100ppm以上に達することもある。

酒類に含まれる尿素は、その含有量が多いと酒に苦味
を与え、また加熱殺菌、長期間の貯蔵により酒類の着色
増加、香味の劣化を引き起こす原因となる。

また、酒類中から発がん性の高い化合物であるエチル
カルバメイトが検出され問題となっている。

（J.Agric,Food Chem.24,323,1976）エチルカルバメイ
トの生成機構は未だ解明されていないが、主として尿素
あるいはカルバミルリン酸から生成されるという説が有
力である。すなわち、酒類中に共存する尿素とエチルア
ルコールが非酵素的に反応し、エチルカルバメイトが生
成することが考えられている。

近年、変敗防止のため比較的高温（65℃以上）で長時
間（10分以上）にわたり加熱殺菌をする必要が生じ、ま
た、酒類の多用化に伴い醸造酒を長期間貯蔵する方法が
行なわれるようになった。これに伴い、加熱又は長期間
貯蔵による着色や香味の劣化防止、および発がん物質で
あるエチルカルバメイトの生成防止のために、この解決
手段として植物（刀豆）由来のウレアーゼ酵素剤を添加
することにより尿素を二酸化炭素とアンモニアに分解す
る方法が知られている（特公昭56−20830）。また、蒸
留酒においても蒸留に供する発酵もろみ中の尿素を除去
する目的でウレアーゼ処理を行なうことは、高温下で促
進されるエチルカルバメイト生成を防止する上から有効
であると考えられる。

しかし、この目的に叶った特性を有するウレアーゼは
ほとんど知られていないのが現状である。すなわち通
常、ウレアーゼの多くは中性、微アルカリに酵素反応至
適pHを持ち（特公昭60−55119、特開昭59−17987、特開
昭61−257183）、酒類のような酸性pH、高濃度アルコー
ル下でほとんど活性を示さず、しかも著しく不安定であ
ることが知られている〔ナタ豆ウレアーゼ;Eur.J.Bioch
em.73,185,1977,バチルスパスツエリ（Bacillus past
eurii）アレアーゼ;The Enzymes3rd ed.4,1,1971な
ど〕。従って、本発明の目的は、発酵食品（とくに酒
類）中に含まれる尿素を効率良く分解できる特性、すな
わち酸性域に反応至適pHを持ち、適度の耐酸性ならびに
耐アルコール性を有するウレアーゼを提供することにあ
る。

本発明の菌株と同属のバクテリアであるアルスロバク
ターオキシダンス（A.oxydans）がウレアーゼを生成
することが知られているが（Arch.Microbiol.139,355,1
984）、多くのバクテリア由来ウレアーゼ同様に反応至
適pHを中性域を持ち、本発明の目的には即さないもので
ある。酸性域に反応至適pHを持つ数少ないウレアーゼと
して、嫌気性菌ラクトバチルスファーメンタム（Lact
obacillus fermentum）の生成するウレアーゼが知られ
ている（Appl.Environ.Microbiol.37,379,1979）。

しかし、この菌株の生産するウレアーゼは菌体に対し
て膜結合性が強く精製が難しいという欠点があり、満足
すべきものではなかった。

問題点を解決する手段本発明者らは、酒類のように酸性pH、高濃度アルコー
ル存在下において含有する尿素を分解する特性を持つウ
レアーゼを広く自然界より検索した結果、アルスロバク
ターに属する一菌株が、上記目的に叶う特性を有するウ
レアーゼを生産することを見いだした。本菌性を液体培
養又は固体培養することによりウレアーゼを生産させ、
これを必要に即して精製純化することにより酒類中の尿
素除去作用酵素剤として効率的に利用することができ
る。すなわち、本発明は新規なウレアーゼ及び該酵素の
製造方法に関する。

本発明者らは、酸性pH域において有効な活性を示すウ
レアーゼを産性する微生物を探索した結果、北海道沙流
郡日高町の牧草地土壌から分離した微生物が酸性ウレア
ーゼを産性していることを見いだした。本発明において
用いる微生物の菌学的特徴を以下に述べる。

（Ａ）形態（１）細胞は多形性を示す。24時間以上培地上で生育
させた菌体は幅約0.8μｍ、長さ約1.0μｍの短かん菌で
あるが、これを新鮮なＬ培地（ポリプペトン１％、Yeas
t extract0.5％、NaCl0.5％、グルコース0.1％;pH7.0）
に接種し、30℃で振盪培養すると、約３時間後には幅約
0.8μｍ、長さ約2.5μｍのかん菌となり、Ｖ字型の細胞
も観察される。さらに培養を続けると約９時間後からし
だいに分裂を生じ、約24時間後には再びもとの球状に近
い短かん菌となる。

（２）胞子を形成しない。

（３）運動性があり、べん毛は極毛である。

（４）グラム染色性は、Ｌ培地に寒天1.5％を加えた
培地で30℃、16時間培養したとき、陽性を示す。

（Ｂ）培地における生育状態（１）肉汁液体培地菌体は淡黄色で、底に沈渣がみられ、全体的に濁りが
観察される。

（２）肉汁寒天平板培地発育は旺盛で、菌体は淡黄色を呈する。コロニーの直
径は約３〜5mmで、表面は滑らかで光沢があり、周縁は
全縁を呈する。

（３）肉汁寒天斜面培地（２）と同様の生育状態を示し、拡布状に生育する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培地ゼラチンを液化する。

（５）リトマスミルクリトマスミルクを淡褐色に変色させるが、凝固、液化
は認められない。

（Ｃ）生理的性質（１）硝酸塩の還元＋（２）デンプンの加水分解 − （３）カゼインの分解 − （４）５％NaClに対する耐性＋（５） 10％NaClに対する耐性＋（６）カタラーゼの生成＋（７）オキシダーゼの生成 − （８）ウレアーゼの生成＋（９）細胞外DNaseの生成＋（10）ゼラチンの液化能＋（11）酸素に対する態度好気性（12）生育温度範囲 10℃〜36℃ 至適生育温度;31℃ （13）生育pH範囲 6.0〜10.0 至適 pH;7.8 （Ｄ）糖から酸およびガスの生成酸の生成ガスの生成（１）Ｌ−アラビノース − − （２）Ｄ−キシロース − − （３）Ｄ−グルコース − − （４）Ｄ−マンノース − − （５） .D−フラクトース − − （６）Ｄ−ガラクトース − − （７）マルトース − − （８）サッカロース − − （９）ラクトース − − （10）トレハロース − − （11）可溶性デンプン − − （12）Ｄ−ソルビット − − （13）Ｄ−マンニット − − （14）イノシット − − （15）グリセリン − − （Ｅ）炭素源の資化性（１）４−アミノ−酪酸 ± （２）ｐ−ヒドロキシ安息香酸 − （３）Ｌ−ロイシン ± （４）Ｌ−アスパラギン＋（５）Ｌ−アルギニン＋（６）Ｌ−ヒスチジン − （７）Ｄ−キシロース＋（８）Ｄ−リボース＋（９）Ｄ−アラビノース＋（10）Ｌ−ラムノース＋（11）イノシトール ± （12）マロン酸 ± （13）クエン酸 − （14）グルコース＋なお、炭素源の資化性については、ツェントラルブラ
ットフューアバクテリオロギー（Zentralblatt f
r Bakteriologie）第１巻,357〜375頁,1980年に従って
試験を行なった。

（Ｆ）有機酸の利用性（１）クエン酸 − （２）ギ酸＋（３）マロン酸 − （４）グルタール酸 ± （５）アジピン酸 − （６）ピメリン酸 − （７）尿酸 − （８）安息香酸 − （９）プロピオン酸＋なお、有機酸の利用性については、ザ・ジャーナル・
オブ・ジェネラル・アンド・アプライド・マイクロバイ
オロジー（The Journal of General and Applied Micro
biology）第18巻,399〜416頁,1972年に従って試験を行
なった。

（Ｇ）DNAのGC含量 DNAのGC含量は、65.2％であった。測定は、FEMS・マ
イクロバイオロジー・レターズ（FEMS Microbiology Le
tters）第25巻,125〜128頁,1984年に従って行なった。

（Ｈ）細胞内キノンの分子種の同定 MK−９（H₂）を主成分として有する。測定は、山田雄
三、倉石衍著ユビキノンとメナキノン駒形和男編
「微生物の化学分類実験法」、143〜155頁,1982年，学
会出版センター出版（東京）に従って行なった。

（Ｉ）菌体内脂肪酸組成菌体内脂肪酸組成（％）は、分枝（イソ、アンテイ
ソ）脂肪酸が主成分で、不飽和脂肪酸はほとんど含まれ
ていない。各脂肪酸組成比は第１表に示す。

測定は、インターナショナル・ジャーナル・オブ・シ
ステマティック・バクテリオロジー（International Jo
urnal of Systematic Bacteriology）第33巻,188〜200
頁,1983年に従って行なった。

（Ｊ）細胞壁のペプチドグリカンタイプ本菌は細胞壁のペプチドグリカン中のジアミノ酸とし
てリジンを有し、ペプチドグリカンタイプは、Lys−Thr
−Ala−Ala型である。

細胞壁ペプチドグリカン中のジアミノ酸の決定、およ
び構成アミノ酸のモル比は、ザ・ジャーナル・オブ・ジ
ェネラル・アンド・アプライド・マイクロバイオロジー
（The Journal of General and Applied Microbiolog
y）第16巻,103〜113頁,1970年に従って細胞壁の精製と
加水分解を行ない、アミノ酸自動分析機（HITACHI AMIN
O ACIDANALYZER835−50）を用いて行なった。

ただし、菌体の破砕には超音波破壊機を用いた。

ペプチドグリカンタイプは、本菌株の細胞壁のアミノ
酸組成モル比が、リジン：グルタミン酸：アラニン：ス
レオニン＝1:1:4:1であることよりジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）第113
巻,8〜17頁,1973年に従うと、Lys−Thr−Ala−Ala型かL
ys−Ala−Thr−Ala型のどちらかであると考えられる。

上記文献に従えば、Lys−Thr−Ala−Ala型のペプチド
グリカンを酸部分加水分解して生じたオリゴペプチドに
はThr−ε−Lysが存在し、Lys−Ala−Thr−Ala型ではAl
a−ε−Lysが存在する。

そこで、本菌株の細胞壁ペプチドグリカンを4N HCl
で30分及び１時間、100℃にて部分加水分解し生じたオ
リゴペプチド及び合成したAla−ε−Lys,Thr−ε−Lys
のジペプチドをそれぞれ、アミノ酸自動分析機（HITACH
I AMINO ACIDANALYZER835−50）で分析し、保持時間を
比較したところ本菌株の細胞壁ペプチドグリカンの酸部
分加水分解物にはThr−ε−Lysと保持時間が一致するピ
ークが検出されたが、Ala−ε−Lysが保持時間と一致す
るピークは検出されなかった。

また、本菌株の細胞壁ペプチドグリカンの酸部分加水
分解物と合成Thr−ε−Lysを混合し、アミノ酸自動分析
機にかけたところ、Thr−ε−Lysと一致するピークの面
積が増加し、このペプチドグリカン部分加水分解物中に
Thr−ε−Lysが存在することが確認できた。

以上の結果、本菌株はLys−Thr−Ala−Ala型のペプチ
ドグリカンを有することが明らかになった。

（Ｋ）DNA−DNA交雑試験細菌壁ペプチドグリカンタイプがLys−Thr−Ala−Ala
型であるアルスロバクターシトレウスIAM12341（Arth
robacter citreus IAM12341）および細胞壁ペプチドグ
リカンタイプがLys−Ala−Thr−Ala型であるアルスロバ
クターウレアファシエンスIAM1658（Arthrobacter ur
eafaciens IAM1658）とのDNA−DNA相同性（％）を第２
表に示す。

測定は、インターナショナル・ジャーナル・オブ・シ
ステマティック・バクテリオロジー（International Jo
urnal of Systematic Bacteriology）第31巻,131〜138
頁,1981年に従って行なった。

以上の菌学的性質に従い、本発明の菌株SAM0752の分
類学的地位をバージェイズ・マニュアル・オブ・システ
マティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of S
ystematic Bacteriology）第２巻により求めると、グラ
ム陽性の好気性菌で多形性を示し、胞子を形成せず、DN
AのGC含量が65.2％であることから、本菌株はコリネフ
ォームグループに属する細菌であると考えられる。

さらに、細胞壁のペプチドグリカン中にリジンを含む
こと、細胞内キノンとしてMK−９（H₂）を有し、菌体脂
肪酸組成が12−メチルテトラデカン酸（ａ−15）、14−
メチルヘキサデカン酸（ａ−17）を主成分とする分枝型
であることから、ザ・ジャーナル・オブ・ジェネラル・
アンド・アプライド・マイクロバイオロジー（The Jour
nal of General and Applied Microbiology）第18巻,41
7〜418頁,1972年，第22巻,203〜214頁、1979年，および
インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティ
ック・バクテリオロジー（International Journal of S
ystematic Bacteriology）第33巻,188〜200頁,1983年に
従うと本菌株はアルスロバクター（Arthrobacter）属に
属する細菌であると考えられる。

さらに詳しい検討を行った結果、本菌株の細胞壁のぺ
プチドグリカンタイプが、Lys−Thr−Ala−Ala型である
事から、アルカイブス・オブ・マイクロバイオロジー
（Archives of Microbiology）第12巻,289〜295頁,1979
年及びジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal
of Bacteriology）第113巻,8〜17頁,1973年により、本
菌株はアルスロバクターシトレウスと同じグループに
含まれる事が判明した。なお、アルスロバクター属でLy
s−Thr−Ala−Ala−型のぺプチドグリカンタイプを有す
る種は現在のところアルスロバクターシトレウスしか
知られていない。

本菌株とアルスロバクターシトレウスIAM12341（基
準菌株）との生理的性質の相違点としては、第３表に示
すように、クエン酸の利用、マロン酸の利用、10％NaCl
に対する耐性、ウレアーゼの生成能、およびアルギニ
ン、キシロースの資化性で異なっている。

さらに、本菌株とアルスロバクターシトレウスIAM1
2341、およびアルスロバクターウレアファシエンスIA
M1658（基準菌株）とのDNA−DNA交雑試験を行った結
果、本菌株は、これら２種のいずれとも30％以下の相同
性を示し、これら２種とは別種と考えられる。

以上のことから、本発明者らは、本菌株SAM0752はア
ルスロバクター属の新菌種に属するものであると判断
し、この新菌種のアルスロバクターモビリス（Arthroba
cter mobilis）と命名した。

アルスロバクターモビリスSAM0752は工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第9658号（FERM Ｐ−
9658）として寄託されている。

本菌株の培養は通常行なわれている通気攪拌培養、振
盪培養、静置培養などの液体培養法もしくは固体培養法
を用いて行なうことができる。

培養培地組成としては、炭素源としてグルコース、澱
粉、シュクロース、ラクトースなど、窒素源としてプペ
トン、酵母エキス、尿素、硫酸アンモニウムなど、無機
塩としてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カル
シウムなど、その他必要に応じてZn⁺⁺,Cu⁺⁺,Fe⁺⁺,Ni⁺⁺
などの微量金属やビオチン、チアミンなどのビタミン類
などを適宜加えたものを用いる。培養温度は生育できる
範囲ならとくに限定されないが、30℃付近が望ましい。
培養はいずれの培養法においても15〜72時間行なう。

このような方法で得られた培養物からウレアーゼを採
取するには、はじめに遠心分離や濾過法などにより培養
物をブロス画分と菌体濃縮画分に分画する。菌体濃縮画
分は更にガラスビーズ法、フレンチプレス法、超音波処
理法、自己溶解法などを単独あるいは組み合わせ菌体破
砕を行ない、菌体残渣を除去することにより粗酵素標品
を得ることができる。

更に、必要に応じた濃縮標品や精製標品を得るために
は、限外濾過、透析、塩析、溶媒沈澱、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、等電点沈澱など周知の精製手法を単
独あるいは組み合わせることにより達成することができ
る。

このようにして精製された本菌株の生産するウレアー
ゼの酵素学的性質は以下のとおりである。

１）熱安定性 0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）および20％（v/v）エタノー
ル含有0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）中で10〜70℃、15分間
処理し、各温度における残存活性を測定した結果、エタ
ノール無添加では40℃、エタノール含有条件では50℃ま
でほぼ安定である。（第１図）２）至適温度１）と同様の緩衝液における至適温度は、エタノール
無添加では50℃付近、エタノール含有条件では60℃付近
にある。（第２図）３）pH安定性 0.1M酢酸緩衝液（pH3.2〜5.5）、0.1Mリン酸緩衝液
（pH5.0〜8.5）を用い、エタノール無添加、20％エタノ
ール含有の両条件下、４℃、16時間処理した後の残存活
性から、両条件下においてともにpH4.5以上で安定であ
る。（第３図）４）至適pH 0.1M酢酸緩衝液における至適pHは、エタノール無添加
ではpH4.2付近、20％エタノール含有条件ではpH5.0付近
である。（第４図）５）エタノール耐性０〜80％（v/v）のエタノールを含有した0.1M酢酸緩
衝液（pH4.5）中での酵素活性は25％付近まで安定であ
り、無添加に比べて活性が増加する傾向が認められた。
（第５図）６）尿素に対するKm値 0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）、37℃における本酵素の尿
素に対するKm値は、エタノール無添加においては約3.6m
M、20％エタノール含有条件下では約3.7mMである。

７）分子量高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過法により
分子量を求めた結果、本酵素の分子量は約240,000であ
った。ゲル濾過担体としてTSK G3000SW XL分析用カラ
ム（東ソー社製）を用い、0.7M NaClを含有する20mMト
リス・塩酸緩衝液（pH7.5）を0.5ml/分の流速で流した
ときの各種標準タンパク質（オリエンタル酵母社製）と
の相対溶出保持時間から分子量を算出した。

SDSポリアクリルアミド電気泳動法による本酵素のサ
ブユニット分子量は67000であった。Phast System電気
泳動装置（ゲルはPhast Gel Gradient8−25使用、ファ
ルマシア製）を用い、各種標準蛋白質との相対移動度か
ら求めた。本酵素は四量体であると思われる。

（８）等電点等電点電気泳動法により本酵素のpIは6.8付近であっ
た。Phast System電気泳動装置（ゲルはPhast Gel IEF3
−９を使用、ファルマシア製）を用い、各種標準蛋白質
（BDHケミカル製）との相対移動度から求めた。

（９）基質特異性尿素に類似の化合物について、基質濃度100mMにおけ
る酵素反応を行なわせた結果、本酵素は尿素にきわめて
特異性が高かった（第４表）。

（10）阻害剤本酵素はHg⁺⁺,Ag⁺,Cu⁺⁺などの金属イオンによって反
応が阻害される（第５表）。

活性測定は、単位時間中に基質である尿素が酵素反応
により分解し生じるアンモニアを定量することにより行
なった。具体的には、通常、0.2mlの0.1M酢酸緩衝液（p
H4.5）、0.025mlの0.1M尿素液を混合した反応液に0.025
mlの酵素液を加え、37℃で所定の時間（10〜20分）イン
キュベーションを行ない、反応は0.025mlの33％トリク
ロロ酢酸溶液を添加し停止させる。反応停止させた上記
反応液を1mlの発色液〔発色液は0.3Mリン酸緩衝液（pH
7.5）を10ml、エタノール1ml当たり25mgのｏ−フタルア
ルデヒドを溶解した液を0.56ml、エタノール1ml当たり
５μｌのメルカプトエタノールを溶解した液を0.56mlず
つ混合して調整する〕に添加し、室温にて45分間放置し
た後の410nm吸光度の増加を測定し、同時に塩化アンモ
ニウムを標準物質として作成した定量曲線から酵素活性
を算出した。この方法は、Heiniらの方法に準じている
（Eur.J.Biochem.162,541,1987）。酵素の活性単位（ユ
ニット）はアンモニア生成量μmol/分として定義した。

本発明の新規微生物の生産するウレアーゼは、上記の
酵素学的諸特性から新規ウレアーゼと考えられる。

次に、本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例１ポリペプトン1.0％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、p
H7.2の培地200mlずつを500mlワイヤーフラスコに入れ12
0℃にて15分間オートクレーブ殺菌したものに、本菌株
を一白金耳ずつ植菌し、28℃、24時間振盪培養した。こ
れを以下に述べる本培養のための種菌として用いた。

グルコース1.0％、ポリペプトン0.5％、肉エキス0.05
％、酵母エキス0001％、KH₂PO₄0.2％、NaCl0.5％、pH7.
2の培地30を50通気攪拌培養槽に入れ、30分間蒸気
殺菌したものに上に記した培養種菌を植菌し、0.8vvm、
30℃にて24時間培養を行なった、培養終了後、培養物を
遠心処理し得られた菌体を10mMのリン酸緩衝液（pH7.
4）で洗浄し、湿重量80gの菌体を得た。上記のリン酸緩
衝液に懸濁した菌体を、ダイノミル（Willy A.Bachofen
社製、ガラスビーズ径0.1mm、流速60ml/分）を用い破砕
した。得られた菌体破砕液中には13000ユニットの酵素
活性が含まれていた。また、比活性は1.0ユニット/mgタ
ンパクであった。

菌体破砕液（1.6）を、あらかじめ10mMリン酸緩衝
液（pH7.4）にて平衡化しておいたイオン交換樹脂FP D
A13カラム（三菱化成社製、６×10cm）にかけ、上記リ
ン酸緩衝液（2.0）に０〜0.6M KClの直線勾配をつけ
て溶出させ、主要なウレアーゼ活性画分600ml（9600ユ
ニット）を得た。この標品の比活性は5.0ユニット/mgタ
ンパクであった。

次に上記活性画分を用い、疎水クロマトグラフィーに
よる精製を行なった。あらかじめ2.5MKClを含有する0.1
Mリン酸緩衝液（pH7.0）において平衡化しておいたブチ
ルトヨパール650C（東ソー社製、３×30cm）に同じく
2.5MKClとなるように調製しておいた活性画分をのせ、
蒸留水を希釈液としKClの濃度を直線的に低下させなが
ら酵素活性画分を溶出させた。得られた標品の総活性は
4800ユニット、比活性は40ユニット/mgタンパクであっ
た。

実施例２実施例１で得られた酵素（60mgタンパク）を20mM Tr
is・HCl緩衝液（pH7.5）で透析し、透析酵素標品を得
た。本標品を用い更にイオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過クロマトグラフィーを組みあわせ精製を行っ
た。透析に用いた緩衝液で平衡化したDEAEトヨパール65
0S（東ソー社製）に透析標品をのせ20mM Tris・HCl緩
衝液にNaClの濃度を直線的に上昇させて酵素活性画分を
溶出させた。

得られた標品の総活性は1200ユニットで、比活性は18
0ユニット/mgタンパクであった。

さらに70％飽和硫安により沈澱濃縮せしめ、遠心分離
後、少量の0.7M NaClを含む20mM Tris・HCl緩衝液に
溶解した。溶解に用いた緩衝液で平衡化したTSK G3000
SW×Ｌカラム（東ソー社製）を用い、上記緩衝液を流速
0.5ml/分で流し分離溶出してきた酵素活性画分を集め
た。この操作により、得られた精製物は総活性580ユニ
ット、比活性970ユニット/mgタンパクであった。

実施例３実施例１で得られたウレアーゼ標品を用いて、清酒
（この実施例では、エタノール19％、pH4.0のものを用
いた）中に含まれる尿素の分解除去についてみた。

清酒10mlに最終的に０〜８ユニット/mlとなるように
ウレアーゼ酵素標品を添加し低温下（10℃）でインキュ
ベーションし、反応させた清酒を0.1mlずつ経時的に採
取し、これを33％トリクロロ酢酸1.8μｌを添加するこ
とにより反応停止させ５μｌの1.0N水酸化ナトリウムで
中和した後に、尿素・アンモニア定量Ｆキット（ベーリ
ンガーマンハイム、山之内（株）社製）を用い、残存尿
素含量を測定した。その結果は、第６図に示したよう
に、ここで用いた酵素力価においては、すべての場合に
おいて48時間内に尿素を測定限界値（〜1ppm）以下にま
で分解除去することが認められた。

なお、この清酒について、ウレアーゼ添加による味臭
いの変化について官能試験を行なったが、ウレアーゼ添
加による異味異臭は全く認められなかった。

実施例４ウレアーゼ標品による清酒中の尿素の分解活性につい
て温度の影響をみた。清酒はエタノール19％、pH4.1の
ものを用い、最終酵素量４ユニット/mlで反応を行なっ
た。残存尿素量測定法などはすべて実施例３と同じであ
る。結果を第７図に示すように、中温域（20〜37℃）で
は速やかに尿素を測定限界値以下にまで分解除去するこ
とが認められた。

実施例５発酵もろみにおける尿素除去について清酒最終発酵も
ろみ（エタノール19％、pH4.1、尿素35ppm）およびバー
ボンウイスキー用発酵最終もろみ（エタノール8.5％、p
H4.2、尿素45ppm）を用い本ウレアーゼの効果を見た。
ウレアーゼ添加条件、反応処理法、残存尿素の測定方法
などすべて実施例３と同じに行ない、どちらの場合にも
48時間内に尿素を測定限界値以下にまで分解除去するこ
とが認められた。

実施例６清酒に本発明菌株生菌体を添加することによる尿素分
解について検討した。本菌株の生菌体は、実施例１で述
べた種菌調製用培地に一白金耳の本菌株を植菌し28℃で
24時間振盪培養し、この培養物から遠心処理により得ら
れた菌体を蒸留水で三度洗浄したものを培養物に対して
十倍濃縮になるように懸濁して用いた。清酒は、実施例
３と同じものを用いた。清酒10mlに対し菌懸濁液0.1ml
を加え、10℃で48時間放置した結果、対照として蒸留水
を加えた清酒中に31ppm含まれていた尿素が測定限界値
（〜1ppm）以下にまで低下していた。

実施例７実施例２で得た精製ウレアーゼ標品5.0mg（550ユニッ
ト）を含んだ水溶液50ml中にキトサンビーズBCW−3013
（富士紡績社製）1000粒を加え、２時間室温で穏やかに
攪拌した。ここに５％ゲニピン水溶液5mlを加え更に18
時間穏やかに攪拌した。キトサンビーズを集め、蒸留水
10mlで２度洗浄してウレアーゼ固定化ビーズを得た。本
ビーズのウレアーゼ酵素活性は500ユニット/1000ビーズ
であった。実施例３で用いた清酒10mlに本ウレアーゼ固
定化ビーズ50粒を添加し攪拌しながら30℃で10時間反応
させた後の残存尿素量を測定したところ測定限界値以下
にまで尿素が分解されていた。

発明の効果本発明のウレアーゼ標品、あるいはこのウレアーゼを
生産する本菌株を添加することにより、清酒など醸造酒
中の尿素が測定限界値以下にまで分解されることが認め
られた。また、清酒発酵もろみやバーボンウイスキーな
ど蒸留酒用の発酵もろみについても、発酵終了段階近く
で本ウレアーゼ標品を添加することにより同様な効果が
認められた。

また、尿素除去反応に使用するウレアーゼ酵素剤とし
ては、周知の酵素固定化技術を用い各種支持体に本発明
ウレアーゼ標品を固定化して目的を達することもでき
る。

【図面の簡単な説明】

第１図から第４図までの実線はエタノール無添加の場
合、破線はエタノール含有条件の場合をそれぞれ示して
いる。第１図は精製ウレアーゼの熱安定性、第２図は至適温
度、第３図はpH安定性、第４図は至適pH、第５図は酵素
活性に対するエタノール添加濃度の影響を示したグラフ
である。第６図は清酒中にウレアーゼ標品を添加したと
きの10℃における残存尿素量の変化を経時的に測定した
グラフ、また第７図はウレアーゼによる尿素分解に対す
る温度の影響を示したグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山本博大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者吉澤淑東京都北区滝野川２―６―30 国税庁醸造試験所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有する新規なウレア
ーゼ（１）作用１モルの尿素より１モルの水を消費し、２モルのアンモ
ニアと１モルの二酸化炭素を生成する。（２）至適 pH 4.2〜5.0 （３） pH安定性４℃、16時間の処理でpH4.5以上で安定（４）至適温度 50〜60℃ （５）温度安定性 pH4.5、15分間の処理で50℃まで安定（６）基質特異性尿素に極めて特異性が高い（７）阻害剤 Hg⁺⁺,Ag⁺,Cu⁺⁺等の金属イオン（８） Km値 3.6〜3.7mM（pH4.5、0.1M酢酸緩衝液）（９）分子量約240,000（ゲル濾過法により測定）（サブユニット分
子量67,000）（10）等電点 pI 約6.8
【請求項２】アルスロバクター（Arthrobacter）属に属
する微生物が産生する特許請求の範囲第１項記載ウレア
ーゼ。
【請求項３】アルスロバクター属に属する微生物がアル
スロバクターモビリス（A.mobilis）である特許請求
の範囲第２項記載のウレアーゼ。
【請求項４】アルスロバクター属に属し、下記の理化学
的性質を有する新規なウレアーゼ産生能を有する微生物
を培養し、培養物中に該酵素を蓄積させ、これを採取す
ることを特徴とする新規なウレアーゼの製造方法。（１）作用１モルの尿素より１モルの水を消費し、２モルのアンモ
ニアと１モルの二酸化炭素を生成する。（２）至適 pH 4.2〜5.0 （３） pH安定性４℃、16時間の処理でpH4.5以上で安定（４）至適温度 50〜60℃ （５）温度安定性 pH4.5、15分間の処理で50℃まで安定（６）基質特異性尿素に極めて特異性が高い（７）阻害剤 Hg⁺⁺,Ag⁺,Cu⁺⁺等の金属イオン（８） Km値 3.6〜3.7mM（pH4.5、0.1M酢酸緩衝液）（９）分子量約240,000（ゲル濾過法により測定）（サブユニット分
子量67,000）（10）等電点 pI 約6.8
【請求項５】アルスロバクター属に属する微生物がアル
スロバクターモビリス（A.mobilis）である特許請求
の範囲第４項記載の製造方法。